Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

transkriptiotekijä PAX6 ensisijaisesti ilmaistaan ​​alkioiden . PAX6 on myös ilmaistu useissa kasvaimissa ja sillä onkogeenisessä rooli. Kuitenkin tiedetään vähän rooli PAX6 keuhkosyövässä.

Methods

toiminta PAX6 keuhkosyövän solut arvioitiin pieniä häiritseviä RNA-välitteinen väheneminen proteiinin, jota seuraa analyysit solujen lisääntymisen ankkurista riippumaton kasvu, ja solusyklin pysähtymisen. Muutokset sykliini D1, pRB, ERK1 /2, p38 ilmaus aiheuttama PAX6 eston havaittiin käyttämällä western-blottauksella. PAX6 mRNA tasolla 52 paria kasvaimia ja vastaavien sovitettu viereisten normaaleissa kudoksissa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä potilaat ja keuhkosyövän solulinjat havaittiin reaaliaikainen PCR.

Tulokset

Suppression of PAX6 ilmaisun esti solujen kasvua ja pesäkkeiden muodostumista A549 ja H1299 soluja. Prosenttiosuus soluja G1-vaiheessa lisääntyi, kun PAX6 ilmentyminen estyi. Sykliini D1 proteiini tasolla, samoin kuin pRB fosforylaation taso laski seurauksena PAX6 alassäätöä. Aktiivisuus ERK1 /2 ja p38 oli myös tukahdutettiin PAX6 knock-down soluissa. PAX6 mRNA ilmentyy suuresti keuhkosyöpää kudosta ja keuhkosyövän solulinjat. Useimmilla potilailla (noin 65%), suhteellinen suhde PAX6 mRNA ensisijainen NSCLC versus viereisten kudosten ylitti 100.

Johtopäätökset

tiedot sekaantunut että PAX6 kiihdyttää solusyklin etenemistä aktivoimalla MAPK signaali polku. PAX6 mRNA tasot olivat merkitsevästi koholla ensisijainen keuhkosyövän kudoksiin verrattuna niiden Hyväksytty viereisiin kudoksiin.

Citation: Zhao X, Yue W, Zhang L, Ma L, Jia W, Qian Z, et al. (2014) alassäätely PAX6 mukaan shRNA Estää leviämisen ja solusyklin etenemisen Ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Cell Lines. PLoS ONE 9 (1): e85738. doi: 10,1371 /journal.pone.0085738

editori: Christina Lynn Addison, Ottawa Hospital Research Institute, Kanada

vastaanotettu: 16 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 01 joulukuu 2013; Julkaistu: 15 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Zhao et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Beijing Novel Program avustus (nro 2006B34); Beijing Research Foundation for Erinomainen Talents (nro 20061D03); Beijing Viljely projekti Key teknis Medicine Tuote (nro Z101100055610030); tieteellinen tutkimus yhteinen ohjelma Pekingin Municipal komission of Education (nro KM201210025024). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Tuore katsaus maailmanlaajuisten syöpä tilastot osoittivat, että keuhkosyöpä oli yleisimmin diagnosoitu syöpä, samoin kuin suurin syy syövän kuolemaan [1]. Varhainen havaitseminen ja kohdennettu hoito on potentiaalinen menetelmä keuhkosyövän ehkäisyä ja hoitoa [2]. On tärkeää löytää jotka sellaisia ​​keinoja tai proteiinit ovat aktiivisia keuhko- syövän etenemistä [3]. Perusteella, että ”syöpä kantasolujen hypoteesi,” kasvainten ajatellaan olevan peräisin kudoksen läpi erityisiä kantasolujen ilmaisu [4] – [6]; toisin sanoen, kasvaimet ovat johtuvan kantasolutekijän yliekspressio [3], [5], [7]. Parilliset-box 6 (Pax6) on tärkeä transkriptiotekijä alkionkehityksen aikana ja kantasolujen tekijä [3]. Siten PAX6 voi olla tärkeä rooli kasvainten synnyssä.

PAX6 kuuluu PAX geeniperheen, joka koodaa yhdeksän ryhmä pariksi-box transkriptiotekijöiden kanssa tärkeä rooli kehityksen ja sairauksien [3]. PAX6 on tärkeä transkriptiotekijä kehittämisessä silmissä, haima, ja keskushermoston [3], [8]. PAX6 ekspressio on äskettäin löydetty kasvaimia, mikä viittaa siihen, onkogeeninen rooli [9]. PAX6 ilmaistaan ​​usein retinoblastooma, haiman kasvaimet, ja suoliston kasvaimet [6], [10], [11]. PAX6 on myös hyvin ilmaistaan ​​aivoissa ja rintasyövän solulinjat [9]. Haimakarsinooma- solulinjoissa, estyminen PAX6 ilmentymisen johtaa vähentää solujen kasvua ja selviytymistä [12]. PAX6 on myös säätelijä MET tyrosiinikinaasin reseptorin ilmentymisen haimakarsinooma- solulinjoissa [12]. MET on potentiaalinen biomarkkereiden ja terapeuttinen kohde kasvainten, joka vahvistaa kasvaimia synnyttävän roolia PAX6 kasvainten synnyssä [13].

Se oli aiemmin raportoitu, että PAX8 ja PAX5 ovat erittäin ilmaistaan ​​ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC ) ja pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjoissa, vastaavasti [14]; mutta hyvin vähän tiedetään PAX6 ilmentymistä ja toimintaa on keuhkosyöpä. Tässä tutkimuksessa tutkimme onko PAX6 säädellä solujen lisääntymisen NSCLC. Tuloksemme osoittavat, että PAX6 edistää G1-S etenemistä aktivoimalla MAPK signaalireitin. PAX6 mRNA ilmaistaan ​​usein keuhkosyöpään kudosta verrattuna vastaaviin viereiseen ei-kasvainkudoksessa. Tämä viittaa siihen, että PAX6 on uusia mahdollisuuksia tavoite keuhkosyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

RPMI 1640, naudan sikiön seerumia (FBS), ja Trizol-reagenssia ostettiin Invitrogen (Carlsbad, CA) ; M-MLV käänteiskopioinnin, CellTiter 96® vesipitoista ei-radioaktiivista soluproleferaatiomäärityksessä, oligo-dT, ja dNTP saatiin Promegalta (Madison, WI); SYBR® Green PCR Master seos Applied Biosystems (Carlsbad, CA); anti-PAX6 vasta-aineet hankittiin Abnova (Taibei, Taiwan), anti-pRB, -ERK1 /2, p38, -pERK, -pp38, -cyclin D1, ja -pRB (S780 fosforylaatio) vasta-aineet on saatu Abcam (Cambridge, England, UK); ja parannettu kemiluminesenssin (ECL) reagenssi saatiin Pierce (Rockford, IL). Propidiumjodidia (PI), RNaasi A, ja proteaasiestäjäseostabletit hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO).

Näytteet

Viisikymmentäkaksi NSCLC näytteet saatiin potilailta, joille suoritetaan kirurgisia resektiota Beijing Rinta sairaalassa. Ensisijainen keuhkosyöpää näytteitä ja Hyväksytty vieressä normaaleissa kudoksissa käytettiin.

Tutkimus ja yksilöiden käyttämistä tarkasteli ja hyväksynyt Tutkimusetiikka komitea Pekingissä Rinta sairaala, Capital Medical University (Peking, Kiina). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta. Kliiniset ominaisuudet potilaiden on lueteltu taulukossa 1.

Soluviljely

Ihmisen keuhkoadenokarsinooma solulinjat A549 ja NCI-H1299, ihmisen suuri keuhkosyövän solulinjoja NCI-H460 , pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjaa NCI-H446, ihmisen alkion keuhkojen fibroblastit (MRC-5) saatiin National Platform of Experimental Cell Resources Sci-Tech. Ihmisen suuret keuhkosyövän solulinjat, 95C, 95D ja 801D saatiin kasvaimen keskustasta Kiina Academy of Medical Sciences. Ihmisen keuhkojen Adenokarsinoomasolulinja A2 ja levyepiteelikarsinooma solulinjaa L eristettiin ja perustettiin meidän lab. Keuhkosyöpä solulinjoja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Gibco, Los Angeles, CA, USA). MRC-5 pidettiin MEM-EBSS täydennetty 10% FBS: ää.

rakentaminen PAX6 shRNA lentivirusvektorilla ja infektion soluihin

neljä RNA-interferenssi (RNAi) ehdokas kohdesekvenssien suunniteltiin perustuen ihmisen

pax6

mRNA-sekvenssin ja kloonattiin pGCSIL-GFP-vektorilla (GeneChem, Shanghai, Kiina). RNAi sekvenssi GAGTAGCGACTCCAGAAGT oli tehokkain on estää PAX6 mRNA H1299 ja A549-soluja, ja käytettiin seuraavissa kokeissa kaataa endogeenisen PAX6. Nonsilencing (NS) -pieni häiritsevä RNA (shRNA) (TTCTCCGAACGTGTCACGT) myös kloonattiin pGCSIL-GFP-vektorilla, ja käytettiin kontrollina (GeneChem). Yhdistelmä-DNA-virus on pakattu 293T-soluissa käyttäen Lentivector Expression System (GeneChem).

solujen infektio, H1299 ja A549-soluja aliviljeltiin 5000 solua /kuoppa 96-kuoppaisille viljelylevyille ja infektoitiin lentivirus-välitteisen pax6-shRNA tai NS-shRNA. GFP havaittiin, kautta fluoresenssimikroskopian (Nikon, Tokio, Japani) määrittämään infektion tehokkuus.

RNA: n eristys ja reaaliaikaisen PCR

Yhteensä RNA kudosten ja solujen eristettiin Trizol mukainen reagenssi valmistajan protokollaa. Kokonais-RNA: n konsentraatio lasketaan mittaamalla OD

260 ja näytteitä säilytettiin -80 ° C: ssa.

Kokonais-RNA (2 ug) käänteiskopioitu käyttämällä M-MLV-käänteistranskriptaasia mukainen kitti valmistajan protokollaa. CDNA (20 ng) sekoitettiin SYBR® Green Master Mix, ja geenit monistettiin sopivilla alukkeilla käyttäen reaaliaikaista PCR havaitsemisjärjestelmä (ABI7500, Life Technologies, Carlsbad, CA). Suhteellinen ekspressiotasot PAX6 mRNA laskettiin normalisointi on β-aktiini-mRNA: n tasolla. PCR-alukkeet olivat seuraavat: PAX6 eteenpäin, 5′-TTCAGCACCAGTGTCTACCA-3 ’; PAX6 käänteinen, 5’-GCTGTAGGTGTTTGTGAGGG-3 ’; β-aktiini eteenpäin, 5’-TTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3 ’; ja β-aktiini käänteinen, 5’-GCTGTCACCTTCACCGTTC – 3 ’.

Soluproliferaatiomääritys

lisääntymisen määritys suoritettiin käyttäen ei-radioaktiivisen proliferaatiomääritystä mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, 5000 solua /kuoppa siirrostettiin 96-kuoppaisille viljelylevyille RPMI 1640, joka sisälsi 10% FBS: ää. Soluja viljeltiin 5 päivää, ja sitten 20 ui 3- (4,5-dimetyyli-tiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4-sulfofenyyli) -2H-tetratsolium (MTS), lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 3 h 24 tunnin välein. Absorbanssi kirjattiin 490 nm: ssä, jossa on yleinen mikrolevylukijalla (Bio-Rad, Hercules, CA). Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SEM.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

Solut ympättiin kolmena rinnakkaisena 300 solua /kuoppa 6-kuoppaiselle levylle. Kun 7 päivän viljelyn jälkeen solut pestiin kahdesti NaCl (0,9%), värjättiin 2% gentiankasvia violetti 20 minuutin ajan, pestiin vedellä, ja kuivattiin ilmassa. Foci laskettiin mikroskoopilla. Kokeet toistettiin kolme kertaa, ja tulokset on esitetty keskiarvoina ± SEM.

Soft-agar-määritys

Cells (1000) ympättiin 6-kuoppaisille levyille 2 ml: ssa elatusainetta, joka sisälsi 0,3 % agar ja käytettiin päällekkäin 1,4 ml kerrokset kasvualustaa, joka sisälsi 0,6% agaria. Sen jälkeen kun 21 päivän viljelyn jälkeen pesäkkeet laskettiin. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SEM.

Solusyklianalyysiä

Solut kerättiin, pestiin kylmällä PBS: llä kaksi kertaa ja kiinnitetään 70% etanolilla -20 ° C: ssa yön yli. Sitten solut sentrifugoitiin (1500 rpm, 10 min) ja pestään kahdesti käyttäen fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS). Seuraavaksi solut suspensoitiin uudelleen 0,5 ml: aan PBS: ää, joka sisälsi 50 ug /ml RNaasi A: lla 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Sitten solut ladattiin 65 ug /ml PI: ssa 30 minuutin ajan pimeässä 4 ° C: ssa. Solujen prosenttiosuus eri vaiheissa solusyklin mitattiin virtaussytometrialla (Beijing määritys perinteisen kiinalaisen lääketieteen tutkimuslaitos). Kokeet toistettiin kolme kertaa. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SEM.

Western blotting

Solut hajotettiin trypsiinillä ja sentrifugoitiin. Solupelletti pestiin kahdesti PBS: llä. Seuraavaksi solut hajotettiin hajotuspuskuriin (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100, 0,1% SDS ja 1 x proteaasi-inhibiittoriseosta) jäillä 15 minuutin ajan ja sentrifugoitiin 12000 rpm: 20 min. Liukenematon materiaali poistettiin ja proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttämällä bikinkoniini- happoa kit. Western blot-analyysi, solulysaateista (30 ug /kuoppa) tehtiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle kalvoja. Membraanit inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla (anti-PAX6, -ERK1 /2, p38, -pERK, -pp38, -cyclin D1, RB: tai RB: S780 fosforylaatio) yön yli 4 ° C: ssa. Toissijainen vasta konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin käytettiin myöhemmin. Signaalit havaittiin käyttämällä ECL ja valotettiin Kodak X-OMAT elokuva. Tulokset skannattiin ja analysoitiin käyttäen Alpha View Analysis Tools.

Tilastollinen

Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Kautta reaaliaikaisen RT-PCR, MTS-määritys, pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa määrityksissä, solusyklin analyysi ja western-blot-määrityksessä vertailla keskenään avulla 2 ryhmää, tilastollisia eroja testattiin parittomia Student

t

-testaukset. Tilastollinen merkitsevyys testattiin käyttämällä SPSS Statistics, version 13.0. P 0,05 (*) katsottiin erilaiset; P 0,01 (**) pidettiin merkittävästi erilainen.

Tulokset

PAX6 mRNA: n ekspressio inhiboitui infektoidut solut PAX6 shRNA lentivirusvektori

PAX6 mRNA-ekspressiota määritettiin tässä tutkimuksessa. Kuten kuviossa 1A on esitetty, PAX6 oli hyvin ilmaistu suurin keuhkosyövän solulinjat. Sen sijaan, MRC-5, normaali ihmisen sikiön keuhkojen fibroblastisolulinja, ei ilmaista PAX6 (kuvio 1A).

A, Real-time PCR analyysi PAX6 mRNA: n ekspression taso H460, A2, 95C , 95D, H1299, H446, 801 D, A549, ja L keuhkosyöpä linjat, sekä normaalin ihmisen sikiön keuhkojen fibroblastisolulinjaa MRC-5. B, C, vahvistus PAX6 mRNA pudotus reaaliaikaisella RT-PCR-määritykset suoritettiin kokonais-RNA eristettiin A549 (B) ja H1299 (C) solut infektoitiin pax6-shRNA tai satunnainen shRNA. PAX6 mRNA: n ekspression tasojen A549 ja H1299-soluja mitattiin kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä. Y-akseli edustaa normalisoidun PAX6 mRNA: n ilmentymisen suhteen A549 (B) tai H1299 (C) solut. ** P 0,01. D, proteiini tasot PAX6 määritettiin western-blot ja GAPDH ekspressiotaso käytettiin kontrollina. Kvantifiointi tehtiin määrittämällä harmaa tason PAX6 proteiinia, joka normalisoitui vastaan ​​GAPDH tasoilla. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM riippumattomasta kokeesta (kertaa Kokeiden on lueteltu edellä histogrammeja). PAX6 ilmentyminen ilmeisesti heikentynyt A549 PAX6 KD ja H1299 PAX6 KD soluja.

Valaistaan ​​onko PAX6 ilme on vaikutusta kasvuun keuhkosyövän soluista, RNAi tuotettiin pax6 knock-down ( PAX6 KD) solulinjat. Valitsimme kaksi tavoitetta solulinjat: H1299, joka osoitti korkeita PAX6 ilmaisun, ja A549, jotka osoittivat alhaisia ​​ilmentymisen. Esillä olevassa tutkimuksessa, pGCSIL-pax6 shRNA-GFP infektoitiin H1299 ja A549-soluja. Solut infektoidaan myös pGCSIL-NS shRNA-GFP (PAX6 NS) negatiivisena kontrollina (NC). Voit selvittää toiminnan PAX6, H1299, H1299NC, A549 tai A549NC soluja käytettiin kontrolleina kaikissa määrityksissä.

PAX6 mRNA tasolla H1299 PAX6 KD ja A549 PAX6 KD solut määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä vahvistamaan, onko PAX6 ilmentyminen inhiboitui spesifisesti läpi RNAi A549 ja H1299 soluja. Kuten kuviossa 1B on esitetty, PAX6 ilmentyminen A549 PAX6 KD-solujen estyi 80-90% verrattuna infektoitujen solujen lentivirus-välitteisen NS-shRNA. Löysimme samankaltaisia ​​tuloksia H1299 PAX6 KD soluja. PAX6 mRNA: n ekspressio näissä soluissa oli myös esti 90-95% verrattuna NC soluihin (*

* P

0,01; kuvio 1 C).

PAX6 proteiinin ilmentymistä näissä soluissa oli havaitaan Western blottauksella. Kuten kuviossa 1D, PAX6 proteiinia H1299 PAX6 KD ja A549 PAX6 KD soluja ei havaita helposti, kun taas selvä PAX6 proteiini bändi näkyi valvonnassa soluissa.

inhibitio PAX6 ilmaisun johtaa laskuun soluproliferaatiota

PAX6 on kriittinen transkriptiotekijä, jolla on tärkeä rooli säätelyssä lisääntymisen ja erilaistumisen aikana ihmisen alkion kehitykseen [3]. Soluproliferaation määritys suoritettiin sen määrittämiseksi, onko PAX6 on rooli solun kasvuun. A549 PAX6 KD, H1299 PAX6 KD, ja valvonta-solut ympättiin 96-kuoppalevyille ja soluproliferaatiota aktiivisuus mitattiin käyttäen Cell Proliferation Assay kit. A549 ja H1299 solujen kasvua oli ilmeisesti tukahdutettiin, kun PAX6 ilmentyminen estyi RNAi (kuvio 2A ja B). Kuten kuviossa 2A ja B, lasku solujen kasvua aiheuttama inhibition PAX6 ilmentymisen H1299 oli paljon voimakkaampaa kuin että A549-soluja. Nämä eri tulokset voivat johtua eri PAX6 ekspressiotasot välillä H1299 ja A549-solut näytetään kuviossa 1A ja D.

A, -B, A549 PAX6 KD, H1299 PAX6 KD-soluja, ja valvonta-solut ympättiin 96-kuoppalevyille ja MTS-määritys suoritettiin. Absorbanssi 490 nm: ssä (y -akselilla) mitattiin 24 tunnin väliajoin, jopa 120 tuntia. C, D, Pesäkkeenmuodostusta tehokkuus A549 PAX6 KD, H1299 PAX6 KD soluja, ja valvonta soluja. Y-akseli edustaa normalisoidun pesäkkeiden muodostumisen määrä suhteessa A549 (C) tai H1299 (D) soluja. E, -F, Pehmeä -agaria määritys suoritettiin tutkimaan vaikutuksia PAX6 on tumorigeneesin in vitro. Y-akseli edustaa normalisoitu pehmeä -agaria pesäkkeiden muodostumisen nopeus suhteessa A549 (E) tai H1299 (F) solua. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM kolmesta erillisestä kokeesta. Aikoina kokeet näkyvät kaavion yläpuolella. * P 0,05, ** P 0,01.

Alennettu pesäkkeiden muodostumista ja pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen PAX6 KD soluissa

Pesäkkeenmuodostusta edustaa kontakti-inhibition menetys tai kyky ylläpitää solujen kasvua ja liikettä huolimatta kosketuksessa ympäröivien solujen. Sen selvittämiseksi, onko PAX6 voisi koituu kontakti-inhibition menetys, infektoidut solut pGCSIL-pax6 shRNA-GFP sekä niiden valvonta-solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja niitä viljeltiin 7 päivää. Sen jälkeen 2% gentiania violetti värjäys, pesäkkeitä, jotka sisältävät yli 50 solut laskettiin valomikroskoopilla. Kuten esitetty kuviossa 2C ja D, estyminen PAX6 ilmentymisen A549 ja H1299-solujen johti selvä väheneminen pesäkkeiden generoidaan verrattuna kontrollisoluihin (*

* P

0,01).

lisätutkimuksia toimintaa PAX6, pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen analysoitiin sen määrittämiseksi, PAX6 osaltaan kiinnittymisestä riippumaton pesäkkeenmuodostusta keuhkosyövän soluja. Määrä pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen laski A549 PAX6 KD ja H1299 PAX6 KD soluja verrattuna NC soluihin (*

* P

0,01,

* P

0,05; kuvio 2E ja F).

PAX6 ilmentyminen lisääntynyt solujen kasvua edistämällä nopeammin eteneminen S-vaiheen solusyklin

havaitsemiseksi vaikutus PAX6 solusyklin etenemisen, solusyklin etenemistä A549 PAX6 KD, H1299 PAX6 KD, A549 PAX6 NC, H1299 PAX6 NC, A549, ja H1299-solut analysoitiin virtaussytometrialla. Kuten esitetty kuviossa 3A, prosenttiosuus soluista tulevien S faasi väheni A549 PAX6 KD solulinja yhdessä kasvuun populaatiossa G0-G1 olevilla soluilla. Samanlainen tulos havaittiin H1299 PAX6 KD, H1299 PAX6 NC, ja H1299-soluja (kuvio 3B). Näissä kokeissa PAX6 ilmentyminen johti solujen kasvun indusoimalla solusyklin etenemisen.

A, B, Solusyklianalyysiä. Solut värjättiin propidiumjodidilla (PI) ja analysoitiin solusyklin vaiheessa jakelun. Histogrammi oli tilastotiedoista kolmesta itsenäisestä kokeellista rinnakkaista. * P 0,05, ** P 0,01.

Tässä tutkimuksessa ekspressiotaso sykliini D1, asiaa sykliini säätelevä G1-S eteneminen [15], [16], oli havaittu A549 PAX6 KD ja H1299 PAX6 KD soluja. Kuten kuviossa 4A, sykliini D1 ilmentyminen väheni A549 PAX6 KD solulinjoja kontrolliin verrattuna soluihin. Löysimme samanlainen tulos H1299 PAX6 KD-soluja (kuvio 4A). Toinen olennainen sykliini säännellä G1 /S eteneminen on sykliini E [17]. Olemme myös päättäneet, onko sykliini E säädeltiin PAX6 ilme. Tämän seurauksena sykliini E ekspressio ei vaikuttanut vakaa shRNA-välitteisen knockdovvn PAX6 keuhkosyövän soluja (tietoja ei esitetty). Tämä osoittaa, että PAX6 saattaa edistää solujen kasvua aiheuttamalla sykliini D1 ilmentymisen.

A, B, ilmentyminen sykliini D1, pRB ja fosforyloitu pRB A549 PAX6 KD, A549 NC, A549-solut sekä H1299 PAX6KD , H1299NC, H1299 solut määritettiin Western blotting. β-aktiinin ja GAPDH ekspressiotaso mitattiin sisäisen kuormituksen valvontaa vastaavasti. Sykliini D1 ja pRB tasot mitattiin harmaustason ja normalisoitiin sisäisen kuormituksen valvonta. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Times Kokeiden on lueteltu edellä histogrammeja. * P 0,05, ** P 0,01.

Suurin alustan sykliini D1-CDK4 /6-kompleksit on retinoblastoomaproteiinia (pRB) [18]. Näin ollen, pRB S780-proteiini fosforylaatio havaittiin myös Western-blottauksella (kuvio 4B). S780 fosforylaatio pRB todettu heikentyvän, kun PAX6 ilmentyminen inhiboitui A549-soluja. Samanlainen tulos saatiin, kun H1299 PAX6 KD-soluja käytettiin (kuvio 4B).

MAPK signaalireitin tukahdutettiin inhibitio PAX6

MAPK (mitogeeni aktivoitu proteiinikinaasi) reitti on sekaantunut säätelyyn G1 /S siirtymiä ja solujen mitoosin [19]. Tutkimuksessamme joitain keskeisiä säätelymolekyyleja MAPK reittejä tutkittiin Western blot -analyysiä käyttämällä. Kuten on esitetty kuviossa 5, fosforylaation tasot ERK1 /2: n ja p38 laskivat sekä A549 PAX6 KD ja H1299 PAX6 KD-soluja. Se osoitti, että MAPK signaali heikkeni johtui RNAi häiriöitä PAX6.

Western-blot-analyysi A549, A549 NC, A549 PAX6 KD, H1299, H1299NC, H1299 PAX6 KD vasta-aineilla ERK1 /2 ( A), p38 (B) ja niiden fosforyloitu lomakkeet kuvassa. GAPDH ja β-aktiini käytettiin sisäisen kuormituksen valvonta vastaavasti. ERK1 /2 ja p38 tasot normalisoitiin GAPDH ja β-aktiini vastaavasti. Data ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa. * P 0,05, ** P 0,01.

PAX6 oli hyvin ilmaistu keuhkosyöpä kudoksen

Pax6 mRNA keuhkosyövän kudosta, sekä sovitettu viereiseen kudokseen, havaittiin vahvistaa roolia PAX6 keuhkosyövässä. Kliiniset ominaisuudet 52 potilaasta on lueteltu taulukossa 1. Kuten on esitetty kuviossa 6A, PAX6 mRNA ilmentyy runsaana kasvainkudoksessa verrattuna viereisiin normaaleihin kudoksiin. Ilmentyminen PAX6 edustaa syöpä-to-viereiseen nontumorous kertymisen suhde kunkin yksittäisen oli osoitettu kuviossa 5B. PAX6 ilmentyminen keuhkosyöpä kudosta oli korkeampi kuin sillä jokaiselle viereiseen normaaliin kudokseen kaikissa paitsi kolmessa tapauksessa (kuvio 6B). Tilastollinen Tulokset luetellaan taulukossa 2 ja suhde (kasvain /viereiseen kudokseen) 65%: lla potilaista (34 näytettä) ylitti 100. Toisin sanoen, useimmissa tapauksissa, PAX6 pääasiassa ilmaistu keuhkosyöpä kudoksissa.

A, Real-time PCR analyysi PAX6 ekspressiotaso keuhkosyöpä kudoksissa, samoin kuin sovitettu viereisiin kudoksiin, 52 potilasta. PAX6 mRNA taso normalisoitiin β-aktiinin ekspressiotason. B, Jokainen sarake edustaa suhteellista suhdetta PAX6 mRNA ensisijainen NSCLC verrattuna viereiseen keuhkokudoksessa, ja viiva kuvaaja edustaa arvoa 1 ja 10 vastaavasti. Kaikki kokeet toistettiin kolme kertaa. ** P 0,01.

Keskustelu

Tutkimuksessamme toiminta PAX6 keuhkojen syöpäsoluja tutkittiin. Kasvu kyky A549 ja H1299 solut hylättiin kun PAX6 ilmentyminen estyi erityisiä PAX6 shRNA. Ehdotamme, että PAX6 edistää G1-S etenemistä aktivoimalla MAPK signaalireitin. Ja PAX6 oli hyvin ilmaistu keuhkosyövän kudoksiin ja keuhkosyövän solulinjat.

transkriptiotekijä PAX6 erilaisia ​​rooleja eri kasvaimissa. Se ilmaistaan ​​usein haimasyövän ja retinoblastooma-soluissa, syytetään onkogeenisen funktion, kun PAX6 on tunnustettu tuumorisuppressori gliooma ja eturauhassyövän [6], [10], [11], [20], [21] .PAX6 ilmentyminen vähenee merkittävästi glioblastoomiin ja ekspressiotaso korreloi enää elossaololuku [22]. PAX6 estää glioblastooma solujen kasvua, ankkurista riippumattomaan kasvuun ja gliooman angiogeneesiä sekä invasiivisuuden glioblastoomasolulinjan kautta matriksin metalloproteinaasi-2 (MMP2) ilmentyminen ja verisuonten endoteelin kasvutekijä A: n (VEGFA) ilmaisu [20], [23], [24]. Eturauhasen syöpä, PAX6 ilmentyminen oli alempi syövän kudoksissa ja syöpäsolulinjoissa kuin normaalit epiteelisolujen [21]. Yliekspressio PAX6 suppressoi proliferaatiota ja pesäkkeiden muodostuminen eturauhasen syöpäsolujen [8].

Mutta PAX6 näyttelee onkogeenisen rooli haimasyövän ja retinoblastooma [4], [22] .Vuonna haiman adenokarsinooma ja haimasyövän solulinjoissa , alas-säätely PAX6 erityisillä siRNA johtaa laskuun solujen kasvuun ja solujen apoptoosin [12]. Metylaatio PAX6-promoottorien lisätään alussa virtsarakon syövän ja metyloitu PAX6-promoottorit voivat olla edustavat biomarkkeri tämän taudin [25]. Ja tukahduttaminen PAX6 mRNA: n ilmentymisen johti esti kasvua ja lisääntynyttä apoptoosia ihmisen viljellyissä retinoblastoomasolujen [26]. Tuloksista käy ilmi, että PAX6 syytöksiä onkogeenisessä toiminnon keuhkosyöpä. Meidän tulokset, PAX6 mRNA ilmentyy suuresti sekä keuhkosyöpä kudoksia ja keuhkosyövän solulinjat. A549 ja H1299 solujen kasvu inhiboituu erityisiä PAX6 shRNA. Suppressio PAX6 ilmaisun vähensivät solujen kasvua ja pesäkkeiden muodostuminen, sekä kiinnittymisestä riippumaton pesäkkeiden muodostumista. Mutta tulokset osoittavat, että apoptoosin ei ollut vaikutusta estämällä PAX6 (tuloksia ei ole esitetty). Ja solumigraation myös ei vaikuta tukahduttaminen PAX6 mRNA: ta (tuloksia ei ole esitetty).

PAX6 on syöpä-riippuvainen, ja on eri signalointireittejä eri kasvaimissa [13], [20] – [24], [26]. HeLa-soluissa, PAX6 säätelee solusyklin etenemisen tuomalla esiin ilmentymistä ihmisen RFPL1 (hRFPL1), joka alas-säätelee sykliini B1 ja Cdc2 ilmaisun ja johtaa kertyminen solujen G2-M-vaiheessa [27]. Olemme myös keskittyneet roolia PAX6 säätelyssä solusyklin etenemistä keuhkosyöpä. Meidän solusyklin analyysi, sykliini D1 tukahdutettiin A549 PAX6 KD ja H1299 PAX6 KD soluja. Se osoitti, että PAX6 ilmaisua edistetään solusyklin etenemisen siirtymässä soluja G1: stä S-vaiheeseen. Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, solusyklin analyysi osoitti merkittävää vähentämistä G0 /G1 pidätystä ja merkittävän induktion G2 /M pidätys PAX6 yli-ilmentymiseen ihmisen retinoblastoomasolujen [28].

sykliini D1-CDK4 ja sykliini D1 CDK6 komplekseja alussa tai puolivälissä G1 vaihe fosforyloivat ja inaktivoivat pRB [29], [30]. Meidän havainnot tässä tutkimuksessa sotkea että pRB S780 fosforylaation taso heikensivät kun PAX6 ilmentyminen estyi. Näin osoitimme, että PAX6 lisääntynyt ilmentyminen sykliini D1 ja parantaa solujen kasvua edistämällä G1-S siirtyminen. Mitogeeni-indusoitua Ras signalointi edistää transkriptiota sykliini D1-geeni, ja se riippuu MAPK signaalireitin [31]. Tuloksemme osoittavat, että esto PAX6 vähentää fosforylaation taso ERK1 /2 ja p38. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että PAX6 säätelee solu G1 /S progressiota MAPK signaalireitin keuhkojen syöpäsoluja.

Kuitenkin sääntelyn mekanismi PAX6 keuhkosyövässä on vielä epäselvä. Tuore tutkimus osoitti, että PAX6 edistää solujen kasvua aktivoimalla MET tyrosiinikinaasireseptori geeni haimakarsinooma- [13]. Keuhkojen syöpäsoluja, ERK1 /2 signaalireitin osallistuu MET koulutusjakson [32]. Meidän havainto osoitti, että ERK1 /2 aktivoitiin PAX6 ilme. Jotta voimme olettaa, että PAX6 aktivoi MAPK signalointi ja edistää solusyklin etenemisen kautta MET geenin transkription keuhkosyöpään.

PAX6 ensisijaisesti ilmaistaan ​​aikana alkionkehityksen; vähän tai ei lainkaan PAX6 proteiinia ei havaita aikuisen kudoksissa [3]. Kuten PAX6 usein ilmaistaan ​​kasvaimissa [9], määritimme PAX6 tasolla ensisijainen keuhkosyövän kudoksia. PAX6 ekspressiotaso täsmäsi viereisiin kudoksiin mitattiin kontrollina. Samanlaisia ​​haimatuumorien, PAX6 ilme oli vahvempi keuhkosyöpään kudosten kuin viereisissä kudoksissa. Syöpä-to-viereiseen nontumorous kudoksen suhde PAX6 mRNA: n ilmentymisen kunkin laskettiin. Vain 3 suhteet olivat alle 1 ja useimmat suhteet olivat huomattavasti yli 100. Kaikki nämä löydökset osoittivat, että PAX6 toimi onkogeenisessä tekijä keuhkosyöpää.

Johtopäätökset

Tässä tutkimuksessa, me raportoimme että lisääntynyt ilmentyminen PAX6 todettiin ensisijainen keuhkosyövän kudoksia. PAX6 edistää solujen kasvua aktivoimalla MAPK signalointi ja kiihtyvä solusyklin etenemisen. Lisäksi PAX6 säännelty G1-S etenemisen indusoimalla sykliini D1 ilmentyminen ja pRB fosforylaatio. Tuloksemme viittaavat siihen, että PAX6 on uusi mahdollinen kohde keuhkosyövässä.

Kiitokset

Kirjoittajat kiittää Meng Gu apua näytteitä kokoelma.