Krooninen sairaus

tiivistelmä

Genisteiini on osoitettu estävän syöpien sekä in vitro että in vivo, muuttamalla ilmentyminen useiden MikroRNA (miRNA ). Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet tuumorisuppressoriproteiinia miRNA säätelevät genistein ja tutkitaan niiden toimintaa eturauhassyövässä (PCA) ja kohde polkuja. Käyttämällä miRNA mikrosiruanalyysi ja reaaliaikaisen RT-PCR havaitsimme, että miR-574-3p oli merkitsevästi säädellään ylöspäin PCa käsitellyissä soluissa genisteiini- verrattuna ajoneuvon hallinnan. Ilmaisu Mir-574-3p oli merkitsevästi pienempi PCa solulinjoissa ja kliininen PCa kudoksiin verrattuna normaaliin eturauhasen solujen (RWPE-1) ja vieressä normaaleissa kudoksissa. Alhainen ilmentymistaso miR-574-3p korreloi kehittynyt kasvain vaiheen ja korkeamman Gleason PCA yksilöitä. Re-ilmentyminen miR-574-3p PCA soluissa esti merkittävästi solujen proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota in vitro ja in vivo. miR-574-3p palauttaminen aiheuttaman apoptoosin vähentämällä Bcl-xL: n ja aktivoimalla kaspaasi-9 ja kaspaasi-3. Käyttämällä GeneCodis ohjelmisto analyysi, useat reitit vaikuttavat miR-574-3p tunnistettiin, kuten ”Pathways syövän”, ”Jak-STAT signalointireitin”, ja ”Wnt-signalointireitin”. Lusiferaasireportteri- analyysit osoittivat, että miR-574-3p sitoutuu suoraan 3 ’UTR useiden kohdegeenien (kuten Rac1, EGFR ja EP300), jotka ovat komponentteja ”Pathways syövän”. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä ja Western-analyysi osoitti, että mRNA: n ja proteiinin ekspressiotasot kolmen kohdegeenien PCa soluja merkittävästi alas-säädellä miR-574-3p. Loss-of-function tutkimukset osoittivat, että kolme kohdegeeneissä merkitsevästi vaikuttaa solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion PCA solulinjoissa. Tuloksemme osoittavat, että Genistein up-regulation tuumorisuppressoriproteiinia miR-574-3p ilmaisu kohdistaminen useita soluviestitykseen reittejä. Nämä havainnot lisätä ymmärrystä siitä, miten genisteiinin säätelee kanssa miRNA PCA.

Citation: Chiyomaru T, Yamamura S, Fukuhara S, Hidaka H, ​​Majid S, Saini S, et al. (2013) Genistein Up-regulation Kasvain vaimennin MicroRNA-574-3p eturauhassyövässä. PLoS ONE 8 (3): e58929. doi: 10,1371 /journal.pone.0058929

Editor: Burton B. Yang, University of Toronto, Kanada

vastaanotettu 16. lokakuuta 2012 Hyväksytty: 08 helmikuu 2013; Julkaistu: 12 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Chiyomaru et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Center for Research Resources National Institutes of Health kautta lupanumeroita R01CA160079, R01CA138642, T32DK007790 ja VA Merit Review ja VA Program Project. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Co-kirjailija Rajvir Dahiya on PLoS One Editorial hallituksen jäsen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Yleisimmin diagnosoitu syöpä miehillä vuonna 2012 on eturauhassyöpä (PCA) jonka odotetaan osuus 29% (241740) kaikista uusista syöpätapauksista. Eturauhassyövän toisella sijalla on keuhkosyövän syöpään liittyvien kuolemien ja sen odotetaan osuus 9% (28170) kaikista mies syöpäkuolemista 2012 [1]. Metastaattinen PCA ole parannettavissa ja on edelleen merkittävä syy syöpäkuolemista [2]. Palliation voidaan saavuttaa hormoni vajaushoidon kuitenkin jälkeen erinomainen ensimmäinen vastaus, noin 2-3 vuotta useimmat näistä kumppanuus- uusiutumisen kuin kastraatio vastustuskykyisiä muodossa tauti [3] kuolemaan yleensä tapahtuneet useita vuosia [4]. Ei ole onnistunut hoitoja androgen riippumaton PCa. Parempi ymmärrys biologisten mekanismien androgeenista riippumattoman PCa voi johtaa uusia lähestymistapoja hoitoon penseä PCa menestyksekkäämmin.

Kehittäminen solunsalpaajalääkeaineiden alhainen potilaan myrkyllisyys tutkii parhaillaan monet tutkijat. Monet näistä aineista ovat peräisin luonnon kasvituotteita. Genisteiini on phytoestrogenic isoflavonoidi, joka on pleiotrooppisia biologisia vaikutuksia monenlaisia ​​syöpiä ilman näkyviä toksisuutta normaaleille soluille [5]. Genisteiini on proteiini tyrosiinikinaasin estäjä ja vaikuttaa solujen lisääntymistä, apoptoosin, kasvaimen angiogeneesi, etäpesäke ja vaimentaa monilääkeresistenssi, joissa keskeiset osat signaalitransduktioreaktioteiden [6], [7], [8].

MikroRNA (miRNA ) ovat pieniä ei-koodaavat RNA: t (21-23 nukleotidia), joka pääasiassa sitoutuvat epätäydellisesti että 3’alue (UTR) kohde- mRNA: iden ja negatiivisesti säädellä geeniekspressiota transkription jälkeen by translaatiota tukahduttaminen ja hajoaminen kohde-mRNA [9], [ ,,,0],10]. Koska tunnistaminen miRNA vuonna 1993 yli 1500 ihmisen miRNA on rekisteröity miRBase tietokannassa (https://microrna.sanger.ac.uk/). Bioinformatiikan osoittavat, että yli 60%, proteiinia koodaavan geenit voidaan kohdistaa miRNA [11]. miRNA tärkeä osa monissa biologisissa prosesseissa, kuten kehitys, erilaistuminen, proliferaatio, apoptoosin, angiogeneesiä ja aineenvaihduntaa. Lisäksi, ne ovat keskeisiä säätävät monia sairauksia kuten syöpää [12] ja miRNA voivat toimia onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille [13], [14]. Vaikutukset genisteiinin sääntelystä useiden miRNA on raportoitu [15], [16], [17]. Laboratoriossamme ovat osoittaneet, että genistein estää syöpäsolujen kasvua kohdistaminen kasvaimia synnyttävän miRNA kuten miR-21, miR-151, miR-221 ja miR-222. Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet tuumorisuppressoriproteiinia miR-574-3p joka säätelee genistein ja tutkitaan sen toiminta PCA ja kohde polkuja.

Tulokset

Genistein Treatment Lisäykset miR-574-3p Expression joka säätyy alas PCA

määrittämiseksi suhteelliset ekspressiotasot Mir-574-3p eturauhasen soluissa, suoritimme kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä käyttämällä PC3 ja DU145 solulinjojen ja vertasi niitä normaalin eturauhasen epiteelisolujen (RWPE-1). Havaitsimme, että miR-574-3p ekspressio oli merkittävästi säädellä vähentävästi PCa solulinjoissa verrattuna RWPE-1-soluja (PC3 0,68-kertainen, DU145 0,65-kertainen) (Fig. 1A).

(A) Expression of miR-574-3p PCA solulinjoissa (DU145 ja PC3) ja normaalissa eturauhasessa epiteelisolut (RWPE-1). Reaaliaikainen PCR osoitti, että ekspressiotasot miR-574-3p oli alassäädetty PCA solulinjoissa (DU145 ja PC3). miR-574-3p ilmentymistä normalisoitu RNU48. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE. *, P 0,05. (B) Expression tasot miR-574-3p hoidon jälkeen genisteiini- (25 uM ja 50 uM). miR-574-3p ilmaisun kasvoi 30-50% vuonna genisteiiniä käsitellyissä soluissa verrattuna kontrolleihin. *, P 0,05. (C) miR-574-3p ilmentymistä kliinisissä näytteissä (Viereinen normaali kudos, n = 48; PCA n = 48). miR-574-3p ilmentyminen määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä ja normalisoitiin RNU48. P 0,0001. (D) Reaaliaikainen PCR osoittaa korrelaation kliinis ominaisuuksien kanssa miR-574-3p ilme.

Tunnistaa miRNA säätelee genistein teimme miRNA mikrosirun avulla PC3-solujen jälkeen genisteiini- hoidon (taulukko 1 ). Ilmaisu 33 miRNA oli merkitsevästi sääteli kahdella pitoisuuksia genisteiinin (25 uM ja 50 uM) kanssa miR-574-3p ollessa eniten. Aiemmat miRNA ilmaus tutkimukset meidän lab osoitti myös, että miR-574-3p oli merkitsevästi alassäädetty PCA näytteissä verrattuna ei-syöpä eturauhasen kudosten [18]. Vahvista ilmentymisen miR-574-3p teimme TaqMan kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi ja totesi, että miR-574-3p ilmentyminen oli merkitsevästi ajan säädellä genisteiini- hoitoon (1,31-1,50-kertainen) (Fig. 1 B).

miR-574-3p on laskenut merkittävästi sääntelemättömien PCA kudosnäytteiden

arvioitiin ekspressiotasot miR-574-3p ihmisen PCa kudoksissa (n = 48) ja viereisen non -cancerous kudoksissa (n = 48). Ilmaisu taso miR-574-3p oli merkitsevästi pienempi PCa verrattuna normaaleissa kudoksissa (P 0,0001; Fig. 1 C). Sen määrittämiseksi, tasot miR-574-3p kasvainkudoksissa korreloi klinikan-patologinen tekijät, analysoimme miR-574-3p ekspressiotasot ihmisen kasvainnäytteestä. Kliiniset Väestörakenne tutkimuskohortissa on koottu taulukkoon 2. Korrelaatio 574-3p ilmaisun kanssa kliinis muuttujia kuten patologinen vaiheessa (PT) ja Gleason on esitetty kuvassa. 1D. Nämä tulokset osoittavat, että tapauksia on alhainen miR-574-3p ilmentymisen suureneminen huono laatu, alhainen patologinen vaiheessa korkealuokkaisesta ja korkea patologinen vaiheessa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-574-3p on merkittävästi alassäädetty PCA ja se voi olla otaksuttu tuumorisuppressorin PCA.

vaikutus miR-574-3p Over-ilme soluproliferaatioon, Migration ja Invasion PCA Cell Lines in vitro ja in vivo

tarkastella toiminnallisia rooleja miR-574-3p, suoritimme voitto-of-function tutkimukset käyttäen ennalta miR-574-3p miRNA esiaste transfektoitujen osaksi PC3 ja DU145 soluja. Ilmaisu Mir-574-3p oli selvästi säädellään ylöspäin Pre-miR miRNA esiaste transfektanteilla (Fig. 2A, PC3 316,8-kertainen, DU145 307,5-kertainen). Soluproleferaatiomäärityksessä (MTS) ja haavan määritys osoitti merkittävää inhibitiota miR-574-3p transfektanttien sekä PC3 ja DU145-soluja verrattuna kontrolliryhmään transfektanttien (Fig. 2B ja 2C). Invaasiomääritys (matrigeelin) osoittivat myös, että määrä hyökkääviä solujen väheni huomattavasti vuonna miR-574-3p transfektanttien verrattuna heidän kollegansa (Fig. 2D). Vahvista vaikutuksen miR-574-3p on tuumorigeenisyyteen in vivo, miR-574-3p ja miR-ohjaus-transfektoidut DU145 solut injektoidaan subkutaani- nude-hiiriin. Havaitsimme, että miR-574-3p yliekspressio inhiboi DU145 kasvain muodostumisen in vivo (Fig. 2E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-574-3p on tärkeä rooli tuumorisolun etenemistä.

(A) miR-574-3p ekspressiotasot PCa solulinjoissa (PC3 ja DU145) määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä 72 tuntia transfektion jälkeen Pre-miR miRNA esiaste. miR-574-3p ilmentymistä normalisoitu RNU48. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE. (B) yli-ilmentyminen miR-574-3p merkittävästi estyy solujen elinkelpoisuuden. Solujen elinkykyisyys analysoitiin MTS solulisäkasvumääritykselle 1, 2 ja 4 päivää sen jälkeen ohimenevän transfektion jälkeen. *, P 0,05. (C) yli-ilmentyminen miR-574-3p merkittävästi estyy solujen vaeltamiseen. Transfektion jälkeen (48 tuntia), haavan muodostettiin kaapimalla ja mitataan sen jälkeen, kun 6, 12 ja 24 tuntia. Edustavat kuvat haavan paranemisen määrityksen on esitetty 200-kertaisella suurennuksella. **, P 0,0001. *, P 0,005. (D) yli-ilmentyminen miR-574-3p merkittävästi vähentynyt soluinvaasiota. Edustavat kuvat invaasiomääritys esitetään 200-kertainen suurennus. *, P 0,005. (E) edustaja kuviin kasvaimista nude-hiirissä, 5 viikkoa ihonalaisen injektion jälkeen transfektoitujen miR-574-3p DU145 solulinjoja tai ohjaus solulinjojen ja ajan kuluessa kasvaimen kasvua.

miR-574-3p vaikutteet Cellular apoptosis PCA Solut

Koska miR-574-3p palauttaminen esti merkittävästi solujen lisääntymisen PCA solulinjoissa, me arveltu, että sen palauttaminen saattaa aiheuttaa apoptoosin. Kuva. 3A ja 3B osoitti, että apoptoottisten ja varhainen apoptoottinen jakeet (oikeassa yläkulmassa ja oikeassa alakulmassa on neljänneksessä kuvia, vastaavasti) oli suurempaa miR-574-3p transfektantit verrattuna kontrolliin. Tämä viittaa proapoptoottinen rooli miR-574-3p ja ehdottaa, että se vaikuttaa apoptoottisia reittejä ja säätelee kasvainten muodostumiseen. Siksi tarkasteltiin ilmentymisen eri apoptoottisten proteiinien Western blot -analyysillä ja havaitsi, että miR-574-3p uudelleen ilmentyminen aiheuttaa Bcl-xL: down-regulation (Fig. 3C). Lisäksi, pilkotaan kaspaasit-9 ja -3 oli säädelty (Fig. 3C), mikä edelleen tukee sitä, että miR-574-3p on pro-apoptoottisten miRNA.

(A) Apoptoosin määritys käyttäen virtaussytometriaa . Edustavia neljännekseen luvut miR-ohjaus ja miR-574-3p transfektanttien PC3 (ylempi) ja DU145 (alempi) soluja. (B) toinen pylväsdiagrammi osoittaa suhde apoptoottisten Solufraktioiden (varhainen apoptoottiset plus apoptoottisia soluja) in miR-574-3p transfektanttien kuin verrokeilla. Tiedot apoptoottisten solujen fraktiot ilmaistaan ​​suhteellisena arvona keskimääräinen ilmentymisen miR-ohjaus transfektanttia. *, P 0,05. (C) Immunoblotit analyysi apoptoottisia merkkiaineiden miR-ohjaus ja miR-574-3p transfektoitujen DU145 soluja. GAPDH käytettiin latauskontrollina.

Etsi miR-574-3p kohdegeenien in silico analyysi

Jos haluat etsiä otaksuttu kohdegeenien miR-574-3p, me käytetään TargetScan tietokantaan. Tämä ohjelma osoitti, että miR-574-3p on 437 ennustettu kohdegeenien. Käytimme in silico analyysi tunnistaa biologisia prosesseja kulkeutumisväylät mahdollisesti säätelee miR-574-3p. Ehdokas kohdegeenien jaettiin väyliä käyttäen GeneCodis ohjelmisto analyysi (https://genecodis.cnb.csic.es) [19], [20], [21], ja tilastollisesti rikastettua reittejä tunnistettiin kuten ”Pathways syövän” ”Jak-STAT signalointireitin”, ja ”Wnt-signalointireitin” (P 0,05, taulukko 3). Suoritimme sitten geeniekspression analysoi kaikille ehdokas kohdegeenien mukana kullekin 9 reittejä käyttäen microarray ilmaisun tiedot, jotka hyväksymä Gene Expression Omnibus (GEO) ja keskityttiin ”Pathways syövän”. Tämän analyysin, useat ratkaiseva geenikohteet tunnistettiin, kuten tropomyosin 3 (TPM3), siivetön-tyyppinen MMTV Integraatiokohdan perhe, 5A (WNT5A), ras liittyvät C3 botuliinitoksiinia alustan 1 (rho perhe, pieni GTP: n sitoutumista proteiini Rac1) (Rac1), epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), retinoidi-X-reseptori, alfa (RXRA), v-akt hiiren thymoma viruksen onkogeenin homologi 2 (AKT2), ​​ja E1A sitovan proteiinin p300 (EP300).

Luciferase Reporter määritykset käyttäminen sisältävien vektoreiden 3’UTR toutumiskohtiin Oletettujen kohdegeenien

vahvista sitoutumisen miR-574-3p 3 ’UTR näistä 7 kohdegeenien, teimme lusiferaasireportterilla määrityksissä. Jokainen kohde on yksi ennustettu sitoutumiskohta miR-574-3p (Fig. 4A). Olemme kloonattiin otaksuttu miR-574-3p 3’UTRs kohdistaa osaksi lusiferaasireportteri- määritys vektori. Lusiferaasireporttiterilla analyysit osoittivat, että miR-574-3p laski suhteellinen lusiferaasiaktiivisuudet Rac1, EGFR ja EP300 (Fig. 4B) lukuun ottamatta neljän muun geenejä. Mutaatio oletetun miR-574-3p sitoutumiskohtien näissä 3’UTRs laski vastetta miR-574-3p osoittaa, että miR-574-3p sitoutuu suoraan 3’UTRs on Rac1, EGFR ja EP300.

(A) Otaksutuista miR-574-3p sitovia ja mutatoitunut sivustoja 3’UTR kohdegeenien. (B) lusiferaasireporttiterilla joissa käytetään vektoreita, jotka koodaavat otaksuttu 3’UTR sitoutumiskohtia. PC3 ja DU145-soluja transfektoitiin ohimenevästi Pre-miR miRNA prekursori- tai negatiivinen kontrolli, jonka jälkeen lyhytaikaisella transfektiolla perus vektoriin tai villityypin 3’UTR toimittaja plasmidit tai mutatoitu 3’UTR plasmidit 24 tuntia. 3’UTR toimittaja aktiivisuus mitattiin lusiferaasianalyysissä ja normalisoitiin aktiivisuus Renillan lusiferaasin. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE. *, P 0,05. (C). MRNA-tasot kolmen kohdegeenien miR-574-3p määritettiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysit transfektion jälkeen miR-574-3p matkii ja negatiivisena kontrollina PCa solulinjoissa (PC3 ja DU145). *, P 0,05. (D) immunoblottianalyysi varten kohdegeenien miR-ohjaus ja miR-574-3p transfektoitujen PC3-soluissa. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina.

asetukseen Target Gene Expression in PCa Cell Lines by miR-574-3p

Quantitative reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti, että mRNA: n ekspressiotasot kolmen kohdegeenien PC3 ja DU145 oli tukahdutettu vuonna miR-574-3p transfektantit kontrolleihin verrattuna (Kuva. 4C). Proteiini ekspressiotasot kolmesta kohdegeenien myös laski miR-574-3p transfektantit kontrolleihin verrattuna (Kuva. 4D).

Effect of Target Gene siRNA Knockdown soluproliferaatioon, Migration, ja Invasion aktiivisuus PCA Cell Lines

Jotta voidaan tutkia toiminnallista roolia kohdegeenien, suoritimme keskeytys- toiminto tutkimukset käyttäen si-RNA pudotus kanssa PC3 ja DU145 soluja. MRNA: n ja proteiinin ilmentymistä Rac1, EGFR ja EP300 oli merkittävästi tukahdutettu si-RNA transfektantit verrattuna kontrolleihin (Fig. 5A ja 5B). Soluproleferaatiomäärityksessä (MTS), ja haavoja määritys osoitti merkittävää inhibitiota si-Rac1, si-EGFR ja si-EP300 transfektanttien sekä PC3 ja DU145-soluja verrattuna kontrolliryhmään transfektanttien (Fig. 5C ja 5D). Invaasiomääritys (matrigeelin) osoittivat myös, että määrä hyökkääviä solujen oli merkittävästi vähentynyt si-Rac1, si-EGFR ja si-EP300 transfektanttien verrattuna niiden ohjaus kollegansa (Fig. 5E).

(A) Target geeni-ilmentymisen tasot PCa solulinjoissa (PC3 ja DU145) määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä 72 tuntia transfektion jälkeen siRNA. Kohdegeenin ilmentyminen normalisoitu GAPDH. Tiedot esitetään keskiarvona ± SE. *, P 0,05. (B) Kohdegeenin ilmentyminen PC3 solulinjoissa määritettiin immunoblot-analyysillä 72 tuntia transfektion jälkeen siRNA. GAPDH: ta käytettiin latauskontrollina. (C) knockdovvn Rac1, EGFR ja EP300 merkittävästi estää solujen elinkelpoisuuden. Solujen elinkykyisyys analysoitiin MTS solulisäkasvumääritykselle 1, 2 ja 4 päivää sen jälkeen ohimenevän transfektion jälkeen. (D) knockdovvn Rac1, EGFR ja EP300 merkittävästi estää solujen vaeltamiseen. Transfektion jälkeen (48 tuntia), haavan muodostettiin kaapimalla ja mitataan sen jälkeen, kun 6, 12 ja 24 tuntia. Edustavat kuvat haavan paranemisen määrityksen on esitetty 200-kertaisella suurennuksella. (E) knockdovvn Rac1, EGFR ja EP300 merkittävästi vähentynyt soluinvaasiota. Edustavat kuvat invaasiomääritys esitetään 200-kertainen suurennus. **, P 0,0001.

Keskustelu

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että genistein säätelee syöpäsolujen lisääntymistä, invaasiota, angiogeneesin ja metastaasin kohdistamalla useita geenejä ja signalointireitteihin [6], [7], [22]. Esimerkiksi genisteiini esti soluinvaasiota vähentää ilmentymistä MMP2 ja MMP-9 ihmisen eturauhasen epiteelisolujen ja metastasoitunut soluihin, joissa kasvaimen etenemistä on positiivisesti korreloi MMP [23], [24], [25]. Olemme aiemmin osoittaneet, että genistein alassäädetty ilmentymistä MCM2 lisäämällä miR-1296 ilmentymistä PCA soluissa [26]. Olemme myös raportoitu, että genistein alassäädetty miR-221/222 ilmentymisen PCa soluissa johtaen lisääntyneen ilmentymisen tuumorisuppressorigeenin Arhi, joka on kohteena miR-221/222 [16]. Genisteiini on myös raportoitu estävän PCa angiogeneesin tukahduttaminen VEGF-välitteistä autokriinisten ja parakriinisten signalointireittien välillä kasvainsolujen ja verisuonten endoteelisoluissa [27]. EP300-geeni on tunnistettu co-aktivaattori HF1A ja on rooli stimulaation hypoksian indusoiman geenejä, kuten VEGF: n [28]. Rac1 on myös tärkeä säätelijä VEGF-välitteistä angiogeneesiä [29] ja miR-151 on onkogeenisen funktion säätelevä aktivointi Rac1 kohdistamalla ARHGDIA [30]. Olemme myös hiljattain osoitettu, että genistein esti PCa solujen vaeltamiseen ja ajan säännelty useita tuumorisuppressorigeeneille lukien ARHGDIA kohteena miR-151. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että genistein sääteli miR-574-3p ilmentymistä PCA soluissa. In silico analyysi ja lusiferaasireportterista analyysit osoittivat, että Rac1 ja EP300 olivat otaksuttu kohdegeenien Mir-574-3p. Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: llä ja Western-analyysi osoitti, että mRNA: n ja proteiinin ekspressiotasot Rac1 ja EP300 PCA soluja merkittävästi alas-säätelee miR-574-3p. Siksi genisteiini voi alas-säädellä Rac1 ja EP300 jopa säätelevä miR-574-3p.

Yli-ilmentyminen Notch1 johtaa induktioon EMT fenotyypin ja lisääntynyt ilmentyminen miR-21 [31]. Genisteiini on osoitettu inaktivoivan Notch ja hedgehog-signalointi [31], [32], ja meidän aiemmin raportoitu, että genisteiini inhiboi kasvainsolujen kasvua vähentämällä miR-21 ilmentyminen munuaissolukarsinooman [15]. Näin genisteiini on tuumorisuppressorina toiminto, säännellä ’Notch signalointi ”, jonka alas-säätely miR-21. Genistein voi myös vähentää solujen lisääntymistä säätelemällä ”Wnt signalointia” [33], [34], [35] kautta miR-574-3p syövässä. Tässä tutkimuksessa EGFR, otaksuttu kohdegeeni Mir-574-3p, oli säädelty PCA ja kasvoi pitkälle kehittynyt syöpä [36], [37]. EGFR korreloi korkean Gleason, taudin uusiutumisen ja hormoni tulenkestävät status [37], [38]. Tutkijat ovat raportoineet, että EGFR säätelevät useat miRNA kuten miR-7, miR-128b, miR-133, miR-145, miR146a, miR-146b-5p, miR-331-3p, miR-542-5p [39] – [47]. Genistein sääteli miR-146a ilmentymistä haiman syöpäsoluissa ja toimii tuumorisuppressori kastraatio kestävä PCa [44], [45]. Genistein saattaa alassäädetty EGFR tasoja jopa säätelevä miR-574-3p.

Genistein indusoi apoptoosia säätelemällä sisäiseen ja ulkoiseen signalointireitteihin. Pro- ja anti-apoptoottisten Bcl-2-perheen proteiinit on ratkaiseva rooli säätelyssä mitokondrioiden apoptoottista polku [48] ja alas-säätely Bcl-x L by genisteiiniä indusoi apoptoosia PCa soluissa [49]. Tämän reitin aktivoitu kaspaasi-9 kiihdyttää executioner kaspaasin aktivaatio, mukaan lukien kaspaasi-3, ja peräkkäin pilkkoo molekyylejä ja solun proteiinit [49], [50]. Tutkimuksessamme miR-574-3p indusoitua apoptoosia ja säädellyn ekspression Bcl-x L, kaspaasi-9 ja kaspaasi-3. Siksi tämä tutkimus osoittaa, että genisteiiniä aiheuttaman apoptoosin PCA soluissa tapahtuu lisääntynyt miR-574-3p ilme.

Tässä tutkimuksessa keskityimme miR-574-3p joka ajan säännelty genistein ja oli merkitsevästi alassäädetty miRNA ominaisia ​​PCA mirna profiilin [18]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että miR-574-3p ehkä tuumorisuppressorina miRNA PCA ja virtsarakon syövän [18], [51], [52]. miR-574-3p sijaitsee kromosomissa 4p14, usein poistettu geenivirhe PCA ja virtsarakon syövän solulinjoissa [51], [53]. Su et ai raportoitu, että ilmentyminen miR-574-3p pienennettiin mahasyövän ja solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion merkittävästi estyy miR-574-3p transfektoiduissa mahalaukun syöpäsoluja [54]. He löysivät CUL2 geeni olla tavoite miR-574-3p käyttäen laskennallisesti ennustaminen ja kokeellinen validointi. Aikaisemmat tutkimus osoitti, että miR-574-3p on kasvaimia estävä toiminta ja että onkogeenisel- MESDC1 geeni on kohdistettu miR-574-3p virtsarakon syöpä [52]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että miR-574-3p säätyy alas kliinisissä PCa näytteitä ja androgeenista riippumaton PCa solulinjoissa (PC3 ja DU145). Down-regulation miR-574-3p ilmentyminen kasvaimissa liittyy korkea kasvain vaiheessa ja Gleason pisteet osoittaa, että miR-574-3p voidaan käyttää biomarkkerina syövän etenemisen PCa.

Yhteenvetona meidän tulokset osoittavat, että genistein up-regulation miR-574-3p ilmaisu, joka on suunnattu useita soluviestitykseen reittejä. Nämä havainnot lisäävät tietämystämme genisteiinin säätelee miRNA ilmentymistä PCA.

Materiaalit ja menetelmät

Kliininen eturauhasnäytteissä

Kaikki kudosta objektilasit uudelleen muussa hallituksen sertifioitu patologi varten tunnistaminen PCa pesäkkeitä sekä viereisen normaalin rauhasepiteeliin. Kaikki syöpäpotilailla oli kohonneita prostataspesifisen antigeenin (PSA) ja oli tehty eturauhasen vuodesta 1998 vuoteen 2004. Potilaan demografiset on esitetty taulukossa 2. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta ja tutkimuksen hyväksyi UCSF komitea Human Research (Hyväksyntänumero: H9058-35751-01).

Cell Culture

Ihmisen PCa solulinjat, PC3 ja DU145 ja ei-pahanlaatuisen epiteelin eturauhasen solulinja, RWPE-1, hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). PCa solulinjoja viljeltiin RPMI 1640 -alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), kosteutetussa atmosfäärissä 5% CO2 ja 95% ilmaa 37 ° C: ssa. RWPE-1-soluja viljeltiin keratinosyyttien kasvualustassa, johon oli lisätty 5 ng /ml ihmisen rekombinantti epidermaalista kasvutekijää ja 0,05 mg /ml naudan aivolisäkeuutetta (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Subkonfluentit solut (60% -70% konfluentteja) käsiteltiin genisteiiniä (25 umol /l ja 50 umol /l, Sigma, St Louis, MO, USA) liuotettiin dimetyylisulfoksidiin ja soluja käsiteltiin vehikkelillä (dimetyylisulfoksidi) toimi kontrollina. Media ja genisteiini vaihdettiin joka päivä ja soluja kasvatettiin 4 päivää.

RNA uuttaminen

RNA uutettiin FFPE ihmisen näytteistä käyttäen miRNeasy formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (Qiagen, Valencia , CA, USA) jälkeen mikrodissektion. Sulattaa DNA, Qiagen RNase-Free DNaasia kit käytettiin. Kokonais-RNA myös erotettu PCa solulinjoista ja ei-pahanlaatuisen epiteelin eturauhasen solulinjaan käyttämällä miRNeasy mini (Qiagen) mukaan valmistajan ohjeiden.

microRNA Microarray

miRNA microarray, kokonais-RNA uutettiin PC3-soluja käsiteltiin genistein käyttäen miRNeasy Mini Kit. Mirna mikrosiruanalyysi suoritettiin ja analysoitiin kaupallinen yritys (Phalanx Biotech, Belmont, CA, USA) käyttäen ihmisen v3 miRNA OneArray alusta, joka on suunniteltu sisältämään 100% of miRBase Sequence Database Release 17.0.

kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

uutetut kokonais-RNA käänteiskopioitiin yksijuosteiseksi cDNA käyttäen iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ja TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR-analyysi suoritettiin Applied Biosystems Prism7500 Fast Sequence Detection System käyttäen TaqMan Universal PCR Master Mix mukaan valmistajan protokollan (Applied Biosystems). Tasot RNA ilmaisun määritettiin käyttämällä 7500 Fast System SDS ohjelmistoversio 1.3.1 (Applied Biosystems). PCR-parametrit pyöräily olivat seuraavat: 95 ° C 20 sekunnin ajan, 40 sykliä PCR-95 ° C: ssa 3 sekunnin ajan, ja 60 ° C: ssa 30 sekunnin ajan. Kaikki reaktiot tehtiin 10 ul: n reaktiotilavuudessa kolmena kappaleena. Aineisto analysoitiin delta-delta Ct laskentatapana kertamuutosta. Taqman ja alukkeet Rac1 (määritys ID: Hs01902432_s1), EGFR (määritys ID: Hs01076078_m1), EP300 (määritys ID: Hs00914223_m1), GAPDH (määritys ID: Hs02758991_g1), miR-574-3p (määritys ID: 002349), RNU48 (määritys ID: 001006) saatiin Applied Biosystems. GAPDH ja RNU48 käytettiin sisäisen valvonnan.

Western-analyysi

72 tuntia transfektion jälkeen solut lyysattiin RIPA-puskurilla (Pierce, Brebieres, Ranska), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (Sigma). Proteiini kvantifiointi suoritettiin käyttämällä BCA-proteiinimäärityksellä (Pierce). Proteiini lysaattia (30 ug) erotettiin 4%: sta 20% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin PVDF-kalvolle. Vasta-aineita EP300 ja Bcl-x L ostettiin Invitrogen ja Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Vasta-aineita Rac1, EGFR ja GAPDH ostettiin GeneTex (Irvine, CA, USA), vastaavasti. Vasta-aineita pilkotaan kaspaasi-3, -9 ja kaspaasi-3, -9 ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Inkubaation jälkeen primaarisen vasta-aineen jälkeen membraani pestiin ja inkuboitiin sitten sekundääriset vasta-aineet on konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Erityiset kompleksit tehtiin näkyviksi kanssa echochemiluminescence (ECL) havaitsemisjärjestelmä (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Kalvo haihdutettiin käyttäen ReBlot Plus Strong Vasta strippaus Solution (Millipore, Billerica, MA, USA). Ilmentymistaso geenien arvioitiin sitten käyttäen ImageJ ohjelmistoa (versio. 1,43; https://rsbweb.nih.gov/ij/index.html).

Transfektio

Pre-miR miRNA edeltäjän ja negatiivinen kontrolli (Applied Biosystems) käytettiin voitto-of-function kokeissa. Rac1, EGFR ja EP300 siRNA (Sigma) ja negatiivinen kontrolli siRNA (D-001810-10; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) käytettiin menettämisestä toiminnon kokeita. PC3 ja DU145 soluja transfektoitiin ohimenevästi käyttäen Lipofectamine 2000 transfektioreagenssia (Invitrogen), mukaan valmistajan suositusten.

Cell Proliferation, Migration, ja Invasion Analyysit

Solulisääntyminen mitattiin käyttämällä CellTiter 96 vesikerros Solution Cell Proliferation Assay (MTS) (Promega, Madison, WI, USA) suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Solujen proliferaatio määritettiin absorbanssilla mittauksia 490 nm: ssä käyttämällä SpectraMAX 190 (Molecular Devices Co., Sunnyvale, CA, USA). Solumigraation aktiivisuus arvioitiin haavan paranemista määrityksessä. Solut maljattiin kuusikuoppaisille ruokia, ja yksisolukerroksista kaavittiin käyttämällä P-20 mikropipetin kärki. Leveys alkuperäinen ero (0 h) ja jäljelle jäänyt aukko 6, 12 ja 24 tuntia haavoittamisen jälkeen laskettiin mikrovalokuvia. Solu invaasiomääritys suoritettiin käyttämällä muunnettua Boyden Chambers koostuu transwell-esipäällystetty matrigeeliä kalvosuodattimella insertit kahdeksan mikronin huokoset 24-kuoppaisille kudosviljelylevyille (BD Biosciences, Bedford, MA, USA). Minimum essential joka sisälsi 10% FBS: ää alemmassa kammiossa toimi kemoattraktanttia, kuten aiemmin on kuvattu [55]. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena.

In vivo tuumorikasvun

Kaikki eläinten hoito oli mukaisesti ohjeiden San Francisco Veterans Affairs Medical Center ja tutkimuksen hyväksyi San Francisco VA IACUC (Protocol numero: 11-008-01). Eläinten käyttäjät ovat suorittaneet koulutusohjelmia käsitellä ja työskennellä hiirillä kautta AALAS (American Association for Laboratory Animal Science) ennen eläinkokeita. Sillä ihonalaisen ksenografti hiirimallissa, DU145-soluja (2,5 x 10

6), jotka transfektoitiin väliaikaisesti miR-574-3p tai miR-ohjaus suspendoitiin 50 ul: ssa RPMI 1640-elatusaineessa ja injektoitiin subkutaanisti naaraspuolisiin nude-hiiriin (kanta BALB /c nu /nu; Charles River Laboratories, Inc., Wilmington, MA, USA, 5 viikkoa). Yhteensä 8 nude-hiirten (4-miR-574-3p, 4-miR-ohjaus) käytettiin, ja kasvaimen kasvua tutkittiin aikana 35 päivää. Kasvaimen tilavuus laskettiin perusteella leveys (x) ja pituus (y): x

2y /2, jossa x y.

Apoptosis Analyysit

Fluoresenssi-aktivoitu solu- lajittelu (FACS) analyysi apoptoosin tehtiin 96 tuntia transfektion jälkeen käyttäen Annexin V-FITC /7-AAD Kit (Beckman Coulter, Brea, CA, USA), mukaisesti valmistajan protokollaa. Stained solut heti analysoitiin virtaussytometrillä (Cell Lab Quanta SC; Beckman Coulter).

tunnistaminen miR-574-3p säädelty kohdegeenien ja bioinformatiikka- Analysis

Jos haluat etsiä geenejä säätelee miR-574-3p käytimme TargetScan algorism (release 6,2, https://www.targetscan.org/).