Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilailla on korkea taipumus kehittyä luuston etäpesäkkeitä, joka aiheuttaa liiallista osteolyyttinen toimintaa. RANKL /RANK /OPG-järjestelmä, joka on keskeinen rooli luun säätelemällä osteoklastien muodostumista ja toimintaa, on mahdollisesti kiinnostaa tässä yhteydessä.

Materiaalit ja menetelmät

Käänteistranskriptaasilla polymeraasiketjureaktio reaktio, western blotting ja immunohistokemiallinen analyysi käytettiin ekspression tutkimiseksi RANKL, RANK ja OPG ihmisen NSCLC solulinjoissa erilaisilla metastaattisen mahdollisuudet, samoin kuin 52 ensisijainen NSCLC näytteitä ja 75 NSCLC luun etäpesäke näytteitä. Ala-pienisoluista keuhkosyöpää, ilmentymistä näiden proteiinien korreloi kliinis parametrit. Rekombinantti ihmisen RANKL ja transfektoituja RANKL cDNA lisättiin Paa solulinjaa arvioimaan promoottorin toiminnan RANKL prosessin aikana etäpesäkkeiden

in vitro

ja

in vivo

.

tulokset

Up-säännelty RANKL, RANK ja OPG ilmaisun ja nousi RANKL: OPG suhde havaittiin NSCLC solulinjoissa ja kasvainkudoksissa luumetastaasipotilailla, ja korreloivat suurempi metastaattisen potentiaalia. Metastaattista potentiaalia NSCLC

in vitro

ja

in vivo

sekä maahanmuuton ja invaasio kyky, oli merkittävästi parannettu yhdistelmä ihmisen RANKL ja transfektoimalla RANKL cDNA, ja oli heikentynyt sen jälkeen OPG lisättiin . Lisääntynyt ilmentyminen RANKL ja OPG korreloivat kasvaimen vaiheessa, imusolmuke etäpesäke, ja etäpesäkkeiden.

Päätelmät

Differential ilmentymisen RANKL, RANK ja OPG liittyy metastaattista potentiaalia ihmisen NSCLC että luuranko, nostaa mahdollisuus, että RANKL /RANK /OPG voisi olla terapeuttinen kohde metastaattisen NSCLC potilaiden.

Citation: Peng X, Guo W, Ren T, Lou Z, Lu X Zhang S, et ai. (2013) Differential Expression of RANKL /RANK /OPG System liittyy luumetastaasipotilailla Human ei-pienisoluinen keuhkosyöpä. PLoS ONE 8 (3): e58361. doi: 10,1371 /journal.pone.0058361

Editor: Rajeev Samant, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 06 helmikuu 2013; Julkaistu: 13 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Peng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat National Natural Science Foundation of China (nro 30973020 ja 81001193). https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) on yleisimmin diagnosoitu maligniteetti ja tärkein syy syövän liittyvät kuolemat Aasian ja Länsi-populaatiot, yli 150000 ihmistä odotetaan kuolevan vuosittain tähän sairauteen [1] . Luuranko edustaa Yleisin kasvaimen etäpesäke. Noin 9%: sta 30%: lla potilaista keuhkosyöpä kehittyy etäpesäkkeitä luustossa, jotka johtavat merkittäviin sairastavuuden selkäydinkompressio, patologisen murtumia, ja hankala kipu [2], [3]. Huolimatta korkea etäpesäke, taustalla molekyylitason mekanismeja, jotka säätelevät kyky keuhkosyöpään solujen lisääntyä ja tunkeutua yhä puutteellisia, ja onnistunut hoitomuotoja jäädä hämäräksi.

Kehitetään tehokkaita hoitoja luun etäpesäke, se on selvennettävä molekyylitason mekanismeista kasvaimen aiheuttamat muutokset luun mikroympäristössä. Normaalisti on koordinoitava tiiviisti tasapaino, jossa osteoklastien välittämää luun hajoamista ja osteoblastien välittämää luun muodostumista ehkäistä ja edistää jatkuvasti remontin luun rakenteen [4]. Kun keuhkosyöpä metastasizes luuhun, häiriöitä tämä tasapaino voi johtaa lisääntyneeseen luun resorptiota, joka aiheuttaa liiallista osteolyyttinen toimintaa ja siitä luuston sairaus [5].

Viimeaikaiset raportit ovat paljastaneet uutta reseptori-ligandi-järjestelmän omistaja että tuumorinekroositekijä (TNF) superperheen: reseptorin aktivaattori tumatekijä (NF) -kB (RANK), sen ligandi (RANKL), ja proteiini osteoprotegrin (OPG) [6], [7]. RANKL, joka on kalvoon sitoutunut proteiini ilmentyy pääasiallisesti pinnalla osteoblastien ja luuytimen stroomasolujen, sitoutuu RANK pinnalla osteoklastien esiasteiden, edistää niiden erilaistumista kypsiksi osteoklasteiksi [8] – [10]. OPG, joka on valereseptori RANKL, joka on myös tuottanut osteoblastien /stroomasolut, voi estää luun tuhoutumisen estämällä välinen sitoutuminen RANKL ja RANK estäen siten osteoklastien erilaistumisen ja aktivaation [6], [11]. Häiriöstä RANKL /RANK /OPG järjestelmä on todettu, että useissa kasvaimissa, kuten rintasyövän [12], [13], eturauhassyöpä [14], pahanlaatuisten luun kasvaimet (esim, multippeli myelooma, giant kasvaimet luun, ja chondroblastoma) [15] – [17], okasolusyöpä [18], ja Hodgkinin tauti [19]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että RANKL on välttämätön kehittämiselle osteolyyttisiä vaurioita luun [20]. Lisäksi estämällä RANKL-RANK vuorovaikutus, osteolyyttisiä vaurioita on onnistuneesti estyy useiden syöpätyyppien, mukaan lukien multippeli myelooma ja eturauhassyövän [21] – [23].

keuhkosyöpä, RANKL /RANK /OPG-järjestelmä on havaittu sekä läsnä ollessa että ilman luun etäpesäkkeitä. Kohonneita seerumin liukoisen RANKL ja OPG on raportoitu keuhkosyöpäpotilaita luuetäpesäkkeistä [24]. Äskettäin on raportoitu, että RANKL myös laukaisee kulkeutumista ihmisen kasvainsolujen, jotka ilmentävät RANK [25]. Lisäksi RANK-Fc, kimeerisen proteiinin, joka estää RANK-RANKL vuorovaikutus, on osoittautunut vastustaa osteoklastogeneesiä [26]. Vastaavasti oletamme, että ilmaus RANKL /RANK /OPG voi korreloida NSCLC etenemiseen. Tässä tutkimuksessa, ilmaus RANKL, RANK ja OPG tutkittiin ihmisen eri keuhkosyövän solulinjat, joilla on erilaiset metastaattinen potentiaali. Rekombinantti ihmisen RANKL ja transfektoitiin RANKL-cDNA lisätään NSCLC solulinjan arvioida promoottorin toimintaa RANKL prosessissa etäpesäke. Immunohistokemiallista analyysiä suoritettiin arvioimaan ilmaus RANKL, RANK ja OPG ensisijainen NSCLC kasvaimissa, sekä luun metastasoitunut kudoksissa NSCLC. Expression näistä proteiineista korreloi kliinis parametrien ensisijaisen NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat

Tässä tutkimuksessa selvitettiin kirurgisen biopsianäyttei- 127 potilasta NSCLC, mukaan lukien 52 tapauksissa vasta diagnosoitu NSCLC ja 75 tapausta luun etäpesäke NSCLC. Kaikkia potilaita hoidettiin klo Pekingin yliopiston Kansan sairaalan ja saanut mitään hoitoa aikaan näytekokoelmatodistuksen. Yksityiskohtaiset kliiniset tiedot näistä potilaista on esitetty taulukossa 1. NSCLC potilaat lavastettu mukaan American Thoracic Society TNM luokittelu, ja lajitellut histologisesti joko hyvin, kohtalainen tai huonosti eriytetty. Tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Boards Pekingin yliopiston Kansan sairaalassa. Eettisten komiteoiden hyväksyneet tämän menettelyn. Tietoon perustuva suostumus koekäyttöä varten kirurgisten näytteiden saatiin kaikista potilaista kirjallisesti mukaan sairaalan eettiset ohjeet.

Soluviljely ja reagenssit

Ihmisen keuhkosyöpä solulinjat PG- BE1, PG-LH7, ja Paa ostettiin Institute of Pathology, Pekingin yliopiston Health Science Center (Beijing, Kiina). Soluja viljeltiin RPMI 1640 (Gibco, NY, USA) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Gibco). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2. Rekombinantti ihmisen proteiini RANKL ja OPG ostettiin ProSpec Biotechnology Inc. (ProSpec, Ness-Ziona, Israel, Cat No: CYT-334 ja CYT-633). -Aineita, joita RANK, RANKL, ja OPG ostettiin Abcam Inc. (Abcam, MA, USA, Cat No: ab12008, ab9957 ja ab73400). β-aktiini-vasta-aine hankittiin Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA, Cat No: sc-130065).

Eläimet

Kuusi viikkoa vanhoja koiraspuolisia vakava yhdistetty immuunivajaisiin ( SCID) hiirille, jotka painoivat 20-25 g, käytettiin tässä tutkimuksessa. Eläin Tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Boards Pekingin yliopiston Kansan sairaalassa. Eläimet saatiin Model Animal tutkimuskeskuksen Pekingin yliopiston Health Science Center, joka sijaitsee alle patogeenivapaissa olosuhteissa noudattaen NIH ohjeiden avulla eläimen protokollaa hyväksymän Animal Care ja Käytä komitean College.

RT-PCR: llä ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Kokonais-RNA uutettiin PG-BE1, PG-LH7, ja PAA-soluissa yksivaiheisella menetelmällä käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen, La Jolla, CA, USA) mukaan valmistajan ohjeiden ja RNA myöhemmin käänteistranskriptio osaksi komplementaarinen DNA. Käytettyjen spesifisten alukkeiden DNA: n monistamiseen on esitetty yhteenvetona taulukossa 2. Monistettu PCR-tuote fraktioitiin 1,5% agaroosigeelielektroforeesilla, valokuvattiin UV-valossa, ja analysoitiin densitometrillä. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin ABI Prism7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Beverly, MA, USA) käyttäen GoTaq qPCR Master Mix A6001 kit (Promega, Madison, WI, USA). Terminen profiili oli 95 ° C: ssa 15 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s ja 58 ° C: ssa 30 s. MRNA: n ilmentyminen RANKL /RANK /OPG analysoitiin käyttämällä 2

– (ΔΔCt) menetelmä (PAA solulinja kalibraattorina), joka perustuu Ct-arvot sekä tavoitearvon ja viite geenejä. Määrästä kunkin transkriptin normalisoitiin suhteessa tunnettuun määrään glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) ja β-aktiini. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tulokset reaaliaikainen PCR-analyysi esitetään keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM). Terminen dissosiaatio tontteja tutkittiin kaksivaiheisesti sulamiskäyriin osoittaa onko aluke-dimeerejä tai muita epäspesifinen tuotteita voidaan edistää vahvistus signaalia.

Western blot-analyysi

Western blot analyysi oli suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [27]. Lyhyesti, proteiinit erotettiin 10% denaturoivalla polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin PVDF-kalvolle. Yksittäiset immunobloteilla tehtiin ensisijainen vasta-aineiden varalta RANK (1:500), RANKL (1:1000), OPG (1:500), ja β-aktiini (1:1000). Membraanit blokattiin TBS-T, joka sisälsi 5% rasvatonta kuivamaitoa, ja sitten niitä inkuboitiin yön yli primaarisen vasta-aineen. Seuraavaksi membraaneja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (Santa Cruz, CA, USA) 1 tunnin ajan. ECL reagenssi (GE Healthcare, NJ, USA) käytettiin proteiinin havaitsemiseksi. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

immunohistokemia

Parafiinisektioista annettiin reagoida kanin polyklonaalista anti-RANKL-vasta-aineita (1:500 laimennos), hiiren polyklonaalisen anti-RANK-vasta-aineita (1:200 laimennus) tai kanin anti-OPG-vasta-aineita (1:100 laimennus), kuten aiemmin on kuvattu [27]. Värjätyistä leikkeistä ei-immuuni kanin tai hiiren seerumia (1:200 laimennus) fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), sen sijaan, että ensisijainen vasta-aine toimi negatiivisena kontrollina. Arvioida RANKL, RANK ja OPG värjäys, syöpäsolut näytteille positiivista värjäytymistä solukalvon ja sytoplasmassa laskettiin vähintään 10 edustajan kentät (400-kertainen suurennus) ja keskimääräinen prosenttiosuus positiivisten syöpäsolujen laskettiin. Tapaukset, joissa osuus positiivisten syöpäsolujen oli ≥50% määriteltiin positiivisia, ja ne, jotka sisältävät 50% positiivisia syöpäsolut määriteltiin negatiivisiksi. Immunovärjäys arvioi kaksi riippumatonta patologia sokeita kliinisiin ominaisuuksiin ja tuloksia.

Computer kuva-analyysin avulla Immunohistokemian

immuunivärjäystä Kaikkien vasta analysoitiin kvantitatiivisesti käyttämällä tietokoneavusteisen kuva-analyysin järjestelmän . Lyhyesti, kuvia värjätyt leikkeet, jotka on otettu Leica digitaalikamera ja käsitellään käyttäen Image Pro Plus-analyysi (versio 6.0, Media Cybernetics, Rockville, MD, USA). Se oli vahvistettu määrittämällä positiivisen värjäytymisen Ohjausosuudet ja käytettiin automaattisesti analysoida kaikkia tallennettuja kuvia kaikista näytteistä, jotka värjättiin samassa istunnossa identtisissä olosuhteissa. Alue immuno- alueiden laskettiin automaattisesti ohjelmiston kuhunkin mikroskooppisen kenttään. Pikselimäärään on immunoreaktiotuotteet laskettiin automaattisesti ja annettiin kokonais- tiheys integroidun Immunovärjäyksen tietyllä alueella jaksoissa. Tämä heijastaa suhteellinen määrä proteiinia, jotka havaitaan vasta-aineiden kasvaimen osiin. Suhde RANKL /OPG laskettiin integroitu immunovärjäystä tiheydet RANKL ja OPG kussakin ryhmässä.

RANKL-cDNA-transfektiolla

Täyspitkä ihmisen RANKL-cDNA (RefSeq: NM_033012.2) lisättiin eukaryoottiseen vektoriin pCMV6-XL5 (ostettu Origene Technologies, Inc. Cat No: SC305532). Paa solut transfektoitiin rekombinantti plasmidi tai vektori yksinään (vale-transfektanttien) käyttäen Lipofectamine 2000-reagenssia (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), kuten valmistaja on kuvannut, ja niitä viljeltiin RPMI1640 täydennettynä 10% FBS: ää ja 500 ug /ml G418: aa (Amresco, OH, USA). RANKL vakaa transfektantit (nimeltään Paa-RANKL) ja mock transfektanteissa (nimeltään Paa-mock) perustettiin ja ylläpidetään RPMI1640 täydennetty 10% FBS: ää ja 250 ug /ml G418: aa.

In vitro

muuttoliike ja invaasio määritykset

muuttoliike ja invaasio määritykset suoritettiin ymppäämällä 3 x 10

5 solua 200 ul RPMI1640 päälle Transwell soluviljelmässä insertit sisältävät polyeteenitereftalaatti kalvon esipäällystetty tai puuttuu Matrigel ( 24 kuopan insertit, 8,0 mm: n huokoskoon, Coster, Corning Inc., Corning, NY, USA). Alempi kammio täytettiin 0,8 ml RPMI1640, tai ei ole lisätty ihmisen yhdistelmä-RANKL ja tai ilman ihmisen yhdistelmä-OPG. Kun oli inkuboitu 24 tuntia, ei-muuttavien solut kaavittiin pois ja kalvot kiinnitettiin ja värjättiin käyttäen Diff-Quik tahra Kit (Sysmex Co., Hyogo, Japani). Solut, jotka olivat vaeltaneet kalvojen läpi kvantitoitiin määrittämällä solujen lukumäärän kolmesta satunnaisesti valitusta näkökentät 200-kertaisella suurennuksella.

sääriluun istutusta keuhkosyövän soluja

Hiiren sääriluunsisäinen injektio mallin luumetastaasipotilailla luotiin osteolyyttisiä vaurioita tässä tutkimuksessa. [28] – [30] keuhkosyövän soluja (5 x 10

5 solua) suspendoitiin 10 ui 1% PBS: ää ja sekoitetaan 10 pl matrigeelin (BD biosciences , San Jose, CA) kunkin sääriluun injektiota. 20 ui soluja ja matrigeeliä seos ruiskutettiin sääriluun proksimaalisessa 6-viikon ikäisiä SCID-hiirissä, kuten on julkaistu aiemmin [29], [31]. Lyhyesti, hiiret nukutettiin käyttämällä isofluraania (1,5-2%) ja happea. Päällä oleva iho prepped steriilisti 70% etanolilla ja betadine. 3-mm pitkittäinen viilto tehtiin yli lumpionivelsiteen useita 12 leikkausveitsellä terä, ja sitten 2 mm: n pitkittäinen viilto tehtiin pitkin mediaalinen rajalla lumpionivelsiteen sääriluun tasanne. 26-1/2 gaugen neula vietiin läpi proksimaalisen sääriluun ja 20 ui keuhkosyövän solujen ja matrigeeliä seos ruiskutettiin medullaariontelon. Haava suljetaan yhdellä 5-0 Vicryl ommel (Ethicon Inc.).

Animal opintoryhmistä

Tässä tutkimuksessa viisikymmentä miespuolinen SCID kävi sääriluun istutusta keuhkosyöpää solujen ja olivat tasan jaettu viiteen tutkimusryhmissä. Ryhmä I (Paa) eläimet saivat sääriluunsisäinen injektion Paa pelkät solut. Ryhmä II (PAA-Mock) sääriluu vastaanotettu PC-3-soluja, jotka oli transfektoitu tyhjällä vektorilla valvoa transfektioon. Ryhmä III (Paa-RANKL) eläimet saivat Paa soluja, jotka oli transfektoitu vektorilla yli ilmentävät RANKL cDNA. Sääriluu IV ryhmässä (PAA-RANKL + OPG) istutettiin PAA-RANKL soluja ja eläimiä käsitellään myöhemmin OPG. OPG käytettiin annoksena 10 mg /kg liuotettuna 100 ui fosfaattipuskuria suolaliuosta (PBS) ja injektoitiin ihonalaisesti kolme kertaa viikossa alkaen päivänä sääriluun istutuksen syöpäsolujen ja jatkettiin kaikkiaan 8 viikkoa. Ryhmä V (PAA-RANKL + PBS) sääriluu istutettiin PAA-RANKL-soluihin ja hiiriä käsiteltiin 100 ui PBS, joka injektoitiin myös ihon alle kolme kertaa viikossa 8 viikkoa.

radiomerkkiaineen valmisteen

Fluoridi-ioni tuotettiin käyttäen O-18 vesi ja protoni pommitusta käyttäen RDS syklotronin (CTI).

18F-fluoridi-ionin tuotettiin erityistoimiin noin 1000 Ci /mmol ja

18F-FDG syntetisoitiin erityistoimiin noin 5000 mCi /mmol julkaisemassa aiemmin [30].

Micro PET /TT vantamismenetelmää

eläimet kuvantamisen alaryhmiin tehtiin positroniemissiotomografia (PET) ja mikro TT 8 viikkoa tekijän laitos mukaisesti aiemmin julkaistu protokolla [30]. Lyhyesti, hiiret nukutettiin isofluraanilla (1,5-2%) ja happea induktio kammioissa. Sitten hiiret injektoitiin suoraan noin 250 uCi

18F-FDG häntälaskimon kautta käyttäen 27 gaugen neulaa pujotettu polyeteeni katetrin. Eläimille annettiin anestesian ylläpidossa 2% Isofluraanin eristämiseen sängyssä järjestelmän aikana radiomerkkiaineen oton. Rakot manuaalisesti ilmaistiin 5-min ennen kuvausta ja eläimet sijaitsee kannettavassa multimodaalisuutta vuode, joka koostuu läpinäkyvään häkkiin anestesiaan satamiin ja koroke. Koko kehon skannaukset suoritettiin 10 minuutin hankinta aika käyttämällä MicroPET® FOCUS 220 järjestelmä (CTI Concorde Microsystems LLC). Heti jälkeenpäin ilman varjoainetta mikro CT tutkimus käyttäen Microcat® II (IMTEK Inc.) kuvantamisjärjestelmä käytettiin skannata eläimelle 10 minuutin hankinta aika. PET scan kuvat rekonstruoitiin käyttämällä suodatin-back projektio. MicroPET ja Microcat® kuvat olivat sitten yhdistettiin analyysiä varten käytettäväksi AMIDE® ohjelmistoa.

kvantitatiivinen analyysi mikro PET /TT data

PET ja CT-aineisto analysoitiin ja kvantifioidaan AMIDE® ( Medical Image Data Examiner) versio 0.7.154 julkaistun aiemmin [30].

18F-FDG otto korreloi solujen sokeriaineenvaihduntaan ja käytettiin mikro PET kuvantamisen havaitsemiseksi ja pitkittäinen seuranta kasvaintaakkaa. Lyhyesti, kiinnostavat alueet (ROI) vedettiin käyttämällä ROI työkalun kahdenvälistä sääriluun tasankoja, jotka olivat kolmiulotteisesti rekonstruoitu rajata kaikki havaittavissa signaali sisäänottokyvyt. Käyttämällä ROI laatikot samankokoisia, data-analyysi työkaluja käytetään laskemaan maksimi ja keskimääräinen signaalin voimakkuuden sekä kasvain istutettu koipiluut ja contralateral injektoimattomat koipiluut. Contralateral sääriluu käytettiin sisäisenä kontrollina kunkin eläimen. Määrällisesti kasvaimen kokoa, 3D isocontour ROI vedettiin kasvaimen sääriluu käyttäen suurinta FDG signaalin intensiteettiä kontralateraaliseen sääriluu kynnyksenä, ja FDG voimakkuus (mm

3) laskettiin sitten vuonna kasvain istutettu koipiluut. Micro CT-kuvia käytettiin tunnistamaan ja määrittämään osteolyyttisiä vaurioita.

Tuumorirasitusta mittaukset

Eläimet tapettiin mikro PET /CT-8 viikon ajan, ja niiden kasvainten takajalan kerättiin pehmeää -tissue mittaus. Pehmytkudoksen kasvaintaakkaa laskettiin käyttämällä kaavaa kuin aiemmin julkaistuista [29], [32].

Tilastollinen

Tiedot kuva-analyysin osat ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvo (SEM) kunkin ryhmän. Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen

t

-testin ja varianssianalyysi (ANOVA), jossa

p

-arvot 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Pearsonin khiin neliö testiä käytettiin määrittämään korrelaatio RANKL /RANK /OPG ilmaisun ja kliinis parametrit. Kaikki tiedot analysoitiin SPSS 15.0 ohjelmistolla (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA).

Tulokset

Expression of RANKL, RANK ja OPG ihmisen keuhkosyövän solulinjoja

ensin määritimme metastaattisen potentiaalin PG-BE1, PG-LH7, ja Paa soluja. PG-BE1 solujen voimakkaammin tunkeutui suodatin kuin muut solulinjat, ja kuinka monen Paa soluja oli vähäistä (

p

0,05; kuvio 1A, B). Lisäksi taso matriksimetalloproteinaasi-9 (MMP-9) mRNA havainnoida RT-PCR-analyysi oli samanlainen taso havaittiin TranswellTM lisätään (

p

0,05; kuvio 1 C). Kaikki edellä osoitti, että nämä kolme solulinjoissa oli erilaiset metastasoitunut potentiaaleja. Seuraavaksi ilmentymä RANKL, RANK ja OPG arvioitiin kaikissa kolmessa solulinjoissa transkription ja proteiinin tasot käyttäen kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä ja western-blottauksella. Kaikki kolme NSCLC solulinjat näytteillä eri RANKL, RANK ja OPG ilme. Kolme solulinjat, PG-BE1-soluja (jotka oli korkein metastaattinen potentiaali) osoitti voimakkaimman ilmentymisen RANKL, RANK ja OPG (

p

0,05 vs. muut solulinjat, kuviot 2 ja 3 ). Paa soluja, jotka olivat vähiten invasiivisia, osoittivat vain vähäisiä RANKL, RANK ja OPG värjäys. Immunosolukemialliset vahvisti RANKL, RANK ja OPG ilmaisun havaittu kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR ja western-blottauksella. Lisäksi merkittävästi suurempi RANKL: OPG tiheys suhde havaittiin soluissa korkeamman metastaattinen potentiaali (

p

0,05, kuviot 2D ja 3D).

metastaattisen potentiaalin kolme NSCLC solulinjoja ensin määritettiin käyttäen in vitro migraatiomääritys (A, B). Ero MMP9 ilmentyminen kolmessa NSCLC solulinjoissa analysoitiin edelleen RT-PCR: llä (C). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM) kolmen erillisen kokeen. **

p

0,05 PG-BE1 versus PG-LH7. *

p

0,05 PG-LH7 vs. paa.

RT-PCR suoritettiin havaitsemiseksi RANKL, RANK ja OPG mRNA tasot PG-BE1, PG-LH7 ja PAA-solut (A). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR paljasti suhteellinen ilmentyminen RANKL, RANK ja OPG mRNA kolmessa NSCLC solulinjoissa käyttäen 2

– (ΔΔCt) menetelmä (Paa solulinja kalibroijana). GAPDH ja β-aktiini käytettiin sisäisenä viitteenä (B, C). Seuraavaksi suhde RANKL: OPG mRNA ilmaisu kolmessa NSCLC solulinjoissa laskettiin Ct-arvot sekä kohde ja viite geeni (D). Pylväät edustavat keskiarvoa ± keskivirhe keskiarvon (SEM) kolmen eri kokeissa. **

p

0,05 PG-BE1 versus PG-LH7. *

p

0,05 PG-LH7 vs. paa.

Western blot -analyysi suoritettiin havaitsemiseksi RANKL, RANK ja OPG-proteiinin tasot PG-BE1, PG-LH7 , ja Paa soluja. Juovien voimakkuudet normalisoitiin p-aktiini (A-C). Seuraava suhde RANKL: OPG-proteiinin ilmentyminen on laskettu kolme NSCLC solulinjoissa (D). Pylväät edustavat keskiarvoa ± keskivirhe keskiarvon (SEM) kolmen eri kokeissa. **

p

0,05 PG-BE1 versus PG-LH7. *

p

0,05 PG-LH7 vs. paa.

Yhdistelmä-RANKL stimuloi Paa maahanmuutto- ja invaasion

In vitro

Kanssa alin metastaattinen potentiaali ja vähiten RANKL lauseke, vähäinen määrä siirtynyt Paa solujen kasvoi kolminkertaiseksi rekombinanttisen ihmisen RANKL (

p

0,05). Tämä vaikutus estettiin lisäämällä yhdistelmä-humaani-OPG annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4B). Stimuloidut invaasio myös kasvoi kaksinkertaiseksi, kun yhdistelmä-DNA-RANKL lisättiin paa soluja. Samoin OPG tuotti annoksesta riippuvan väheneminen Paa soluinvaasiota. Nämä tulokset osoittivat, että RANKL /RANK /OPG järjestelmä oli toiminnallinen keuhkojen syöpäsoluja.

Western blot-analyysi osoitti korkeampia RANKL proteiinin ilmentymistä PAA-RANKL soluissa verrattuna PAA ja Paa-Mock-solut (A). Rekombinantti RANKL kannustanut paa solujen vaeltamiseen, ja vaikutus RANKL hallinnon estettiin lisäämällä OPG elatusaineeseen annoksesta riippuvaisella tavalla. *

p

0,05 300 ng /ml rekombinanttia RANKL verrattuna kontrolliryhmään ja 200 ng /ml OPG-käsiteltyjen näytteiden (B). Lisääntynyt maahanmuutto PAA-RANKL soluissa in vitro osoitettiin, ja voitiin estää lisäämällä OPG viljelyalustaan. *

p

0,05 PAA-RANKL vs. paa, PAA-Mock ja 200 ng /ml OPG-käsiteltyjen näytteiden (C). Tulokset ilmoitetaan keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM) kolminkertaisten määritysten.

RANKL cDNA transfektion stimuloi Paa maahanmuutto- ja invaasion

in vitro

ja

vivo

selventämään lisäksi biologisia toimintoja RANKL /RANK /OPG järjestelmä NSCLC, käytimme transfektiotekniikasta nimenomaan säädellä RANKL geeniekspression paa soluissa. Paa-solut transfektoitiin plasmidi-DNA, joka koodaa täyspitkää RANKL-geenin. Sen jälkeen G418 seulonta useita viikkoja, vakaa transfektanttisolun linja Paa-RANKL perustettiin. RANKL ilme oli merkitsevästi säädelty tässä solulinjassa verrattuna alkuperäiseen PAA linjan ja mock transfektantin kanssa pCMV6-XL5 vektorin (Paa-Mock) (

p

0,05; kuva 4A).

Seuraavaksi tutkimme vaikutus säätely ylöspäin RANKL ilmaisua metastaattisen käyttäytymiseen kasvainsolujen Transvvell- määrityksessä. Lukumäärä siirtynyt solujen oli yli kaksi kertaa suurempi PAA-RANKL soluissa kuin PAA ja Paa-Mock-solut; määrä hyökkäsi solujen oli myös kaksi kertaa suurempi. Molempia vaikutuksia blokattiin lisäämällä OPG elatusaineeseen annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4C).

tutkimiseksi edelleen roolin RANKL in NSCLC in vivo, me perustettiin ksenografti hiirten mallia sääriluunsisäinen injektiona PAA solujen tai PAA-RANKL soluista SCID hiiriin. Sen jälkeen, kun 8 viikkoa, havaitsimme, että kasvaimen tilavuus peräisin PAA-RANKL-soluissa oli merkittävästi suurempi kuin johdettu PAA-soluja (taulukko 3). Micro PET-analyysi paljasti myös merkittäviä eroja luun leesion koon välillä Group (PAA) ja ryhmä (Paa-RANKL) (taulukko 3, kuvio 5). Lisäksi, OPG injektoidaan subkutaanisesti kolme kertaa viikossa, sekä kasvaimen tilavuus ja

18F-FDG luuvaurion koko ryhmän (PAA-RANKL + OPG) olivat merkittävästi pienempiä kuin Group (Paa-RANKL) ja ryhmä (PAA-RANKL + PBS) (taulukko 3, kuvio 5).

A-Plain radiograph; B-mikro CT (poikittainen näkymä); C-mikro PET /TT overlay (poikittainen näkymä). Tavallinen röntgenkuva ja mikro PET /TT osoitti lisääntynyt luun tuhoutumisen (valkoiset nuolet) ja

18F-FDG kertymä ryhmässä (PAA-RANKL) ja ryhmä (PAA-RANKL + PBS) 8-viikon sääriluunsisäinen kasvainsolujen injektion, kun taas kasvu estyi ryhmässä (PAA-RANKL + OPG).

Yhteenvetona nämä tiedot edellä osoittivat, että RANKL /RANK /OPG-järjestelmä on keskeinen rooli luuston etäpesäkkeitä NSCLC in vivo. Nämä havainnot ovat sopusoinnussa in vitro -tutkimuksissa ja ennusteeseen viittaavia tietoja.

Proteiinin ilmentymistä RANKL, RANK ja OPG ensisijainen NSCLC vaurioita ja etäpesäkkeitä

Seuraavaksi käytimme immunovärjäyty- tutkia RANKL, RANK ja OPG proteiini- tasojen ihmisen NSCLC kudosnäytteistä. 75 NSCLC luuetäpesäkkeiden mainita nykyisessä tutkimuksessa, 60 tapausta (80%) ja 54 tapausta (72%) oli ilmaus RANKL ja RANK, vastaavasti, kun taas 62 tapauksessa (82,7%) oli OPG lauseke (taulukko 4). RANKL ja RANK värjäytyminen havaittiin pääasiassa solukalvon ja sytoplasmassa syöpäsoluja. Ei-neoplastisia luukudoksia osoitti heikkoa ja polttoväli RANKL, RANK ja OPG värjäys, ja värjäytymisen intensiteetti kaikkien kolmen proteiineihin oli vahvempi syöpäsolun /luun rajapintoja kuin keskellä syöpäsolun pesät (kuvio 6A). Vertailun vuoksi 52 primaarisyöpien vain 53,8% ja 59,6% tapauksista näytteillä RANKL ja RANK ilme, vastaavasti, ja 63,5% tapauksista osoitti OPG lauseke (

p

0,05; taulukko 4). Merkittävästi vahvempi immuunivärjäykseen kaikki kolme proteiinia havaittiin luun etäpesäkkeitä kuin kasvainsoluissa on ensisijainen sivustolla. Tämä havainto vahvistettiin kvantitatiivisen analyysin Immunovärjäyksen tiheys proteiinien kussakin ryhmässä.

Immunosytokemia varten RANKL, RANK ja OPG suoritettiin kudososat ensisijainen NSCLC vaurioita ja luustometastaaseja peräisin NSCLC, ja värjäytymisvoimakkuuksia arvioitiin (A). Seuraavaksi suhde RANKL: OPG immunovärjäyksellä tiheys laskettiin ensisijaisen NSCLC vaurioita ja luustometastaaseja peräisin NSCLC (B). Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM) kolmen erillisen kokeen. *

p

0,05.

Seuraavaksi tarkemmin arvioida Immunovärjäyksen tuloksia, laskimme RANKL: OPG suhteet mittaamalla optinen tiheys kudosten peruskoulusta NSCLC ja NSCLC luumetastaaseja. Analyysi paljasti merkittävästi suurempi RANKL: OPG suhdelukuja luun etäpesäkkeitä verrattuna ensisijaisen NSCLC kudoksiin (kuvio 6B).

Korrelaatio RANKL, RANK ja OPG ilmaisutapoja kliinis parametrien keuhkosyöpää

Various kliinis-ensisijaisen NSCLC potilaita verrattiin perustuu ekspressiotasot RANKL, RANK ja OPG. Kuten on esitetty taulukossa 1, RANKL, RANK ja OPG ilmaisu ei ole liittynyt iän, biologisen sukupuolen, tupakoinnin historiaa, tai histotype. Kuitenkin selkeä korrelaatioita perustettiin välillä RANKL ja OPG ilmaisun ja kasvaimen vaiheessa imusolmuke etäpesäke, ja kaukainen etäpesäke. Siksi suurempi RANKL (78,6%, 71,4%, ja 88,9%) ja OPG lauseke (64,3%, 76,2%, ja 77,8%) havaittiin kehittyneempien etäpesäkkeitä (

p

0,05; Taulukko 1 ). Lähes kolme neljäsosaa (71,4%) vaiheen T3 /4 kasvainnäytteestä värjättiin positiiviseksi RANK verrattuna 39,5% vaiheen T1 /2 kasvain näytteet (

p

0,05, taulukko 1). Ei ollut merkittävää yhdistyksen välillä RANK ilmaisun ja imusolmuke etäpesäke tai kaukaisia ​​etäpesäkkeitä. Lopuksi, potilaille, joilla on huonosti eriytetty histologinen luokka esillä paljon suurempi RANKL ilmaisun kuin ne, joilla on hyvin eriytetty histologinen luokka (90,9% vs. 43,9%,

p

0,05); ei merkittävää yhteyttä ei havaittu koskien RANK tai OPG.

Keskustelu

Luuetäpesäkkeiden jotka ovat peräisin keuhkosyövän ja muiden pahanlaatuisten kasvainten liittyy vakavia luustokomplikaatioita, ja keuhkosyöpä etäpesäke luun edelleen merkittävä lähde sairastuvuutta, muutamia onnistunut hoitovaihtoehtoja. Useimmat NSCLC luuetäpesäkkeiden luonnehditaan tyypillisesti osteolyytti- mukaan röntgenkuvissa ulkonäkö [20], [33], [34]. Normaalissa luu on dynaaminen tasapaino osteoklastien säännelty luun hajoamista ja osteoblastien säännelty luun muodostumista [4].