Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mykofenolihappo (MPA) on metaboloituu tuote ja aktiivisen elementin mykofenolaattimofetiilin (MMF), joka on laajalti käytetty ehkäisyyn akuutin siirteen hyljinnän. MPA estää voimakkaasti inosiinimonofosfaattidehydrogenaasin (IMPDH), joka on säädelty monissa kasvaimissa ja MPA tiedetään estävän syöpäsolujen lisääntymistä sekä fibroblastien ja endoteelisolujen migraatiota. Tässä tutkimuksessa osoitimme ensimmäistä kertaa MPA: n antimigratory ja anti-hyökkäys kyvyt MPA-herkkien AGS (mahalaukun syöpä) soluja. Genominlaajuisten ilmentymisen analyyseistä Illumina koko genomin mikrosiruja tunnistettu 50 geenien kanssa ≥2 kertaiseksi muutoksia ja 15 geenien 4 kertaa muutokset ja useiden molekyylitason reittejä osallisena solujen vaeltamiseen. Reaaliaikainen RT-PCR-analyysit valittujen geenien vahvisti myös ilmaisua eroja. Lisäksi kohdennettu proteomic -analyyseissä useita proteiineja muuttaa MPA hoitoa. Tuloksemme osoittavat, että MPA moduloi mahasyövän solujen vaeltamiseen kautta alas-säätely useita geenejä (

PRKCA

,

DOCK1

,

INF2, HSPA5, LRP8

ja

PDGFRA

) ja proteiineja (PRKCA, AKT, SRC, CD147 ja MMP-1) kanssa promigratory toiminnot sekä säätely ylöspäin useiden geenien kanssa antimigratory toiminnot (

ATF3

,

Smad3

,

CITED2

ja

CEAMCAM1

). Kuitenkin muutamat geenit voivat edistää muuttoliikettä (

Cyr61

ja

NOS3

) on ylöspäin säädelty. Siksi MPA yleistä antimigratory rooli syöpäsolujen heijastaa tasapainoa promigratory ja antimigratory signaaleja vaikutteita MPA hoitoon.

Citation: Dun B, Sharma A, Teng Y, Liu H, Purohit S, Xu H, et al . (2013) mykofenolihappo Estää Migration ja Invasion mahasyövän Cells kautta Useita Molecular Pathways. PLoS ONE 8 (11): e81702. doi: 10,1371 /journal.pone.0081702

Editor: Ying Xu, University of Georgia, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 heinäkuu 2013; Hyväksytty 15. lokakuuta 2013. Julkaistu: 15 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Dun et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat varoja Georgia Regents yliopistossa. JXS osittain tukee Georgia Research Alliance niin etevä tutkija. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Useimmat kiinteät kasvaimet ovat pitkälti parannettavissa, jos ne diagnosoidaan ja käsitellä ennen levitystä pidemmälle Ensi ensisijainen sivusto. Kuitenkin, kun kasvaimet levitä muihin paikkoihin, ne yleensä tullut erittäin sairaalloinen ja todennäköisesti sikiön. Siksi on välttämätöntä rajoittaa alkuperäiseen levittämistä ja estää toissijaisia ​​leviämisen. Invasion ja etäpesäke ovat kaksi suurta tilaa kasvaimen levittämistä, joita kumpaakin käyttää eri mekanismeja ja johtavat selvästi terapeuttisen haasteet [1]. Kuitenkin molemmat muodot levittäminen edellyttävät solun liikkuminen ensisijainen sivustoja toissijaiseen sijainti sekä palauttamista ja selviytymistä kasvainsolujen toissijaisessa paikoissa. Nämä prosessit on suoritettu kautta lukuisiin molekyylitason muutoksia syöpäsoluja. Vaikka molekyylimekanismin taustalla solujen vaeltamiseen on tutkittu laajasti, romaani oivalluksia molekyylitasolla tapahtumat voivat tarjota uusia terapeuttisia lähestymistapoja. Todellakin, esto molekyyleistä, jotka edistävät solujen vaeltamiseen ja säätely ylöspäin molekyyleja, jotka estävät solujen vaeltamiseen farmakologisin interventioita on tullut tärkeä osa weaponries syöväntorjunnan. Kehittäminen tai repurposing ylimääräisten estävien lääkkeiden muuttoliikkeen ja invaasio on tärkeä jatkuva vaivaa syöpähoitojen.

Mykofenolaattimofetiili (MMF) on hyväksytty ehkäisyyn akuutin siirrännäisen hylkimisreaktion munuaisissa, sydämessä, ja maksansiirto [ ,,,0],2,3]. MMF on morfolinoetyyliesteri aihiolääke mykofenolihapon (MPA), joka on tehokas kilpailukykyisiä estäjä inosiinimonofosfaattidehydrogenaasin (IMPDH), nopeutta rajoittavaa entsyymiä varten

de novo

synteesiä guanosiini nukleotidin [4,5 ], joka pelaa ratkaiseva rooli solujen lisääntymisen ja muiden solun toimintoja, kuten DNA: n replikaatio, RNA ja proteiinisynteesiä ja solun signalointi [6]. Näin ollen, MPA estää T-ja B-lymfosyyttien proliferaatiota ja kloonilaajenemisen, ja estää sytotoksisten T-solujen ja muiden efektori-T-soluja. Muut mekanismit voivat myös edistää tehoa MPA estämisessä siirteen hylkimistä. Kautta ehtyminen guanosiini nukleotidin, MPA voi estää glykosylaatiota ja ilmaisu useiden adheesiomolekyylien, mikä vähentää rekrytointi lymfosyyttien ja monosyyttien tulehdus- ja siirteen hylkimisen [5].

Koska IMPDH ilme on huomattavasti säädelty monissa kasvainsoluissa [7,8], se on siis mahdollisesti tavoite syöpähoitoa lisäksi immunosuppressiivisille kemoterapiaa. MPA /MMF on raportoitu estävän syöpäsolujen proliferaatiota ja indusoi apoptoosin useissa syöpäsolujen [9-14]. MPA /MMF on myös raportoitu estävän migraatiota fibroblastisolujen [15] ja ihmisen napalaskimon endoteelisoluja (HUVEC: t) [16]. On kuitenkin epävarmaa, MPA voi muuttaa siirtolaisuuden ja hyökkäys valmiuksia syöpäsoluja. Lisäksi tarkka muuttoliike signalointireittejä ja efektorimolekyyleille taustalla MPA: n toiminta pysyy hämäräksi.

Tässä tutkimuksessa ensin osoitettiin, että MPA muuttuu merkittävästi migraation ja invaasion kyky AGS solujen ja me sitten käytetään geenien ilmentyminen ja proteomiikka teknologioita tunnistaa geenien ja proteiinien taustalla näitä toimintoja.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat, reagenssien ja vasta-aineiden

kaksi mahasyövän solulinjoissa (AGS ja Hs746T) saatiin American Type Culture Collection (ATCC). Molemmat solulinjat kasvatettiin RPMI 1640 -alustassa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa 5% CO2. MPA ostettiin VWR. CD147, integriini beta5 vasta-aine hankittiin Abcam, GAPDH ja ICAM-1antibodies Santa Cruz; Src, Akt, ja p-Akt (Ser473) vasta-aineet Cell Signaling.

In vitro trans- hyvin muuttoliikettä ja invaasiota määritykset

Solun muuttoliikettä suoritettiin TranswellTM (Costar) järjestelmä, joka sallii solujen kautta muuttaa 8-um huokoskoon polykarbonaattikalvon. Lyhyesti seerumia AGS tai HS746T soluja lisättiin ylempään kammioon (5 x 104 solua inserttiä kohti) ja DMEM-väliainetta, jossa eri Mykofenolihapon (1 ug /ml, 1.5μg /ml ja 2 ug /ml) käytettiin kemoatrak- alemmassa kammiossa. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 8 tunnin ajan, solut alemmassa kammiossa fiksoitiin metanolilla ja värjättiin 0,2% kristallivioletilla. Numerot vaeltavien solujen yhdeksällä satunnaisesti valitun kentille kolmena kammioista laskettiin kussakin kokeessa alle faasikontrastimikroskoopissa. Invasiivista potentiaalia solujen analysoitiin käyttäen Matrigel-pinnoitettu modifioitu Boyden kammion (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), kuten aiemmin on kuvattu [17]. DMEM sisältävä MPA lisättiin alempaan kammioon. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 24 tunnin ajan, solujen määrän, jotka tunkeutuivat alemmalle puolelle ylemmän kammion laskettiin.

Micorarray kokeissa

Kokonais-RNA uutettiin AGS-soluja käyttäen magnatic helmiä RNA kit (Jinfiniti Biosciences, Augusta, GA). Geeniekspressioprofilointi suoritettiin käyttämällä ihmisen Illumina HumanHT-12 v4 BeadChip (Illumina, San Diego, CA). Alikvootti 200 ng kokonais-RNA muutettiin kaksijuosteiseen cDNA: n (ds-cDNA) käyttämällä Illumina TargetAmp-Nano -leimauskittiä oligo-dT-aluketta, joka sisältää T7 RNA-polymeraasin promoottorin (Genset, St. Louis, MO).

In vitro

transkriptio suoritettiin edellä ds-cDNA käyttäen Enzo RNA-kopion -leimauskittiä. Biotiini-leimattu cRNA puhdistettiin käyttäen RNeasy-affiniteetti- pylvästä (Qiagen), ja hajanaista satunnaisesti koot vaihtelevat 35-200 emäksistä inkuboimalla 94 ° C: ssa 35 min. Hybridisaatio sisälsivät 100 mM MES, 1 M Na

+, 20 mM EDTA ja 0,01% Tween 20: n lopullinen konsentraatio hajanainen cRNA oli 0,05 ug /ul hybridisaatioliuoksessa. Tavoite hybridisaatio valmistettiin yhdistämällä 40 ui hajanaista transkriptin kanssa sonikoitua sillin sperman DNA: ta (0,1 mg /ml), BSA: ta ja 5 nM kontrollioligonukleotidin puskurissa, joka sisälsi 1,0 M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), ja 0,005 % Triton X-100. Target hybridisoitiin 16 tuntia 45 ° C: ssa Illumina hybridisaatio uuni. Sitten hake pestiin 50 ° C: ssa tiukkoja liuosta, sitten taas 30 ° C: ssa ei-tiukat pesua. Arrays värjättiin streptavidiini-Cy3. Microarray tiedot ovat MIAME yhteensopiva ja on talletettu NCBI Gene Expression Omnibus ja pääsee läpi GEO Sarjan hakunumero GSE46671.

Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi

alikvoottia kokonais-RNA ( 2 ug per näyte) on puettu 96-kuoppalevyille ja sitten muunnetaan cDNA käyttäen High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems) ja PTC-100TM ohjelmoitava lämpösäätelijään (MJ Research, Inc.). CDNA tuotteet käytettiin kvantitatiivista tosiaikaista PCR: llä käyttämällä valmiita käyttöön TaqMan geenien ilmentymisen määrityksissä päässä Applied Biosystems. Viisi viite geenien suhteellisen vakio ilme (GAPDH, ESD, GUSB, IPO8 ja MRPL19) käytettiin normalisoida RNA-pitoisuus. Reaaliaikainen PCR suoritettiin 96×96 Fluidigm Expression pelimerkkejä. Standard lämpökäsittelyyn olosuhteissa (10 min 95 ° C: ssa, 40 sykliä 15 sekuntia 95 ° C: ssa, 1 min 60 ° C: ssa) käytettiin kaikkien geenien. Kaikki näytteet analysoitiin samalla levyllä ja kukin näyte analysoitiin kahtena kappaleena.

Western blotting

Solut kerättiin ja suspensoitiin uudelleen PBS: ään. Kun oli sentrifugoitu 2000 rpm 5 minuutin ajan, pelletti hajotettiin jääkylmässä M-PER Mammalian Protein Extraction Reagent, joka sisältää 1% Halt proteaasi ja fosfataasilla Inhibitor Cocktail (Thermo Scientific) 30 minuutin ajan. Supernatantti kerättiin 10 minuutin kuluttua ja sentrifugoinnin 12000 rpm, vastasi spektrofotometrisesti, denaturoitu -näytepuskuria 10 minuuttia 95ᵒC ja säilytettiin 4 ° C: ssa tulevaa käyttöä varten. Proteiinit erotettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin PVDF-kalvolle (Bio-Rad), ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla kiinnostavia 4 ° C: ssa yön yli. Sopiva piparjuuri-konjugoidun sekundaarisen vasta-ainetta laimennoksena 1: 10000 estopuskurissa (3% BSA-TBST: ssä) lisättiin ja inkuboitiin 1 tunti huoneen lämpötilassa. Kaikki vasta-aineet laimennettiin 3% BSA-TBST. Immunoblotit kehitettiin käyttäen ECL kemiluminesenssin reagenssia (Thermo Scientific).

Virtaussytometria

Solut trypsinoitiin ja pestiin kahdesti PBS: ssä. Noin 1×10

6 soluja inkuboitiin 1 ug anti-CD147, anti-ICAM-1 ja anti-integriini-beta-5-vasta-aineita 30 minuutin ajan, pestiin PBST: llä kahdesti ja sitten inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen konjugoitu TRITC tai APC: ssa 30 minuuttia, ja pestiin kaksi kertaa PBST: llä. Virtaussytometriset analyysit suoritettiin FACScaliburTM virtaussytometria kanssa CELLQuestTM ohjelmiston (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA).

Luminex määritys

MMP-proteiinien kasvatusväliaineeseen mitattiin Luminex tuotesarjoja Millipore Company (Billerica, MA, USA) valmistajan suositusten mukaan. Soluviljelyalusta (1:10 laimennos) inkuboitiin vasta-aineen kanssa, joka on kytketty mikropallot ja sitten biotinyloidulla havaitsemisen vasta-aineen, ennen kuin lisättiin streptavidiini-fykoerytriini. Kaapattu helmi-komplekseja mitattiin kanssa FLEXMAP 3D-järjestelmän (Luminex, Austin, TX). Mediaani fluoresenssin intensiteetti (MFI) kerättiin ja käytettiin laskemiseen proteiinikonsentraatioilla.

Tilastollinen

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen R kielen ja ympäristö tilastollinen laskenta (www.r-projekti. org). Vertailut ryhmien keskiarvojen tehtiin ANOVA (for ≥ 3 ryhmää), jota seuraa pareittain vertailut käyttäen Bonferroni post-hoc-testaukseen. Tilastollinen merkitys erojen asetettiin P 0,05.

Lumi paketti käytettiin esikäsittelyä microarray data. Differentiaalikaavojen analyysit tehtiin käyttäen Limma paketin Bioconductor hanke [18]. Käytimme väärä löytö määrä (FDR) säätämiseksi useita testaus [19]. Yhdistelmä oikaistu p-arvo ja itseisarvo kertainen muutos (FC) käytettiin valittaessa differentiaalisesti ilmentyvien geenien.

Cluster analyysi suoritettiin ryhmittelyyn differentiaalisesti ilmentyvien geenien, joilla vastaava ilmaisu kaavoja käyttäen HPCluster ohjelmaa [20]. Bioconductor paketti ”GOstats” käytettiin testaamiseen yhdistyksen Gene ontologia termejä (biologiset prosessit) differentiaalisesti ilmentyvien geenien [21] p-arvo, joka perustuu hypergeometrisen testissä laskettiin arvioida, onko määrä geenejä, jotka liittyvät termin on odotettua suurempi. P-arvot saatiin säädettiin useita testejä käyttäen FDR. Geeni lista analysoitu myös prebuild Kegg reittejä. Käytimme ”SPIA” (signalointireitin vaikutusten arviointi) paketti tunnistaa polkuja vaikutti havaitut muutokset geenien ilmentyminen [22]. Verkko analyysi tehtiin rakentaa molekyylien vuorovaikutus verkoissa käyttämällä STRING tietokantaa [23]. Verkkojen tuotiin yksinkertainen vuorovaikutus muodossa Cytoscape visualisointia [24].

Tulokset

MPA estää AGS solumigraatioon ja invaasiota

leviämiskyky Kahden mahasyövän solulinjoissa (AGS ja Hs746T) kanssa ja ilman MPA hoitoa arvioitiin käyttämällä 8 um huokosia siirtokuoppaan kammiot ilman matrigeeliä. Kuten kuviossa 1A on esitetty, prosenttiosuudet vaeltavien AGS solujen vähentynyt on MPA annoksesta riippuvalla tavalla, mikä vähentää vähemmän kuin 50%: n valvonnan AGS solut pitoisuuksina 1.5μg /ml. Kuitenkin muuttavia kykyä Hs746T soluja ei vaikuttanut MPA pitoisuudet vastaavat. Samoin soluinvaasiota analysoinnissa käytettiin 8 um huokosia BioCoat matrigeelin 8-mikronin invaasio kammiot (kuvio 1 B). MPA hoito myös vähensi merkittävästi hyökkääviä kykyä AGS soluissa, mutta ei Hs746T soluja.

V: Kuvia vaeltavien solujen käsittelyn jälkeen ajoneuvo (DMSO) tai eri Mykofenolihapon 24 tuntia. Keskimääräinen suhteellinen vaeltavien solujen näkyvät alaosassa. B: Kuvia tunkeutuvat soluihin käsittelyn jälkeen ajoneuvo (DMSO) tai eri Mykofenolihapon 24 tuntia. Keskimääräinen suhteellinen tunkeutuvat solut näkyvät alaosassa. * P 0,05 verrattuna DMSO-kontrollin.

MPA aiheuttama geenien ilmentymisen muutoksia, jotka liittyvät syöpään solujen vaeltamiseen

Tunnistaa geenien muuttaa MPA hoitoa teimme maailmanlaajuinen transcriptomic profilointi kokeilla AGS soluja käsiteltiin MPA. Käyttäen kokonaisen geenin ilmentymisen aineisto tunnistimme Kegg polkuja, jotka ovat merkittävästi muuttunut MPA. Kahdeksan kymmenen merkittävästi muuttunut väyliä (p53 signalointi, solusyklin, reittejä syöpä, PPAR signalointi, virtsarakon syöpä, proteiini käsittely ER, pienisoluinen keuhkosyöpä ja MAPK signalointi) ovat hyvin tiedetään olevan syöpään liittyvien. Differentiaalisesti ilmentyvien geenien myös kartoitettu Gene ontologia biologisten prosessien ja hypergeometrisen suoritettiin arvioimaan merkitystä rikastamiseen kunkin luokan. Meidän analyysi osoitti, että merkittävästi rikastettu geenit ovat osallisina solusyklin (1,6 kertainen rikastus, p 10

-5), solukuolemaa (1,7-kertainen rikastaminen, p 10

-7), solujen lisääntymisen (1,8-kertainen rikastaminen, p 10

-7), ja solumigraatio (1,5-kertainen rikastus, p 0,005). Maailmanlaajuinen geenien ilmentyminen tiedot ovat yhtäpitäviä MPA: n aktiivisuutta estämällä syöpäsolujen lisääntymistä, apoptoosin induktio ja eston muuttoliike.

Koska pääpaino tutkimuksessa on selvittää molekyylimekanismin taustalla MPA vaikutus syövän solujen vaeltamiseen, analysoimme yksityiskohtaisesti 50 maahanmuuttoon liittyvien geenien kanssa 2-4 kertaiseksi eroja ja 15 maahanmuuttoon liittyviä geenejä 4-kertainen eroja hoidettujen ja hoitamattomien AGS-soluja (kuvio 2). Neljä erillistä klustereita geenien tunnustetaan. Klusteri 1 geenit ovat nopeasti ylös-säädellään 12h ajankohtana ja oli korkeimmillaan 24 ajankohtana mutta hieman alassäädetty myöhemmin. Klusteri 2 geenit ovat hieman nousseet 24h ajankohtana, mutta sitten tulee enemmän ylös-säädellään 48h ja 72h ajankohtina. Klusteri 3 geenit ovat nopeasti alassäädetty klo 12h ja 24h ajankohtina mutta alassäätöä tulee paljon vähemmän myöhempinä ajankohtina, kun klusterin 4 geenejä alassäädetty klo 24 ja myöhempinä ajankohtina. Toiminnalliset suhteet näistä geeneistä on kuvattu geeniregulatiivista verkon (kuvio 3). Myöhemmin olemme myös arvioineet pätevyyden ilmaisun datan analysoimalla osajoukko kandidaattigeenien käyttäen reaaliaikaista RT-PCR: llä (kuvio 4). Eri sarja RNA-näytteet saatu eri kohtelu ajankohtina (0, 12, 24 ja 48 tunnin kuluttua altistuksesta) päässä MPA-herkkien AGS solujen ja MPA-tunteettomia Hs746T soluissa.

Heatmap geenejä ilmentyvät differentiaalisesti jälkeen MPA hoidon 0h, 12h, 24h, 48h ja 72h. Kukin näyte on edustettuna sarakkeen ja jokainen geeni edustaa peräkkäin. Lisääntynyt ilmentyminen on merkitty punaisella ja vähentynyt ilmentyminen on merkitty vihreällä. Edustavia geenit näkyvät oikeanpuoleisessa paneelissa ja geeni klustereita merkitty vasemmalle.

Box blots näkyvät kunkin geenin. Suhteelliset ekspressiotasot esitetään log 2 mittakaavassa. FC (fold change) kunakin ajankohtana (12h, 24h ja 48h) verrataan käsittelemättömiin kontrolleihin (0h) vastaavien p-arvojen.

MPA hoitoa vakavasti alassäädetty kaksi solupintareseptorikomplekseihin geenit (

PDGFRA

ja

LRP8

), proteiinikinaasi geeni (

PRKCA

), ja viisi muita geenejä (

INF2

,

DOCK1

,

HSPA5

,

ARRB1

, ja

IGFBP5

) (kuva 2). Kuusi näistä geeneistä valittiin RT-PCR-vahvistus, ja kaikki kuusi geenien vahvistettiin olevan merkittävästi alas-säädellä MPA AGS solut, jotka ovat herkkiä MPA (kuvio 4). Mielenkiintoista, useimmat näistä geeneistä eivät olleet merkittävästi alas-säädellä MPA kohtelun Hs746T solut, jotka eivät ole herkkiä MPA hoitoon (kuva 4).

Lisäksi MPA hoito AGS solujen merkittävästi sääteli ilmaus useita geenejä osallisena solujen vaeltamiseen. Seitsemän geenit (

ATF3

,

Smad3

,

CITED2

,

CEAMCAM1

,

Cyr61

,

NOS3

ja

CDH10

) on enemmän kuin neljä-kertainen ero, ja on korostettu mikrosirulla heatmap (kuva 2). Reaaliaikainen RT-PCR vahvisti, että

ATF3

on kasvanut 10-20 taittuu AGS soluissa jälkeen MPA hoidon, kun se on vain kasvanut 2-3 taittuu siinä Hs746T soluissa (kuva 4). Samoin MPA hoito lisäsi merkittävästi

CDH10

ilmentymistä AGS soluissa, mutta ei Hs746T soluissa (kuva 4).

suoritettiin myös polku rikastamiseen analyysi 65 solujen vaeltamiseen geenit ilmentyvät differentiaalisesti jälkeen MPA hoidon. Viisi parasta Kegg polkuja, jotka ovat merkittävästi muuttunut MPA on esitetty taulukossa 1. fokaalisen adheesion, aktiinisytoskeletonin ja aksoniohjauksen reitit ovat erittäin liittyvät solujen vaeltamiseen ja merkittävästi estävät MPA hoito, sopusoinnussa havaittu väheneminen siirtymisen kyky MPA saaneista AGS soluissa. Lisäksi väylän syöpä on myös merkittävästi estyy useita geenejä tärkeitä rooleja solujen lisääntymisen ja apoptoosin. TGF-beeta-reitti merkittävästi aktivoidaan MPA käsittely ja tämä havainto on yhdenmukainen tukahduttaminen toiminta TGF-beeta- ja MPA: n aktiivisuutta estämällä solujen vaeltamiseen ja lisääntymistä.

Pathway Name

ID

pFDR

Status

Focal adhesion45101.46E-06InhibitedRegulation aktiini cytoskeleton48101.22E-05InhibitedPathways in cancer52002.21E-05InhibitedAxon guidance43600.00016InhibitedTGF-beeta signalointi pathway43500.00021ActivatedTable 1. Top viisi Kegg-polkuja 65 solumigraation geenien muuttunut merkittävästi MPA hoitoon.

CSV Lataa CSV

MPA aiheuttamaa opasteiden maahanmuuttoon liittyviä

AKT

on keskeinen geeni, joka yhdistää suuren määrän muuttoliikkeen geenien differentiaalisesti ilmaistut microarray data. Ilmaisulla on

AKT

geenejä ei muuttunut MPA hoitoa. Lisäksi koko AKT-proteiini osoitti vain pientä muutosta myöhempinä ajankohtina (kuvio 5A). Mielenkiintoista, fosfo-Akt (Ser473) oli vakavasti pieneni MPA käsittely (kuvio 5A). Nämä tulokset viittaavat siihen, että MPA voi myös muuttaa migraation kykyä AGS solun kautta vaikutus aktivointistatuksen keskeisten signalointi proteiineja, kuten AKT lisäksi säätelevät geenien ilmentymistä.

V: Western blotit valituille proteiineja . B: FACS-analyysi.

geenien koodaavat Src-tyrosiinikinaasi on vain hieman alas säädellään microarray data. Koska Src on toiminnallisesti liittyy suuri määrä maahanmuuton geenien ilmentyvät differentiaalisesti microarray data (kuva 3), päätimme proteiinin ilmentymisen taso Src ja totesi, että proteiini on huomattavasti alas-säätelee MPA käsittely (kuvio 5A). Kuitenkin tarkka syy havaittuun geenin ja proteiinin ilmentyminen poikkeavuudet on epäselvä ja jää tutkitaan edelleen.

MPA aiheuttama CD147 vähentäminen

Src-tyrosiinikinaasin myös lähettää integriini-riippuvaisen signaaleja keskeinen solun liikkumista ja lisääntymistä. Useat ero ilmaistuna geenejä (

CEACAM1

ja

Cyr61

) ovat myös sekaantuneet integriinin signalointireitin. Näin ollen, olemme analysoineet ilmentyminen useiden integriinien AGS ja Hs746T solun pinnalla käyttäen FACS-analyysiä. Vaikka ilmaus

CD147

geeni ei muuttunut MPA käsittely (kuvio 4) CD147 pinta-proteiinin ilmentyminen on huomattavasti säädeltiin jälkeen MPA hoidon (kuvio 5B). Lisäksi Western blot-analyysi vahvisti myös, että koko CD147 proteiini oli merkittävästi alas-säädellä MPA käsittely (kuvio 5A). Mielenkiintoista on, että MPA hoitoon Hs746T-solut eivät merkittävästi muuta CD147: n pinnalla ilmenemisen. ICAM-1 ja integriinin beeta 5 ei ole muuttanut MPA käsittely (kuvio 5B).

MPA vähentää matriisimetalloproteinaasi 1 (MMP-1) B

kolme MMP-proteiinit mitattiin kasvatusalustaa AGS ja Hs746T-soluja jälkeen MPA hoidon käyttämällä Luminex määritykset (kuvio 6). Proteiinin tasot MMP2 ja MMP9 olivat hyvin alhaiset AGS soluviljelyalustassa (tuloksia ei ole esitetty). MMP-1 on merkittävästi vähentynyt MPA käsittely annoksesta riippuvalla tavalla AGS soluviljelyalustassa (kuvio 6A), kun taas mitään merkittävää muutosta ei havaittu Hs746T-soluja (kuvio 6B).

V: AGS soluja. B: Hs746T-soluja.

Keskustelu

MPA tiedetään inhiboivat spesifisesti IMPDH, nopeutta rajoittavaa entsyymiä varten

de novo

synteesi guanosiini nukleotidia, jotka ovat välttämättömiä DNA: n replikointiin sekä RNA: n ja proteiinien synteesiä. MPA on myös hyvin tiedetään estävän syöpäsolujen proliferaatiota ja indusoi apoptoosin. Tässä tutkimuksessa osoitimme ensimmäistä kertaa, että MPA voidaan merkittävästi vähentää muuttoliikettä ja hyökkäys kyvyt AGS soluja. Koska etäpesäke on suurena ongelmana syöpäpotilaita, MPA: n kyky inhiboida syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota, lisäksi sen kyky estää solujen lisääntymisen ja apoptoosin, tekee MPA erinomainen syöpälääke ehdokas.

tässä tutkimuksessa käytettiin myös erilaisia ​​molekyylitekniikkaa valottaa molekyylitason mekanismeista MPA: n toiminta estävän syöpäsolun muuttoliikettä. Ensin käytetään maailmanlaajuinen transcriptomic analyysien tunnistaa muuttoliikkeen kandidaattigeenit muuttaa MPA hoitoa. Nämä tutkimukset viittasivat 50 geenien kanssa 2-4 kertaiseksi erot ja 15 geenien 4 kertaa eroja (kuvio 2). Näitä geenejä ovat solun pinnan reseptorit, proteiinikinaasien ja muiden geenien säätelyyn osallistuvan maahanmuuton. Voimassaoloaika microarray tiedot on vahvistettu reaaliaikainen RT-PCR Valittujen geenien kanssa 4-kertainen eroja (kuvio 4). Lisäksi transcriptomic analyysiä varten käytetään myös useita proteomic ja toiminnalliset tekniikat valaista molekyylitason mekanismit anti-migration aktiivisuutta MPA. Transcriptomic profilointi on tehokas tekniikka arvioida globaalin molekyylitason muutoksia. Suuri etu geeniekspression microarray on sen kyky nopeasti ja taloudellisesti arvioida ekspressiokuviota lähes kaikki geeneistä soluissa ilmennetty kohteisiin. Huolimatta valtaa tämän luokan teknologiaa, on olemassa useita asioita, jotka rajoittavat microarray ensisijaisesti olettamuksia tuottavan työkalun. Vakavin rajoitus on epätäydellinen korrelaatio tai puute korrelaatio geenien ilmentyminen ja proteiinien ilmentyminen /toiminto. Tämä puute näkyy hyvin tässä työssä suuria eroja proteiinien ilmentyminen aktivoinnin tila oli muuttunut MPA taas geenin ilmentymisen pysyivät ennallaan. Siksi on välttämätöntä yhdistää transcriptomic ja proteomiikka tekniikoita maailmanlaajuisen karakterisointi biologisia toimintoja.

Ainakin kolme geeniä, jotka ovat tunnetusti solujen vaeltamiseen (

INF2

,

DOCK1

, ja

HSPA5

) ovat vakavasti alassäädetty ( 4-kertaisesti) MPA käsittely (kuva 2).

INF2

koodaa käänteinen formin 2-proteiinia, joka edistää muodostumista detyrosinated mikrotubulusten tarpeen sentromeeriantigeenin suunnata siirryttäessä soluissa [25]. Dedicator of sytokineesin 1 (DOCK1) proteiini vuorovaikutuksessa HER2 ja edistää HER2 aiheuttama Ras aktivointi ja solumigraatio [26]. HSPA5 on stressivaste proteiinin aiheuttama aineet tai olosuhteet, jotka vaikuttavat haitallisesti Endoplasmakalvosto toiminto. Se säätelee aktiivisesti useiden pahanlaatuisten fenotyyppejä kuten solun kasvussa, muuttoliike, ja hyökkäystä. Down-regulation näiden geenien MPA on sopusoinnussa alennettu vaeltavia kapasiteettia AGS solujen jälkeen MPA hoidon. Sen sijaan yli-ilmentyminen β-arrestin-1 (

ARRB1

) vähensi muuttavia taipumus rintasyövän solujen linjat, kun taas hiljentäminen lisääntynyt maahanmuutto [27]. Eräässä tuoreessa tutkimuksessa [28],

ARRB1

todettiin edistää leviämiskyky keuhkosyöpään muuttoliikettä. Siksi on epäselvää tällä hetkellä, onko

ARRB1

estää tai edistää muuttoliikkeen AGS soluissa. Toinen rajusti alassäädetty geeni,

IGFBP5

, indusoi soluadheesion ja lisää solujen selviytymistä MCF-7 ihmisen rintasyövän solujen [29]. IGFBP5 näyttää estävän migraatiota MCF7-solujen [29], mutta edistää migraatiota perifeerisen veren mononukleaaristen solujen [30]. Siksi rooli IGFBP5 on AGS solumigraation on vielä määrittämättä.

MPA hoitoon AGS solujen myös merkittävästi sääteli ilmaus useiden geenien osallisena solujen vaeltamiseen. Näistä seitsemän geenit (

ATF3

,

Smad3

,

CITED2

,

CEAMCAM1

,

Cyr61

,

NOS3

ja

CDH10

) ovat erittäin kiinnostavia, koska ne osoittavat yli nelinkertaiseksi eroja mikrosirulla heatmap (kuva 2). Kaksi seitsemästä geenien (

ATF3

ja

CDH10

) valittiin ja varmistettiin reaaliaikaisen RT-PCR.

ATF3

ilmentyminen kasvoi 11-kertaiseksi 12 tunnin kuluttua MPA hoidon ja 19-kertaiseksi 48 tuntia.

CDH10

ilmentyminen on muuttunut AGS soluissa, mutta ei Hs746T-soluja (kuvio 4). ATF3 on äskettäin osoitettu tukahduttaa etäpesäke virtsarakon syöpä säätelevä Gelson-välitteisen remodeling aktiinisytoskeletonin. Yliekspressio

ATF3

erittäin metastaattinen virtsarakon syövän solujen vähenee muuttoliikkeen

in vitro

ja

in vivo

[31]. TGF-β /Smad signalointireitin on kriittinen rooli haiman adenokarsinooma kasvu, muuttoliike ja etäpesäke. SiRNA-välitteisen vaiennettu Smad3 lisää TGF-β-aiheuttama syöpä solumigraatio [32]. Pienentynyttä leviämiskyky AGS solujen jälkeen MPA hoidon, Smad3 on merkittävästi ajan säädellään MPA käsittely (kuva 2).

CITED2

koodaa CBP /p300-vuorovaikutuksessa transaktivoijaproteiinia 2-proteiinia, joka säätelee positiivisesti TGF-β signalointi kautta yhdessä Smad /P300 /CBP välittämän transkription koaktivaattorikompleksien monimutkainen ja stimuloi useita muita transkription toimintaa. On osoitettu, että

Cited2

hiirten ovat kasvaneet sukurauhasten solumigraation [33]. Siksi säädelty

CITED2

geenin ilmentyminen voi osaltaan pienentää muuttavia kykyä AGS käsiteltyjen solujen MPA.

CEACAM1

koodaa karsinoembryonaalinen antigeeni liittyvät soluadheesiomolekyyli (CD66a), joka vaikuttaa integriini-riippuvaisen signaloinnin ja säätelee solunulkoisen matriisin proteiini-spesifinen morfologia ja endoteelisolujen migraation [34]. Vaikka useimmat tutkimukset ovat osoittaneet, että CEACAM1 yksin näyttelee promigratory rooli, vuorovaikutus CEACAM1 ja filamiini rajusti kulkeutumista ja solujen hajonta [35]. Siksi rooli CEACAM1 solujen muutto voi riippua solun puitteissa.

Kuitenkin kaksi geenien erittäin up-säännellään MPA (

Cyr61

ja

NOS3

) itse asiassa edistää muuttoliikettä.

Cyr61

koodaa kysteiiniä runsaasti proteiinia 61, joka edistää solujen vaeltamiseen kautta muuttaminen toimintojen integriini [36]. Ylös-säätely

Cyr61

MPA hoito voi vähentää anti-muuttavien rooli MPA. Typpioksidi edistää nisäkasvain solumigraation läpi peräkkäisen aktivoinnin typpioksidisyntaasin, guanylaattisyklaasin ja mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi [37].

NOS3

koodaa typpioksidisyntaasia 3 ja on erittäin säädelty MPA hoitoa. Jälleen säätely ylöspäin

NOS3

voi vähentää antimigratory funktio MPA.

CDH10

geeni koodaa yksi kadheriinin proteiinien kriittisiä rooleja solu-solu pito. On päätelty, että CDH10 voi olla ratkaiseva rooli mesendodermal solujen vaeltamiseen vaikka johdettua suhdetta ei ole kokeellisesti testattu.

CDH10

jyrkästi kasvanut MPA hoitoon AGS soluissa, mutta ei Hs746T soluissa ja sen rooli maahanmuuton pitäisi kokeellisesti testata.

PDGFRA

koodaa solun pinnan tyrosiinikinaasireseptori jäsen verihiutaleiden kasvutekijän perhe ja sen tiedetään liittyvän läheisesti kanssa solumigraation [38].