Krooninen sairaus

tiivistelmä

Erityisissä solutyypeissä kuten keratinosyyteissä, Notch signalointi tärkeä pro-erilaistumista ja kasvaimen estävä toiminto, jossa on alas-modulaatio Notch1 geeni liittyy syövän kehitystä. Sen lisäksi, että ohjataan p53, vähän muuta tiedetään sääntelystä Notch1 geenin ilmentymisen tässä yhteydessä. Me raportoimme tässä, että transkriptio tämän geenin ohjaa TATA-less ”terävä huippu” promoottori ja että minimaalinen funktionaalinen alue tämän promoottorin, joka ulottuu -342 bp kannan aloituskodonin, on eri tavoin aktiivinen normaalissa verrattuna syöpää solut. Tämä GC rikas alue puuttuu p53 sitoutumiskohtia, mutta sitoo Klf4 ja SP3. Tämä havainto on todennäköisesti biologisesti merkittävä, koska Klf4 ja vähemmässä määrin, SP3 on säädelty useilla syöpäsolujen jossa Notch1 ilme on alas-moduloitu, ja Klf4 yli-ilmentyminen normaaleissa soluissa riittää alas -modulate Notch1 geenin transkription. Yhdistetty knock-alas Klf4 ja SP3 oli tarpeen päinvastainen vaikutus lisätä Notch1 transkription, sopusoinnussa kaksi tekijää kohdistamaan päällekkäinen repressori toimintoa niiden sitoutumisen Notch1 promoottori.

Citation: Lambertini C, Pantano S, Dotto GP (2010) Differential valvonta Notch1 Gene transkriptio Klf4 ja SP3 -transkriptiotekijät Normal versus Cancer-Derived Keratinosyyttejä. PLoS ONE 5 (4): e10369. doi: 10,1371 /journal.pone.0010369

Editor: Joanna Maria Bridger, Brunelin yliopisto, Iso-Britannia

vastaanotettu 24. marraskuuta 2009; Hyväksytty: 22 maaliskuu 2010; Julkaistu: 28 huhtikuu 2010

Copyright: © 2010 Lambertini et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Swiss National Foundation, avustusta Euroopan unionin (Epistem, kuudennen puiteohjelman, LSHB-CT-2005-019067), ja NIH Grants AR39190 ja AR054856 ja GPD Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Notch signalointi on keskeinen rooli valvonnassa solun kohtalon määrittämiseen, kasvuun ja erilaistumiseen [1], [2]. Se on myös tekijä Karsinogeneesin joko positiivinen tai negatiivinen rooli riippuen solutyypistä ja erityistilanteessa [3], [4]. Paras tunnettu ”kanoninen” reitillä Notch aktivointi liittyy proteolyyttisen katkaisun ja translokaation sytoplasmisen domeenin reseptorin tumaan, jossa se on yhteydessä DNA: ta sitovan proteiinin CSL muuntamalla se repressorin osaksi aktivaattorin transkription [1], [ ,,,0],2]. Eniten huomiota on kiinnitetty valvonnan Notch reitin klo transkription jälkeisellä tasolla, mukaan lukien jalostus ja kypsymisen Notch reseptorien aktivointi ligandeja solun pinnalla, ja proteiinia muutos ja hajoaminen [1], [2]. Kuitenkin tärkein sääntelyä voi olla myös tasolla geenin transkription. Expression neljästä Notch-reseptorin geenien ja niiden ligandit säädellään solun spesifisiin tapahtumiin ja voidaan muuttaa syövän kehittymisessä [3], [5]. Lisäksi aktivointi yksi reseptori on omiaan vaikuttamaan omaa ilmaisua sekä muiden perheenjäsenten, ja voivat myös törmätä, positiivisella tai negatiivisella tavalla, on ligandi ilme [1], [2].

esimerkkinä tästä kompleksilukumoodi sääntelyn Notch ilmaisun on antanut tutkimuksissa keratinosyyteissä, joissa tämän reitin avainasemassa edistettäessä erilaistumista ja tukahduttamalla kasvaimen kehittymisen [3]. Tyvisolukerroksessa orvaskeden, vastavuoroinen negatiiviseen säätelyyn välillä ligandit Delta perheen ja Notch-reseptorien on ehdotettu ohjaamaan tasapaino oletetun keratinosyyttien kantasolujen populaatioiden ja solujen sitoutunut erilaistumista [6]. Toisaalta, positiivinen palaute asetuksen välillä Notch-reseptorien ja ligandien Jagged perhe on pidetty mahdollisena mekanismi synkronointia keratinosyyttien siirtyminen pohjapinta lisääntyvän suprabasaalisiin erottaa orvaskeden [7]. Vaikka sekä Notch1 ja Notch2 reseptorit ilmentyvät interfollicular iho, niiden sääntely ja toiminta ovat vain osittain päällekkäisiä. Erityisesti vaikka Notch2 tasot tasaisesti koholla erottaa orvaskeden, ilmaus Notch1 suljetaan syrjäisimmillä kerroksissa [7]. Tämä voi olla toiminnallinen merkitys, koska kohonnut Notch1 aktiivisuutta, kun taas vaaditaan sitoutumista ja käyttöönoton erilaistumista, voi sitten tukahduttaa uusimmat vaiheet tämän prosessin [7], [8]. Samoin keratinosyyttispesifisestä johdettu kasvaimia, kuten ihon levyepiteelikarsinoomien (SCC), tyvisolusyöpien (BCC) [9], [10] ja myöhäisessä vaiheessa kohdunkaulan karsinoomien [11], Notch1 ilmentyminen vähenee oleellisesti enemmän kuin Notch2 . Tämä on todennäköisesti toiminnallinen merkitys, vaikka läsnä on Notch2, poisto Notch1 geeni on sinänsä riittävät edistämään keratinosyyttien kasvainten kehittymiseen [9], [11], [12].

Yllättävän vähän on tietävät torjunnasta Notch1 geenin ilmentymisen. Keratinosyyteissä, endogeeninen p53 sitoutuu Notch1 promoottorin, lisäämällä sen transkription, ja heikentynyt p53 funktio voi selittää, ainakin osittain, kasvaimeen liittyvää alas-modulaatio Notch1 ilmaisun [9], [13], [14]. Samoin vähentynyt p53 tasojen kautta virus E6 riippuvaa hajoamista voi selittää jo mainittu alas-säätely Notch1 ilmentymisen HPV-positiivisten kohdunkaulansyövän solut [14]. Valvonta Notch1 ilmentymisen p53 on merkityksellinen myös Sarveiskalvosoluviljelyjen vastaus UV-valolle, merkittävä etiologinen ihon vanhenemisen ja syövän [13], [14]. Lisäksi keratinosyytit, ja niiden pahanlaatuinen kollegansa, Notch1 ilme on alle positiivinen p53 valvonnan keuhko- ja eturauhassyövän solut, muut solutyypit, joissa lisääntynyt Notch signalointi syitä kasvun hidastuminen [15], sekä krooninen lymfaattinen leukemia soluja, joissa Notch signalointi parantaa solujen selviytymistä [16]. Monissa näistä tapauksista, p53 todettiin erikseen mukana valvonnassa Notch1 geenin vähän tai ei lainkaan vaikutusta muihin perheenjäseniin [9], [14], [15]. Mielenkiintoista, tällaista sääntelyä löydettiin koolonkarsinoomasoluja huolimatta sitoutumisen p53 että Notch1 promoottori edes näissä soluissa, osoittaen todennäköinen vuorovaikutus p53 ja muut vielä tunnistamattomien tekijöitä Notch1 geenin transkription [9].

Sp /KLF perheen transkriptiotekijöiden koostuu proteiineista, jossa on kolme hyvin säilyneitä DNA sitova sinkkisormidomeenia, jotka tunnistavat GC /CACCC laatikot läsnä monissa GC-rikas promoottorit [17]. Näillä tekijöillä on tärkeä rooli transkriptio taloudenhoito geenien sekä geenien rajoitetumpi solutyypin tiettyjä toimintoja [18]. Niistä Klf perheenjäsenet, Klf4 on herättänyt viime aikoina huomiota, koska sen kyky, yhteisesti muiden tekijöiden, ohjelmoida solun kohtalon määrittämiseen [19], sekä edistää tai tukahduttaa syövän kehityksen yhteydessä riippuvaisella tavalla [20]. Me raportoimme tässä, että keratinosyyteissä Klf4 sitoutuu Notch1 promoottori ja yhdessä SP3, toimii negatiivisena säätelijänä Notch1 geenin transkription, joka vaikuttaa rekrytointi PolII preinitiation monimutkainen erillisen mekanismin p53. Inhibitio Notch1 ilmentymisen Klf4 on yhdenmukainen keskeistä roolia Klf4 loppuvaiheissa sarveiskalvosoluviljelmiä erilaistumisen [21], joille ilmentymisen Notch1 geenin täytyy olla pois päältä [7]. Kuitenkin sama sääntelymekanismi voi myös edistää alas-modulaatio Notch1 ilmentymisen keratinosyyttispesifisestä peräisin kasvaimiin, jossa Klf4 voivat olla poikkeavasti yli-ilmentynyt.

Tulokset

1. Transkriptio Notch1 geeni ”terävä piikki” TATA vähemmän promoottori

Lisäksi osallistuminen p53 [9], [13], [14], [22], vähän tiedetään valvonnan Notch1 geenin transkription . Ihmisen Notch1 geeni sijaitsee kromosomissa 9 ja rakenteeltaan 34 eksonien jotka koodaavat suuren proteiinin noin 270 kDa. Edelleen oivalluksia transkriptionaalisen säätelyn tämän geenin, vertasimme sen ylävirran ei-koodaava sekvenssi ihmisen verrattuna hiiren genomeja. Useat ennustettu p53 sitoutumiskohdat ovat läsnä 3,0 kb ylävirtaan sekvenssin hiiren ja ihmisen Notch1 promoottorit vaikkakin eri asennoissa suhteessa aloituskodonista (Fig. 1A). Gradientti kasvaa sekvenssihomologia löydettiin kohti ihmisen ja hiiren aloituskodonit, jossa 70% sekvenssi-identiteetti GC-rikas domain asennosta -500 bp ATG. Nukleotidin analyysi huomautti myös otaksuttu TFIID-sitoutumiskohta noin asemassa -230 bp ympäröi distaalinen keskeisiä elementtejä, kun taas mitään TATA laatikoita voitiin tunnistaa (käyttäen TESS, Consite tai Genomatix ohjelmia www.cbil.upenn.edu/cgi-bin /tess /tess, asp.ii.uib.no:8090/cgi-bin/CONSITE/consite, www.genomatix.de) (Fig. 1 B).

(A) nukleotidisekvenssi vertailu 3,0 kb ylävirran alueen ihmisen ja hiiren Notch1 geenien yhä homologia kohti koodausalue havainnollistaa harmaa intensiteettiä kaltevuus. Asemaa oletetun p53-sitoutumiskohtia, kun ennustettu bioinformatiikan ohjelman (Matlnspector, https://www.genomatix.de) on osoitettu, suhteessa aloituskodoni. ”Canonical” p53-sitoutumiskohdat koostuu kahdesta puoli-sivustoja, joilla on nukleotidisekvenssi RRRCA /T-T /AGYYY (R = puriini; ja Y = pyrimidiini), joiden välissä on välike 0-21 nukleotidia. Quarter-sivustoja (RRRCW ja WGYYY) voi olla läsnä miestä vastaan, tai päästä häntään suunnan, kuten nuolet (→ tai ←). Numerot ylä- ja alapuolella viittaavat sovitus- välisen nukleotidisekvenssin kunkin päällä ja ennustetun matriisi, jossa täydellinen ottelu = 1,00, ja ”hyvä” match 0,80. (B) Core promoottorielementtejä ihmisen Notch1 geenin osoitus runsaasti GC proksimaalinen alue, otaksuttu TFIID sitoutumiskohta ja distaalisen keskeisten elementtien (DCE) [53] (mikä tunnistetaan TESS-ohjelma) ja Notch1 transkription aloituspaikkoja ( TSS). (C) kokeellinen määrittäminen Notch1 TSS 5 ’RACE. Ihmisen primääristä keratinosyyttejä käytettiin lähteenä kokonais-RNA: 5 ’RACE monistus käyttämällä GeneRacer ja erityistä reverse-aluketta sijaitsee +242 bp aloituskodonista. Kloonaus ja sekvensointi monistusreaktion tuotteen (kuten on esitetty sen jälkeen, kun geelielektroforeesin) osoitti merkittävän TSS asemassa -262 ja toinen asemassa -259. Sekvenssi päällekkäisten initiaattorin elementtien (Py Py A (+1) NT (+3) Py Py), meidän tapauksessamme TCA (+1) TT (+3) AG tärkeimmille TSS, ja CTA (+1) GT ( +3) GC toisen TSS, on lihavoitu, kun taas ensimmäinen nukleotidia kaksi TSS ovat kursiivilla.

Muodosta kokeellisesti transkription aloituskohdasta (TSS) on Notch1 nauhoituksen ensisijainen ihmisen keratinosyyttejä (HKC), me kloonattu ja sekvensoitu tuotteiden 5′-RACE (Rapid monistaminen 5 ’täydentäviä DNA päättyy) reaktio näissä soluissa (Kuva. 1 C). Tulokset viittasivat tärkein TSS ihmisen Notch1 geenin asemassa -262 bp ATG, toisella pieni TSS at -259 bp. Niinpä transkriptio Notch1 geeni ohjaa CpG-saarekkeen promoottori, joka, toisin kuin useimmat promoottorit tämän luokan [23], on ominaisuuksia ”terävä piikki” promoottori, tarkat TSSs luultavasti määrittää päällekkäinen aloittaja (Inr) elementti [24].

2. Mapping toiminnallisen Notch1 promoottorialue normaaleissa verrattuna syöpäsolujen

mRNA ilmaisu voidaan ohjata eri tasoilla, ensimmäisestä vaiheet transkription (aloittamisesta /venymä) RNA käsittely ja vakaus [25]. Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi alukkeilla, jotka ovat spesifisiä 5′- ja 3′-alueiden Notch1 otteen ja ensimmäisen intronin osoitti, että korkeampi ilmentyminen Notch1 mRNA aiemmin raportoitu HKC verrattuna keratinosyyttien johdettuja syöpäsoluja [9], [11] oli ylläpidetään riippumatta erityisten alueiden Notch1 transkriptio että analysoitiin (Fig. 2).

(A) järjestön Notch1 geenin, jossa ilmoitetaan avoimen lukukehyksen (ORF), jossa koodaus eksonit ja välissä intronit (musta paksu laatikot ja linjat, vastaavasti) ja 5 ’ja 3’alueet (UTR). Asento eri alukejoukkoa käytetään reaaliaikaisen RT-PCR-analyysi on myös merkitty (ohut nuolet). (B) Kokonais-RNA primaarisista ihmisen keratinosyyttien (HKC), kohdunkaulan karsinooma (HeLa, CaSki ja SiHa), ja ihon (SCC13) ja suun kautta (SCCO28) squamous karsinooma solut analysoitiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä käyttäen alukkeita, jotka vastaavat eri alueella Notch1 geenin osoitettu (A). Tästä ja kaikki muut luvut, arvot normalisoituivat 36B4 ja /tai 18S RNA-tasot, ja ilmaistaan ​​suhteessa kuin ensisijaisen keratinosyyteissä.

Nämä tulokset viittaavat siihen, transkriptio Notch1 geeni on differentiaalisesti ohjattu normaaleissa verrattuna syöpäsolujen jo alkuvaiheet transkription. Edelleen testata tätä mahdollisuutta, päätimme minimaalinen toiminnallista aluetta Notch1 promoottorin ja arvioi, onko tällainen alue on differentiaalisesti aktiivinen normaaleissa verrattuna syöpäsoluja. Tätä tarkoitusta varten, 2,4 kb: n alueen Notch1 ylävirtaan aloituskodonista kloonattiin lusiferaasireportteri-, jonka jälkeen promoottorin aktiivisuuden määrityksissä HKCs verrattuna HeLa-soluissa. Testaus sarja-fragmenttien alenevia pituus 5′-päästä osoittivat, että 342 bp: n alueen aloituskodonista edelleen täysin promoottorin aktiivisuutta HKCs, samalla kun muita lyhentäminen Notch1 promoottorin -315 bp ja -300 bp: n alueiden johti vähitellen vähentyneestä aktiivisuudesta (Fig. 3A). Notch1 promoottorialueille täysin aktiivisuus HKCs oli huomattavasti vähemmän aktiivisia HeLa-soluissa, mikä heijastaa eroja endogeenisen Notch1 geenin transkriptio, vaikka ero promoottorin aktiivisuus väheni lyhyemmillä Notch1 promoottorifragmenttien (Fig. 3A).

(A) eri fragmentteja ihmisen Notch1 promoottorin vähenee 5 ’päät kloonattiin lusiferaasireportteriplasmidi, minkä jälkeen hetkellisellä trans- ihmisen primaarisia keratinosyyttejä ja HeLa-soluja (mustat ja harmaat pylväät, vastaavasti) yhdessä Renilla minimaalinen reportterina normalisointia . Promoottorin aktiivisuus mitattiin 48 tuntia transfektion jälkeen. Suhteellinen promoottorin aktiivisuus eri toimittajille HKC versus HeLa laskettiin myös (oikea taulukko). (B) fragmentteja ihmisen Notch1 promoottorin osittain tai kokonaan poistetaan sekvenssin TSS aloituskodonin (puuttuvat nukleotidit -159–1, ja -262–1, vastaavasti) kloonattiin lusiferaasireportteriplasmidi, jonka jälkeen lyhytaikaisella transfektiolla /promoottorin aktiivisuus määrityksissä primaarisissa ihmisen keratinosyyteissä ja HeLa-soluja kuten edellisessä paneelissa. Suhteellinen promoottorin aktiivisuus HKC versus HeLa laskettiin myös. (C) Kokonais-RNA ensisijainen keratinosyyteistä ja erilaisten syöpäsolujen linjat, mukaan lukien PC3, CaSki ja HeLa kahdesta eri lähteestä (HeLa # 1 ja 2), käytettiin RT-PCR-monistuksella 5’-UTR-alueen Notch 1 geeni (pohjamaali asennossa -262 /-174). Huomaa nopeammin liikkuva vyöhyke, jotka on saatu HeLa näytteitä. Kloonaus ja sekvensointi päällekkäiset genomin alueella (asennosta -392 bp -1 että Notch1 promoottori) osoitti poisto asennosta -215–202 HeLa-soluissa. (D) Sama Notch1 genomin alueella plus /miinus edellä poistetaan kloonattiin lusiferaasireportteriplasmidi, jonka jälkeen promoottorin aktiivisuuden määrityksissä HKC verrattuna HeLa-soluissa, mitattuna kuten (A) ja (B).

nukleotidisekvensseillä alavirtaan transkription aloituspaikkoja (TSS) soittaa myös tärkeä rooli valvonnassa promoottorin aktiivisuuden, vaatimatta muodostumista transkription valmiiksi aloittamista ja aloittamisen kompleksit [26]. Yhdenmukainen tärkeyttä tällä alueella, promoottorin aktiivisuus väheni huomattavasti, kun sekvenssi Notch1 promoottorin alavirtaan TSS aloituskodonin (välillä -262 -1,) oli osittain tai kokonaan poistettu (jossa promoottorikonstrukteja puuttuu nukleotideistä -159 kohteeseen -1, ja -262–1, vastaavasti) (Fig. 3B). Tässäkin tapauksessa, luonnostaan ​​vähentynyt promoottorin aktiivisuus liittyi vähäisemmässä ero normaalin ja syöpäsolujen (Fig. 3B).

PCR-monistus perimän DNA tarkoituksena oli arvioida sen metylaatiotila esitetyllä jäljempänä, paljasti olemassaolo pieni deleetio Notch1 promoottorialueen kaksi eri kantoja HeLa-solujen, joka ei ollut läsnä muissa syöpäsoluissa, kuten PC3 ja CaSki (Fig. 3C). Kloonaamalla ja sekvensoimalla tällä alueella, olemme kartoittaneet poistetaan sen -215–202 bp asentoon, juuri alavirtaan TSS. Funktionaaliset promoottorin aktiivisuus määrityksissä kloonatun promoottorialueen promoottori HKC versus HeLa solut osoittivat, että tämä 10 nukleotidin poisto ei vaikuttanut promoottorin aktiivisuutta eikä sen ero sääntelyä normaaleissa verrattuna syöpäsolujen (Fig. 3d).

3. Negatiivinen kontrolli on Notch1 geenin transkription Klf4 ja Sp3

ero transkription aktiivisuus GC-rikas proksimaalisen alueen Notch1 promoottori voi olla yhteydessä eri metylaation tilassa HKCs verrattuna HeLa-soluissa. Vedä alas määrityksissä vasta-aineilla metyloitua DNA seuraa PCR-monistaminen osoitti merkittävällä tasolla metylaation ensimmäisen introni alueella (nukleotidien + 1168 /+ 1798) HeLa-soluissa, mutta ei HKCs, jotka voivat edistää eri transkriptio Notch1 -geeni (Fig. 4A). Kuitenkin, mitään havaittavaa metylaatio havaittiin Notch1 promoottorin alue, joka voi selittää sen eri aktiivisuuden kaksi solua. Toinen mahdollisuus on, että ero Notch1 promoottorin aktiivisuus on liitetty transkription tekijöitä, jotka sitoutuvat tämän alueen ja valvoa sen toimintaa. Transkriptiotekijöiden kanssa suurin todennäköisyys sitoutua GC rikas verkkotunnuksia jollainen läsnä Notch1 promoottori proksimaalinen alue ovat sinkki-sormen proteiinit SP-ja KLF perheille [27]. Yksi tai useampi näistä tekijöistä voidaan ilmentää eri tavalla normaaleissa verrattuna syöpäsoluja. Itse asiassa reaaliaikainen RT-PCR HKCs vs. paneelin kohdunkaulan syöpä ja keratinosyyttien johdettujen SCC solut osoittivat, että useista Sp /KLF perheenjäsenet, jotka tutkittiin, Klf4 oli vahvasti ja johdonmukaisesti säädelty syöpäsoluissa (kuvio . 4B). SP1 SP3 olivat myös säädelty näissä soluissa, vaikkakin vähemmässä määrin kuin Klf4, kun taas ilmaus muiden perheenjäsenten, kuten KLF5 tai KLF10a häiriintyi vain hieman ja /tai alas-moduloitu (Fig. 4B). Lesser eroja havaittiin proteiinin tason, todennäköisesti seurauksena transkription jälkeisen ja /tai proteiini epävakautta tapahtumia (Fig. 4C).

(A) Nuclear poimii ensisijainen ihmisen keratinosyyttien (HKC) ja HeLa-solut immunosaostettiin vasta-aineita metyloitua DNA: ta, jota seuraa PCR-analyysi saostunut DNA spesifisten alukkeiden kanssa mainituilla alueilla on Notch1 promoottorin ja ensimmäinen introni alueella. PCR: llä alukkeilla, jotka ovat spesifisiä tunnettujen metyloitua geeniä käytettiin positiivisena kontrollina. (B) kokonaismäärä RNA-näytteet primäärisistä ihmisen keratinosyyttien (HKC) ja osoitettua syöpäsolulinjoissa analysoitiin reaaliaikaisella RT-PCR: llä alukkeilla, jotka ovat spesifisiä Sp1, Sp3, Klf4, KLF5 ja KLF10a. (C) Ensisijainen keratinosyytit, HeLa ja SCC13 solut analysoitiin immunoblottaus vasta-aineita SP1, Sp3 ja Klf4, ja β-aktiini kuin yhtä suuri kuormituksen valvonta.

arvioimiseksi toiminnalliset seuraukset lisääntynyt Klf4 ilmentymisen on Notch1 transkriptio, kaksi toisiaan täydentävää lähestymistapaa tehtiin. Ensimmäisessä, HKCs transfektoitiin ohimenevästi kanssa Notch1 reportteri; promoottorin aktiivisuus tukahdutettiin samanaikainen transfektio Klf4 ekspressiovektorilla (Kuva. 5A). Toisena lähestymistapa, HKC infektoitiin Klf4 ilmentävien retrovirus. Reaaliaikainen RT-PCR sekä immunoblot-analyysi osoitti, että endogeeninen Notch1 ilmentyminen väheni merkittävästi näissä soluissa seurauksena Klf4 yli-ilmentymisen (Fig. 5B, C).

(A) Ensisijainen keratinosyytit olivat co -transfected jossa reportteri, joka sisältää minimaalisen toiminnallisen Notch1 promoottorin (peräisin -392pGL4) yhdessä ekspressiovektorin ihmisen Klf4 tai tyhjän vektorin kontrolli. Renillaa minimaalinen toimittaja käytettiin sisäisen normalisoinnin ja promoottorin aktiivisuus mitattiin 48 tuntia transfektion jälkeen. Siinä on esitetty tulokset kahdesta eri kokeessa. (B) Ensisijainen keratinosyytit infektoitiin retrovirusvektorilla ekspressoi KlfF4 (pMSKlf4) tai tyhjän vektorin ohjaus ja kerättiin 48 tunnin kuluttua, minkä jälkeen määritys Klf4 ja Notch1 mRNA: n ilmentymisen by real-time PCR. Infektion tehokkuudesta kanssa pMSKlf4 virus arvioitiin myös laajalti morfologiset muutokset litistyminen soluja (ylempi paneeli). (C) Ensisijainen keratinosyytit infektoitiin KlfF4 ilmentävät retrovirus vs. tyhjän vektorin kontrolli kuin edellisessä paneelissa, jonka jälkeen immunoblot-analyysillä vasta-aineilla Notch1, Klf4 ja γ-tubuliinin tasavertaisina latauskontrollina. Oikea paneeli: tietoja kvantitoitiin densitometrinen skannaus Autoradiogrammin ja ilmaistaan ​​mielivaltaisina yksikköinä jälkeen normalisointi γ-tubuliinin ilme. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin toisessa erillisellä kokeella.

Käänteisesti testata Klf4 tukahduttaminen johtaa Notch1 ylössäätöä, HKC sekä HeLa-solut transfektoitiin siRNA varten Klf4. Tehokas alas-modulaatio tämän geenin ei vaikuttanut Notch1 geenin transkription, ja vastaavat puute vaikutukset havaittiin jälkeen knock-alas SP3 ja SP1 (Fig. 6A ja tietoja ei näytetty). Kuitenkin yhdistetty siRNA-välitteisen knockdovvn Klf4 ja SP3 aiheutti johdonmukaisesti säätely ylöspäin Notch1 ilmaisun sekä HKCs ja syöpäsolujen (HeLa ja SCC13 solut), samanaikaisen knock-down SP1, joilla ei ole muita vaikutuksia (Fig. 6B , C ja tietoja ei ole esitetty).

(A) Ensisijainen keratinosyytit transfektoitiin kaksi siRNA: iden ja Klf4, SP1 tai Sp3 rinnakkain salattu siRNA säätimet 48 tuntia, minkä jälkeen ilmaisu analyysin kohteena geenien reaaliaikaisella RT-PCR ja immunoblottauksella (vasen ja keskimmäinen paneeli, vastaavasti) samat RNA-näytteet analysoitiin myös tasoja Notch1 ilmaisun (oikea paneeli). (B) Ensisijainen keratinosyytit, transfektoitiin kuten edellisessä paneeli kaksi erilaista siRNA: iden osalta Klf4 ja SP3 (siRNA-1, siRNA-2) (vasen pylväät) tai siRNA: ita varten Klf4, SP1 ja SP3 (oikea pylväät), seuraa reaaliaikainen RT-PCR-analyysi Notch1 ilmaisua. Näkyy on laskettu keskimäärin neljä eri kokeiden avulla 36β4 ja 18S RNA sisäisen normalisoinnin. (C) HeLa ja SCC13 solut transfektoitiin kaksi erilaista siRNA: iden ja Klf4 ja Sp3 (siRNA-1, siRNA-2), jota seuraa määritys Notch1 ilmentymisen reaaliaikaisella RT-PCR: llä kuten edellisessä paneelissa. Ensisijainen keratinosyytit ja SCC13-solut transfektoitiin siRNA: t vastaan ​​osoitetaan geenien seurasi immunoblot-analyysi Notch1 proteiinin ilmentymisen kanssa γ-tubuliinin tasa-arvoisina loading ohjaus. Oikea paneeli: tietoja kvantitoitiin densitometrinen skannaus Autoradiogrammin ja ilmaistaan ​​mielivaltaisina yksikköinä jälkeen normalisointi γ-tubuliinin ilme.

Tarvittava yhteenlaskettu knockdovvn Klf4 ja SP3 säätely ylöspäin Notch1 ilmaisun voi johtua samanaikaisen sitoutumisen näiden tekijöiden on Notch1 promoottorin. Itse asiassa, kromatiinin immunosaostus (ChIP) määritykset osoittivat, vuonna HKCs ja HeLa-soluissa, että sekä Klf4 ja Sp3 sitoa GC: tä paljon proksimaalisen alueen Notch 1-promoottori (Fig. 7A-D). Mielenkiintoista on, että HKCs, Sp1 on myös havaittu sitoutuvan tämän alueen, mutta paljon vähäisemmässä määrin kuin proksimaalisen alueen p21WAF1 /CIP1 promoottorin, vakiintunut SP1 tavoite [28]. Ei Sp1 sitoutuminen Notch1 promoottorin todettiin HeLa-soluissa (kuvio. 7B). Samanlaisia ​​Chip määritykset suoritettiin myös vasta-aineita liity GC-sitova transkriptiotekijä, Maz [29]. Vaikka Maz1 havaittiin sitoutuvan p21-promoottorin samoin kuin Sp1, Sp3 ja Klf4, oli vain vähän tai ei lainkaan sitoutumista tämän proteiinin proksimaalisen alueen Notch1 promoottorin (Fig. 7B, C).

( A) Ennustettu Klf4- ja SP1 /SP3 sitoutumiskohdat -340 /-300 emäsparin Notch1 promoottorialueen. Näkyy on nukleotidisekvenssi tämän alueen kanssa, päälle, ennustettu sitoutumiskohtia Klf4- ja SP1 /SP3. (B ja C) Primary keratinosyyttejä (HKC) ja HeLa-solut prosessoitiin kromatiinin immunosaostuksella (ChIP) analyysi vasta-aineilla SP1, Sp3 (B), Klf4 (C) tai Maz, kuten on osoitettu, jonka jälkeen amplifikaation kaksi Notch1 promoottorialueiden välissä emäsparin -740 /-262 (Chip 1) ja noin -6600 emäsparin (Chip 2), jotka sisältävät sekä puutteen, vastaavasti, otaksuttu SP1 /SP3 ja Klf4 sitoutumiskohdista. Monistaminen proksimaalisen promoottorialueen p21

WAF1 /CIP1-geenin (Chip p21) käytettiin positiivisena kontrollina. Un-saostunut chromatin valmisteita käytettiin rinnakkain monistusreaktioihin kuten ”input” DNA valvontaa. (D) Chip määritykset anti-SP3 ja Klf4 vasta-aineita ja ei immuuni IgG: t kuin edellisessä paneelien seurasi reaaliaikaista PCR-monistuksella alue1 on Notch1 promoottori. Määrä saostunut DNA laskettiin suhteessa koko panos kromatiinin ja ilmaistaan ​​prosentteina mukaisesti seuraavan kaavan [54]: Prosentuaalinen yhteensä = 2ΔCt x 5, jossa ACt = Ct (input) – Ct (immunosaostus), ja Ct on syklin kynnys.

4. Vastapäätä valvonta Notch1 transkription p53 versus Klf4 /SP3

Tärkeä kysymys on, p53 ja Klf4 /SP3 ohjaus Notch1 geenin transkription erillisten tai yhtenevät mekanismeja. Keskeinen sääntely vaihe on transkriptiotekijä riippuva rekrytointi transkription valmiiksi initiaatiokompleksin, joka sisältää RNA-polymeraasi II (PolII), kohdistaa promoottorit [30]. Sen arvioimiseksi, onko tämä ensimmäinen vaihe Notch1 transkriptio on alle p53 ja Klf4 /SP3 ohjaus, kaksi toisiaan täydentävää lähestymistapaa tehtiin. HeLa-soluissa, joissa p53 on hyvin alhainen johtuen E6-riippuvainen hajoamista, arvioimme vaikutuksia lisääntynyt p53 adenoviruksen välittämä yli-ilmentyminen. Vuonna ohjaus HeLa-solut, siru määritykset osoittivat vähän tai ei lainkaan sitoutumista PolII promoottori ja 3’UTR Notch1 geenin, vaikka tällainen sitoutuminen oli helposti havaittavissa solujen lisääntynyt p53 ilme (Fig. 8A). Vuonna HKC, jossa tasot Klf4 ovat yleensä alhainen, arvioimme vaikutus lisääntynyt Klf4 ilmaisun kautta retrovirusinfektiota. ChIP analyysit osoittivat sitoutumisen PolII promoottoriin ja 3’UTR Notch1 geenin valvonta HKCs, kun taas mitään tällaisia ​​sitovia oli havaittavissa solujen lisääntynyt Klf4 ilmentymistä (Fig. 8B).

(A) HeLa solut infektoitiin rekombinantti-adenovirusta, joka ekspressoi villityypin p53 (Adp53) tai GFP-ohjaus (AdGFP) ja käsitellään ChIP testeissä, joissa vasta-aineiden RNA-polymeraasi II (α-PolII) ja ei-immuuni IgG-immunoglobuliineja kontrollina. PCR-monistus osoitti alueiden Notch1 geenin suoritettiin, rinnakkain samanlainen vahvistus tulon kromatiinin DNA. Oikea paneelit: kvantifiointi tuloksia, kromatiinin immunosaostettiin materiaali analysoitiin myös reaaliaikaista PCR-monistus osoitti alueiden Notch1 promoottorin, rinnakkain syöttö kromatiinin DNA, jota seuraa laskeminen mukaisen siteen samaa kaavaa hyödynnetään Kuva. 7D. (B) Ensisijainen keratinosyyttejä (HKC) infektoitiin retrovirusvektorilla yli-ilmentävät Klf4 (pMSKlf4) tai tyhjän vektorin ohjaus (Ctrl) 48 tuntia ja sen jälkeen ChIP määritykset PolII sitova kuin edellisessä paneelissa myös määrällisesti tulokset reaaliaikainen PCR (oikea paneeli).

Toiminnallisesti arvioida, lisääntynyt p53 ilmaisun ja Klf4 /SP3 alas-modulaatio voi synergize, kaksi toisiaan täydentävää lähestymistapaa tehtiin. Ensimmäisessä, HeLa-solut infektoitiin p53 ilmennä adenoviruksen plus /miinus knock-alas Klf4 ja SP3 ilme. Toisessa, HeLa-solut transfektoitiin siRNA: illa, jotka ovat spesifisiä UBE3A proteiinin, negatiivinen säätelijä p53 vakautta menetelmä endogeenisen p53: n ilmentymistä [14]. Lisääntynyt p53 tasot joko lähestymistapoja aiheutti odotettavissa induktion Notch1 ilmaisua. Yhdistetty knockdovvn Klf4 ja SP3 aiheutti myös kasvua Notch1 ilmaisun, mutta mitään lisäainetta tai synergistisiä vaikutuksia havaittiin samanaikainen lisääntynyt p53 ja knock-alas Klf4 ja SP3 (Fig. 9A ja B).

(A) HeLa-solut transfektoitiin siRNA: t ja Sp3 ja Klf4 rinnakkain salattu siRNA valvonnan sen jälkeen, 48 tuntia transfektion jälkeen, infektio p53 ilmennä adenoviruksen (Adp53) tai GFP-ohjaus (AdGFP), 24 tunnin ajan. Tasot Notch1 mRNA ilmaisun määritettiin reaaliaikaisella RT-PCR. Odotetut muutokset p53, SP3 ja Klf4 ilmaisu varmistettiin myös reaaliaikaisen RT-PCR, jossa tulokset esitetyn kaltaisia ​​edellisissä kuvissa. (B) HeLa-solut transfektoitiin siRNA: t for UBE3A, Klf4 ja SP3 yksin tai yhdistelminä kuten rinnalla salattu siRNA valvontaa. UBE3A ja Notch1 ilmentyminen arvioitiin reaaliaikaisen RT-PCR. (C ja D) Ensisijainen keratinosyyttejä (HKC) (C) ja HeLa ja SCC13 soluja (D infektoitiin Klf4 ilmentävät retroviruksen tai tyhjän vektorin ohjaus 48 tuntia, jonka jälkeen infektion Adp53 tai AdGFP virukset 24 tuntia. Notch1 mRNA tasot arvioitiin reaaliaikaisen RT-PCR.

Sen arvioimiseksi, onko Klf4 voi estää induktioilmiöiden p53, HKCs, HeLa ja SCC13 solut infektoitiin Klf4 ilmentävien retroviruksen tai tyhjän vektorin ohjaus, ja sen jälkeen infektio p53 ilmennä adenoviruksen tai GFP-ohjaus. lisääntynyt p53 tason aiheutti induktio Notch1 ilmentymisen kontrolli HKCs sekä HKCs jossa Notch1 geeni alas-moduloitu seurauksena lisääntynyt Klf4 ilmentymistä (Fig. 9C). merkittävämpiä induktio Notch1 ilmentyminen oli aiheuttanut Ad-p53-infektion syöpäsolujen, kuten HeLa ja SCC13 soluja, jotka jakavat mutatoitu tai hiljainen p53-reittiin ja alhaisen endogeenisen Notch1 tasolla [9], [11]. näissä soluissa, jotka ilmentävät korkea endogeenisen Klf4 edelleen ilmaus Klf4 ei laskenut Notch1 ilmaisua eikä häiritse sen induktion p53 (Fig. 9D).

Niinpä p53 ja Klf4 yhtenevät valvonnasta Notch1 geenin transkription alku- vaiheessa PolII rekrytointi, joissa p53 induktio esiintyvien erillisen mekanismin Klf4 /SP3 tukahduttaminen.

Keskustelu