Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

peräsuolen syöpä (CRC) on toiseksi suurin syy syöpäkuolemista vaikka havaitseminen tämän syövän alkuvaiheessa aiheuttaa yli 90% eloonjääneitä. Tällä hetkellä alle 45% riskiryhmään yksilöitä Yhdysvalloissa seulotaan säännöllisesti, paljastaen tarvitaan parempia seulontatestejä. Suoritimme kaksi tapausverrokkitutkimukset validoimiseksi veren pohjainen testi, joka tunnistaa metyloitua DNA plasmassa kaikissa vaiheissa CRC.

Menetelmät /Principal Havainnot

Käyttämällä PCR-määritystä varten analyysi

septin 9

(SEPT9) hypermetylaation DNA uutettu plasmasta, kliininen suorituskyky oli optimoitu 354 näytettä (252 CRC, 102 ohjaa) ja validoitu sokaissut, riippumaton tutkimus 309 näytettä (126 CRC, 183 valvonta). 168 polyypit ja 411 ylimääräistä tautien valvonta arvioitiin myös. Koulutusvaatimusten perusteella tutkimuksen SEPT9 perustuva luokitus havaittu 120/252 CRC (48%) ja 7/102 valvonta (7%). Testissä tutkimuksessa 73/126 CRC (58%) ja 18/183 kontrollinäytteitä (10%) olivat positiivisia SEPT9 validoida opetusjoukolla tuloksia. Lisätään uusi mittaus jäljitellä lisäsi herkkyyttä testaukseen asetettu 72% (90/125 CRC havaittu) säilyttäen 90%: n spesifisyys (19/183 valvontaa). Positiivinen hinnat plasmat muista syövistä (11/96) ja ei-syöpä olosuhteissa (41/315) oli alhainen. Nopeus polyyppi tunnistus ( 1 cm) oli -20%.

Johtopäätökset /merkitys

analyysi SEPT9 DNA: n metylaation plasman edustaa yksinkertaista, invasiivisia menetelmä havaitsemaan kaikkia vaiheita CRC mahdollisten tyydyttää tyydyttymättömiä tarpeita kasvoi noudattamista seulonta väestöstä. Edelleen kliininen testaus on perusteltua.

Citation: Grützmann R, Molnar B, Pilarsky C, Habermann JK, Schlag PM, Saeger HD, et al. (2008) Sensitive Detection kolorektaalisyövän Peripheral Blood septin 9 DNA metylaatiomääritystä. PLoS ONE 3 (11): e3759. doi: 10,1371 /journal.pone.0003759

Editor: Joseph Najbauer, City of Hope Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 04 elokuu 2008; Hyväksytty: 21 lokakuu 2008; Julkaistu: 19 marraskuu 2008

Copyright: © 2008 Grützmann et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus sponsoroi Epigenomics AG, Berliini. Tutkimus sponsori osallistuivat tutkimuksen suunnittelu ja näytteiden analysointi. Tulkinta tietojen ja kirjoittaminen paperin sekä päätös jättää sen julkaistavaksi suoritti kaikki kirjoittajat myös tekijöille palveluksessa sponsori.

Kilpailevat edut: Fabian Malli, Volker Liebenberg, Theo Devos, Xiaoling Song, Robert H. Day, Andrew Z.Sledziewski ja Catherine Lofton päivän työskentelee Epigenomics, sponsori tutkimuksen.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi yleisimmät kasvaimet löytyy miesten ja naisten Yhdysvalloissa. American Cancer Society oli arvioinut, että 154000 uutta tapausta CRC tapahtuisi vuonna 2007, jolloin yli 52000 kuolemantapausta. Seulontaohjelmia tunnistamiseksi varhaisessa vaiheessa CRC ja preneoplasti- edellytykset voivat merkittävästi parantaa sairauden lopputulokseen, koska hoidon hyöty varhaisen havaitsemisen [1]. Nykyinen ei-invasiivisia seulontamenetelmät eivät ole kovin tehokkaita, koska ne vaativat potilaiden hoitomyöntyvyyttä itse kerätä ulosteesta näytteestä vuosittain läsnäolon piilevän veren (FOBT) [2]. Tähän mennessä parannuksia ulostetta tehtävät kokeet tekemällä niistä herkempiä ja käyttäjäystävällisempi eivät ole nousseet noudattamista CRC seulonnan. Invasiivisia seulontatestejä kuten kolonoskopia tai sigmoidoskopiaa, vaikka tehokkaampaa, vaativat laajaa suolen valmisteluun, loukkaa yksityisyyttä, ja sedaatio, eivätkä ratkaisemaan nykyiset noudattamista kysymyksiä CRC seulonnan. On yhä enemmän odotuksia, että uuden sukupolven seulonta perustuvat testit molekyylien biomarkkereita läsnä veressä pitäisi parantaa potilaiden hoitomyöntyvyyttä CRC seulonta osoituksena menestys muiden seulontaohjelmien kuten kolesteroli /lipidejä ja prostataspesifisen antigeenin (PSA) [5] – [7].

määritys epigenetic tapahtumista on vahva ehdokas varhainen havaitseminen taudin koska geenin ilmentymisen säätelyyn poikkeava DNA: n metylaatio on hyvin kuvattu tapahtuma tuumoribiologiassa [8], [9], ja on laajasti kuvattu CRC [10] – [12]. Kohonneeseen vapaa-kiertävän metyloituja DNA veressä syöpäpotilaiden terveisiin kontrolleihin verrattuna on raportoitu [13], [14]. Useat laboratoriot myös raportoitu lupaavia DNA: n metylaatio-pohjainen markkeri ehdokkaita havaitsemiseen CRC [15] – [19]. Kääntäminen tällainen merkki ehdokkaita osaksi kliinisesti validoitu ja kaupallisesti kannattavaa testit on ollut äärimmäisen hidasta ja riittämätöntä. Parannusten helpottamiseksi biomarkkereiden translation lääketieteessä Pepe

et al.

Ehdotti systemaattinen biomarker validointi syövän varhainen havaitseminen 5 vaihetta, kukin vaihe tarjoavien tehostettuun todisteita merkki validointi [20]. Alustavassa tutkimuksessa esitettiin ensimmäisen tason näyttöä siitä SEPT9, DNA metylaatio-pohjainen biologisten merkkiaineiden, tehokkaasti erottelee CRC normaalista yksilöt [21]. Septin 9 -geenin kuuluu luokkaan GTPaasit mukana lukuisissa soluprosessin [22] kantavassa geeni on osoitettu olevan useita vaihtoehtoisesti liitettyjä transkriptien, joka koodaa vähintään 5 tunnettu polypeptidien nimetty v1-V5 [23], joista osa on liittynyt syöpä. Suhde v4 ja v4 * ilme, samanlainen koodaamien proteiinien eri transkriptien, on osoitettu muuttua munasarjasyöpää kanssa v4 ollessa vallitseva muoto ilmentyy normaaleissa soluissa ja v4 * ilmaistaan ​​kasvaimissa [24]. Viimeaikaiset tutkimukset v1 isomuodon mukaan yli-ilmentyminen tämä polypeptidi voi edistää syövän etenemisen rintarauhaskudoksessa [25]. Aikaisemmat työ kuvataan poikkeava metylaatio promoottorialueen v2 transkriptin osoittaa, että metylointi tällä alueella liittyy peräsuolen syöpään [21]. Eteenpäin prosessissa ehdottaman Pepe

et al

, tässä raportissa tarjoamme toisen tason näyttöä esittämällä tulokset validointi kliinisistä määrityksen SEPT9 kaksi suurta itsenäistä plasma sarjaa osoittaa mahdollisuuksia tämän merkkiaine varhainen havaitseminen CRC. Määrän lisääminen määrityksen replikaatissa testattu johti korkea herkkyys CRC erinomainen spesifisyys myös terveiden. Spesifisyys arvioitiin edelleen useita taudin valvonnan. Lopuksi SEPT9 metylointi premaligneja vaurioita on raportoitu.

Methods

Potilaat

700 potilasta, joita kerättiin 9 sivustoja mitattiin koulutuksessa tutkimuksessa. Se osallistui potilaita, joilla kaikissa peräsuolen syöpä, yksilöille paksusuolen sairauksia kuten varmistettiin kolonoskopia, lisätoimenpiteitä taudin valvontaa ja useita potilaita, joilla adenomatoottisia polyypit (taulukko 1). Osajoukko 354 näytteen (vain CRC ja normaalit täysin SEPT9 mittausta) käytettiin tuottamaan opetusjoukolla algoritmi. Testi Tutkimus koostui 547 potilaan näytettä (osajoukko 309 CRC ja normaalit täysin SEPT9 mittausta käytettiin Koepakettia) kerätty 14 sivustoja ja mukana kaltaiset kliiniset luokkiin näytteistä, joita käytetään koulutuksessa tutkimuksessa. Muita tautien valvonta kerättiin yksilöiden kuin kolorektaalisyövissä ja erilaisia ​​ei-syöpätaudit ylimääräisiä spesifisyystutkimuksiin. Kaikkia näitä aiheita olivat todentaa kolonoskopia niin CRC-ja /tai adenooma-ilmaiseksi. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta TET kiinni paikallisten eettisten ohjeiden.

Kaikki syöpäpotilaiden ja terveiden verrokkien ilmoittautunut molemmissa tutkimuksissa olivat vähintään 40 vuoden ikäisiä suosivat potilaille 50 ja vanhemmat ja peräisin pääasiassa samasta klinikoilla. Kaikki koehenkilöt osallistuva ei ollut henkilökohtainen historia HIV, HBV tai HCV tai aiempi syövän lukuun ottamatta tyvisolusyöpä eikä oireita vakava akuutti eikä pahentaa krooninen sairaus.

Veri kaikista aiheista on tehty joko ennen tai yli 2 päivää ja enintään 6 kuukautta sen jälkeen kolonoskopia ja ennen aloittamista tahansa syövän erityistä hoitoa. Syöpä Diagnoosi vahvistettiin histologisesti kirurgisesta näytteen ja vain adenokarsinooman olivat mukana tässä tutkimuksessa.

Näytteen käsittely työnkulun

3-osa työnkulun kehitettiin SEPT9 testi (kuva 1). DNA Extraction: Vapaasti kelluva kiertävä DNA uutettiin plasmasta käyttäen Total Nucleic Acid suuria määriä DNA: n eristämiseksi pakki (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) ja Roche MagNaPure laite. Kahdeksan tai 16 ml plasmaa jaettiin MagNaPure kuoppiin (1 ml per kuoppa), uutettiin sen jälkeen kitin, ja DNA eluoitiin 100 ul: n eriä. Eluaatit kustakin potilaan yhdistettiin ja konsentroitiin lopulliseen tilavuuteen 100 ui käyttäen Microcon YM-30-suodattimet (Millipore). 5 ul: n erä kutakin näytettä säilytettiin mittaamiseksi genomisen kokonais-DNA: lla käyttäen reaaliaikaista PCR (CFF1) kuvattu Täydentävä taulukko S1. Bisulfiittikäsittelyn: Väkevä DNA-näytteet olivat bisulfiitti käsiteltiin käyttäen menetelmiä saavuttaa maksimaalisen muuntaminen ja DNA talteenotto [35]. 5 ul: n erä kutakin näytettä säilytettiin mittaamiseksi yhteensä vetysulfiitilla käsitellyn DNA: n käyttäen reaaliaikaista PCR (HB14) kuvattu Täydentävä taulukko S1. Real Time PCR Analyysi: SEPT9 reaaliaikainen PCR on suunniteltu ympäröivä transkription aloituskohdasta ja v2 transkriptio. Todellinen aika määritys sekvenssit, pyöräily olosuhteet ja laadunvalvonta prosessi on kuvattu täydentävä teksti S1 ja Täydennyskuvio S1. Täydellistä genomista ja yhteensä vetysulfiitilla muunnetulle DNA mittauksia, PCR suoritettiin 1:10 laimennoksen (eluointipuskuri) vastaavien materiaalien. Saat SEPT9 näytteiden mittauksiin, reaktiot suoritettiin 10-12,5 ui laimentamatonta DNA riippuen kokeessa. PCR suoritettiin käyttäen Roche LightCycler 2.0 laitteeseen FastStart DNA Master HybProbe master mix (Roche Applied Science). Kukin PCR run sisältyi DNA Vakiokuvaajan valmistettu käyttäen bisulfiitin käsitelty CpGenome Universal Metyloidut DNA (Millipore (Chemicon), Billerica, MA) pitoisuuksina 50 pg /reaktioajan-20 ng /reaktioajan. Jokainen ajaa myös templaattia sisältämättömään verrokkiin, joka jäi ilman korkkia koko prosessin kontrolloida saastumista, ja 3 no-templaattikontrollien joita käytettiin luomaan perustason PCR-reaktion. Näytteet ajettiin yksittäisinä kapillaarit jokaisesta PCR ajaa, ja rinnakkaisnäytteiden suoritettiin erillisissä PCR kulkee. Monistuskäyriä kutakin reaktiota manuaalisesti varmistettiin 2 itsenäistä arvostelijoita.

kaavio kuvaa suurta näytteen käsittely ja laboratorioon työnkulun vaiheita. Siitä näkyy, prosessinohjaus näytteitä tuodaan työnkulkuun ja mitä määrityksiä käytettiin mittaamaan tuotoksen kussakin vaiheessa. Harmaa ruutu osoittaa testijärjestely erityisiä työnkulun vaiheita.

Tietojen analysointi

Patient näytteitä koulutusta ja testi tutkimus ryhmiteltiin diagnoosin ja sukupuolen ja satunnaisesti DNA: n uuttaminen erissä. Lisäksi testi tutkimuksessa näytteet sokaissut ennen käsittelyä laboratoriossa ja tietojen analysointi. Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi plasman näytteiden suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu, ja rinnakkaisnäytteessä mittausten keskiarvo. [21] Chi square-testiä käytettiin vertaamaan havaitseminen hinnat eri paikoissa kasvain, iän, kasvaimen vaiheen ja sukupuolen mukaan. Wilcoxonin-Mann-Whitneyn testi ja Kruskall-Wallisin testiä käytettiin kvantitatiivisesti vertailla metyloitua septin 9 DNA pitoisuudet eri paikoissa kasvain, ikä, kasvaimen vaiheesta ja sukupuoli. Luottamusväli mittasuhteet havaittujen näytteitä asetettiin 95% ja perustuu binomijakauma. Kaikki P-arvot ovat kaksipuolisia.

Tulokset

tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli validoimaan SEPT9 hypermetylaation biomarkkerina peräsuolen syövän määrittämällä optimaalinen luokittelija käyttämällä joukko näytteitä (koulutus tutkimus) ja vahvistaa valitun luokittelija itsenäisessä näytejoukolla (testi tutkimus). Kukin plasma näyte käsitellään käyttäen kolmivaiheinen työnkulku hahmoteltu kuvassa 1. työnkulkuprosessiin seurattiin huolellisesti lisäämällä positiivisten ja negatiivisten kontrollien kussakin vaiheessa ja yksittäiset näytteet vastaanotettujen kädessä ohitettuaan laadunvalvonta määrityksiä (katso Täydentävät Teksti S1).

Training Study

demografiset ja kliiniset parametrit aiheita koulutukseen sisältyvät tutkimuksessa esitetään taulukossa 1. Kolmesataa neljäkuudettakymmentä peräsuolen syövän ja normaali kontrollinäytteiden sisältyivät ensisijainen tietojen analysointi. Koulutuksen Tutkimus Aineisto analysoitiin laadullisesti, jossa SEPT9 reaktiota kutsutaan positiiviseksi, jos erilliset PCR käyrä havaittiin. Kukin plasma näyte mitattiin kolme riippumatonta PCR-reaktioissa ja analyysiin perustuvat kliiniset ominaisuudet, potilaan näytteet luokiteltiin positiivisiksi, jos kaksi kolmesta PCR rinnakkaista kutsuttiin positiivinen. Tämän perusteella laadullisen algoritmi mittasimme herkkyys on 48% ja peräsuolen syövän ja spesifisyys 93% ei-peräsuolen sairauksien kolonoskopia vahvistamat näytteitä. Vaihtoehtoisesti voimme määrittää optimaalinen kynnysarvot perustuvat kvantitatiivinen analyysi SEPT9 merkki. Nämä määrälliset algoritmit eivät parantaneet yleistä merkki suorituskykyä (katso Täydentävä taulukko S2). Käyttämällä laadulliseen analyysiin, analysoimme korrelaatioita havaitsemisen paksusuolisyövän ja erilaiset kliiniset parametrit. Ei ollut merkittävää eroa havaitsemismäärä sijainnin kasvaimen, iän tai sukupuolen. Alkuvaiheen kolorektaalisyövissä havaittiin hieman alempi (43%) kuin myöhemmin syöpiä (55%), mutta ero ei ollut merkittävä. Ei myöskään ole merkittävää määrällistä eroa määriä metyloitua SEPT9 DNA eri vaiheiden välillä (kuvio 2A). SEPT9 merkki myös havaittu 22% polyyppien suurempi kuin 1 cm.

Box-prosenttipiste kuvaajia opetusjoukolla metyloitu SEPT9 DNA plasmassa on esitetty kolonoskopia vahvistama normaaleilla potilailla (Normaali) ja potilailla, joilla peräsuolen syöpä ( CRC). Mediaani DNA pitoisuudet ovat punaisia ​​vaakaviivoja; 25. ja 75. prosenttipisteet ovat sinisiä vaakarivillä. Leveys laatikko prosenttipiste juoni tiettynä korkeus on verrannollinen prosenttia havainnot, jotka ovat äärimmäisiä suuntaan pois johtavaan mediaani. Yksittäiset mittausarvot piirretään harmaa piireissä. B) Box-persentiili kuvaajia testaus joukko metyloitu SEPT9 DNA pitoisuuksia plasmassa.

Test Study

Vahvista kliinistä suorituskykyä SEPT9 koulutus algoritmi keräsimme plasmanäytteistä riippumattoman potilaan setti (test set – taulukko 1). Verrattuna koulutuksen asettaa Koepakettia sisälsivät merkittävästi vähemmän varhaisessa vaiheessa syöpiä ja syöpäpotilaiden olivat hieman vanhempia. Käyttämällä SEPT9 kynnys määritetään koulutuksessa tutkimuksessa pystyimme vahvistamaan merkki suorituskykyä testissä joukko 309 peräsuolen syövän potilaiden ja terveiden verrokkien kanssa herkkyys 58% ja spesifisyys 90% (taulukko 2).

ei ollut merkitsevää eroa havaitsemismäärä sijainnin kasvaimen, iän tai sukupuolen. Alkuvaiheen kolorektaalisyövissä havaittiin alhaisemmalla (36%) kuin myöhemmin syöpiä (73%), mutta ero detektioprosentti ei ollut merkittävä. Kuitenkin, oli merkittävä kvantitatiivinen ero määrien metyloitua SEPT9 DNA eri vaiheiden välillä (P 0,002; kuvio 2B). Suuret polyypit ( 1 cm) havaittiin nopeudella 18%.

Parannettu prosessi tuottaa parempia SEPT9 suorituskyky

Aikana rutiini laadunvalvonta havaitsimme satunnaista esto PCR-reaktion (katso Täydennyskuvio S2). Siksi olemme analysoineet ylimääräisen SEPT9 jäljitellä käyttämällä 10-kertaisesti laimennettua näytettä saatavissa alkuperäisestä koko bis-DNA mittauksia. Korrelaatio juoni standardin SEPT9 mittaus (keskiarvo kolmen standardin toistoa) ja yksi mittaus laimennetun näytteen on esitetty kuvassa 3.

X-akseli – pitoisuus SEPT9 standardin Koepakettia näytteitä (keskiarvo kolme standardia toistoa) Y-akseli – pitoisuus SEPT9 1:10 laimennettu Koepakettia näytteitä (single toisinto). MDNA – metyloitua DNA. Ryhmä 1 – näytteet samalla SEPT9 vahvistus vakio ja laimennettu keskittyminen, ryhmä 2 – näytteiden SEPT9 vahvistus vain vakio pitoisuus, ryhmä 3 – näytteiden SEPT9 vahvistus vain laimennettu keskittyminen. Green kolmiot – terve paksusuolen, punaiset ympyrät – peräsuolen syöpä, musta neliö – polyypit.

On olemassa kolme ryhmää näytteet: group1 jossa SEPT9 vahvistus oli identtinen standardin ja laimennettuja näytteitä, ryhmä 2 jossa ainoa standardi keskittyminen näytteet vahvistetaan ja ryhmä 3, jossa vain laimennettu näytettä monistettiin. Ryhmä 2 koostuu näytteistä, joista ei PCR estoa ei havaittu, mutta sisälsi tasot kasvaimen DNA riittämätön monistamiseen SEPT9 laimentamisen jälkeen. Ryhmä 3 näytettä näkyy PCR esto vakio pitoisuus, mutta laimennettuna, osoitti SEPT9 vahvistusta. Olemme sisällyttäneet johtuva ylimääräinen mittaus uuteen algoritmiin, jossa potilas näyte luokitellaan positiivinen, jos jompikumpi kaksi kolmesta standardin PCR rinnakkaista ovat positiivisia (opetusjoukolla algoritmi) OR mittaus laimennetun näyte on positiivinen. Uudelleenanalysoinnissa koepaketin tuloksia käyttämällä tätä algoritmia parantanut suorituskykyä SEPT9 määrityksen (taulukko 2).

Kaiken peräsuolen syövän havaitseminen oli 72% säilyttäen samalla erittäin korkea spesifisyys 90%. Erityisen vaikuttava oli parantamisen havaitseminen varhaisessa vaiheessa syöpä (vaihe I /II – herkkyys 62%) vahvistaa mahdollinen arvo SEPT9 kuin varhaisen havaitsemisen biomarkkereiden paksusuolisyövän.

Non peräsuolen syöpä (NCC) ja syövättömät sairaudet (NCD) analyysissä

myös kerätty ja analysoitu osajoukko plasmanäytteistä joilla potilailla on diagnosoitu ei-paksusuolen ja peräsuolen syöpiä (NCC), mukaan lukien virtsarakko-, rinta-, keuhko-, maksa-, haima- ja eturauhasen syövät sekä non -cancerous tauti, joka voi olla sekoittavia vaikutuksia SEPT9 merkki suorituskykyä. Kuten taulukosta 3, SEPT9 on poikkeuksellisen erityinen suhteen peräsuolen syövän verrattuna havaitsemiseen väärennöskeskukset: vain muutaman plasmanäytteistä maksasyövän (2 out of 8 näytettä), keuhkosyöpä (4 ulos 13) ja virtsarakon syöpä (4 ulos 19) potilasta oli positiivinen merkki. Alhainen prosenttiosuus SEPT9 läsnä useita ei-syöpä tauti ryhmät, esim krooninen munuaisten vajaatoiminta, gastriitti, ja krooniset hengitystieinfektiot (katso taulukko 3) pistettä sen korkea spesifisyys paksusuolisyövän maligniteetti.

Keskustelu

Tässä raportissa määritellään suorituskykyä todellisen -Aika PCR metyloidulle SEPT9 DNA ensin koulutus- tutkimuksessa ja sitten pidennetyn riippumattoman testauksen tutkimus. Kaiken herkkyys ja peräsuolen syöpiä oli samanlainen molemmissa tutkimuksissa yksilöidyt käyttäen alkuperäistä koulutusta algoritmi. Herkkyys kasvoi 72% ja lisäksi SEPT9 toisinto 10-kertaisesti laimennettua plasmaa näytteestä. Merkitsin osoitettiin olevan herkkiä alkuvaiheen paksusuolen ja peräsuolen syöpiä tunnistamaan 62% vaiheen I /II CRC. Oli suuntaus varhaisen vaiheen kolorektaalisyövissä voidaan havaita hieman hitaampana kuin myöhemmin syöpiä sekä koulutus ja testaus tutkimus, mutta erot eivät olleet merkittäviä riittämättömän määrän näytteitä kunkin yksittäisen vaiheessa syöpään. Herkkyys CRC havaitseminen on täysin riippumaton kasvaimen sijainnista paksusuolen. Tämä voi olla yleinen piirre metylaation biomarkkereiden koska Chen

et al.

Huomattava samanlaisen korrelaation puuttuminen vaiheessa tai paikalla tuoreessa tutkimuksessa ulosteesta potilailla, joilla peräsuolen syöpä [26]. Muut ulosteen testejä, kuten FOBT ja iFOBT on osoitettu olevan alentunut herkkyys sekä proksimaalinen paksusuolen ja peräsuolen syöpiä, ja varhaisessa vaiheessa syöpiä [27]. Lopuksi tuloksemme osoittavat, että biomarkkereiden on myös erittäin spesifinen (90-93%) terveillä henkilöillä.

Olemme kehittäneet erittäin herkkä PCR-määritys havaitsemaan metyloidut v2 edistäjä SEPT9 Plasmanäytteissä. Tehokas validointi Tällaisen testin riippuu yhtä paljon laadusta biomarkkereiden kuin laadusta ja johdonmukaisuutta työnkulun vaiheita, mukaan lukien lopullinen merkki mittauksen. Me ohjattu meidän työnkulun jokaisessa vaiheessa; Arvioidessaan vaihtelevuus DNA: n eristämiseksi, bisulfiittikonversion ja PCR-monistus ja koska tällaisten laadunvalvonta pystyimme tunnistamaan satunnaista PCR inhibition testissä asetettu. Voittaminen tätä kysymystä laimentamalla PCR-reaktion 10-kertaiseksi ja yhdistämällä tämä mittaus laimentamattoman mittaus tuotti todellisen suorituskyvyn SEPT9 merkki. Käyttö neljä määritys näytteitä (3 standardin rinnakkaisnäytteiden ja 1 laimennettu) mahdollistaa vaihtoehtoisten analyysi keskittyy joko herkkyys tai spesifisyys merkkiaineen määrityksen. Vaatimalla SEPT9 olla läsnä kaikissa vakio rinnakkaisnäytteiden tai yksi laimennettua toisinto ennen näytteen luokitellaan positiivinen, testi saavuttaa erittäin korkea spesifisyys (97%) ja edelleen on huomattava herkkyys (65%). Kun vain 1 4 rinnakkaisnäytettä (joko yksi tasoa tai laimennettu) oltava positiivinen positiivinen puhelun (suuri herkkyys -tila) herkkyys kasvaa 77%, kun taas spesifisyys on edelleen kunnioitettava 75% [ks täydentävä taulukko S3].

ohjaus potilasryhmät meidän tutkimuksissa oli mukana ensisijainen joukko yksilöitä ilman paksusuolen sairauksia kuten varmistettiin kolonoskopia mutta joissakin olosuhteissa todennäköisesti läsnä sisällä CRC seulonta väestöstä. Teimme kaikkemme välttää potilaiden valinnan bias tutkimuksessa vaatimalla tarkastusten olla samassa ikäryhmään kuin CRC ja olevan peräisin pääasiallisesti samasta klinikoiden kuin meidän CRC potilaita. Näistä pyrkimyksistä huolimatta joidenkin harhat säilyi: valtaosa CRC potilaista koulutukseen ja Koepakettia miehiä (57% ja 60% vastaavasti), ja Koepakettia potilaat ovat hieman vanhempia kuin koulutus asetettu potilailla. Koska huomasimme, että havaitseminen CRC on riippumaton iästä ja sukupuolesta raportoitujen SEPT9 suorituskyky ei pitäisi vaikuttaa. Ensisijainen analyysi vertaa suorituskykyä merkkiaineen plasmassa potilailla, joilla peräsuolen syöpä vs. aiheista ilman peräsuolen sairaus. Suoritimme lisämäärityksistä käyttämällä ei-syöpä tautien valvonta ja plasman syövät muista kuin peräsuolen tunnistamaan mahdolliset spesifisyyden kysymyksiä. Potilaiden määrä näitä edellytyksiä ei painotetaan niiden esiintyvyyttä, ja siksi todellinen spesifisyys näistä sairauksista ei voida määrittää, että kohteena seulonta väestöstä. Koska havaittu positiivisia merkkiaineen on hyvin alhainen kontrollinäytteissä, uskomme, että SEPT9 markkeri suoriutuu hyvin tulevissa mahdollisille kliinisissä tutkimuksissa mitattuna CRC seulonnan väestöstä.

SEPT9 Testi pyritään havaitsemaan oireeton peräsuolen syöpätapausta. Olemme myös saaneet alustavat tiedot polyyppi havaitsemisen kanssa SEPT9 määrityksen, jotka osoittavat joidenkin premaligneja muutokset tunnistetaan meidän testi. Lopullisena CRC seulontatesti tulisi kohdistaa adenoomia, joka edistää syövän ja että voitiin poistaa aikana seurata kolonoskopia. Vaikka emme tänään vielä täysin ymmärrä luonnollista historiaa adenoomien, ja voi ennustaa, mitkä olisivat edetä syöpään, on houkuttelevaa spekuloida, että epigeneettisiä markkereita, kuten SEPT9, voi auttaa tällaisia ​​polyyppien kerrostumista.

septin 9

geeni, jota kutsutaan myös MSF, koodaa nisäkkään septin proteiinin mukana monissa solun prosesseissa. Häiriöt toiminnan

septin 9

johtaa epätäydellinen solunjakautumisen [28].

septin 9

n ja muiden proteiinien on osoitettu olevan fuusio-osapuolet, että proto-onkogeenin

MLL

viitaten rooliin tuumorigeneesiin [29], [30].

septin 9

on myös osoitettu olevan usein poistettu alueen rinta- ja munasarjasyövän syöpien Heterotsygotian menetys (LOH) tutkimukset, päätelmä edelleen syytöksiä geeni mahdollisena tuumorisuppressoriproteiinia [31]. Burrows

et al.

Raportoitu perusteellisen tutkimuksen ilmaus useiden isomuotojen

septin 9

geenin munasarjasyövän ja osoittivat kudos- erityinen ilmentymä eri transkriptien [32]. Ilmentäminen v4 transkriptio

septin 9

osoitettiin olevan poissa tai vähentynyt useissa solulinjoissa ja voidaan aktivoida käsittelemällä 5-atsasytidiini, joka tarjoaa aluksi näytöt mahdollisista sääntelyn geenin DNA metylaatio. Lisänäyttöä metylaation valvonnan v2 transkriptin annettiin äskettäin kvantitatiivisen analyysin kudoksissa ja plasmassa peräsuolen syöpä potilaista [21]. Lisäksi tuoreessa tutkimuksessa Bennett

et al.

Osoittaa, että metylaatio septin 9 -geenin esiintyy myös pään ja kaulan alueen syöpiin, mutta alueella metylointi tapahtumaa ei ole kuvattu [33]. Yli-ilmentyminen

septin 9

isoformien on osoitettu myös useissa tuumorikudoksissa. Aiemmassa tutkimuksessa on yli 7000 normaalia ja tuumorikudoksissa osoittaa, että kudoksen erityinen ilmaisu septin 9 transkriptien esiintyy monenlaisia ​​syöpiä [23] Tutkijat spekuloivat, että geeni on todennäköisesti tyypin II syövän geeni, joiden muutokset RNA transkriptikäsittelystä valvonta-asetus eri proteiini tuotteita, ja tasot nämä muuttuneet proteiini-isoformit voidaan antaa vastauksia geenin roolia maligniteetti. Tämä hypoteesi on yhdenmukainen viimeaikaiset tutkimukset, jotka osoittavat septin 9 isoformi yli-ilmentyminen liittyy onkogeenisen fenotyyppi [24], [25] ja todisteet siitä, että septin 9: v1 yli-ilmentyminen liittyy kasvaimen vastustuskyky lääkkeille, jotka häiritsevät mikrotubulusten muodostumista [34 ].

toistaiseksi nykyinen CRC seulonta strategioita ei pystynyt parantamaan potilaiden hoitomyöntyvyyttä ja alentaa kuolleisuus paksusuolen syövän. Useimmat asiantuntijat ennakoivat parannettua potilaan CRC seulonnan noudattamista veripohjaisten testi, kuten tapahtui eturauhassyövän seulontaan PSA tai sydänsairaus kolesteroli /lipidien testaus. Tässä raportissa kuvataan ensimmäinen validointi plasma-pohjainen DNA metylaatio suoritetun kaksi suurta hyvin kontrolloituja tapausverrokkitutkimukset vahvistaa kliinistä potentiaalia SEPT9 biomarkkeri CRC seulonnan sovelluksen. Uskomme, että tällainen helposti annostella veripohjaisten testi varhaisia ​​peräsuolen syöpä seuraa kolonoskopia positiivisille henkilöille on potentiaalia olla erittäin tehokas keino vähentää kuolleisuutta tähän tautiin. SEPT9 merkki määritys optio arvioida tarkemmin testi varhaisen CRC havaitsemiseksi ja mahdollisille tutkimuksiin on suunniteltu määrittämään kliinisiä suorituskyvyn seulontaan ohjeellinen tukikelpoisia seulonta populaatioissa.

tukeminen Information

teksti S1.

Täydentävä menetelmät

doi: 10,1371 /journal.pone.0003759.s001

(0,03 MB DOC) B Taulukko S1.

Primer, koetin ja esto sekvenssit markkerin SEPT9 reaaliaikainen PCR-määritystä, ja ohjaus- CFF1 ja HB14 reaaliaikainen PCR-määrityksissä

doi: 10,1371 /journal.pone.0003759.s002

(0,02 MB DOC)

Taulukko S2.

SEPT9 merkki suorituskykyä koulutukseen set – vaihtoehto algoritmeja.

doi: 10,1371 /journal.pone.0003759.s003

(0,02 MB DOC) B Taulukko S3.

SEPT9 merkki suorituskyky Koepakettia – vaihtoehto analyysi

doi: 10,1371 /journal.pone.0003759.s004

(0,03 MB DOC) B Kuva S1.

Shewhart valvontakortit koko genomi-DNA: talteenotto (ylempi) ja SEPT9 Merkki-DNA (alempi) käsittelemiseksi valvontaa harjoitussarjassa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0003759.s005

(0,08 MB DOC )

Kuva S2.

Shewhart valvontakortit koko genomi-DNA: talteenotto (ylempi) ja SEPT9 Merkki-DNA (alempi) käsittelemiseksi valvonnan testipakkauksesta.

doi: 10,1371 /journal.pone.0003759.s006

(0,08 MB DOC ) B

Kiitokset

kirjoittajat haluavat kiittää diagnostiikkaan seulonta teknologian kehittämistä ryhmien Epigenomics suorittamiseksi kliinisissä tutkimuksissa. Esitetty osa: tiivistelmä # LB165 AACR Annual Meeting 2007, Los Angeles CA