Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kantasolu (CSC) teoria ennustaa, että pieni osa syöpäsolujen on ainutlaatuisia itseuudistumisen aktiivisuutta ja välittävät kasvain ja levittämisen. Kuitenkin molekyylitason mekanismeja CSC asetuksessa jää epäselväksi, osuvan tehokkaan kohdentamisen CSCS syövän hoidossa. Tässä olemme tutkineet hypoteesia, jonka mukaan Rac1, Rho GTPaasina osallisena syöpäsolujen lisääntymistä ja invaasio, on kriittinen kasvaimen aloittamisen ja etäpesäke ihmisen ei-pienisoluisen keuhkosyövän adenokarsinooma (NSCLA). Rac1 Knockdown jonka shRNA tukahdutti kasvaimia toimintaa ihmisen NSCLA solulinjojen ja ensisijainen potilaan NSCLA yksilöitä, mukaan lukien vaikutukset invaasio, proliferaatio, ankkurointi riippumattoman kasvun, pallo muodostumista ja keuhkojen kolonisaatio. Yksittäisiä puolella väestöstä (SP) solut edustavat otaksuttu CSCS ihmisen NSCLA solut sisälsivät kohonneita Rac1-GTP, tehostettu

in vitro

muuttoliike, invaasio, lisääntynyt

in vivo

kasvaimen aloittamista ja keuhkojen asuttamistoiminnan in ksenosiirrettyjä hiirillä. Kuitenkin CSC aktiivisuus Havaittiin myös ei-SP väestöstä, mikä viittaa siihen, että on tärkeää terapeuttisen kohdentamista kaikkien solujen kasvain. Edelleen, farmakologinen tai shRNA kohdentaminen Rac1 esti kasvaimia toimintaa sekä SP ja ei-SP NSCLA soluissa. Nämä tutkimukset osoittavat, että Rac1 on hyödyllinen tavoite NSCLA, ja sen estäminen voi olla terapeuttista arvoa tukahduttamaan CSC leviämisen ja etäpesäkkeiden.

Citation: Akunuru S, Palumbo J, Zhai QJ, Zheng Y (2011) Rac1 kohdistaminen estää ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Adenokarsinooma Cancer Stem Cell Activity. PLoS ONE 6 (2): e16951. doi: 10,1371 /journal.pone.0016951

Editor: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasilia

vastaanotettu: 13 elokuu 2010; Hyväksytty: 18 tammikuu 2011; Julkaistu: 09 helmikuu 2011

Copyright: © 2011 Akunuru et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain NIH R01 CA141341 ja T32 HL091805. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä edelleen johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti. Tauti on yleisesti luokitellaan kahteen histo-patologinen ryhmät – pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC) ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), jossa myöhemmin edustava ryhmä -80% keuhkosyöpää tapauksista. Adenokarsinoomia esiintyy noin 55%: n NSCLC ja 40% kaikista keuhkosyövässä. Huolimatta jatkuvasta kehittämisestä syöpähoitojen, tällä hetkellä yleistä viisi vuotta selviytymisen kurssi keuhkosyöpäpotilaita on alle 15% [1]. Usein olemassa oleviin kemoterapian, sädehoidon tai kirurgian voi vain osittain poistaa kasvaintaakka, jättäen jälkeensä hoito resistenttejä syöpäsoluja, jotka voivat uusiutumaan kasvaimeen ensisijaisen paikan päällä ja /tai etäpesäkkeitä toissijaiseen sivustoilta aloittaa uuden kasvaimia.

Viimeaikaiset julkaisut ovat raportoineet tunnistamiseen syöpä aloittamista tai syövän kantasolut (CSCS) verestä [2], aivot [3], rintojen [4], paksusuolen [5], [6], maksan [7], haiman [8] , kumartaen [9], [10], sekä keuhkosyövässä [11], [12], [13]. CSCS tunnistetaan joko ainutlaatuisia solujen ominaisuudet, kuten Hoechst eksluusio (Hoechst dye-matalilta väestö) tai spesifisten pinta markkereita, kuten CD133, ALDH tai CD24 /CD44, ja ne liittyvät usein kemoterapiaa ja sädehoitoa vastus. CSCS määritellään niiden kantasolun kuten itseuudistumisen ominaisuudet, niiden kyky erilaistua solutyypit, jotka muodostavat suurimman osan kasvaimen, ja aloittaa kasvaimia huomattavasti pienemmällä annoksella hiiren ksenograftin tutkimuksissa [7], [14]. NSCLC aloittamista soluja on eristetty ihmisen keuhkosyövän solulinjoja joka perustuu lisääntyneeseen Hoechst 33342 väriaine effluksiaktiivisuus [12]. Hoechst-väriaine matalilta väestöstä (SP) solut rikastetaan kasvaimen aloittamaan toiminnan verrattuna ei-puolelle väestöstä (NSP) soluja ja ilmentävät kohonnut ABCG2 ja muut monilääkeaineresistenssi kuljettajat, jotka voivat välittää terapeuttista vastarintaa.

etenemisen syövän kantasolujen teoria on johtanut ehdotukseen, että kohdentaminen CSC: n voi johtaa hävittämiseksi jäljellä hoidon resistenttien kasvainsolujen potilailla. Äskettäin Gupta

et al

ehdotti, että erilaistumisen indusoimiseksi CSC käyttämällä salinomysiinin, selektiivinen kaliumin ionofori voi estää maitorauhasen CSC aktiivisuus ja etäpesäkkeiden [15]. Kuitenkin useat viimeaikaiset raportit ovat osoittaneet, että CSCS ja ei-CSCS voi olla muovia ja keskenään muutettavia luonteeltaan [16] – [17]. Esimerkiksi JARID1 negatiivisia soluja osoitettiin edustaa ohimenevä hidas pyöräily kuin CSC väestö voi aiheuttaa nopea pyöräily JARID1 positiivinen CSCS melanooman (13). On olemassa näyttöä siitä, että ei-CSCS voidaan muuntaa CSCS vuorovaikutuksessa soluväliaineen ja muiden ympäristön ärsykkeille (14). Tämä nostaa esiin sen mahdollisuuden, että lähestyy ainoastaan ​​kohdistaminen CSCS eivät riitä syövän hoidossa, koska jäljelle jäävä CSCS voidaan ohjelmoida CSCS aloittaa uudelleen kasvaimien syntyyn.

Rac1 on solunsisäinen molekyyli kytkin, joka transdusoi signaaleja eri onkogeenisia reittejä. Se on usein havaittu olevan koholla ilmaisun ja /tai aktiivisuutta erilaisissa kasvainsolujen ja säätelevät tärkeitä solun prosesseja, jotka liittyvät syöpäsolujen käyttäytymistä, mukaan lukien geenien ilmentyminen, solujen lisääntymistä, aktiinisytoskeletonin remodeling ja on välttämätön solujen vaeltamista ja tarttuvuus. Rac1 aktiivisuus voi vaikuttaa solusyklin etenemistä ja eloonjäämistä, ja sen osoitettiin tarvitaan K-ras välittämä keuhko kasvaimen kasvua hiiren spontaanin keuhkosyöpä malli [18]. Kuitenkin, onko Rac1 edistää ihmisen NSCLA kasvaimen kasvun ja /tai etäpesäkkeitä, erityisesti jos Rac1 on tärkeä rooli säätelyssä CSCS, vaatii lisätutkimuksia. Nykyisessä työssä osoitamme, että Rac1 on kriittisesti mukana NSCLA solumigraatioon, invaasion ja keuhkojen etäpesäkkeiden SP soluja, siis se on hyödyllinen terapeuttinen tavoite estämällä kasvaimen aloittaminen ja etäpesäke CSC väestöstä NSCLA.

materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

A549, H23, H1299 ja H441 soluja viljeltiin ohjeiden mukaan ATCC. Ihmisen keuhkoputken epiteelisolut (HBEC) oli antelias lahja tri Jeffery Whitsett (Cincinnati Lasten Hospital Medical Center). Ensisijainen potilaan keuhkojen adenokarsinooman näytteitä saatiin kirjallinen suostumus potilailta hyväksytyn laitoksen arviointilautakunnan protokolla yliopiston Cincinnati Scientific Review komitean (IRB # 01-09-27-07), ja niitä käytettiin kokeissa mukaan Cincinnati Lasten Hospital Medical keskusta Scientific Review komitean (IRB # 06-07-57) että identiteetti potilaista pysyy salassa. Kasvaimet hienonnettiin ja suspendoitiin uudelleen DMEM, joka sisälsi 0,5 mg /ml Liberase (Roche) ja 1% penisilliiniä ja streptomysiiniä. Sen jälkeen kun 45 minuutin inkuboinnin, liete, solujen läpi 100 mikronin suodattimen ja koko solut pestiin, maljattiin 10% naudan sikiön seerumia, joka sisältää kasvualustaa. Epiteelisyöpäsolujen rikastettiin kasvattamalla soluja alalla viljelyolosuhteissa.

A549, H23, H1299, H441, HBEC tai ensisijainen adenokarsinooman solut infektoitiin lentiviruksen ilmentävien YFP tagged salattu shRNA (SCR) tai Rac1 shRNA1 tai Rac1 shRNA2 aiemmin on kuvattu [19]. Salatut shRNA konstruktio oli antelias lahja tri Lee Grimes (Cincinnati Lasten Hospital Medical Center) ja Rac1 shRNA konstruktit olivat antelias lahja tri Jim Mulloy (Cincinnati Lasten Hospital Medical Center). 72 tunnin kuluttua infektion, YFP positiiviset solut lajitellaan käyttäen FACS ja käytetään eri kokeissa.

Rac1 mutantti pelastus kokeissa, neljä epäsuhta pistemutaatiot tehtiin shRNA sitoutumiskohtien Rac1 cDNA: n MIEG3 vektoriin käyttäen mutageneesillä (Stratagene, Agilent Technologies) per valmistajan ohjeita. A549-soluja infektoitiin Rac1 mutantti ekspressoi retrovirus ja 72 tunnin jälkeen, GFP-positiiviset solut lajitellaan käyttäen FACS: llä. Solut infektoidaan seuraavaksi lentiviruksen ilmentävät scr shRNA tai Rac1 shRNA. 72 tunnin jälkeen, GFP

+ YFP

+ soluja käytetään suorittamaan useita toiminnallisia määrityksiä.

soluproliferaatiomääritykset

Solut (2000 solua /kuoppa) 96-kuoppaisille levy kolmena rinnakkaisena. Elävien solujen lukumäärä joka päivä määritettiin ei-radioaktiivisella MTS proliferaatiomäärityksellä (Promega).

BrdU, BrdU (10 ug /ml) lisättiin soluihin 60%: n konfluenssiin 2 tuntia 37 ° C: ssa. Solut kerättiin, kiinteä, värjätään ja FACS-analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [20]. Havaitsemaan BrdU-positiivisten solujen CD133

+ ja CD133

– populaatiot, solut värjättiin CD133 /2-APC-aine (Miltenyi Biotechnologies Inc.) jälkeen BrdU värjäyksen. BrdU-positiiviset solut porteilla sekä CD133

+ ja CD133

– soluja.

Soft agar pesäkemuodostusta

Solut ympättiin (10000 solua /kuoppa) 0,3% matalan sulamispisteen agaroosia tehdään elatusaineeseen, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia ja kerrostettiin 0,6% agaroosia elatusaineeseen. Muodostuneiden pesäkkeiden määrästä jälkeen joko 2 viikon ajan (A549, H1299) tai 3 viikon ajan (H441, H23) laskettiin alla valomikroskoopilla.

Sphere muodostumisen määritys

Solut (10000 solua /ml) olivat maljattiin suspensioviljelmäolosuhteissa seerumittomassa alalla media (DMEM: F12, joka sisälsi 0,4% BSA: ta, 10 ug /ml insuliinia, 10 ng /ml EGF: ää, 10 ng /ml FGF) 6-kuoppaisille levyille, jotka oli esipäällystetty 1%: isessa estää solujen kiinnittymistä. Väliaine vaihdettiin joka 2-3 päivä, ja pallojen lukumäärä on muodostettu 2 viikkoa laskettiin valomikroskoopin alla.

Adhesion määrityksessä

Levyt päällystettiin 50 ug /ml fibronektiiniä yön yli 4 ° C: ssa ja blokattiin 2% BSA 2 tuntia 37 ° C: ssa. Blokkauksen jälkeen Solut maljattiin (10000 solua /kuoppa) ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 60 minuutin ajan. Tarttumattomat solut imettiin pois ja levyt pestiin kolme kertaa PBS: llä. Numbers kiinnittyneiden solujen kuoppiin jälkeen pesujen määritettiin käyttäen ei-radioaktiivista leviämisen MTS-määritys.

Muuttoliike ja invaasio määritykset

trans-no migraatiokokeessa, 50000 solua lisättiin ylempään kammioon seerumittomassa median ja muuttoliike 37 ° C kohti 10% FBS sisältävien kasvualustojen määritettiin joko 24 tunnin kuluttua (A549, H1299, H23) tai 48 tuntia (H441). Solut muuttivat kalvon läpi kiinnitettiin, värjättiin Giemsa tahra (Sigma) ja laskettiin valomikroskoopilla.

invaasiomääritys, alempi kammioihin Matrigel päällystettyjä invaasion levyjä päällystettiin 10 ug /ml fibronektiinin yön yli 4 ° C ja solut tunkeutuvat läpi matrigeeliä kiinnitettiin ja värjättiin joko 48 tunnin kuluttua (A549-solut) tai 72 tuntia (H441-solut) samanlainen migraatiokokeessa.

Immuno-värjäys

solut maljattiin fibronektiiniä päällystetty dioja ja sen jälkeen 18-20 tunnin solut kiinnitettiin käyttämällä 3,7% Formaldehydi. Solut värjättiin aktiinisytoskeletonin (Rhodamine–falloidiinia Invitrogen), ytimet (DAPI, Invitrogen) käyttäen standardi immunovärjäyksessä aikaisemmin kuvattuja menetelmiä [21]. Vaihtoehtoisesti solut värjättiin joko fosfo-FAK (Focal Adhesion Kinase, Millipore) tai vinkuliini (Sigma) tai fosfo-paksilliini (Cell signalointi Technologies).

Side-väestö, CD133 solujen värjäytymisen ja eristäminen

Solut trypsiinillä ja ne pestään PBS: llä. Solut värjättiin Hoechst 33342 värjäyspuskuria kuten aiemmin on kuvattu, jonka lopullinen konsentraatio on 5 ug /ml Hoechst 33342 [22] puolelle väestöstä (SP), tai anti-CD133-vasta-aineen CD133-positiiviset solut. Solut analysoitiin tai lajitellaan SP /CD133

+ solujen virtaussytometrialla.

Voit hankkia Rac1 Knockdown SP- tai CD133

+ soluja, solut infektoitiin lentiviruksen ilmentävien YFP tagged scr tai Rac1 shRNA ja 72 tunnin jälkeen solut värjättiin puolella väestöstä tai CD133. YFP positiivinen SP tai ei-SP solut lajitellaan joko Western analyysiä tai funktionaalisia määrityksiä.

Rac1-GTP avattavasta määritys

Jos haluat suorittaa Rac1 kaatamaan määrityksiä, solut hajotettiin lisäämällä hajoamiseen puskuria, joka sisälsi 20 mM Tris-HCI, pH 7,6, 100 mM NaCl, 10 mM MgCI, 1% Triton X-100, 0,2% SDS: ää, proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorit suoraan kiinnittyneitä soluja. Solulysaatit, jotka sisältävät yhtä suuret määrät proteiinia, inkuboitiin glutationihelmiin konjugoitu GST-PAK1, jotka sisältävät aktiivisia Rac1 vuorovaikutuksessa toimialueen ja käsitellään edelleen kuten on aiemmin kuvattu [23].

Lung kolonisaatiota määrityksessä

käyttö hiirillä ksenograftikasvaimina isännät hyväksyi IACUC komitea Cincinnati Lasten Hospital Medical Center (Protocol # 8D06052). Tietty määrä solut suspendoitiin PBS: ään ja on annettu suonensisäisesti immuunikatopotilaiden NOD /SCID /yc – /- (NSG) hiiret häntälaskimoinjektiona. Lopussa Tutkimuksen keuhkot fiksattiin Bouinin ratkaisu laskea useita kasvaimia.

ihonalainen ksenografti määritys

tietty määrä solut suspendoidaan 200 ui PBS: matrigeelin mix (1 :1 tilavuus) ja ihon alle kylkiin immuunikatopotilaiden NOD /SCID /γ – /- (NSG) hiirillä. 3-4 viikon kuluttua injektio kasvaimen koko mitattiin viikoittain käyttäen jarrusatulat ja kasvaimen tilavuus määritettiin kaavalla 0.52XLXW

2 cm3.

Kasvainsolulinja homing määrityksessä

ilmentävät solut YFP injektoitiin suonensisäisesti NSG hiiriin. 24 tunnin kuluttua, keuhkot eristettiin perfuusion jälkeen PBS: llä. Yhteensä keuhkojen solut eristettiin Liberase ruoansulatusta ja solujen kokonaismäärään määritettiin Hemavet solulaskijalla. Prosenttiosuus YFP positiivisten solujen määritettiin flow-sytometria analyysi koko keuhkojen soluja. Homing-indeksi määritettiin laskemalla prosenttiosuus YFP positiivisten solujen ohjautui keuhkojen normalisoitu hallita soluihin.

Tulokset

Rac1 kohdistaminen huonontaa leviämisen ja pesäkkeiden muodostuminen ihmisen NSCLA solujen

tutkimiseksi rooli Rac1 GTPaasi on NSCLA solujen kasvua, A549, H441, H1299, ja H23-solut infektoitiin lentiviruksen koodausta scr tai Rac1 shRNA (shRNA1, 2). Western blot analyysi paljasti tehokas knockdovvn Rac1 proteiinia sekä shRNA rakentaa (50% ja 90% verrattuna scr) A549-soluissa (kuvio. 1A). Rac1shRNA1 ilmaisu osittain pelkistetty leviämisen keuhkojen syöpäsoluja ja Rac1shRNA2 voimakkaammin esti solun kasvua (Fig. 1 B) ja aiheutti merkittävän laskun määrän pesäkkeitä kasvatettiin pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys (Fig. 1 C). Edelleen, solukierron suorittaman analyysin BrdU värjäystä ja FACS-analyysi paljasti lasku S-vaiheen ja vastaava lisäys G0 /G1 vaiheessa solusyklin kun Rac1 kohdistaminen (Fig. 1 D). Vuonna H441-soluissa, Rac1 shRNA2 johti ~75%: n vähennys Rac1 proteiinia (Fig. S1A), ja suhteellinen vähäinen vaikutus proliferaatioon (Fig. S1B). In H1299 ja H23-soluja, Rac1 pudotus aiheutti huomattavaan vähenemiseen proliferaation (Fig. S1C, S1E) ja pehmeä agar pesäkemuodostusta (kuvio. S1D, S1F). Sen määrittämiseksi, Rac1 pudotus vaikutukset lisääntymistä ja pehmeä agar kasvu ovat ominaisia ​​Rac1, suoritimme shRNA kestävä Rac1 cDNA mutantti pelastus kokeiluja knockdown soluissa. Ilmentämään Rac1 shRNA kestävä mutantti-cDNA voitaisiin useimmiten pelastaa leviämisen Rac1 pudotti A549-soluissa ilman havaittavaa vaikutusta scr shRNA hoidettuun kontrolliryhmään soluja (Kuva. 1 E). Samoin havaitsimme pelastamiseen pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen ilmaisemalla shRNA kestävistä Rac1 cDNA mutantti (Fig. 1 F). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että Rac1 tarvitaan proliferatiivisen potentiaalin NSCLA soluja.

(A) Solulysaatit kerättiin joko salattu shRNA (SCR) tai Rac1 shRNA (shRNA1, shRNA2) A549-solut altistettiin Rac1 western blot-analyysi. GAPDH käytettiin latauskontrollina. (B) infektoidut solut lajitellaan ja maljattiin 96-kuoppalevylle ja lisääntymisen määritys suoritettiin käyttäen MTS-reagenssia. Määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja edellä on yksi edustaja kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) tartunnan soluja lajiteltiin metallilla pehmeälle agarille -pesäkemääritys ja pesäkettä kentän laskettiin 2 viikon kuluttua. Määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja edellä on yksi edustaja kolmesta itsenäisestä kokeesta. (D) infektoidut solut lajitellaan ja inkuboitiin BrdU log vaiheessa solujen kasvua. Solut trypisinized, värjättiin BrdU-vasta-aineen, 7AAD ja solusyklin analyysi suoritettiin käyttäen virtaussytometrialla. Määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja edellä on yksi edustaja neljästä itsenäisestä kokeesta. Virhepalkkeja edustaa SD. (E) Ohjaus soluja tai soluja, jotka ilmentävät shRNA resistenttejä Rac1 mutantti infektoitiin scr tai Rac1 shRNAs, lajitellaan ja maljattiin 96-kuoppaiselle levylle. Lisääntymisen määritys suoritettiin käyttäen MTS-reagenssia. Määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja edellä on yksi edustaja kaksi toisistaan ​​riippumatonta koetta. (F) tartunnan soluja lajiteltiin metallilla pehmeälle agarille -pesäkemääritys ja pesäkkeet laskettiin 10 päivän jälkeen. Määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja yllä on yksi edustaja kaksi toisistaan ​​riippumatonta koetta.

Rac1 Knockdown johtaa vähentynyt tarttuvuus, muuttoliike ja invaasion NSCLA solujen

Yhdenmukainen tunnetun roolin Rac1 in tukirankansa asetuksessa, Rac1 knockdown sekä A549 ja H441-soluissa johti muuttuneessa aktiinisytoskeletonin järjestö (tuloksia ei ole esitetty). Tukahduttaminen Rac1 A549-soluissa aiheuttanut vähentynyt fokaalisen adheesion kompleksin muodostumisen, jossa ohjaus solujen näytteille vankka polttoväli kiinnitysalueisiin visualisoitu immuunivärjäys polttoväli adheesioproteiineja p-FAK, vinkuliini, ja p-paksilliini taas Rac1shRNA2 tartunnan saaneiden solujen osoitettiin pienentää polttovälin tarttuvuus kompleksin muodostumisen (Fig. 2A). Havaitsimme myös laskenut p-FAK, p-paksilliinin ja p-MLC Rac1 pudotus soluissa verrattuna kontrollisoluihin, Western blot -analyysillä (kuvio. S2A). Yhdenmukainen vähentynyt tarttuvuus komplekseja Rac1shRNA tartunnan saaneiden solujen adheesio fibronektiiniin väheni näissä soluissa verrattuna kontrollisoluihin (Fig. 2B). Samanlainen vaikutus proliferaatioon, Rac1 osittainen knockdown in H441-soluissa johti suhteellisen vähäinen vaikutus tarttumisen fibronektiiniin verrattuna A549-solut (Fig. S2B). Lisäksi Rac1 knockdown sekä A549 ja H441-solujen alensivat trans-hyvin muuttoliikettä ja invaasio toimintaa verrattuna ohjata soluihin (kuviot. 2C, 2D, Fig. S2C, Fig. S2D). Vastaavasti, Rac1 pudotus on H1299 tai H23-soluissa merkittävästi vähentynyt muuttoliikkeen kontrolliin verrattuna soluihin (kuvio. S2E, Fig. S2F). Ekspressoivat shRNA kestävä Rac1 cDNA mutantti kykeni täydellisesti pelastaa muuttoliike fenotyyppi Rac1 Knockdown A549-soluissa (kuvio. 2E). Nämä tulokset osoittavat, että on tärkeää Rac1 vuonna NSCLA syöpäsolujen tarttuvuus, muuttoliikettä ja invaasiota.

(A) Infected A549-soluja lajiteltiin, maljattiin fibronektiinin pinnoitetut dioja ja värjättiin joko p-FAK (yläpaneeli) tai vinkuliini (keskimmäinen paneeli) tai p-paksilliini (alempi paneeli) ja DAPI. Kuvat kerättiin fluoresenssimikroskooppia suurennoksella 40X. Kuvat yllä edustavat useita kuvia on saatu kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta. (B) A549 lajitellut solut maljattiin fibronektiinillä päällystetyn 96-kuoppaiselle levylle

in vitro

adheesiomääritys ja solut kiinnitetään levyyn 1 tunnin kuluttua määritettiin käyttäen MTS-reagenssia. Adheesiomääritys suoritettiin viisi rinnakkaista ja data edustaa kolmen erillisen kokeen. (C) Lajittelu solut maljattiin laajuisia hyvin muuttoliike levyjen ja solujen kulkeutumista kohti 10% FBS mitattiin yön yli. Määritys suoritettiin rinnakkaisnäytteiden ja Yllä olevat tiedot edusti kolmen erillisen kokeen. (D) Lajittelu A549-solut maljattiin Matrigel pinnoitetut invaasio levyt ja solujen kulkeutumista kohti 10% FBS ja 10 ug /ml fibronektiiniä mitattiin 48 tunnin kuluttua. Määritys suoritettiin kolmena kappaleena ja edellä on esimerkkinä kolmesta itsenäisestä kokeesta. Virhepalkkeja edustaa SD. (E) Valvonta tai soluja, jotka ilmentävät Rac1shRNA resistenttejä mutantti infektoitiin Rac1 shRNA ja lajitellaan. Solut maljattiin laajuisia hyvin muuttoliike levyjen ja solujen kulkeutumista kohti 10% FBS mitattiin yön yli. Määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja Yllä olevat tiedot edusti kaksi toisistaan ​​riippumatonta koetta.

Rac1 Knockdown estää keuhkojen asuttaminen NSCLA solujen hiirillä

Seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus Rac1 knockdown on kasvaimen kehittymisen ja metastaattisen käyttäytymisen keuhkoadenokarsinooma soluja. Rac1 Knockdown tai kontrolli solua injektoitiin suonensisäisesti immuunivajavaisissa NSG hiirten keuhkojen kolonisaation malli. Sekä A549 (Fig. 3A) ja H441-solut (Fig. S3A), joka ilmaisee Scr (500000 solua /hiiri) aiheutti kasvainten muodostumista keuhkoihin, kun taas Rac1 taintumisen solut (500.000 solua /hiiri) ei muodostaa kasvaimia keuhkoissa 8 viikkoa post injektio. Kuten odotettua, Rac1shRNA1 infektoitujen solujen, jotka oli osittainen Rac1 proteiinin knockdown muodostunut pienempi määrä kasvaimia. Sen määrittämiseksi, onko vaikutus keuhkojen kolonisaation liittyy homing viasta Rac1 pudotus solujen keuhkojen, testasimme kykyä kasvainsolujen kotiin keuhkokudoksen 48 tunnin kuluttua häntälaskimoinjektio. Virtaussytometria-analyysi osoitti, että YFP

+ Rac1 pudotus soluilla väheni merkittävästi keuhkojen homing aktiivisuus verrattuna YFP

+ Scr-solut (Fig. 3B). Lisäksi, ihon alle ksenograftin kasvaimen solut (500.000 solua /hiiri) NSG hiirillä osoitettu, että Rac1 pudotus solut olivat viivästynyt kasvaimen kehitystä ja vähentää kasvaimen tilavuus kontrolliin verrattuna soluihin (Fig. 3C). Mielenkiintoista on, että pallo muodostumista H441-solujen, joka korreloi kasvaimen aloittamista mahdollisia, myös vaarantunut Rac1 pudotus (kuvio. S3B), kun taas mitään vaikutusta ei havaita Rac1 pudotus on alan muodostavaa aktiivisuutta ei-transformoiva HBEC kontrollisoluja (Fig. S3C ). Näin ollen on todennäköistä, että Rac1 pudotus vaikutukset kasvainsolujen keuhkojen kolonisaation, kasvun vuoksi yhdistetty vaikutus syöpäsolujen itseohjautuva ja proliferaatio keuhkoissa.

(A) 5 x 10

5 A549-soluja injektoitiin häntälaskimoon of NSG hiiriä (n = 6 per ehto) ja keuhkot leikattiin 8 viikon kuluttua. Lung värjättiin Bouins liuoksella ja väri poistettiin 70% etanolia. Kvantifiointi keuhkojen kolonisaation tietojen osoitettiin oikeassa paneelissa. Virhepalkin edustaa SE. Kolikon on edustaja kaksi toisistaan ​​riippumatonta koetta. (B) Kasvainsolulinja homing-määritys suoritettiin, kuten on kuvattu menetelmissä (n = 6 tilaa kohti kussakin kokeessa). Homing-indeksi mitattiin prosentteina YFP positiivisten solujen havaittiin keuhkoissa, normalisoitu hallita. Kolikon on edustaja kolmen erillisen kokeen. (C) 5 x 10

5 scr tai Rac1 shRNA infektoituneita soluja ruiskutettiin ihonalaisen osaksi kylkiin NOD /SCID-hiirten ja kasvaimen tilavuus mitattiin viikoittain 7 viikon ajan. Virhepalkin edustaa SE.

Side populaation soluja sisältävät kohonnut Rac1-GTP ja lisääntynyt maahanmuutto, invaasio, ja keuhkojen asutustoimintaa

Syöpä kantasolu teorian mukaan vain murto-osan syöpä solupopulaatio rikastetaan kasvaimen aloittamisen valmiudet, mikä edellyttää etuoikeutettu kohdentamista saavuttaa terapeuttisia etuja. Side väestöstä on yksi kantasolujen merkkiaineita, jota on käytetty eristämään keuhkosyövän kantasoluja [12]. Olemme eristetty SP-soluja virtaussytometrialla A549-soluja (Fig. 4A) ja varmistettiin RT-PCR: llä että ne ilmaista lisääntynyt ABCG2 kuljettimen (Fig. S4A). Mielenkiintoista on, että SP-solut sisälsivät lisääntynyt Rac1 aktiivisuutta (Fig. 4B) ja näytetä lisääntynyt liikkuvuus verrattuna ei-SP-soluja tai emosoluista (Fig. 4C). Esto Rac1 aktiivisuuden käyttämällä pienimolekyylinen Rac estäjä, NSC23766, alensivat muuttoliike ja invaasion SP-soluissa (kuvio. S4b, S4C), mikä viittaa kohonnut Rac1-GTP SP solujen edistää näiden tuumorisolujen käyttäytymistä. Lisäksi SP solut osoittivat lisääntynyttä keuhkojen kolonisaation kyky

in vivo

verrattuna ei-SP tai vanhempien soluja (Fig. 4D). Mielenkiintoista, vaikka erillinen kasvaimen aloittamista toiminta

in vivo

, SP ja ei-SP solut lisääntyivät samalla nopeudella kuin vanhempien solut

in vitro

(Fig. S4d). Kuitenkin SP soluilla lisääntynyt pesäkkeiden muodostumisen aktiivisuutta kasvaa pehmeässä agarissa verrattuna ei-SP ja vanhempien soluja (Kuva. S4E). Jäljelle jäänyt tuumorigeenistä aktiivisuudesta ei-SP-soluissa ei johtunut epäpuhtauksia näiden solujen, koska rinnakkaisia ​​FACS-analyysillä havaittu yli 99,9% rikastumisen ei-SP solut Hoechst 33342 väriainetta lajittelu (tuloksia ei ole esitetty). Sen vuoksi on todennäköistä, että plastisuus ei-SP-solujen avulla ne voivat aiheuttaa syöpää aloittamista solujen tuloksena havaittu jäljellä kasvainten muodostumiseen.

(A) A549-soluja värjättiin Hoechst 33342 väriainetta ja analysoitiin virtaussytometrialla for puolella väestöstä (vasen paneeli). Soluja käsiteltiin 10 uM Fumitremorgen varten estäjäkontrollia (oikea paneeli). Kolikon on edustava usean SP analyysit. (B) Solulysaatit kerätty lajitellut SP ja ei-SP solut altistettiin GST-PAK vetää alas määritys ja käsitellään Rac1 western blot analyysi määrittää Rac1 aktiivisuuden. Yhteensä Rac1 blot käytettiin kontrollina. Kolikon on edustaja kolme riippumatonta Rac1 aktiivisuutta avattavan määrityksissä. (C) Lajittele A549-solut maljattiin laajuisia hyvin migraatiokokeessa ja solujen siirtyneet yön aikana kohti 10% FBS värjättiin ja laskettiin. Edellä on esimerkkinä kolmesta itsenäisestä kokeesta ja virhepalkkeja edustaa SD. (D) 5 x 10

4 lajitellaan SP ja ei-SP-soluja injektoitiin häntäsuoneen NSG hiiriä (n = 4 per ehto). Keuhkot irrotettiin lopussa 12 viikkoa. Oikea paneeli näyttää kvantifiointiin keuhkojen kolonisaation tietoja. Virhepalkin edustaa SE. Edellä on esimerkkinä kolmesta itsenäisestä kokeesta.

SP-soluja havaittiin myös H441-solujen alhaisempi kuin A549-solut (Fig. S4F; 0,5-2% vs. 4-10%). Samanlainen A549 SP soluja, H441 SP soluilla lisääntynyt keuhkojen kolonisaation immuunikatopotilaiden hiirissä verrattuna ei-SP-soluissa (kuvio. S4G), ja muodostunut enemmän pesäkkeitä pehmeässä agarissa verrattuna ei-SP ja vanhempien soluja (Kuva. S4H).

Nämä tulokset johtavat meidät päättelemään, että SP soluja NSCLA edustaa alaryhmän irtotavarana syöpäsolujen sisältävät kohonnut Rac1 aktiivisuus, lisääntynyt maahanmuutto, invaasio, ankkurointi riippumattoman kasvun toimintaa, ja rikastetaan soluja, jotka kykenevät kolonisoitumaan keuhko. Ne viittaavat myös siihen, että ei-SP-soluissa voisi jäädä tuumorigeenisia, vaikkakin alennettu CSC toiminnan aiheuttavan kasvaimia.

Rac1 Knockdown tukahduttaa tartuntaa, muuttoliike, ja hyökkäys sekä SP ja ei-SP-soluissa

edelleen vaikutuksen tutkimiseksi Rac1 knockdown SP-soluissa, A549-solut infektoitiin lentiviruksen joko sisältävien scr tai Rac1 shRNA, ja SP ja ei-SP soluja eristettiin virtaussytometrialla. Western blot analyysi vahvisti tehokkuutta Rac1 Knockdown sekä SP ja ei-SP-soluissa (kuvio. S5a). Linjassa aikaisempien tietojen vanhempien soluihin, Rac1 Knockdown muuttunut tukirankaproteiinin järjestäminen sekä SP ja ei-SP-soluissa (kuvio. S5B), ja vähensi polttoväli kiinnitysalueisiin visualisoituina p-FAK immunovärjäys Sekä SP ja ei-SP-soluissa (Fig. 5A). Johdonmukaisesti, tarttuvuus aktiivisuus sekä SP ja ei-SP-solujen fibronektiiniin väheni myös (kuvio. 5B). Edelleen Rac1 knockdown vähentynyt muuttoliike ja hyökkäys sekä SP ja ei-SP-soluissa (kuvio. 5C, 5D). Näin ollen, Rac1 kohdistaminen voi estää muuttoliike ja invaasio sekä SP ja ei-SP syöpäsoluja.

(A) Lajittelu solut maljattiin fibronektiinillä päällystetyn dioja, kiinteät ja alistettiin immunovärjäys p-FAK-vasta-ainetta. Cell kuvat kerättiin 40X suurennoksella käyttäen Fluorescent mikroskooppia. Yllä kuvattu edustavat useita kuvia kerätty. (B, C, D) A549 lajitellut solut maljattiin joko fibronektiinin päällystetty 96-kuoppaiselle levylle

in vitro

adheesiomäärityksellä (B), trans-kuoppaisille levyille migraatiokokeessa (C) tai Matrigel päällystetyt invaasio levyjä invaasiomääritys (D). Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ja virhepalkit edustavat SD. Esitetään edustavat kolmen erillisen kokeen.

Rac1 kohdentamista vähenee leviämisen ja keuhkojen kolonisaatio sekä SP ja ei-SP-soluissa

tutkia havaitun proliferaation esto yleistä syöpä solupopulaatio mukaan Rac1 pudotus johtuu erityinen vaikutus CSCS, seuraavan kerran testattiin kasvun ominaisuuksien eristetty SP ja ei-SP-soluissa ennen ja jälkeen transduktio Rac1-erityisiä shRNA. Lisääntyminen SP ja NSP solujen

in vitro

näytti samanlaiselta tavanomaisissa kudosviljelyolosuhteissa, ja Rac1 knockdown tukossa

in vitro

leviämisen Sekä SP ja ei-SP solut samassa määrin (kuvio . 6A). BrdU merkintöjä osoitti, että sekä SP ja ei-SP solut esti S-faasimuutos vastaavaan kasvuun G0 /G1 vaiheessa solusyklin jälkeen Rac1 taintumisen (Fig. 6B). Kun salattu RNA ei vaikuttanut lisääntynyt pesäkkeiden muodostumisen aktiivisuutta SP solujen pehmeässä agarissa määrityksen verrattuna ei-SP-soluissa joko vähentynyt seerumin tai normaali seerumin olosuhteissa (Fig. 6C; tietoja ei esitetä), Rac1 shRNA kykeni huomattavasti vähentämään pesäkkeenmuodostus sekä SP ja ei-SP A549-solut. In tail-vein pistetään NSG hiiriä, keuhkojen asuttaminen Rac1 shRNA SP-soluissa jyrkästi laski verrattuna scr soluihin ja vastaavien muiden kuin SP-soluissa ei osoittanut kasvaimen kolonisaatiota aktiivisuutta (Fig. 6D). Nämä tulokset osoittavat vahvaa todistetta sille, että Rac1 kohdistaminen on tehokas inhiboimaan leviämisen ja metastaasin sekä SP ja ei-SP-soluissa. Voit testata, jos Rac1 pudotus vaikutukset leviämisen sovelletaan syövän kantasoluja merkitty CD133, joka on BrdU suoritettiin joka BrdU-positiiviset solut aidatulla CD133

+ tai CD133

– väestö sekä SCR ja Rac1 shRNA käsitellyt solut. Havaitsimme lasku BrdU

+ solujen sekä CD133

+ ja CD133

– osapopulaatioiden upon Rac1 taintumisen (Fig. 6E). Näin ollen, Rac1 tarvitaan leviämisen CSC väestöstä.

(A) Lajittelu-soluja maljattiin 96-kuoppalevylle ja lisääntymisen määritys suoritettiin käyttäen MTS-reagenssia. Määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja virhepalkkeja edustaa SD. Kolikon on edustaja kolmen erillisen kokeen. (B) A549 lajiteltu soluja inkuboitiin BrdU ja solusyklin analyysi suoritettiin BrdU-värjäys ja virtaussytometria-analyysiä. Määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja virhepalkkeja edustavat SD. Yllä on edustaja kaksi toisistaan ​​riippumatonta koetta. (C) Lajiteltu solujen maljattiin suoraan pehmeälle agarille pesäkkeiden muodostumisen määritys ja muodostuneiden pesäkkeiden määrästä laskettiin jälkeen 2-3 viikkoa. Määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja virhepalkkeja edustavat SD. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen.