Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

endoteeli ei ole homogeeninen elin. Endoteelisolujen heterogeenisyys on kuvattu tasolla solun morfologia, toiminto, geenin ilmentymisen, ja antigeenin koostumus. Seurauksena geneettisen, transcriptome ja ympäristön monimuotoisuus, endoteelisolut eri valtimoverisuoniverkostoihin on eriytetty toimintoja ja fenotyypin. Detection verenkierrossa endoteelisolujen (KIE) virtaussytometrialla on lähestymistapa on laajalti käytetty syöpäpotilailla, ja niiden määrä, elinkelpoisuus ja kineettinen on lupaava työkalu ositusta saavalle potilaalle antiangiogeenisiä hoitoa.

Menetelmät /Principal Havainnot

tällä hetkellä KIE tunnistetaan positiivisina ydin- sitova antigeeni (DNA +), negatiivinen pannulla valkosolujen merkki CD45, ja positiivinen CD31 ja CD146. Sen jälkeen lähestymistapa äskettäin validoitu laboratoriossamme, tutkimme ilmaus CD109 on KIE perifeerisestä verestä terveiden aihe ja syöpäpotilailla. Endoteelin luonne näiden solujen validoitu RT-PCR: n läsnäolo m-RNA: n taso CDH5 (Ve-kadheriini) ja CLDN5 (Claudin5), kaksi endoteelin spesifisten kopioiden. Ennen hoitoa, merkitsevästi korkeampi CD109 + KIE-maiden ja elinkelpoinen CD109 + KIE löytyivät rintasyöpäpotilaiden ja glioblastooma potilaita terveisiin kontrolleihin verrattuna, ja niiden määrä merkittävästi vähentynyt hoidon jälkeen. Korkeammalla endoteelisolujen spesifisten kopioiden ilmaistuna kehittää endoteelisoluissa CLEC14a, TMEM204, ARHGEF15, GPR116, havaittiin lajitellun CD109 + KIE verrattuna lajitellut CD146 + KIE, viittaa siihen, että nämä geenit voivat olla tärkeä rooli ei ainoastaan ​​alkionkehityksen aikana, vaan myös aikuinen angiogeneesiä. Mielenkiintoista, mRNA tasot TEM8 (tunnistettu Antrax Toxin receptor1, Antrax1) ekspressoitiin CD109 + KIE + muttei CD146 + KIE-maissa.

Johtopäätös

Yhteenvetona tulokset viittaavat siihen, että CD109 edustavat harvinainen väestöstä verenkierrossa kasvain endoteelisolujen, jotka toistavat mahdollisesti hyödyllinen ennustetekijöiden rooli potilailla, joilla glioblastooma. Rooli CD109 ilmentyminen syövässä aluskohtainen endoteelisolujen ansaitsee lisätutkimuksia geeniekspressiotutkimuksissa.

Citation: Mancuso P, Calleri A, Gregato G, Labanca V, Quarna J, Antoniotti P, et ai . (2014) alapopulaatio Kiertävä endoteelisoluissa Express CD109 ja rikastuu Veren syöpäpotilaita. PLoS ONE 9 (12): e114713. doi: 10,1371 /journal.pone.0114713

Editor: Lu-Gang Yu, University of Liverpool, Iso-Britannia

vastaanotettu: 05 toukokuu 2014; Hyväksytty 13 marraskuuta 2014; Julkaistu 15 joulukuuta 2014

Copyright: © 2014 Mancuso et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki olennaiset tiedot ja tukevat tiedot peräisin virtaussytometrialla tiedostoja ja molekyylibiologian tutkimuksessa ovat paperin.

Rahoittajat: Tuettu osittain AIRC (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro), Fondazione Umberto Veronesi, ja Ministero della Salute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Angiogeneesi on keskeinen rooli kasvaimen kasvussa ja etenemisessä [1] – [3] ja perustuu teoriaan, että kohdentaminen endoteelisolujen voi olla tehokkaampi strategia kuin kohdistaminen kasvainsoluja, viimeisen vuosikymmenen aikana monet anti -angiogenic lääkkeitä on otettu käyttöön kliinisessä ympäristössä [4] – [8].

sen arvioimiseksi kiertävä biomarkkerit angiogeneesin, joka voi ennustaa lopputulos antiangiogeenistä hoitomuotojen syöpäpotilailla, monet lähestymistapoja on testattava kummassakin prekliinisiä ja kliinisiä tutkimuksia [9] – [11], ja näiden joukossa kvantifiointia verenkierrossa endoteelisolujen (KIE) virtaussytometrialla on löytänyt laaja soveltaminen [12] – [14].

KIE ovat kypsiä endoteelisolujen vapautetaan aluksista aikana fysiologisia endoteelin liikevaihdon tai, syöpäpotilailla, mistä kasvaimen verisuoniston, joissa ne todennäköisesti heijastavat endoteelin vaurioita tai toimintahäiriö. Nämä solut lisääntyvät syöpäpotilailla verrattuna terveisiin henkilöihin, ja niiden muutoksia lukumäärä ja elinkelpoisuus on osoittanut ennustavan, prognoosi-, dynaaminen tai paeta biomarkkereiden arvo [15] – [18].

endoteeli ei ole homogeeninen elin. Endoteelisolujen heterogeenisyys on kuvattu tasolla solun morfologia, toiminto, geenien ilmentyminen, ja antigeenin koostumus [19]. Seurauksena geneettisen, transcriptome ja ympäristön monimuotoisuus, endoteelisolut eri valtimoverisuoniverkostoihin on eriytetty toimintoja ja fenotyypin [20] – [24], [35].

Tällä hetkellä endoteelisolujen markkereita käytetään tunnistamaan KIE ovat CD34, CD31 ja CD146 yhdistettynä CD45 jättää leukosyyttien ja tumavärjäystä merkki (kuten Syto16 Hoechst tai DRAQ5) poistamiseksi laskeminen sia ei-solu endoteelin mikrohiukkasia [14], [25] – [26].

CD109-geeni koodaa glykosyyli-phosphatidylinositolanchored glykoproteiini, joka on jäsen, alfa (2) -macroglobulin /C3, C4, C5 perheen tioesterin sisältävät proteiinit [27]. CD109 vaikuttaa suoraan tyypin I transformoiva kasvutekijä beeta (TGF-β) signalointi-reseptorin ja negatiivisesti moduloi TGF-β signalointi [28]. Se ilmentyy alapopulaatio CD34 + soluihin [29], on aktivoituneiden verihiutaleiden ja aktivoitujen T-solujen [30] ja alapopulaatio endoteelisolujen [31]. Mielenkiintoista on, että on raportoitu, että CD109 on yksi 12 endoteelimerkkiaineita yli-ilmentynyt kasvaimen endoteelisoluissa [23], [24]. Jotta saataisiin kattavampi käsitys CEC fenotyypin, tutkimme ilmaus CD109 viljellyillä endoteelisoluilla ja KIE perifeerisestä verestä terveiden aihe ja syöpäpotilailla. Käytimme virtaussytometria lähestymistapa validoitu laboratoriossamme, ja endoteelin luonne näiden solujen validoitu RT-PCR ja geenin ilmentymisen.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki potilaat antoivat tietoon suostumus ennen sisällyttämistä terapeuttinen protokolla ja tutkimuksen tarkoitukseen. Kaikki kliiniseen tutkimukseen tehtiin periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistuksen.

rintasyöpäpotilaiden: Tutkimuksessa oli Eurooppa syöpäinstituutti, Milano, Italia ja hyväksymä ”IRCCS – Istituto Europeo di Oncologia e Centro Cardiologico Monzino ”Eettinen komitea rekisteröityä instituutin tietokannasta (# 2007-006025-27).

glioblastoma potilaat: tutkimuksessa oli vuoden neurologinen instituutti” Carlo Besta ”Milan, Italia ja hyväksymä ”Lombardian alueella Sezione Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Besta” Eettinen komitea rekisteröityä instituutin tietokannasta (# 1/08).

havaitseminen CD109 endoteelin pesäkkeet

vahvista virtaussytometrialla ilmentymistä CD109 endoteelisoluissa in vitro endoteeli- pesäkettä saatiin perifeerisestä verestä (PB) 10 terveiltä luovuttajilta (7 naaras, 3 miestä) ja 23 syöpäpotilaiden kuten aikaisemmin on kuvattu [32].

Lyhyesti, mononukleaariset solut (MNC) eristettiin PB käyttämällä Ficoll-Paque-gradienttisentrifugoinnilla, resuspendoitiin EGM2 väliaineessa (Lonza, Walkersville, MD) ja ympättiin Kollageeni I petrimaljoihin (35 mm, BIOCOAT, BD Labware, Bedford, MA) . Viljelmiä inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO 2, 95%: n suhteellisessa kosteudessa 3-4 viikkoa. Medium vaihdettiin joka 2 päivä 7 päivän ajan ja sitten kahdesti viikossa, kunnes ensimmäinen kanava, ja kulttuurin seurataan havaitsemiseksi endoteelin pesäkkeiden perusteella morfologiset ominaisuudet, kuten aiemmin on kuvattu [32]. Jälkeen 15-20 päivää, solut irrotettiin trypsiini /EDTA: a (Gibco, BRL, UK) ja värjättiin monoklonaalisilla vasta-aineilla (MoAbs) anti- CD31-PeCy7, CD34-APC, CD45-H7, ja 7-AAD (kaikki Beckman Coulter) CD146-Pe (Chemicon), VEGFR-2- PE (R 0,05.

Tulokset

endoteelisolujen pesäkkeiden fenotyypin

Perifeerisen veren MNC (30 x 10

6 solua pinnoitettu) tuotetaan endoteelin pesäkettä 9 10 terveillä koehenkilöillä ja 14 23 potilasta. Kaikki endoteelin pesäkkeet olivat positiivisia CD31, CD146, CD34 ja VEGFR-2 ja negatiivinen CD45.

endoteelisolujen pesäkkeitä kaikista terveillä koehenkilöillä ja 10 syöpäpotilaiden arvioitiin myös CD109 ilme. CD109 ilmentyi 1/9 endoteelin kulttuureissa terveillä henkilöillä (11%) ja 5/10 (50%) endoteelin viljelmät joukossa syöpäpotilaista.

RT-PCR lajitellun CD109 + KIE-maiden ja CD146 + KIE

Taita muutoksia alas- tai ylöspäin säädelty geenit ilmentyvät vertaamalla cDNA CD109 + KIE että CD146 + KIE referenssinä solut (Fig. 2).

Taita muutoksia alas- tai ylöspäin geenien ovat ilmaisi verrataan cDNA CD109 + ja CD146 + soluihin referenssinä soluja. Varmistaakseen biologinen toistettavuutta, verta cDNA keräys saatiin 8 eri luovuttajilta.

Molemmissa CD109 + KIE-maiden ja CD146 + KIE varmistimme ilmentymistä mRNA tason CDH5 (Ve-kadheriini) ja CLDN5 (Claudin V), kaksi endoteelispesifiset selostukset, mikä viittaa siihen, että molemmat solut liittyvät ja endoteelisolujen luonnon [23] – [24]. Samat tulokset saatiin mRNA-tasoja vWF, VCAM1 ja CD34.

Korkeammalla endoteelisolujen spesifisten kopioiden ilmaistuna kehittää endoteelisoluissa [33] CLEC14a, TMEM204, ARHGEF15, GPR116, havaittiin lajitellun CD109 + KIE kun verrattuna lajiteltu CD146 + KIE.

Mielenkiintoista, mRNA tasot TEM8 (tunnistettu Antrax Toxin receptor1, Antrax1) on ilmaista vain CD109 + KIE + muttei CD146 + KIE-maissa.

CD109 + ja CD146 + CEC fenotyypin

Kuten kuviossa. 3, joukossa Syto16 + 7-AAD-CD31 + CD45- soluja, havaitsimme kaksi erilaista väestöstä KIE-maissa on yksi positiivinen CD109 + mutta negatiivisia CD146, ja yksi positiivinen CD146 mutta negatiivisia CD109. Molemmat CD146 + KIE-maiden ja CD109 + KIE olivat negatiivisia CD90 ja CD117, vahvistaa nämä solut ovat todennäköisesti erilaistuneita soluja eikä esiasteita. CD34 oli positiivinen 30%: n CD146 + KIE-maiden ja 20%: CD109 + KIE-maissa ja CD13 oli positiivinen 50% ja 60% CD146 + KIE-maiden ja CD109 + KIE vastaavasti, vahvistetaan nämä solut aktivoituvat soluja angiogeenisten verisuonien [44].

kun syrjäytymisen roskia (A) ja valinta CD45- (B), nukleoida (Syto16 +) ja CD31 + -soluja (C), CEC tunnistettiin positiivinen CD109 tai CD146 (E). (D): negatiivinen kontrolli. CD109 + KIE ja CD146 + KIE arvioitiin virtaussytometrialla ilmentymisen CD34, CD117, CD90 ja CD13.

Molemmat CD146 + KIE ja CD109 + KIE oli positiivinen Ulex europeaus lektiini (Fig. 4 A-B1). Sulkea epiteelisolujen saastuminen, me stained nukleoida (Syto16 +) CD45- soluja EpCAM, ja vaikka alapopulaatio EpCAM + -solujen on läsnä, nämä solut ovat negatiivisia CD31 ilmentymisen (Fig. 4 C-C1).

EpCAM värjäytymistä (4C-C1) vahvisti, että epiteelisolujen vaikka läsnä DNA + CD45- soluosastoon, ovat negatiivisia ekspression CD31 läsnä vain endoteelisoluissa.

tutkimiseksi CD109 + KIE toiminto, suoritimme Ac-LDL up-kestää. Koska Ac-LDL tarttunut makrofagit /monosyytit, käytimme näitä soluja ”sisäinen positiivinen kontrolli” Vahvista endosytoosin toimintaa. Kuten raportoitu kuvassa. 5, joukosta Ac-LDL + solujen sekä CD45 + CD31 + CD14 + (monosyytit) ja CD45-CD31 + CD109 + (endoteelisolut) havaittiin.

Kun dublets (A) ja roskat (B) ulkopuolelle, Ac-LDL + soluja havaittiin (C). Näistä solut, CD45 + CD31 + ja CD45-CD31 + soluja havaittiin (D). CD45 + CD31 + olivat positiivisia myös CD14 (monosyytit, E) ja CD45-CD31 + olivat positiivisia myös CD109 + (endoteelisolujen, F). Ac-LDL + solut nukleoida (Syto16 +, F). C1, D1, E1 ja F1 ovat negatiivisia kontrolleja.

Detection of CD109 + KIE Terveillä henkilöillä ja syöpäpotilaiden

Potilaat ominaisuudet on esitetty taulukossa 1.

kohonnut merkittävästi CD109 + KIE, CD146 + KIE, elinkelpoinen CD109 + KIE-maiden ja elinkelpoinen CD146 + KIE (P = 0,0001) todettiin lähtötilanteessa rintasyöpäpotilaiden ja glioblastooma potilaita terveisiin kontrolleihin verrattuna (taulukko 2). CD109 + KIE oli 26 ± 20 /ml terveillä henkilöillä (n = 50), 62 ± 43 /ml metastasoituneen rintasyövän potilaiden (n = 66, p 0,0001) ja 101 ± 84 /ml glioblastooma potilailla (n = 134 , p 0,0001) ennen hoitoa. Osa apoptoottisten /nekroottisen CD109 + KIE oli 71 ± 18% terveillä aihe, 51 ± 18% syöpäpotilaista ja 60 ± 21 glioblastoma potilasta.

Hoidon jälkeen CD109 + KIE ja elinkelpoinen CD109 + KIE olivat 52 ± 42 /ml ja 15 ± 20 /ml vastaavasti rintasyöpäpotilailla, ja 64 ± 60 /ml ja 35 ± 30 /ml glioblastooma potilailla (taulukko 3).

CD146 + KIE olivat 43 ± 23 /ml terveillä henkilöillä (n = 50), 103 ± 83 ug /ml syöpäpotilaista (n = 64, p 0,0001) ja 117 ± 87 glioblastoma potilailla (n = 134, p 0,0001).

osa apoptoottisten /nekroottisen CD146 + KIE oli 67 ± 20% terveillä aihe, 62 ± 20% syöpäpotilaista ja 66 ± 18 /ml glioblastoma potilasta ennen hoitoa.

hoidon jälkeen CD146 + KIE-maiden ja elinkelpoinen CD146 + KIE olivat 96 ± 121 /ml ja 41 ± 88 /ml vastaavasti rintasyöpäpotilailla, ja 78 ± 84 /ml ja 23 ± 31 /ml glioblastooma potilailla (taulukko 3) .

keskustelu

endoteelisolujen heterogeenisuus on kuvattu tasolla solun morfologia, toiminto, geenien ilmentyminen, ja antigeenin koostumus. Koska verisuonten jaetaan koko kehon, endoteelisolujen altistetaan valtavasti erilaisia ​​kudoksen mikroympäristöihin, ja monenlaisia ​​signaalitulo on riittävä tuottamaan fenotyyppisen heterogeenisuus Verisuonipuun [19], [21], [35] .

Detection verenkierrossa endoteelisolujen virtaussytometrialla on lähestymistapa on laajalti käytetty syöpäpotilailla, ja tunnistaminen numeron, elinkelpoisuutta ja kineettinen endoteelisolujen on lupaava työkalu ositusta saavalle potilaalle antiangiogeenistä hoito [ ,,,0],15] – [18].

tällä hetkellä KIE luetellaan jonka moniparametrisissä virtaussytometrialla lähestymistapaa, jossa yhdistyvät CD146, CD31, CD45, ydinvoiman sitova antigeeni (Syto16, Dapi tai HOECST) yhdessä elinkelpoisuuden solujen värjäytymistä ( kuten 7-AAD tai anneksiini V).

CD109 on glykosyylifosfatidyyli-ankkuroidun pintaglykoproteiinille ja on yksi 12 endoteelimerkkiaineita yli-ilmentynyt kasvaimen endoteelisoluissa [23], [24].

tässä työssä seuraavaa lähestymistapaa äskettäin validoitu laboratoriossamme [14], me lajitellaan CD109 + KIE-maiden ja CD146 + KIE-maiden ja me varmistettiin RT-PCR, sekä väestön ilmentymisen mRNA tason CDH5 (Ve-kadheriinin) ja CLDN5 (Claudin5) kaksi geeniä ilmentyy selektiivisesti endoteelisoluihin. Korkeammalla CLEC14a, TMEM204, ARHGEF15, Gpr116 ilmaistuna kehittää endoteelisoluissa [33], oli läsnä CD109 + KIE verrattuna CD146 + KIE, viittaa siihen, että nämä geenit voivat olla tärkeä rooli paitsi kehittämään endoteelisoluissa, mutta myös aikuinen angiogeneesiä.

osoitettu, että CD109 + KIE ja CD146 + KIE ovat kaksi eri alaryhmästä endoteelisolujen, että nämä kaksi antigeenejä ei ilmaistaan ​​samojen solujen, kun taas CD34 (merkki tunnistamiseen nykyisin käytettävät esisolujen) oli positiivinen 20%: CD109 + KIE-maiden ja 30%: n CD146 + KIE.

Arvioimme määrä, elinkelpoisuus ja kineettinen of CD109 + KIE-maiden ja CD146 + KIE-maiden ja todenneet, että kyseiset alaryhmästä endoteelisolujen rikastetaan veressä glioblastooma ja syöpäpotilaista, ovat kannattavampia verrattuna arvoon terveillä aihe, ja niiden määrä vähenee merkittävästi hoidon jälkeen.

meidän aikaisempaa kokemusta, me raportoitu, että potilailla, joilla on rintasyöpä jossa metronomisella kemoterapiaa, CD146 + CEC tasolla kahden kuukauden hoidon liittyivät pitkäaikaiseen PFS [15]. Toisessa kliinisessä tutkimuksessa, syöpäpotilaista hoidettu metronomisella kemoterapiaa ja bevasitsumabi, lähtötilanteen CEC tasoja liittyy myös PFS [36], [37] vahvistetaan, että määrällisesti CD146 + KIE on hyödyllistä tunnistaa potilaat, jotka hyötyisivät antiangiogeenisesti hoidoista [ ,,,0],38].

sarjassa sairastavien potilaiden glioblastoma hoidettiin AZD2171, pan-VEGF-reseptori tyrosiinikinaasiestäjä, Batchelor havaittu, että elinkelpoinen CEC tasot olivat korkeampia potilailla, joilla sairaus eteni aikana AZD2171 hoidon verrattuna potilaisiin ilman eteneminen päivänä 112 [39].

Olemme hiljattain raportoitu [40], että glioblastoma hoidetuilla potilailla bevasitsumabin ja irinotekaanin tai bevasitsumabia yksinään, PFS ja OS lisääntyivät merkitsevästi potilailla, joilla lähtötilanteessa syytettä CD109 + KIE korkeampi kuin 41,1 /ml, (1stquartile), kun taas mitään ennustetekijä liittyi sen CD146 + KIE.

Nämä tiedot viittaavat siihen, että CEC heterogeenisyys voi heijastaa verisuoni kasvain monimutkaisuutta ja että CD109 + KIE saattaa olla potentiaalisesti käyttökelpoinen prognostinen merkkiaine glioblastoma potilaita.

on raportoitu, että CD109 on yli-ilmaistaan ​​kasvaimen verisuonistossa [24], ja tässä tutkimuksessa havaitsimme, että kaikki endoteelin pesäkettä terveillä koehenkilöillä ja 10 syöpäpotilaiden olivat positiivisia CD31, CD146, CD34 ja VEGFR-2 ja negatiivinen CD45 kun CD109 oli positiivinen 1/9 endoteelin kulttuureissa terveillä henkilöillä (11%) ja 5/10 (50%) endoteelin viljelmät joukossa syöpäpotilaista.

Lisäksi m -RNA taso TEM8, joka on pintaglykoproteiinille tunnistettu Anthrax Toxin Receptor 1, olivat havaittavissa CD109 + KIE-maissa, mutta ei CD146 + KIE-maissa. On raportoitu, että TEM8, on säädelty kasvaimen aluksiin [41], [42]. Vuonna TEM8 Knockout-hiirissä fysiologisen angiogeneesin ja haavan paranemista esiintyy normaalisti, mutta kasvain kantavissa hiirissä, kasvaimen kasvu on heikentynyt, mikä osoittaa, että TEM8 voidaan tarvita edistää kasvaimen angiogeneesiä, mutta ei normaalin kehityksen [43].

Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että CD109 voisi olla harvinainen populaatio verenkierrossa kasvain endoteelisolujen, jotka toistavat mahdollisesti hyödyllinen ennustetekijöiden rooli potilailla, joilla glioblastooma. Rooli CD109 ilmentyminen syövässä aluskohtainen endoteelisolujen ansaitsee lisätutkimuksia geeniekspressiotutkimuksissa.

Johtopäätökset

On kasvava tarve tunnistaa verenkierrossa biologinen markkeri ositusta potilaille, jotka voivat hyöty anti-angiogeenisen hoidon. Tässä työssä me raportoimme että CD109 on potentiaalinen hyödyllinen prognostinen markkeri glioblastoma potilasta, ja että sen rooli syövän angiogeneesi on tutkittava eri kasvain ympäristössä.

Kiitokset

Tuettuja osittain AIRC, (Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro), Fondazione Umberto Veronesi, ja Ministero della Salute.