Krooninen sairaus

tiivistelmä

Noin 40% peräsuolen syöpiä Harbor aktivoivan K-RAS mutaatioita, ja nämä mutaatiot liittyvät huono kliininen vaste kemosädehoito. Meidän tavoitteena oli tunnistaa pienmolekyylisalpaajien (pkt), joka synergoida ionisoiva säteily (IR) ( ”säteilyherkistimet”), jotka voidaan sisällyttää nykyiseen hoitostrategioiden paikallisesti levinnyt peräsuolen syöpiä (LARCs) ilmentävät mutantti K-RAS. Ensin optimoitu suurikapasiteettisten määritys mittaamiseksi yksittäisten ja yhdistettyjen vaikutusten -teollisuuden ja IR, joka tuottaa samanlaisia ​​tuloksia kultakantaan pesäkemuodostusta. Käyttämällä tätä seulonta alustan ja K-RAS mutantti peräsuolen syövän solulinjoissa, testasimme pkt kohdistamista monipuolinen signalointi väyliä sädeherkistävä toimintaa ja arvioidaan sen jälkeen meidän top osumaa jatkokokeilut. Kaksi tehokkain säteilyherkistimet olivat Chk1 /2-estäjän AZD7762 ja PI3K /mTOR-estäjä BEZ235. Kemoterapeuttinen aine 5-fluorourasiilin (5-FU), jota käytetään hoitoon LARC, synergized kanssa AZD7762 ja parannettu säteilylle herkäksi, jonka AZD7762. Tämä tutkimus on ensimmäinen vertailla eri pkt yhdistettynä IR hoitoon K-RAS mutantti peräsuolen syöpä, ja meidän havainnot viittaavat siihen, että Chk1 /2: n estäjien tulisi arvioida uusia kliinisissä tutkimuksissa LARC.

Citation : Kleiman LB, Krebs AM, Kim SY, Hong TS, Haigis KM (2013) vertaileva analyysi Radioherkistinaineisiin K-RAS Mutant Peräsuolen Syöpä. PLoS ONE 8 (12): e82982. doi: 10,1371 /journal.pone.0082982

Editor: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 29 lokakuu 2013; Julkaistu: 12 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Kleiman et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat American Cancer Society (MGO-114877 ja KMH ja PF-11-260-01 jotta LBK) ja pilottihanke avustusta Proton Beam liittovaltion Share ohjelmaa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

arviolta 1,2 miljoonaa ihmistä maailmassa on diagnosoitu kolorektaalisyöpä (CRC) vuosittain ja noin 600000 ihmistä kuolee tautiin [1]. Tehokkaampi hoitovaihtoehtoja tarvitaan kiireellisesti. Heikompilaatuisen CRC voidaan hoitaa leikkaus yksin, kun taas myöhemmässä vaiheessa syöpiä ovat lisäksi käsitellään joitakin yhdistelmiä kemoterapiaa, IR, ja kohdennettuja hoitomuotojen riippuen anatomiset päällä ja lavastus kasvain. Kohdennettu hoitojen (pkt ja monoklonaalisia vasta-aineita (mAb: t)) vaikuttaa signalointireiteissä poikkeuksellisesti aktivoituu syöpäsoluissa ja hiljalleen tiensä klinikalle hoitoon eri syöpiä, joko monoterapioita tai muuten parantaa vastauksia standardin hoidot. Kolme tällaista huumeita (kaikki mAb: t) ovat hyväksytty hoitoon metastaattisen CRC: setuksimabi ja panitumumabi, jotka estävät epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR, jäsen erbB reseptorityrosiinikinaasien) ja näyttää hyötyä ainoastaan ​​K-RAS villityypin syöpiä, ja bevasitsumabi, joka estää angiogeneesiä edistävän verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) [2]. Nämä mAb: t ovat toistaiseksi ole osoittaneet hyötyä paikallisesti edenneessä sairaudessa [3,4], eikä kohdennettuja hoitoja ovat hyväksyttyjä ei-metastasoituneen CRC.

Koska niiden anatominen sijainti, kirurginen asemointia ovat haastavampia peräsuolisyövässä verrattuna paksusuolen syöpä, ja siksi on suurempi riski paikallisen uusiutumisen [5,6]. Leikkausta edeltävä sädehoito vähentää paikallisen uusiutumisen nopeus ja sitä käytetään yhdessä kemoterapian hoitoon LARC [7,8]. Kuitenkin vain 10% näistä potilaista saavuttaa patologisesti täydellinen vaste (PCR) ja yksi kolmasosa kuolee 5 vuoden sisällä [9,10]. Strategioita parantaa vastetta tavoitteena on lisätä sytotoksista vaikutusta IR kasvainsoluihin ilman samalla vaikuttamatta normaalin kudoksen, minimoimiseksi hoidon sivuvaikutuksia. Tunnistaminen chemoradiosensitizing huumeiden on erityisen olennaista, että ~ 40% peräsuolen syövän potilaiden että satama K-ras-mutaatioiden [8]. Mutant K-RAS on laajasti sidoksissa radioresistance ihmisen syövän solulinjoissa [11-17]. Lisäksi vaste LARC potilaiden sädehoitoa on erittäin vaihteleva, ja jotkut potilaat, joilla pCR ja muut minimaalinen vaste. K-RAS mutaatiot ovat yleisempiä potilailla, joilla on ei-PCR [18], joka liittyy pienentynyt tautivapaan elinajan [10].

K-RAS on pieni GTPaasina joka toimii alavirtaan solupintareseptorien , kuten EGFR, ja vaihtaa ei-aktiivisen, BKT sitoutuneena ja aktiivinen, GTP sitoutuneena [19]. GTP-sidottu K-RAS aktivoi eri signalointikaskadien, kuten kanoninen Raf-MEK-ERK (MAPK) ja PI3K-Akt-mTOR polkuja, säännellä solun prosesseja, kuten lisääntymistä ja selviytymistä. Mutaatiot K-RAS yleisimmin löytyy kodoneissa 12 ja 13 ja kompromissi GTP hydrolyysin stimuloida GTPaasia aktivoivat proteiinit (GAP), jolloin hyperaktiivinen K-RAS ja hallitsematon leviäminen [19].

IR tuottaa eri DNA vaurioita, jossa näkyvin on DNA double-säikeen katkoksia (DSB: t), ja usein pidättää solut G1-S tai G2-M siirtyminen solusyklin mahdollistaa DNA korjaukseen [20]. Jos on olemassa tai korjaamattomia vaurioita, solut voivat kuolla apoptoosin kautta tai kuolio, tai niille solujen vanhenemista [21]. Sädehoito voidaan parantaa moduloimalla DNA korjaukseen, solusyklin tarkastuspisteitä tai signaalintransduktioreitteihin kuten MAPK tai PI3K väyliä [22,23]. Kuitenkin optimaalinen strategia sisältää kohdistettuja hoitomuotoja osaksi hoito-ohjelmia on epäselvä. Tässä tutkimuksessa olemme optimoitu suurikapasiteettisten säteilylle herkäksi näytön peräsuolisyövässä solulinjoissa ja tunnistaa sädeherkistävä lääkkeitä K-RAS mutantti peräsuolen syöpiä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja lääkeliuoksiin

DLD-1 ja HCT116 paksusuolen syövän soluja saatiin Vogelstein laboratorio (Johns Hopkins Kimmel Cancer Center, Baltimore, MD). Peräsuolen ja haimasyövän solulinjoissa saatiin Center for Molecular Therapeutics (Massachusetts General Hospital, Boston, MA). DLD-1 ja HCT116-soluja viljeltiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Peräsuolen ja haimasyövän solulinjoissa viljeltiin DMEM /F-12, johon oli lisätty 5% FBS: ää. Katso taulukko S1 solulinjan tiedot ja taulukko S2 huumeiden tietoja.

Drug ja sädehoidot

Seuraavana päivänä kylvö soluja, media korvattiin jotka sisälsivät ajoneuvon tai huumeiden, ja IR oli sovelletaan 2 tuntia myöhemmin JL Shepherd Mark I Malli 25 säteilyttäjällä kanssa Cs-137 lähde. Sham säteilytetty (0 Gy) valvonnan käsiteltiin täsmälleen samalla tavalla kuin säteilytettyjen näytteiden, paitsi että ei säteilyä sovellettu. O reuna kuoppiin 96-kuoppaisia ​​levyjä käytettiin analyysiä varten. Lääkettä sisältävä väliaine vaihdettiin joka toinen päivä, mutta säteilylle herkäksi Tulokset olivat samanlaiset, kun lääke ei ole korvattu.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille siten, että kukin kuoppa sisälsi at vähintään 20 pesäkettä, jotka minimaalisesti koskettavat jälkeen 2-3 viikkoa. Solut kiinnitettiin ja värjättiin 30 minuutin ajan seoksella, jossa oli 6% glutaraldehydiä ja 0,5% kristalliviolettia tislattua vettä. Levyt skannattiin ja pesäkkeet, joissa on vähintään 50 solut laskettiin käyttäen ImageJ. Elossa fraktio (SF) seuraavan lääkeaineen ja IR hoitoja määriteltiin: (plating tehokkuus x muodostuneiden pesäkkeiden määrästä) /(solujen lukumäärä päällystetty), jossa maljaustehokkuus tietyn solulinjan määriteltiin vastaavan ohjaus kohtelun: (pesäkkeiden määrä) /(solujen lukumäärä ympätään).

CyQuant

CyQuant Direct proliferaatiomääritystä (Life Technologies, Molecular Probes) suoritettiin 96-kuoppalevyillä mukaisesti valmistajan ohjeita, paitsi että CyQuant Direct Nucleic Acid Stain käytettiin lopulliseen pitoisuuteen 1: 1000 ja CyQuant Direct tausta vaimennin I 1: 200, ja itämisaika oli 30 minuuttia. Fluoresenssi mitattiin SpectraMax M5 fluoresenssilevylukijaa (Ex /Em = 485 /538nm). Taustaa signaali kuopista median mutta soluissa vähennettiin ulos.

Hoechst värjäys ja analysointi

Solut 96-kuoppalevyillä kiinnitettiin 10 minuuttia 4% paraformaldehydillä ja värjättiin Hoechst nukleiinihapon tahra 33342 (Molecular Probes) laimennettuna 1: 40000 PBS: ssä 30 minuutin ajan. Jokaista hyvin, kuvia saatiin Zeiss Axio Observer Z1 mikroskoopilla neljällä paikkakunnalla toisistaan ​​100gm erilleen ja tämän jälkeen analysoitiin CellProfiler2 Cell Image Analysis ohjelmisto (www.cellprofiler.org). Keskimääräinen ytimet lasketa neljä kuvaa kunkin kuopan käytettiin lisäanalyysiä.

Cell laskemalla

Solut siirrostettiin 6- tai 12-kuoppalevyille ja kokeen lopussa irrotettiin käyttäen trypsiini /EDTA ja kerättiin kasvualustojen. Solususpensio laimennettiin 1: 1 0,2% trypaanisinisellä ja solupitoisuus ja elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen Nexcelom Cellometer Auto T4 solulaskijalla. Lukumäärä eläviä soluja käytettiin lisäanalyysiä.

CellTiter-Glo

CellTiter-Glo Luminescent solunelinkykyisyysmääritys (Promega) suoritettiin 96-kuoppalevyillä mukaisesti valmistajan ohjeiden , paitsi että 1/4 suositellusta määrästä CellTiter-Glo Reagenssi käytettiin kuoppaa kohti. Taustaa signaali kuopista median mutta soluissa vähennettiin ulos.

laskeminen elossa jakeet

SF kuvataan osa soluista jäljellä hoidon jälkeen. Keskiarvot kolminkertaisina kokeet piirrettiin ja virhepalkkien edustavat keskihajonnat. Data normalisoitiin ajoneuvon plus huijausta IR. Tontteihin tietojen seuraavista IR hoidon tilille vaikutuksia lääkkeellä yksin, lääke plus IR oli lisäksi normalisoitiin huumeiden plus sham IR kunkin lääkkeen pitoisuus (edustaja katkoviivalla arvossa 1). SF huumeiden plus IR vähemmän kuin SF ajoneuvon plus IR ehdottaa synergiaa. Studentin t-testejä käytettiin arvioimaan, keskimääräinen rakennerahastojen hoitoihin ja tarkastukset ovat merkittävästi erilaiset. p-arvot ≤ 0,05 huumeiden plus IR hoitoon verrattuna ajoneuvon ohjaus ja IR on merkitty tähdellä kuvioissa.

Western blotting

Western blottaus suoritettiin käyttäen RIPA lyysipuskuria ja standardimenetelmiä. Sillä lohkaistaan ​​PARP mittauksia, kelluvat solut kerättiin joka kerta, kun media on muuttunut ja lopussa kokeen, ja hajotuksen jälkeen yhdistetään lysaatti kiinnittyneet solut. Membraaneja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla oli laimennettu Odyssey estopuskuria yön yli 4 ° C: ssa, pestiin PBS: ssä, joka sisälsi 0,1% Tween-20, ja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämmössä sekundaarisen vasta-aineita laimennettiin 1: 10000 Odyssey estopuskuria. Kalvot skannattiin käyttäen LI-COR Odyssey lämpökamera ja Odyssey 2.1 ohjelmistoa käytettiin kvantitointiin. Katso taulukko S3 on luettelo käytetyt vasta-aineet.

Cell cycle profilointi

Solut istutettiin 6-kuoppaisille levyille ja hoidon jälkeen pestiin PBS, trypsinoitiin ja kerättiin mediassa. Kaikki seuraavat vaiheet suoritettiin jäissä tai sentrifugissa asetettu 4 ° C. Soluja sentrifugoitiin 1500 rpm 5 minuutin ajan ja pestiin PBS: ssä, ja sitten suspendoitiin uudelleen Mg2 + – ja Ca2 + vapaata PBS: ää. 95% EtOH lisättiin tipoittain samalla vorteksoiden alhaisella nopeudella, ja solut varastoitiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. Sitten soluja sentrifugoitiin 5 minuuttia 2000 rpm, pestiin kahdesti PBS: ssä, suspendoitiin uudelleen 1 mg /ml RNaasiA, ja sitten siirretään FACS-putkiin. Propidiumjodidia (PI) laimennettiin PBS lisättiin lopulliseen PI pitoisuus 1 ug /ml. Soluja pidettiin pimeässä kunnes analysoitiin LSR II quad-laser taussytometrin käynnissä FACSDiva ohjelmisto (BD Immunocytometry). FlowJo versio 7.6 käytettiin analysointiin kanssa Dean-Jett-Fox (DJF) matemaattinen malli.

Tulokset

optimointi suurikapasiteettisten määritys (HTA) B

säteilyn viljellyillä solulinjoilla tyypillisesti arvioidaan kautta pesäkemuodostusta (CFA). Tämä lähestymistapa ei voida nostaa korkean suoritustehon analyysin, mutta koska se on aikaa vievää, kallista ja edellyttää merkittävää optimointia kunkin solulinjan ja hoito. Sinänsä meidän alkuperäinen tavoite oli optimoida HTA varten mittaamalla vasteet huumeita ja IR. Ensin tuotetaan viittaus aineisto CFA, jossa solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille, erilaisia ​​IR-annokset levitettiin seuraavana päivänä, ja pesäkkeiden lukumäärä määritettiin 2 viikkoa myöhemmin. Seuraavaksi soluja siirrostettiin 96-kuoppalevyille, IR levitettiin seuraavana päivänä, ja elävien solujen lukumäärä arvioitiin, että CyQuant määrityksen jälkeen 3-8 päivää (kuvio S1). 1 viikon määräajan pisteen 96-kuoppaisille levyille tuottivat samankaltaisia ​​tuloksia CFA.

Huomasimme, että hoitoon noin peräsuolen syövän solulinjoissa IR ja /tai -teollisuuden aiheuttanut ytimet ja solujen laajentamiseksi ja litistää. Näissä tapauksissa CyQuant ja muiden yhteisten proliferaatiomäärityksillä, jotka perustuvat DNA: n määrä (esim syto-60) tuotti epätarkkoja lukemiselle solujen määrä selvästi eri mieltä, mitä havaitsimme silmämääräisesti. Tämä vaikutus on erityisen silmiinpistävää IR-käsiteltyjen RCM-1-soluissa (kuvio S2A), mutta ei SW837-soluissa. Päätimme tahraa ytimien 96-kuoppalevyille Hoechst, kuva levyt, ja sitten arvioida solujen lukumäärä jokaisessa kuopassa segmentoimalla ytimet kanssa CellProfiler ohjelmiston. Tämä määritys tuotti laadullisesti samanlaisia ​​tuloksia solujen laskenta 1 viikkoa post-IR (low-throughput) ja CFA sekä solulinjoissa (kuvio S2B). Protokolla ( ”HTA”), jota käytetään säteilylle herkäksi näytön näkyy kuvassa S3.

säteilylle herkäksi näyttö

Lääkkeet valittuna näyttöruudun vaikuttaa monipuolinen signalointireittejä, kuten ne, joilla on tunnettu rooli in säteilylle herkäksi, samoin kuin ajatus voidaan hyperactivated syövän mutta ilman vakiintunut asema säteilyn vastausta. Olemme mukana huumeiden onkologian putkistoja suurten lääkeyhtiöiden lupaavia esikliinisiä tai kliinisiä tietoja. Joissakin tapauksissa useat lääkkeet kohdistuvat samaa reittiä sisällytettiin verrata potensseissa ja käsitellä roolia off-tavoite vaikutuksia. Lopullinen valinta huumeiden käsitti 28 pkt (taulukko 1). Käytimme lääkeainepitoisuudet vaihtelevat ~ 10 nM 1 um, koska nämä ovat tyypillisesti kliinisesti saavutettavissa pitoisuuksissa. IR annokset vaihtelivat 2 Gy 8 Gy koska LARC potilaat saavat usein fraktioitua annosta 1,8 Gy IR, mutta joskus saada suurempia annoksia.

Drug

Ensisijainen target

GefitinibEGFRAZD8931pan-ErbBGDC-0941PI3KBKM120pan-PI3KBEZ235PI3K/mTORGDC-0980PI3K/mTORPerifosineAKT/mTORSorafenibRaf/VEGFR/etc.PLX4032Raf (V600E) Raf265Raf /VEGFRCI-1040MEKAZD6244MEKGSK1120212MEKPD325901MEKSP600125JNK IILY2228820p38DovitinibFGFR/PDGFRAbt888PARPAT-406IAPsAZD1480JAK1/2PD0332991CDK4/6AZD7762Chk1/2KU-55933ATMVorinostatHDACAUY922Hsp90AZD1152Aurora kinaseSunitinibmultiple targetsMidostaurinmultiple targetsTable 1. Lääkkeet arvioitiin yksittäisinä aineina ja yhdessä säteilyn näytön.

CSV Lataa CSV

K-RAS mutantti peräsuolen syövän solulinjat SW837 ja RCM-1 käytettiin näyttöä, ja tulokset on esitetty kuviossa S4. Pkt oli monenlaisia ​​potensseja, MEK estäjien ollessa yleensä vahvin omasta (kuvio S5a). Käytimme kaksi toimenpidettä kvantitatiivisesti luonnehtia säteilylle herkäksi. Ensin lasketaan aste säteilylle herkäksi vertaamalla eroja rakennerahastojen johtuvat SMI hoidon ja ilman IR (esimerkiksi kuvio S5B). Toiseksi, käytimme Bliss riippumattomuus (BI), onko vaikutukset ovat vastakkaisia, lisäaine tai synergistinen. BI olettaa, että toimintaa SMI ja IR ovat toisensa poissulkevia. Odotettu yhdistetty vaikutus (F

Cexp) on murto-tuotteen vaikutusten yksittäisten hoitoja. Ero F

Cexp ja havaitun yhdistetty vaikutus (F

Cobs) määrittää, onko kahden hoidot ovat vastakkaisia ​​(F

Cexp F

Cobs), lisäainetta (F

Cexp = F

Cobs), tai synergistinen (F

Cexp F

Cobs). Ei antagonismia (negatiivinen BI arvo) havaittiin minkä tahansa SMI ja IR. BI arvot kuusi voimakkainta säteilyherkistimet on esitetty kuvassa 1. Ainoastaan ​​PI3K /mTOR-estäjä BEZ235 ja tarkistuspisteen kinaasien 1 ja 2 (Chk1 /2) estäjä AZD7762 synergized 2 Gy IR molemmissa solulinjoissa.

BI arvot vastaavat (F

Cexp – F

Cobs) x 100 ja laskettiin perustuvat raaka näytön tietojen kuviossa S4. Lääkeainepitoisuudet vaihtelivat 10 nM 1.25μM. Säteilylle herkäksi ei pidetty jos eloonjääntifraktio (SF) seuraava lääke hoito yksinään oli alle 0,125, koska synergistinen vaikutus yhdistelmänä IR saa olla havaittavissa. Vaikka CI-1040, Raf265 ja GDC-0980 oli hieman sädeherkistävä, ne eivät kuuluneet seurantatutkimuksissa koska muut inhibiittorit samaa reittiä (AZD6244 ja BEZ235) oli voimakkaampi synergia.

viiden estäjiä käytetään että tavoite PI3K /Akt /mTOR-reitin, SW837 solut olivat herkempiä lääkkeellä yksin, kun taas RCM-1-soluja voimakkaammin radiosensitized. Kaikki nämä lääkkeet vähintään lievästi radiosensitized RCM-1-soluja 8 Gy IR, mutta vain BEZ235 voimakkaasti sädeherkistävä 2 Gy IR. Toisaalta, kaikki neljä inhibiittorit kohdistuvat MEK olivat tehokkaampia omillaan RCM-1-soluissa, ja se osoitti suuntaus kohti hieman säteilylle herkäksi RCM-1, mutta ei SW837-soluissa.

BEZ235 ja AZD7762 radiosensitize

säteilylle herkäksi vahvistettiin varten BEZ235 ja AZD7762 CFA (kuva S6). Nämä pkt radiosensitized laajalla IR annosten niinkin alhainen kuin 0,5 tai 1 Gy (Kuva S7). Koska 1,8 Gy IR annetaan tyypillisesti viiden peräkkäisen päivän useita viikkoja aikana hoito LARC, kysyimme, onko -teollisuus ovat edelleen sädeherkistävä fraktioituun annoksilla IR. Ensin arvioitiin soveltamisen vaikutukset 2 Gy IR neljä peräkkäistä päivää, mutta tämä jätti liian vähän soluja jäljellä säteilylle herkäksi analyysi (kuva S8A-B). Kuitenkin, meidän tulokset viittaavat siihen, että lääkkeet, jotka ovat säteilylle herkistävän yksi IR: n on myös säteilylle herkistävän käyttämällä tätä protokollaa (tietoja ei esitetty). Voidakseen arvioida vaikutuksia peräkkäisen päivän IR, haimme 0,5 tai 1 Gy neljä peräkkäistä päivää. Olemme havainneet samanlaisia ​​säteilylle herkäksi, jonka BEZ235 ja AZD7762 kuin silloin, kun IR-levitettiin kerran (kuvio S8C-D).

Useimmat haimasyöpä satama K-ras-mutaatioiden [19], ja nämä kasvaimet ovat usein käsitelty sädehoitoa. Tutkimaan mahdollisuutta meidän havaintojen seuranta tehtiin tutkimuksia, joissa ainoat muita vakiintuneita peräsuolen syövän solulinjoissa (SW1463 ja CaR-1) ja haimasyöpä solulinjoissa. Kaikki nämä linjat satama K-ras-mutaatioiden paitsi CaR-1-soluissa. BEZ235 voimakkaasti radiosensitized kaikki peräsuolen syöpä solulinjoissa, mutta vain heikosti radiosensitized yksi haimasyöpä solulinja (PANC-1) 2 Gy IR (kuvio 2A). AZD7762 radiosensitized kaikki peräsuolen syövän solulinjat mutta vain MiaPaca-2 haimasyöpäsoluissa 2 Gy IR (kuvio 2B). AZD7762 on arvioitu ensisijaisesti haimasyövän yhdessä gemsitabiinin, ja MiaPaca-2-solut ovat useimmiten käytetään näissä prekliinisissä tutkimuksissa [24,25]. Sädeherkistämään havaittiin myös PATU8988T soluissa 5 Gy IR (kuva 3), joka on annos, joka on tutkittu kliinisissä tutkimuksissa. Kuitenkin, haimasyövän solulinjoissa esiintyi enemmän muuttujan vaste AZD7762 läsnä ollessa IR verrattuna peräsuolen syövän solulinjat, ja tuloksemme viittaavat siihen, että BEZ235 ja AZD7762 voi yleisemmin radiosensitize peräsuolen syöpiä.

Effects of BEZ235 ( A) tai 250 nM AZD7762 (B) 1 viikko post-IR. Eri pitoisuuksia BEZ235 käytettiin herkkyydestä riippuen kunkin solulinjan BEZ235 hoidon puuttuessa IR (haiman linjat olivat herkempiä BEZ235): 250 nM ja SW837, RCM-1, ja SW1463 soluja, 50 nM Auton-1 ja Capan-1-solut, 25 nM ja PANC-1-soluissa, ja 1 nM varten PATU8902 ja PATU8988T soluja. Liittyen HTA käytettiin peräsuolen syövän solulinjat ja Capan-1-solut, ja solujen laskenta käytettiin jäljellä linjat.

Vasen

, Tulokset on normalisoitu ajoneuvon plus sham IR hoitoon (vaikutukset -teollisuuteen puuttuessa IR).

Oikea

, Tulokset on normalisoitu vastaavilla ei-säteilytetty valvontaa. p-arvot ≤ 0,05 IR plus SMI hoitoon verrattuna IR plus ajoneuvon hallinnan, on merkitty tähdellä.

CellTiter-Glo määritys suoritettiin 1 viikkoa post-IR.

Vasen

, Tulokset on normalisoitu ajoneuvon plus sham IR hoitoon (vaikutukset -teollisuuteen puuttuessa IR).

Oikea

, Tulokset on normalisoitu vastaavilla ei-säteilytetty valvontaa; kiinteät pylväät edustavat vaikutuksia IR yksinään. p-arvot ≤ 0,05 IR plus SMI hoitoon verrattuna IR plus ajoneuvon hallinnan, on merkitty tähdellä.

5-FU toimii synergiassa AZD7762 ja parantaa säteilylle herkäksi

SMI sisällyttää kliinisen LARC potilaille voidaan antaa samanaikaisesti IR ja 5-FU-kemoterapian [3]. Antimetaboliitit, kuten 5-FU ja gemsitabiinin estää DNA: n replikaatiota ja johtaa S-vaiheen pysähtymisen. AZD7762 hoito oli synergistinen 5-FU: n peräsuolen syövän solulinjat puuttuessa IR (kuvio 4A (katso tiedot 250 nM AZD7762) ja S9), mutta ei synergia havaittiin BEZ235 ja 5-FU (kuvio S10). Lisäksi 5-FU parannettu säteilylle herkäksi by AZD7762, mutta ei BEZ235 (kuva 4B (katso tiedot 50 nM AZD7762) ja S10). Siksi keskittyneet AZD7762 koska lupaavimmista chemoradiosensitizer.

HTA tulokset SW837 soluja esitetään. Katso kuva S10 tietojen RCM-1-soluissa ja BEZ235 hoitoa. (A) Tulokset on normalisoitu ajoneuvon plus huijausta IR. (B) Tulokset on normalisoitu vastaavilla ei-säteilytetyn valvontaa. p-arvot ≤ 0,05 IR plus SMI hoitoon verrattuna IR plus ajoneuvon hallinnan, on merkitty tähdellä.

Yhdistelmä hoitoon AZD7762 ja IR edistää DNA-vaurioita ja apoptoosin

IR-induced DSB havaitaan seriini /treoniiniproteiinikinaasit ataksia teleangiektasia mutatoitunut (ATM) ja ATM ja Rad 3 liittyvä kinaasi (ATR), jotka fosforyloivat monia solunsisäisiä substraatteja, mukaan lukien Chk1 /2, H2AX ja p53 [26]. Chk1 ja Chk2 ovat seriini /treoniini-kinaasit että on keskeisiä rooleja vastauksena DSB: ihin säilyttämällä S- ja G2-vaiheen tarkistuspisteitä ja säännellä homologinen rekombinaatio korjaus [26,27]. ATR fosforyloi Chk1 päälle S317 ja S345, jotka katalyyttisesti aktivoi Chk1 ja johtaa autofosforyloitumiseen päälle S296, ja ATM fosforyloi Chk2 on T68, mikä Chk2 homodimerisoitumisessa ja autofosforylaation on T383, T387 ja S516 [28,29]. Chk1 estäjät lisäävät fosforylaatiota Chk1 S345 vuoksi ATR aktivoinnin ja heikon defosforylaatio PP2A [30,31]. Samoin Chk2 estäjät lisäävät fosforylaatiota Chk2 T68, joka on ATM-riippuvainen ja säätelevät useat proteiini fosfa- [32].

tulokset peräsuolen syövän solulinjat ovat yhdenmukaisia ​​näitä vakiintuneita vaikutukset Chk1 /2-estäjät ja AZD7762. Chk1 ja Chk2 aktiivisuus (Chk1 pS296 ja Chk2 pS516) inhiboi AZD7762 läsnä ja poissa ollessa IR (kuviot S11A ja S12A), mikä osoittaa, että lääke esti tehokkaasti tavoitteensa. Fosforylaatiota Chk1 ja Chk2 ATM /ATR-välitteisen sivustoja (Chk1 pS345 ja Chk2 pT68) kasvoi seuraavat AZD7762 hoidon (kuviot S11B ja S12B). Fosforylaatio Chk1 on S345 tiedetään edistävän Chk1 proteolyyttiselle hajoamiselle [33], ja huomasimme, että AZD7762 laski Chk1 tasoilla (kuvio S11C).

Syöpäsolut usein menettävät G1 tarkistuspisteen, esimerkiksi mutaation kautta kasvain p53, ja ovat riippuvaisempia G2 tarkastuspiste ja Chk1 /2 aktiivisuus [22]. Chk1 /2 ehtyminen tai esto, erityisesti p53-vajaiden solujen, kumoaa G2 tarkastuspiste genotoksisten aineiden aiheuttamien ja estää korjaus DNA, joka lopulta johtaa mitoottisiin katastrofin ja apoptoosin tai vanhenemista [20,28]. Puute DNA korjaukseen yleisesti havaitaan pitkäaikainen fosforylaatio histoni variantin H2AX on S139, joka on nopeasti fosforyloidaan ATM, ATR tai DNA-PK vastauksena DSB: ihin [34]. Itse asiassa huomasimme, että AZD7762 hoito kumosi IR-indusoidun G2 pidätys (kuvio S13) ja lisännyt fosforylaatioon H2AX (γH2AX) ja apoptoosin peräsuolen syövän solulinjat (kuviot 5 ja S14).

Western blotting tulokset RCM-1-soluissa esitetään. Katso kuva S14 kvantifiointiin ja tiedot SW837 ja SW1463-soluissa. Päivien lukumäärä jälkeisen IR on merkitty. (A) DNA-DSB: t kuten on esitetty γH2AX tasoilla. (B) Apoptoosin kuten osoitetaan pilkotun PARP tasoilla.

AZD7762 on tehokkaampi säteilyherkiste kuin muut ATM-Chk1 /2-estäjät

Huomasimme, että muiden lääkkeiden kohdistaminen ATM-Chk1 /2 eivät ole yhtä hyviä kuin AZD7762 on sädeherkistävä peräsuolen syövän solulinjat. AZD7762 radiosensitized noin 40 kertaa pienempi pitoisuus kuin ATM estäjä KU-55933 (kuvio 6). Useita Chk1 ja Chk2 inhibiittorit ovat prekliinisen kehityksen ja varhaisen kliinisiä kokeita [26]. Vertasimme AZD7762 ja kaksi muuta, jotka ovat kaupallisesti saatavilla (SCH900776 ja LY2603618) [35]. AZD7762 on samalla voimakas vastaan ​​Chk1 ja Chk2 in vitro (IC

50 = 5 nM ja 10 nM, vastaavasti), kun taas SCH900776 on selektiivinen Chk1 (IC

50 = 3 nM) yli Chk2 (IC

50 = 1.5μM), ja LY2603618 on raportoitu olevan selektiivinen Chk1 estäjä, mutta ei ole olemassa julkaistua tietoa [20]. AZD7762 radiosensitized, ja se esti Chk1 aktiivisuutta 10-kertaisesti alempaa pitoisuutta kuin SCH900776 ja LY2603618 (kuvio 7), vaikka ainakin AZD7762 ja SCH900776 ovat samanlaisia ​​in vitro sitoutumisaffiniteetit Chk1.

CellTiter-Glo määritys suoritettiin SW837-solujen 1 viikkoa post-IR. Aineisto on normalisoitu vastaavilla ei-säteilytetyn valvontaa. p-arvot ≤ 0,05 IR plus SMI hoitoon verrattuna IR plus ajoneuvon hallinnan, on merkitty tähdellä.

(EN) CyQuant määritys suoritettiin SW837-solujen 1 viikkoa post-IR. SCH900776 ja LY2603618 ovat Chk1 estäjiä. Aineisto on normalisoitu vastaavilla ei-säteilytetyn valvontaa. p-arvot ≤ 0,05 IR plus SMI hoitoon verrattuna IR plus ajoneuvon hallinnan, on merkitty tähdellä. (B) SW837-soluja käsiteltiin vehikkelillä tai SMI kaksi tuntia ennen IR, ja proteiini lysaatit kerättiin kolme tuntia post-IR. Chk1 ja Chk2 autofosforylaatio sivustoja mitattiin Western blottauksella.

Keskustelu

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa uusia hoitovaihtoehtoja LARC potilaalla on K-ras-mutaatioiden optimoimalla korkealla -throughput määritys ja seulomalla paneeli -teollisuuden kohdistaminen erilaisia ​​signalointi väyliä säteilylle herkäksi. Meidän olettamus tästä työstä oli, että SMI kanssa synergistinen vaikutus syöpäsoluihin yhdistettynä sädehoitoon on suotavampaa kuin yksi, joka on erittäin sytotoksinen vaikutus omasta. Havaitsimme kuusi pkt että radiosensitize K-RAS mutantti peräsuolen syöpäsolujen: BEZ235 (PI3K /mTOR-estäjä), AZD7762 (Chk1 /2-estäjä), AZD8931 (pan-erbB reseptorin estäjä), AT-406 (estäjä apoptoosin proteiinin (IAP) perhe estäjä), AZD6244 (MEK estäjä), ja Abt888 (PARP estäjä). Vaikka muut inhibiittorit ErbB-reseptorien ja anti-apoptoottisten proteiinien on osoitettu olevan sädeherkistävä [23], AZD8931 ja AT-406 ei ole aiemmin raportoitu olevan säteilyherkistimet. BEZ235 ja AZD7762 oli voimakkain säteilyherkistimet ja olemme keskittyneet näitä kahta lääkettä.

BEZ235 on osoitettu radiosensitize kasvaimia eri kudoksissa, mukaan lukien glioblastoomat, fibrosarkoomat, ja NCSLC solulinjat kätkeminen K-ras-mutaatioiden [36- 38]. BEZ235 myös normalisoi kasvaimen verisuonistossa vierassiirrekokeissa, sillä ne parantavat kasvain perfuusio, hapetus, ja vastaukset sädehoidon [36]. Erilaisia ​​mekanismeja on ehdotettu selittämään sädeherkistävä vaikutus nähnyt BEZ235, jopa saman solulinjan (H460-solut): kumota IR aiheuttama G

2 pidätyksen ja apoptoosin [37], ja lisääntynyt G

2 pidätys ja vanhenemista [39]. Yhteistä kaikille paperit kuvaavat sädeherkistävä vaikutus BEZ235 viivästyy korjaus DNA-vaurioita. Tässä osoitamme ensimmäistä kertaa, että BEZ235 toimii voimakas radioherkistäjä peräsuolen ja haimasyövän solulinjoissa. Solut, joissa PIK3CA aktivoivia mutaatioita tai menetys PTEN tuumorisuppressorigeenin ovat herkempiä BEZ235 kuin soluja, joista puuttuu nämä mutaatiot [40], ja korkea herkkyys PATU8902 ja PATU8988T solujen BEZ235 voidaan selittää niiden PTEN puutos (taulukko S1). Esto PI3K ja mTOR mukaan BEZ235 näyttäisi olevan lupaava terapeuttinen lähestymistapa, erityisesti yhdessä IR peräsuolisyövässä. On ollut mitään kliinisissä tutkimuksissa BEZ235 CRC tai yhdistettynä IR (www.clinicaltrials.gov).

AZD7762 on osoitettu radiosensitize eri syövän solulinjoissa in vitro ja ksenograftimalleissa kumoamalla G2 tarkastuspiste ja estämällä DNA: n korjaukseen. AZD7762 on ensisijaisesti arvioitu haimasyövän, mutta on myös osoitettu radiosensitize eturauhas-, keuhko-, rinta- ja paksusuolen syövän soluja [24,25,41-43]. Ihmisen normaaleja fibroblasteja ja ohutsuolen epiteelisolut eivät radiosensitized mukaan AZD7762 [25,42].

Ei aiemmat tutkimukset ovat verrattuna säteilylle herkäksi, jonka AZD7762 ja muiden estäjien, ja olemme havainneet, että on parempi radioherkistäjä peräsuolen syövän soluja kuin inhibiittorit muiden proteiinien mukana vastauksena genotoksinen aineita, samoin kuin muita inhibiittoreita ATM-Chk1 /2 kautta. AZD7762 on selvästi erilaisia ​​vaikutuksia verrattuna tarkistuspisteen estäjät SCH900776 ja LY2603618 että se on ainoa, joka vähentää elinkelpoisuus omasta klo 1 gM (via DSB: t ja apoptoosin; tuloksia ei ole esitetty), ja se on vahvin säteilyherkiste. Yksinkertaisin selitys näille eroille on, että AZD7762 estää Chk2 kun taas kaksi muuta lääkkeet eivät, ja että Chk2 tärkeä rooli sädeherkistävä peräsuolen syövän soluja. Kuitenkin monet tutkimukset (perustuu ensisijaisesti siRNA Knockdown) ovat ehdottaneet, että kemo- ja säteilylle herkäksi välittävät Chk1 ja huomattavasti vähäisemmässä määrin Chk2, ja että vaikutukset AZD7762 johtuvat sen esto Chk1 [20,24,44- 46]. On epäselvää Chk2 inhibiittoreiden olevan merkittävää kemo- ja sädeherkistävä aktiivisuus [47-49]. Lisäksi osoitamme, että AZD7762 on vahvempi estäjä Chk1 kuin SCH900776 ja LY2603618. Siten vahvempi säteilylle herkäksi mukaan AZD7762 johtuu todennäköisesti sen tehostetun vaikutukset Chk1, ja vähäisemmässä määrin, sen estäminen Chk2.

Havaitsimme, että AZD7762 synergized 5-FU ja että 5-FU tehostettu säteilylle herkäksi by AZD7762.