Krooninen sairaus

tiivistelmä

Belinostat on hydroksamaatti luokka HDAC estäjä, joka on osoittanut aktiivisuutta syrjäisillä T-solulymfooma ja on käynnissä kliinisissä tutkimuksissa ei-hematologisia syöpiä. Tutkimme farmakokinetiikkaa belinostat maksasolukarsinoomassa potilailla määrittää tärkeimmät metabolian of belinostat. Farmakokinetiikkaa belinostat maksassa syöpäpotilailla leimasi nopea plasman belinostat laaja aineenvaihdunta yli 4 kertaa suurempi suhteellinen systeeminen altistus päämetaboliitilla belinostat glukuronidi kuin belinostat. Oli merkittävää vaihtelua yksilöiden belinostat glukuronidaatiota. Suurimmat metabolian liittyy UGT1A1- välittämää glukuronidaatiota hyvä korrelaatio on havaittu välillä belinostat glukuronidi muodostumista ja glukuronidaatiota tunnettujen UGT1A1- alustoille. Lisäksi maksan mikrosomeissa kätkeminen UGT1A1 * 28-alleelien on alhaisempi glukuronisaatio toimintaa belinostat verrattuna villityyppiseen UGT1A1. Pääasiallinen metaboliareitti belinostat kautta glukuronidaatiota välittyy pääasiallisesti UGT1A1, erittäin polymorfinen entsyymi. Kliinistä merkitystä tämän havainnon on vielä määrittämättä.

Trial Rekisteröinti

ClinicalTrials.gov NCT00321594

Citation: Wang LZ, Ramírez J, Yeo W, Chan M-YM , Thuya WL, Lau J-YA, et ai. (2013) Glukuronidaatio mukaan UGT1A1 on hallitseva Pathway on metabolinen sijoittelu Belinostat Liver syöpäpotilaille. PLoS ONE 8 (1): e54522. doi: 10,1371 /journal.pone.0054522

Editor: John Luk, Johnson Cilag, Kiina

vastaanotettu: 02 elokuu 2012; Hyväksytty: 12 joulukuu 2012; Julkaistu: 30 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus sponsoroi National Research Foundation of Singapore (Experimental Therapeutics Program) ja National Medical Research Council of Singapore (NMRC /CSA /021/2010). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa. Huomaa, että belinostat on Topotarget tuote. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

histonideasetylaasi estäjät (HDACis) on osoitettu olevan syövän vastaista aktiivisuutta pahanlaatuisten solujen avulla asetylaatio sekä histoni ja ei-histoni-proteiinien. Asetylointi histonien välittää epigeneettisten modulaatio geenejä, jotka voivat indusoida apoptoosia, estävät solujen kasvua ja vähentää neoangiogeneesiä [1] – [7]. Useat HDACis on hyväksytty perifeerisen tai ihon T-solulymfooma [8] – [10].

Belinostat on hydroksaamihappo perustuu pan-histonideasetylaasi-inhibiittori kliinisen kehityksen syövän hoito erilaisia ​​hematologisia ja kiinteitä pahanlaatuisia sekä ainoana lääkkeenä sekä yhdistelmähoidot [11] – [18]. Tällä hetkellä belinostat on myönnetty nopeutettu ja harvinaislääkkeeksi U.S. Food and Drug Administration hoitoon uusiutunut tai vaikeahoitoinen perifeerinen T-solujen lymfooma. Kliinisesti lääke on suhteellisen hyvin siedetty, yhteinen haittavaikutuksia olivat väsymys, pahoinvointi ja oksentelu, ja uneliaisuus, saavutti asteen 3 suurimmalla siedettävä 1200 mg /m

2 annetaan 30 minuutin (min) infuusiota varten 5 peräkkäisenä päivänä joka 3. viikko. Belinostat on saatavana sekä suun kautta että laskimoon muotoiluja, ja kun lääke on tarkoitus antaa pitkäaikaisella pohjalla, kumulatiivinen toksisuudet ovat mahdollisia. Siksi olisi tärkeää määritellä aineenvaihduntaan belinostat, ymmärtää sen

in vivo

disposition. Tähän asti hyvin vähän tiedetään metaboliareittiä belinostat.

muut jäsenet hydroksaamihappoa luokan HDAC-inhibiittorit kuten vorinostat ja panobinostat tehdään primaariaineenvaihduntaan glukuronidoitumalla [19] – [21]. Toisaalta, romidepsin, syklinen tetrapeptide luokan HDAC estäjä, metaboloituu pääasiassa CYP3A4- [22]. Siksi me arveltu, että glukuronidaatio olisi ensisijainen koulutusjakson aineenvaihduntaa belinostat. Lisäksi monet glukuronosyylitransferaasin isoformit ovat erittäin polymorfisia, ja vaikutusten funktio, esimerkiksi homotsygoottinen deleetio UGT2B17 alleelien (UGT2B17 * 2) johtaa viallisen aineenvaihdunnan vorinostat [23]. Näin ollen olisi tärkeää tunnistaa päähuumausaineen metaboloivien isoformin belinostat, ymmärtää paremmin vaikutuksen Farmakogenetiikan annetun välisen vaihtelun ollessa belinostat farmakodynamiikalla. Se antaa myös ohjeita edelleen lääkeinteraktiotutkimuksia.

Tässä tutkimuksessa tutkimme farmakokinetiikkaa belinostat ja tunnistaa sen aineenvaihduntatuotteiden perustuu massaspektrit ja maksimi UV imeytymistä. Olemme tunnistaneet hallitseva metaboliitti belinostat kuin belinostat glukuronidin, ja edelleen tutkittiin glukuronisaatiota belinostat käyttäen paneelia UGT isoentsyymien ja ihmisen maksan mikrosomeissa määrittää tärkeimmät isoformin vastuussa sen aineenvaihduntaa. Lopuksi mahdollisia farmakogeneettisten vaikutus farmakodynamiikkaan belinostat tutkittiin.

Materiaalit ja menetelmät

Protokolla tälle kokeelle on saatavana tukevat tiedot; katso pöytäkirja S1.

reagenssit

Belinostat (PXD101) oli lahja National Cancer Institute (Bethesda, MD, USA). Belinostat glukuronidi (belinostat-G) erotettiin kromatografisesti HPLC-UV ja eristetty ihmisen plasmasta käyttäen fraktiokeräimellä. Sen kemiallinen rakenne ja puhtaus on varmistettu kautta LC-MS /MS (API 4000 triple-kvadrupolimassa- spektrometri, AB Sciex, Concord, Kanada) ja HPLC-UV-analyysi. Vorinostat glukuronidi (vorinostat-G), sisäisen standardin, oli lahja Merck Sharp Dohme (IA) Corp. asetonitriiliä (HPLC-laatu), metanolia (HPLC-laatu), etanolia (analyyttinen laatu), muurahaishappoa (analyyttinen laatu), di-natrium faattidihydraatin (Na

2HPO

4.2H

2O) ja ortofosforihappoa (85%) saatiin Merck (Darmstadt, Saksa). Suora-QTM vettä (Millipore Milford, MA, USA) käytettiin liikkuvana faasina valmistamiseksi. Ihmisen UGT supersomien ja UGT reaktio-Solutions A ja B ostettiin BD Gentest (San Jose, CA, USA). Nämä ovat cDNA ilmaisivat UGT ja paneeli 12 (UGT1A1-, UGT1A3, UGT1A4, UGT1A6, UGT1A7, UGT1A8, UGT1A9, UGT1A10, UGT2B4-, UGT2B7, UGT2B15, UGT2B17) käytettiin.

Human Liver mikrosomipreparaatteja valmistelu

Ihmisen maksa 37 normaalista valkoihoinen luovuttajien käsiteltiin tohtori Mary Relling laboratoriossa St. Jude Lasten Research Hospital (Memphis, TN, USA) ja toimitti maksakudosta hankinta ja Distribution System (rahoittama # N01- DK-9-2310) ja osuuskunnan Human Tissue Network. 37 ihmisen maksan mikrosomeja (HLM) eristettiin eri maksan näytteestä ilman korrelaatiota keskenään. Mikrosomeja valmistettiin erotussentrifugoinnilla.

Tutkimus Kohorteissa

Tämä monikeskustutkimus vaiheen I tutkimuksessa belinostat tehtiin Hongkongissa ja Singaporessa. Kaikki potilaat toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen mukaan Good Clinical Practice suuntaviivat, ja protokolla hyväksyi institutionaalisten tarkastuslautakunta Prince of Wales sairaalan, Hong Kong ja National University Hospital, Singapore. Seitsemäntoista potilasta hoidettiin belinostat at nousevia annoksia 600 (n = 3), 900 (n = 3), 1200 (n = 6), 1400 (n = 5) mg /m

2 vuorokaudessa laskimoon (iv) infuusiona 30 minuutin aikana 5 päivän välein 21 päivän ajan.

Farmakokinetiikka Assessment

Verinäytteitä kerättiin ennalta näytteenotto- ajankohtina 1. päivänä ennen annosta, 15 min, 30 min, 45 min, 1 tunti (h), 1,5 h, 2 h, 3 h, 5 h ja 24 h postinfusion ja päivä 5 ennen annosta, 30 min, 1 h, 1,5 h, 3 h, 5 h postinfusion ja päivänä 22 sen jälkeen, kun alusta 30 min iv infuusiona vaiheen I kliinisen tutkimuksen of belinostat. Laskimoverinäytteet oli kerätty heparinisoituihin putkiin. Kerätyn veren näytteitä sentrifugoitiin 3000 g: llä 10-15 minuutin ajan, ja plasman (supernatantti) erotettiin solupelletti ja tallennetaan yksinkertaiset putket -80 ° C: ssa kunnes analyysi. Pitoisuudet belinostat ja belinostat glukuronidin kvantitoitiin modifioitu korkean erotuskyvyn nestekromatografia /massaspektrometria menetelmä [24]. Lyhyesti, vorinostat-G käytettiin sisäisenä standardina belinostat-G. Massaspektrometriin toimi positiivisionisella tilassa optimaalinen massa siirtymät belinostat-G:

m /z

495 93 ja vorinostat-G:

m /z

441 232, vastaavasti . Analyyttinen menetelmä on hyvin varmennettu hyvä lineaarisuus (determinaatiokerroin, r

2≥0.999) on alueella 1-100 uM belinostat-G.

tunnistaminen Belinostat metaboliitteja ja eristäminen Belinostat- G

Metabolinen seulonta potilasnäytteissä käsittelyssä oli HPLC-UV aallonpituudella 268 nm, Absorptiomaksimi aallonpituus belinostat. Lähtötilanteessa erottaminen kaikkien analyyttien saatiin aikaan Alltima C

18 (150 mm x 2,1 mm, 5 um) läpi. Liikkuva faasi liuotin A oli 20 mM Na

2HPO

4 (pH 4,2, oikaistuna ortofosforihappoa), kun taas liikkuva faasi liuotin B koostui 70% asetonitriiliä ja 30% metanolia (v /v). Gradientti liikkuva faasi ohjelman avulla – alkuperäinen prosentuaalinen liuotinta A oli 75% (v /v), ja että liuotin B oli 25% (v /v); prosenttiosuus liuotinta B nostettiin 95% (v /v) yli 13 minuutin ajan ja välittömästi pois takaisin 25% (v /v) 7 min ennen injektiota myöhemmän näytteen. Yhteensä ajoaika kustakin näytteestä oli 25 min. Virtausnopeus pidettiin arvossa 0,5 ml /min.

Mahdollinen belinostat metaboliittia edelleen varmennetaan tandem massaspektrometriä Q1, tuotteiden ja edeltäjä skannaa. Eristäminen ja puhdistaminen päämetaboliitti belinostat suoritettiin Nova-Pak 3,9 x 300 mm: n C18-kolonnia (Waters, Irlanti), käyttäen 20 mM ammoniumasetaattia (pH 5,0) ja 100% metanolia ensimmäisen liikkuvan faasin koostumus 60% :40% (v /v) virtausnopeudella 0,6 ml /min. Metanolia lisättiin 95% 10 minuutin aikana ja välittömästi pois takaisin 40%: ssa 6 minuutin ajan ennen seuraavaa injektiota. p-glukuronidaasi hydrolyysi ja massaspektrometrian (sekä positiivisia että negatiivisia mode) puhtauden varmistamiseksi ja identiteetin päämetaboliitti.

Hapan Stability Testi Belinostat-G

1 mg /ml belinostat -G ja vorinostat-G valmistettiin erilaisissa ajoneuvoissa erilaisilla pH-arvoilla. Nämä ajoneuvot oli 10 mM ammoniumasetaatti (pH = 6,5), 10 mM ammoniumformiaattia (pH = 6,0), 0,1% etikkahappoa (pH = 3,2) ja 0,1% muurahaishappoa (pH = 2,6). Kaikki nämä testit näytteitä inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 tuntia. Milli Q vedellä (pH = 5,5) käytettiin kontrolliliuosta, joka oli varastoitu -20 ° C: ssa. Kaikki näytteet analysoitiin LC-MS /MS saada arvot huippujen pinta belinostat-G ja vorinostat-G. Hapan vakaus molempien konjugoitujen yhdisteiden arvioitiin vertaamalla piikkien pinta-alojen suhde on testinäytteiden verrokkiin nähden.

In vitro

Teho Arviointi Belinostat ja Belinostat-G

määrittämään läsnäolo tai puuttuminen annoksesta riippuvainen aktiivisuus belinostat ja belinostat-G vastaan ​​hepatosellulaarisen syöpäsoluja, ihmisen hepatosellulaarinen maksan karsinooma (HepG2) soluja siirrostettiin kaksi 24-kuoppalevyille 10000 solua per kuoppa. Yksi levy, 5 eri pitoisuuksia belinostat lisättiin, jolloin saatiin 2 rinnakkaista per pitoisuus (0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10 uM). Jotta toinen levy, yhtäläiset moolipitoisuuksien belinostat-G lisättiin samalla tavalla. 72 tunnin jälkeen solut värjättiin Katkero Violet maali (0,5% w /v, kp) ja arvioitiin elinkelpoisuuden. Lisäksi herkkyyttä HepG2 ja belinostat ja belinostat-G kvantitatiivisesti mitattiin käyttäen MTS-määritystä. Lyhyesti, HepG2-solut siemennettiin 96-kuoppalevyille 3000 solua /kuoppa, käsiteltiin seitsemän eri annoksilla belinostat tai belinostat-G ja arvioidaan sitten kasvun inhibitio Promega CellTiter 96® AQ

ueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay . Kun oli inkuboitu 24 h, 100 ui lääkeliuosta tai tyhjä väliainetta lisättiin kuhunkin kuoppaan 96-kuoppalevyillä. 72 tuntia myöhemmin, 20 ui MTS /PES lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 3 tunnin ajan. OD-arvot mitataan aallonpituudella 490 nm. Solujen kasvun esto laskettiin luminoiva yksiköiden vähennetty tausta käsittelyssä vain alustassa, joka sisältää kuoppiin. Kasvu esto määriteltiin prosentteina keskimääräisestä luminescent yksiköt lääkkeellä käsiteltyihin kuoppiin yli että kontrollista kaivoista ilman hoitoa. Koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena. IC

50-arvot laskettiin käyttäen GraphPad PRISM ohjelmistoa (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA).

Western-blottaus

western blot analyysiä, HepG2 solut käsiteltiin jossa belinostat kerättiin ja lyysattiin solujen hajoamisen, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) ja proteaasiestäjäseostabletit (Roche). Proteiinikonsentraatiot kvantitoitiin käyttäen Bradfordin menetelmällä (Invitrogen). Proteiinit erotettiin 12% SDS-PAGE-geelissä ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille. Epäspesifinen proteiiniin sitoutuminen estettiin inkuboimalla 5% rasvatonta maitoa (BioRad Laboratories) 0,1% PBS-Tween (PBST) huoneenlämmössä 1 h ja inkuboidaan spesifisten vasta-aineiden, Histone H3 ja Ac-H3 [K9 /K14] (Cell Signaling), 4 ° C: ssa yön yli. Asianmukaisia ​​lajispesifinen piparjuuren peroxidises-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineet lisättiin sitten, ja inkuboitiin huoneenlämmössä 1 h, mitä seurasi havaitseminen käyttämällä tehostettua kemiluminesenssi- kittiä (GE Healthcare).

seulonta 12 Ihmisen UGT supersomien ja Kinetic Analysis

tyypillinen inkuboinnin koostui 50 ug UGT, 2 mM UDPGA (UGT reaktio liuos A), 50 mM Tris-HCI: ää, 8 mM MgCI

2 ja 0,025 mg /ml alamethicin (UGT reaktio liuos B) lopullinen inkubointitilavuus on 100 ui. Ennen substraatin lisäystä, inkubaatio seos esilämmitetty ja tasapainotettiin 5 min ajan 37 ° C: ssa. Reaktiot aloitettiin lisäämällä 10 uM belinostat liuosta DMSO: ssa, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 min; reaktiot lopetettiin lisäämällä 200 ui jääkylmää metanolia ja vorteksoimalla. Inkubaation seosta vorteksoitiin ja sentrifugoitiin (10060

g

) 4 ° C: ssa 10 minuutin ajan, ja supernatantit analysoitiin. Hyönteisten mikrosomeja ilman UGT cDNA toimi negatiivisena kontrollina. Kineettinen parametrit (

K

m ja

V

max) belinostat glukuronidaation UGT1A1- supersomien määritettiin käyttäen substraattia pitoisuuksia 10-750 uM. Inkuboinnit suoritettiin kuten edellä on kuvattu. Kolmen erillisen kokeen tehtiin kineettinen analyysi.

korrelaatiotutkimuksen kanssa UGT1A1- Pohjat, UGT1A1 Gene Expression ja UGT1A1 * 28 polymorfismi

korrelaatiotutkimuksessa Glukuronidaation of belinostat ja UGT1A1- alustoille, belinostat glukuronidaation oli mitattuna kuten edellä on kuvattu, käyttämällä 100 uM belinostat ja 50 ug HLM; tämä pitoisuus belinostat valittiin, koska se on lähellä Km UGT1A1-. Glukuronidaatiota bilirubiinin, tyroksiinin ja SN-38 näissä mikrosomeissa mittaus UGT1A1 geenien ilmentyminen ja genotyyppaus varten UGT1A1 * 28 on kuvattu aiemmin [25] – [27].

Data Analysis

Belinostat-G muodostumisen nopeus (

v

) laskettiin cm, 30 min /inkubaatioaika /CYP pitoisuus, jossa cm, 30 min oli metaboliittipitoisuus 30 min inkubaation jälkeen. Tontit substraattikonsentraation, S (X-akseli) vs.

v

(Y-akseli) on sitten rakennettiin. Km ja Vmax laskettiin käyttäen Michaelis-Menten-yhtälöön (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA). (1) B

Association between belinostat glukuronidi pitoisuuden ja UGT1A1- substraattien suoritettiin käyttäen sekä Pearsonin korrelaatiota ja Spearmanin korrelaatio testit (GraphPad Prism-ohjelmisto, La Jolla, CA). Farmakokineettiset parametrit arvioitiin perustuvat ei-analyysillä mallia käyttäen WinNonlin ohjelmistoversio 5,3 (Pharmsight, Sunnyvale, CA, USA). Suhteellinen altistuminen belinostat-G potilaiden plasman edusti moolikonsentraatiota AUC suhde belinostat-G yli belinostat. Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) käytettiin määrittämään merkitys joukossa genotyyppien kanssa Tukey posthoc testit säätö vertailu yksittäisten ryhmien. Arvoa p 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Farmakokinetiikka ja metabolia Belinostat Human Plasma

pitoisuudet belinostat ja belinostat-G 17 potilaalta kirjoilla vaiheen I kliinisen tutkimuksen maksasolukarsinoomassa (HCC) kvantitoitiin arvioimiseksi farmakokineettisten parametrien (taulukko 1). Belinostat seurasi lineaarista farmakokinetiikkaa annosalueella 600-1400 mg /m

2, suurempia välisen vaihtelun tila suuremmilla annoksilla. Variaatiokertoi- vaarattomuusilmoitus (CL) oli 29,0% ja 30,6% 1200 ja 1400 mg /m

2, vastaavasti. Belinostat poistettiin nopeasti sen jälkeen, kun i.v. hallinnon takia intensiivisen vaiheen glukuronidikonjugaatio M1 (kuva 1).

Kromatogrammi 5. päivänä ja päivä 22 (A); day1 (B).

Viisi aineenvaihduntatuotteiden belinostat tunnistettiin vertaamalla ultravioletti (UV) imeytyminen plasmanäytteiden aallonpituudella 268 nm ennen ja jälkeen annostuksen. Samanlaisia ​​kromatogrammi profiilit havaittiin päivänä 1 (kuvio 1 B) ja päivänä 5 (kuvio 1A). MS /MS tuoteionia Näiden viiden aineenvaihduntatuotteiden seurataan positiivinen toiminto tuetaan niiden kemiallisen rakenteen tunnistaminen (taulukko 2). Glukuronidaatio oli merkittävin polun belinostat aineenvaihduntaa; kaksi vaihtoehtoista biotransformaatioreittejä mukana metylaatio metyyli belinostat ja vähentäminen hydroksiamidihapon ryhmän sitä vastaavaan belinostat amidi. Belinostat happo ja belinostat glucoside olivat 2 muuta metaboliittia havaittu. Ehdotettu metaboloitumisreitin belinostat on merkitty kuvioon 2. kemialliset rakenteet näiden metaboliittien ehdotti perustuvat heidän protonoidut molekyyli massa piikkejä [M + H]

+, 2-kertainen molekyylin massa piikkejä [2M + H]

+ ja massa pirstoutumista profilointi tuottaman tuotteen scan. Nämä rakenteet varmistettiin vielä analyysillä pirstoutumisen ionien esiasteen ioneja, mikä paljasti yhteisen tuoteioniparien (m /z 93, fenyyliamino fragmentti) on belinostat ja sen viisi aineenvaihduntatuotteiden. Perustuen metaboliitin rakenteiden hydroksamidi osa on keskeinen rakenne teho belinostat. Skannaus m /z spektrejä potilaiden plasmassa tuettu glukuronidaatiota belinostat detektoimalla 495, 989, 493, jotka edustavat protonoidut belinostat G, protonoidut kaksinkertainen belinostat G, ja deprotonoidaan belinostat G, vastaavasti. Kemiallinen rakenne belinostat-G eristetty plasma selvitetty massaspektrometrialla. Sarja massaspektrit belinostat-G hankittiin ehdottaa kemiallista rakennetta. Esimerkiksi m /z 495 ja m /z 989 tunnistettiin sen protonoitu molekyyli massa piikkejä [M + H]

+ ja 2-kertainen molekyylin massa piikkejä [2M + H]

+, vastaavasti. Skannaus negatiivina havaita sen vastaavan deprotonoiduilla emäioni kuin m /z 493 [M-H]

-. Samanlainen massa pirstoutuminen profiloinnin positiivinen toiminto todettiin sekä belinostat ja belinostat-G. Perustuen yhteiseen tuoteioniparien (fenyyliamino fragmentti), edeltäjä ioni skannauksen m /z 93, oli käsitelty belinostat ja belinostat-G ammentavat emoionien kun m /z 319 [M + H]

+ varten belinostat ja m /z 495 [m + H]

+ for belinostat-G, vastaavasti. Olettaen tämä oli oikea, kemiallisia rakenteita sen aineenvaihduntatuotteiden voidaan odottaa olevan samanlaisia ​​UV-spektri näiden aineenvaihduntatuotteiden ja sen lähtöaineen sekä johtuen samankaltaisuudesta niiden perus molekyylirakenteiden, ja tämä tukivat UV spektrianalyysi tuottama diodirividetektori (DAD) osoittavat samanlaisia ​​maksimi aallonpituudella 268 nm belinostat ja sen viisi aineenvaihduntatuotteiden.

päämetaboliitti tunnistettiin belinostat-G, mikä vahvistettiin edelleen läpi entsyymihydrolyysin reaktion. Eristetty belinostat-G: potilaan plasmanäytteistä saatettiin

Escherichia coli-

johdettu β-glukuronidaasi- (6,8 mg /ml) inkuboitiin 5 h, ja saatu reaktioseos analysoitiin LC-MS /MS: llä. Määrällinen farmakokineettinen analyysi osoitti, että belinostat-G altistus oli 4-kertainen korkeampi kuin belinostat ihmisen plasmassa, joka perustuu molaarinen konsentraatio AUC suhde belinostat-G /belinostat (taulukko 1). Siksi belinostat glukuronidaation vahvistettiin hallitseva metaboliareitti belinostat.

Stability of Belinostat-G happamassa ympäristössä

edelleen karakterisoimiseksi glukuronisaatiota belinostat testasimme hapan vakaus belinostat -G. Belinostat-G ja vorinostat-G, rinnakkainen ohjaus belinostat-G, osoitettiin olevan stabiileja, kun oli inkuboitu 24 tuntia 37 ° C: ssa eri happamissa liuoksissa (pH 2.6- pH 6,5). Vaihtelu mitatut pitoisuudet alussa kokeen ja 24 tunnin kuluttua oli hyvin marginaalinen ( 4%). Tämä on sopusoinnussa myös ehdotettu O-konjugoitu rakenne belinostat-G (M1) on esitetty kuviossa 2. Kuitenkin, vähäinen hajoaminen (7%) havaittiin vain silloin, kun pH-arvo oli laskenut 2,6. Tulokset vahvistivat belinostat konjugoidaan glukuronidiksi at O-asentoon, kuten O-glukuronidia mutta ei N-glukuronideja Hydroksiamidihapot ovat stabiileja happamassa ympäristössä [28], [29]. Kuten vorinostat-G on vahvistettu olevan O-konjugoitua glukuronidia [30], se osoittaa, että eristetty belinostat-G on O-konjugoitu metaboliitin samoin.

määritys

In vitro

Sytotoksisuus vaikutukset Belinostat ja Belinostat-G

Kuvio 3a ja 3b esittävät tulokset annos-kasvavia pitoisuuksia belinostat ja belinostat-G suoritettiin erillisellä 24-kuoppaisille levyille inkuboinnin jälkeen 72 tuntia. Kuten belinostat pitoisuus kasvoi, elinkykyisten solujen lukumäärä (värjätty violetti) osoitti annoksesta riippuvaa vähenemistä. Toisaalta, kasvavia pitoisuuksia belinostat-G ei näytä vaikuttavan solun elinkykyä pitoisuusalueella testattu. Siten, että niiden ekvimolaarinen konsentraatio on välillä 0-10 uM, belinostat osoittaa merkittävää annoksesta riippuva sytotoksisuus, kun belinostat-G ei. Lisäksi tulokset MTS määrityksissä olivat myös yhdenmukaisia ​​kuin fluoresenssi (kuvio 3c). Histoni H3 asetylointi varten belinostat altistumisen osoittanut aika ja pitoisuus riippuvainen kasvu (kuvio 3d).

a: belinostat inkubointi; b: belinostat-G inkubointi; (Malleja pitoisuuksien lisätty (alempi) ja tulokset 24 hyvin annoksesta kasvavia pitoisuuksia HepG2 solut (ylempi). C: MTS tulokset belinostat (IC

50 = 6,4 uM) ja belinostat-G (ei voi lähentyneet) . d: Belinostat asetylointi aktiivisuus HepG2-soluissa (western blot). V: asetyyli histoni 3 lisääntynyt Annoslisäys kuluttua 5 h inkuboinnin; B: Kinetic muutokset asetyyli histoni 3 ajan lisäys 10 uM.

In vitro

Metabolism seulonta UGT varten belinostat-G muodostaminen ja Enzyme Kinetics

UGT1A1- glukuronidoitua belinostat merkittävästi (kuvio 4A), kun taas mitään metaboliaa havaittiin inkubaation jälkeen UGT1A4, UGT1A6, UGT1A7 , UGT1A9-, UGT1A10, UGT2B15 ja UGT2B17. Minor aineenvaihduntaa (alle 3%), havaittiin UGT1A3, UGT1A8, UGT2B4- ja UGT2B7. 73,6% ja 89,4% ja belinostat muutettiin belinostat-G 2 h ja 4 h inkuboinnin UGT1A1, vastaavasti (kuva 4B). Entsyymi kineettiset parametrit glukuronisaatiota belinostat arvioitiin sovittamalla yhdistettyjen tulosten perusteella UGT1A1- inkuboinnit suoritettiin kolminkertaisesti Michaelis-Menten yhtälö. Näennäinen Km ja Vmax-arvot glukuronidi muodostuminen oli 99,6 uM ja 353,1 pmol /min /mg proteiinia, vastaavasti (kuvio 5). Luontainen puhdistuma (Vmax /Km) muodostamiseksi belinostat-G arvioitiin olevan 3,5 ul /min /mg proteiinia. Vuonna ohjaus hyönteinen mikrosomeja, ei belinostat-G muodostusta ei havaittu.

näennäinen Km ja Vmax-arvot glukuronidi muodostumista olivat 99,6 uM ja 353,1 pmol /min /mg proteiinia, vastaavasti.

korrelaatio glukuronidaatio of Belinostat kanssa UGT Alustat

ihmisen maksan mikrosomeissa yhdistyksen välillä glukuronisaatiota belinostat ja UGT substraatteja testattiin käyttämällä muuttujien (henkilön korrelaatio) ja ei-parametrinen (Spearmanin korrelaatio) testejä. Belinostat-G muodostuminen korreloi voimakkaasti bilirubiinin glukuronidi- muodostumiseen (kuvio 6A) (Pearson r

2 = 0,53; Spearman r

2 = 0,61 p 0,0001) ja muut vakiintuneet substraatteja UGT1A1 kuten tyroksiinin ja SN38 (Pearson r

2 = 0,68; Spearman r

2 = 0,81 ja Pearson r

2 = 0,82; Spearman r

2 = 0,62, vastaavasti, kaikki p 0,001) (kuvio 6B, ja 6C). Belinostat-G pitoisuuksien kanssa inkuboinnin jälkeen HLM korreloi hyvin UGT1A1- mRNA: n ekspression (Pearson, r

2 = 0,66, p 0,0001, kuvio 7A). Yhdessä nämä viittaavat siihen, että UGT1A1 on hallitseva UGT isoformi belinostat glukuronidaatiota.

V: Bilirubiini-G; B: tyroksiinia 4-G /CPT-11; C: SN38-G /CPT11.

V: Korrelaatio belinostat glukuronidi muodostumisen UGT1A1- ilme ihmisen maksan mikrosomeissa; B: Belinostat glukuronidi muodostuminen ihmisen maksan mikrosomeja mukaan villityypin heterotsygoottista ja homotsygoottinen UGT1A1 * 28 genotyyppejä.

UGT1A1 genotyypin ja glukuronidaatiota Belinostat ihmisen maksan mikrosomeissa ja Korrelaatio UGT1A1- Gene Expression

UGT1A1 on polymorfinen entsyymi alleeliset variantit, jotka vaikuttavat sen entsymaattinen aktiivisuus. UGT1A1 * 28 on usein polymorfismi, joka vähentää glukuronidaatiota aktiivisuutta. Siksi määrittää vaikutus UGT1A1- * 28 muodostumiseen belinostat-G, mittasimme belinostat-G pitoisuudet inkuboinnin jälkeen belinostat kunkin 37 HLM näytteiden aiemmin genotyypitettiin

UGT1A1- * 28

. 30-min jälkeisen inkubaation belinostat-G pitoisuudet (keskiarvo ± SD) oli 15,39 ± 6,00, 11,35 ± 4,11 ja 7,14 ± 3,28 umol varten UGT1A1 * 1 homotsygoottinen, UGT1A1 * 28 heterotsygoottinen ja homotsygoottinen mikrosomeissa vastaavasti. Yksisuuntainen ANOVA-analyysi osoitti, että merkitsevää eroa ryhmien välillä ei havaittu (p = 0,01). Tukey posthoc analyysi viittasi siihen, että vain ero UGT1A1- * 1 ja UGT1A1- * 28 homotsygoottista mikrosomeissa oli tilastollisesti merkitsevä. Kuten kuviossa 7B, UGT1A1 * 1 homotsygoottinen mikrosomeissa oli 2 kertaa suurempi tarkoittaa belinostat-G pitoisuudet verrattuna UGT1A1 * 28 homotsygoottista mikrosomeja inkuboinnin jälkeen (

p

0,001).

Keskustelu

Tietääksemme tämä on ensimmäinen raportti, jossa kuvataan glukuronisaatiota belinostat. Olemme osoittaneet, että belinostat metaboloituu läpi glukuronidaatiota esiintyvät hydroksamaatti-osan, joka johtaa inaktivointi sen sytotoksisuuden. Tämä on johdonmukaista muun hydroksamaatti luokan HDAC-inhibiittorit sekä, jos glukuronisaatio on merkittävä rooli niiden aineenvaihduntaan. Aineenvaihduntatuotteen profilointi inkubaation jälkeen paneelin supersomien yli-ilmentävät tiettyjä UGT-isoformit, korrelaatio glukuronidaatiota hinnat tunnettujen UGT1A1- substraattien käytettiin ihmisen maksan mikrosomeja, ja analyysi massaspektrometrillä profiilia belinostat kohortin maksasyöpäpotilailla esittänyt todisteita siitä, että belinostat glukuronidaatiota

in vitro

ja

in vivo

välittyy pääasiassa UGT1A1. Mielenkiintoista, entsyymi isoformi, joka ensisijaisesti aineenvaihdunta toinen hydroksaamihappohartsi- perustuu HDAC estäjä vorinostat

in vivo

on UGT2B17, kun taas belinostat metaboloi UGT1A1, joka on runsaampaa isoformi ihmisen maksassa [31]. UGT1A1 on läsnä ruoansulatuskanavassa, mikä todennäköisesti vähentää suun imeytymistä belinostat, ja vähentävän hyötyosuutta [32]. Lisäksi korkea hyötysuhde UGT1A1- varten metabolisoivien belinostat todennäköisesti edelleen vähentämään oraalista hyötyosuutta läpi laajan ensikierron metabolia, poseeraa haaste kehittämiseen suun belinostat.

HDAC-inhibiittorit, jotka ovat kliinisessä kehittämisessä on potentiaalia vakavia sivuvaikutuksia. Jotkin luokan liittyvät vaikutuksia ovat trombosytopenia, pitkittynyt QT on EKG, voimakas väsymys ja mahasuolikanavan haittavaikutusten, ja nämä näyttävät olevan annoksesta riippuvainen. Belinostat on liittynyt väsymystä, ripulia ja QT-ajan pidentymistä vaiheen I ja II tutkimuksissa [11], [33]. Ottaen huomioon kapea terapeuttinen, on tärkeää määritellä tekijät, kuten farmakogenetiikassa of belinostat jotka muodostavat välinen vaihtelu sen farmakokinetiikkaa. Olemme aiemmin osoittaneet, että potilailla, joilla poistetaan UGT2B17 alleelien on alhaisempi vorinostat-glukuronidi ja vorinostat area under the curve suhde ja suurempi sivuvaikutuksia [20]. Näin ollen olisi tärkeää ymmärtää laajuuden välinen vaihtelu on belinostat farmakokinetiikkaa ja farmakodynamiikkaa johtuvat polymorfisen ilmentymisen UGT1A1-. Tutkimuksemme ihmisen maksan mikrosomeissa on ensimmäinen askel tähän suuntaan.

UGT1A1 * 28 on geneettistä vaihtelua on promoottorialue, jossa ylimääräinen TA toista on läsnä TATA joka on yleensä 6 TA toistaa, ja aiheuttaa alentuneen ekspression UGT1A1- [34]. Ihmisen maksan mikrosomeissa, glukuronidaatiota SN-38, aktiivisen metaboliitin irinotekaanin, on tehottomampi mikrosomeissa kätkeminen UGT1A1 * 28 villityyppiin verrattuna genotyypin [25]. Yhtäpitävästi, yksilöiden yhden tai useamman UGT1A1- * 28-alleelien kokea suurempi riski neutropenian alkaen irinotekaanin hoitoa suurempia annoksia 250 mg /m

2 [35], [36]. Tämä polymorfismi on myös yleisempää valkoihoiset kuin aasialaiset, joiden alleelifrekvenssi noin 30% valkoihoisilla ja 10% aasialaisilla [37]. Tuloksemme osoittavat, että UGT1A1 * 28 liittyy alentunut belinostat glukuronidaation, mikä viittaa siihen, että potilailla, joilla on tämä genotyyppi voi mahdollisesti olla suurempi altistus aktiiviseen belinostat johtuvat heikentyneestä puhdistumaan belinostat. Vaikka kliinisiä seurauksia tämän korkeamman altistus suositellulla annoksella belinostat ei toistaiseksi tunneta, korkeampi toksisia belinostat odotetaan. Jos tämä on todistettu, UGT1A1 genotyypitys ennen belinostat hoito, kuten on tällä hetkellä saatavilla irinotekaanin, on tapa yksilöidä terapia.

Onko UGT1A1 * 28 vaikutteita farmakokinetiikkaa ja ratkaisevasti farmakodynamiikkaan belinostat potilaille jää olla tutkittu;