Krooninen sairaus

tiivistelmä

Munasarjasyöpä (OvCa) on viidenneksi yleisin kuolinsyy kaikista syövistä naisten keskuudessa United oloja ja johtava kuolinsyy gynekologisista syöpäsairauksia. Vaikka useimmat OvCa potilasta aluksi vastata kirurgisten debulking ja kemoterapiaa, 75% potilaista myöhemmin periksi tauti. Näin ollen on kiireellinen tarve testata uusia terapeuttisia aineita vastapainoksi suuri kuolleisuus liittyy OvCa. Tässä yhteydessä olemme kehittäneet ja suunniteltu Nanoceria (NCE), nanopartikkelit ceriumoksidin, jolla on antioksidantti ominaisuuksia, voidaan käyttää terapeuttisena aineena OvCa. Osoitamme ensimmäistä kertaa, että EPM esti merkittävästi reaktiivisten happiradikaalien (ROS) A2780 soluissa, heikennettyjä kasvutekijän (SDF1, HB-EGF, VEGF

165 ja HGF) välittämän solumigraation ja invaasion SKOV3- soluja, ilman vaikuttaa soluproliferaatioon. NCE hoito esti myös VEGF

165 indusoitua proliferaatiota, kapillaariputki muodostumista, aktivointi VEGFR2 ja MMP2 ihmisen napanuoran verisuonten endoteelisoluissa (HUVEC). NCE (0,1 mg /kg kehon paino) hoitoon A2780 munasarjasyöpäsoluja injektoitiin intraperitoneaalisesti nude-hiiret osoittivat merkittävästi vähentää (p 0,002) kasvaimen kasvun mukana laski kasvainsolujen proliferaatiota ilmenee pienentää kasvaimen kokoa ja Ki67-värjäys. Kertyminen NCE todettiin kasvaimia eristää hoidetussa ryhmässä käyttäen lähetyksen (TEM) ja induktiivisesti kytketty plasma massaspektroskopia (ICP-MS). Vähentää kasvaimen massaa mukana vaimennus angiogeneesiä, kuten havaittiin vähentämällä CD31-värjäyksellä ja erityisiä apoptoosin verisuonten endoteelisolujen. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ceriumoksidin perustuu NCE on uusi nanohiukkasten, jotka voidaan mahdollisesti käyttää anti-angiogeeninen terapeuttisen aineen munasarjasyöpä.

Citation: Giri S, Karakoti A, Graham RP, Maguire JL, Reilly CM, Seal S, et ai. (2013) Nanoceria A harvinaisten maametallien Nanoparticle uutena antiangiogeenisestä Terapeuttisen munasarjasyövässä. PLoS ONE 8 (1): e54578. doi: 10,1371 /journal.pone.0054578

Toimittaja: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 13 joulukuu 2012; Julkaistu: 31 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Giri et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus pääasiassa tuettu CA123249 ja tukea Mayo Clinic College of Medicine VS ja osittain tukee Marsh Rivkin myöntää SG ja RR. Tämä työ oli osittain tukevat NSF CBET, 0708172 ja 0930170 SS (varten nanohiukkasten kehitystä biolääketieteen sovellukset). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Yhdysvalloissa, 27000 naiset ovat äskettäin diagnosoitu ja noin 14 000 naista kuolee OvCa vuosittain [1]. Tällaiset korkeat kuolleisuusluvut johtuvat suurimmalla osalla potilaista (75%), joilla on pitkälle edennyt (vaihe III tai suurempi) taudin aikaan diagnoosi [2]. Yli 90%: lla potilaista on parempi ennuste, jos syöpä havaitaan sen varhaisessa vaiheessa. Hoito munasarjan epiteelin syövän liittyy yleensä kirurginen debulking jälkeen kemoterapiaa yhdistelmä platinan ja taksaanin sisältävää ainetta. Kuitenkin suurin osa potilaista toistuu ja lopulta periksi niiden syövän. Näin ollen on kiireellinen tarve kehittää uusia terapeuttisia jotka voivat olla tehokkaampia hoidettaessa munasarjasyöpää ja viivyttää tai estää toistuminen. Uusien hoitomuotojen jotka kohdistuvat munasarjojen kasvaimien syntyyn ovat laajasti tutkittu, mutta emme ole vielä keksiä lupaava lääke.

Nanoteknologia pohjaisia ​​työkaluja ja tekniikoita nopeasti syntymässä lääketieteellisen kuvantamisen ja kohdennettua lääkeannostelun. Seriumoksidin on harvinaisen maametallin oksidia, joka on todettu lantanidisarjan jaksollisen. Nanokiteiset cerium oksidi (nanoceria) osoittaa sinisen siirtymän ultraviolettiabsorptiospektri, siirtyminen ja laajentamista Raman sallittu tilat ja ristikko laajentaminen verrattuna irtotavarana ceriumoksidin osoittaa sen ainutlaatuiset ominaisuudet. NCE on tullut tuottoisa aineena biolääketieteen koska sen ainutlaatuinen kyky vaihtaa hapetustilojen välillä (III) ja (IV) riippuen ympäristöstä. Kyky vaihtaa seka hapetus valtioiden nanoceria on verrattavissa biologisiin antioksidantteja. Tämä saa aikaan nanoceria erittäin tärkeä biologinen ominaisuus radikaaleja, jotka voidaan virittää perustuu säilyttämisestä happiaukot (vikoja) ja pitoisuus Ce3 + lajien nanoceria. Palautuvuus hapetustila on keskeinen ominaisuus tekemään nanoceria voimakas antioksidantti, mikä vähentää tarvetta usein toistuvaa annostusta. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ceriumoksidin nanohiukkasten on erinomaiset antioksidanttisia ominaisuuksia ja toimimaan voimakas, regeneratiivinen vapaa radikaalipuhdistajia biologisissa järjestelmissä [3], [4], [5]. Nämä regeneratiivisen antioksidanttisia ominaisuuksia johtuvat osittain valenssin rakennetta cerium atomin yhdistettynä luonnostaan ​​viat kidehilarakenteen, joka suurennetaan at nanoluokan. On ehdotettu, että ainutlaatuinen rakenne suunniteltu ceriumoksidin nanohiukkasten osalta valenssi ja hapen vikoja, edistää solujen pitkäikäisyyttä ja vähentää myrkyllisten solvauksia nojalla sen antioksidanttivaikutuksia joka syntyy, kun nanopartikkelit pääsevät soluihin [6], estää kertymistä reaktiivisten happilajien (ROS) solussa [3].

Kasvaimen angiogeneesi on tunnusomaista, että muodostuu uusia epäsäännöllinen verisuonten ennestään verisuonten verkosto. Tämä epänormaaliin angiogeneesiin tarvitaan kasvua, selviytymistä, ja etäpesäke useimpien kiinteiden kasvainten [7], [8]. Verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) on yksi tärkeimmistä pro-angiogeenisten tekijöiden, joka toimii mitogeeni verisuonten endoteelisolujen

in vitro

ja angiogeenisen tekijän

in vivo

[9 ]. Se on yli ilmaistu erilaisissa ihmisen syövissä [10], [11], [12], [13] kuten OvCa. Viime aikoina on ehdotettu, että ROS on tärkeä rooli säätelyssä kasvaimen indusoimaa angiogeneesiä ohjaamalla VEGF tuotantoa. Tehostettu tuotanto VEGF: n on osoitettu korreloivan huono tulos potilailla, joilla on sekä aikaisin ja kehittyneet OvCa. Erilaisia ​​antiangiogeenisiä aineita ovat olleet ja ovat käynnissä arviointeja munasarjasyövän kliinisissä tutkimuksissa. Vaiheen II kliinisen tutkimuksen yhden aineen bevasitsumabin (monoklonaalinen vasta-aine kohdistuu VEGF) osoitti lupaavia tuloksia [14]. Siksi VEGF signalointi on tulossa painopiste antiangiogeenisen-täsmähoitoihin in OvCa.

Tässä tutkimuksessa olemme testanneet Seriumoksidin nanohiukkasten terapeuttisena aineena sekä

vitro

ja

in vivo

in OvCa soluissa. Tuloksemme osoittavat, että EPM kykeni inhiboimaan kasvutekijä välittämiä, muuttoliike ja invaasion SKOV3- solujen VEGF

165 indusoitua proliferaatiota, kapillaariputki muodostumisen ja aktivoinnin VEGFR2 ja MMP2 HUVEC-soluissa. Vielä tärkeämpää NCE hoito esti kasvaimen kasvua

in vivo

estämällä angiogeneesiä, erityisesti kohdentamalla verisuonten endoteelisolujen.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit ja vasta-

Trypan Blue, MTT 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi) ja HB-EGF olivat Sigmalta. SDF1, VEGF

165 ja HGF ostettiin R urea; albumiini) kuten aiemmin on kuvattu [24]. Kaikki määritykset suoritettiin käyttäen sarjat biotestisysteemeissä seuraavista valmistajan ohjeiden (CA, USA).

määritys NCE kudoksissa.

Lopussa Tutkimuksen eri kudoksissa, mukaan lukien kasvain, maksan , perna ja munuaiset NCE hoidetussa ryhmässä asetettiin 70% typpihappoa yössä aloittaa ruoansulatuksessa. Näytteet olivat sitten mikroaaltouuni pilkottu. Lämpötila nostettiin 200 ° C: seen 20 minuutin aikana ja pidettiin siinä vielä 20 min. Sitten näytteet keitettiin alas vähemmän kuin 1 ml kutakin ja sekoitetaan veteen ja tarkka tilavuus on 10 ml. Cerium tasot arvioitiin käyttäen induktiivisesti kytkettyä plasma massaspektroskopia (ICP-MS) kuten aiemmin on kuvattu [25].

siirto (TEM), munasarjojen kasvain eristetty NCE käsitellyistä hiiristä fiksattiin Trump kiinnitysainetta (1 % glutaraldehydiä ja 4% formaldehydiä 0,1 M fosfaattipuskurissa, pH 7,2). Kasvaimen upotettiin Spurr n hartsia ja ohut (90 nm) leikattiin Reichert Ultracut E ultramikrotomilla, asetetaan 200 mesh kupari verkkojen ja värjättiin lyijyä sitraatti. Micrographs otettiin sijoitukset TECNAI 12 toimii 120KV.

IHC.

Kiinteät tuumorit leikattiin hiiristä käsiteltiin immunohistokemiaan CD31, Ki-67 ja TUNEL (Millipore) kuten aiemmin on kuvattu [24 ]. H 0,001; ** P 0,01, * P 0,05; NS: ei merkittävää verrattuna hoitamattomiin.

Tulokset

synteesi ja karakterisointi Seriumoksidin Nanohiukkasten

Seriumoksidi nanohiukkasia käytettiin tässä tutkimuksessa sisältää yksittäisiä kristalliitteja 3-5 nm, joka löyhästi agglomeroitu 15-25 nm. Koska synteesi prosessi on vapaa kaikista orgaanisista pinta kova taajama nanohiukkasten ohjataan tiukasti kontrolloida pH nanopartikkelit alle 3,5 synteesin aikana pitää ne kolloidinen alueella. Nanohiukkasten voidaan laimentaa vesi- tai solujen median synteesin jälkeen. Kuva 1 A ja B esittää korkean resoluution lähetys nimikroskooppikuvia (HRTEM) on NCE nanohiukkasia. On ilmeistä kuvasta, että nanohiukkaset löyhästi agglomeroidaan noin 15-25 nm aggregaattien, jotka voivat saada aikaan myös kuivumista. Hydrodynaaminen säde (37,8 nm ± 0,8) päässä multimodaalinen kokojakauma (tilavuus%) analyysi DLS mittauksia yhtyy löysä agglomeraatin koon HRTEM analyysin. Korkea suurennos kuvan vahvistaa ristikko lentokoneet NCE yksittäisissä 3-5 nm crystallites. UV-Visible spektroskopiaa käytettiin analysoimaan hapetustiloja ceriumoksidin nanohiukkasten ennen ja jälkeen ikääntyminen hoitoa. Kuvio 1 esittää UV-Visible spektrit tuoreista ja vuotiaiden seriumoksidijauheen nanohiukkasten selvästi osoittaa hallitsevuus Ce

hapetustilassa +3 päässä absorptiohuippu 252 nm verrattuna absorptiohuippu 298 nm Ce

4+ . Varmistuksen hapetustiloja nanohiukkasten saatiin XPS analyysi. XPS-spektri cerium on hyvin monimutkainen, joka sisältää useita huippuja spin kiertoradalla kytkentä 3d-orbitaalien [26]. Useat piikit Ce3d alueella, joka on katsoneet 3d

3/2 (899,5, 900,9, 903,5, 906,4 ja 916,6) ja 3d

5/2 (880,2, 882,1, 8885, 888,1 ja 898), jotka aiheutuvat useiden valenssi valtiot cerium. Kirjon NCE näyttää vallitsevana cerium vuonna hapetustilassa +3 kuin kuvata tunnusomaisia ​​piikkejä 880,2, 885,0, 899,5 ja 903,5 eV. Yhdessä data luonnehdinta NCE on yhdenmukainen aikaisempien raporttien jossa cerium voidaan kiinnittää kolmenarvoista hapettumisen pienentämällä kokoa nanohiukkaset [15], [16], [17], [26].

korkean resoluution lähetys nimikroskooppikuvia osoita, että läsnä löysä agglomeraattien 15-20 nm pienellä suurennuksella B yksittäisten 3-5 nm crystallites. D väli 0,31 nm osoittaa, että läsnä tasojen ceriumoksidin, kun taas valitun alueen elektronin diffraktio (Saed) kuvio vahvistaa läsnäoloa fluorite ristikon ceriumoksidin. Kehitys hapetustilan nanoceria C osoittaa, että syntetisoitu nanohiukkasten hallitsevuus kolmenarvoisen hapetustila, joka käy läpi hitaan muunnos Ce

hapetustilassa +3 aikana 28 päivän D röntgenfotoelektronispektroskopian kirjon viittaus ceria näytettä, jossa cerium on pääasiassa hapetustilassa +4 verrataan spektrin alkaen 4 viikkoa vuotiaiden näyte nanoceria osoittaa runsaasti Ce +3 hapetustiloissa. E. Basal tasot ROS munasarjasyövän solulinjassa. A2780-soluja käsiteltiin NCE (50-100 uM) 48 tuntia. Solut pestiin PBS: llä ja täynnä DCF-DA väriaine (5 uM) ja fluoresenssi kirjattiin heräte 485 nm ja emissio 530 nm eri ajanjaksoja (5-60 min). Kuopat, jotka sisälsivät vain soluja ilman DCFDA väriainetta (cross) tai ilman soluja, jotka sisältävät DCFDA väriainetta (täytetty timantti) käytettiin tyhjä. F. Pylväsgrafiikka edustaa ROS tasot 60 min hoidon DCF-DA väriaine. Tulokset on esitetty keskiarvona ± S.D. 4 näytettä. *** P 0,001 NCE 100 uM; * P 0,05 EPM käsittelemättömiin soluihin verrattuna käyttämällä kaksisuuntaisella Studentin t-testiä (Prism).

NCE hoito inhiboi ROS tasot A2780

Seriumoksidi nanohiukkasten on osoitettu toimivan vapaiden radikaalien poistajia estämällä reaktiivisten hapen lajien (ROS) [3], [4], [5]. Koska se on vakiintunut, että ROS kerääntyminen on tärkeä rooli taudin alkamisen ja etenemisen tumorigeneesin ihmisen munasarjasyöpä [27], [28], [29], tutkimme vaikutus NCE ROS sukupolvi munasarjasyövän solulinjassa A2780. A2780 käsiteltiin NCE (50-100 uM) ja lähettää 48 h hoidon ROS sukupolvi mitattiin DCFH2-DA väriaine seuraa fluoresenssi lukema. Kuten kuviossa 1E-F, NCE hoito estivät merkittävästi ROS tasoilla A2780, mikä viittaa siihen, että NCE hoito estää pohjapinta tasoilla oksidatiivista stressiä A2780 OvCa solulinjassa.

NCE ei vaikuttanut Cell Proliferation munasarjasyövässä Solulinjat

Voit selvittää NCE hoito inhiboi solujen lisääntymistä, A2780, C200 ja SKOV3 96- kuoppalevyille 4 x 10

3 solua /kuoppa ja käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla NCE (25-200 uM). Solujen elinkelpoisuus määritettiin 72 tunnin MTT: llä. Kuten kuviossa 2A, NCE hoito ei ollut merkittävää vaikutusta proliferaatioon tai eloonjäämistä munasarjasyövän solulinjoissa. Tämän mukaisesti havainnon, meidän klonogeeniset määritykset myös osoittanut mitään muutosta proliferaationopeus yhä NCE pitoisuus (Fig. 2B). [3H] tymidiinin A2780, C200 ja SKOV3- soluja (Kuva. S1), vahvisti myös, että EPM käsittely ei muuttanut määrä leviämisen. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin lisää munasarjasyövän solulinjoissa, mukaan lukien CaOV3 ja TOV21G (tietoja ei ole esitetty). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että EPM hoito ei merkittävästi estää kasvun munasarjasyöpäsoluja linjat

in vitro

.

. Prosenttia elinkelpoisuus A2780, C200 ja SKOV3- soluja käsiteltiin osoitetulla annoksilla NCE (25-200 uM) määritettynä MTT-määrityksellä. Aineisto on edustaa kolme erillisiä kokeita tehdään kolmena kappaleena. NS: ei merkittävää, verrattuna käsittelemättömiin soluihin vastaavissa kohtaan käyttämällä kaksisuuntaisella Studentin t-testiä (Prism). B. pesäkemuodostusta, 2000 solua /kuoppa (A2780, C200 ja SKOV3) maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin osoitetulla pitoisuudet NCE, joka kolmas päivä 2 viikkoa, kunnes pesäkkeitä muodostui. Pesäkkeet värjättiin MTT ja laskettiin. Aineisto edustaa kolmea erillistä koetta tehdään kolmena kappaleena. NS: ei merkittävää verrattuna käsittelemättömiin soluihin käyttämällä kaksisuuntaisella Studentin t-testiä (Prism).

NCE Inhibioitu Growth Factor välittämää Cell Migration ja Invasion

in vitro

Koska NCE hoito ei vaikuttanut solujen lisääntymistä, arvioimme vaikutus NCE kasvutekijän välittämän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. SKOV3- soluja kasvatettiin yli yön matalan seerumin (0,2%), joka sisälsi alustaa naarmuuntunut käyttämällä steriiliä 200 ui pipetin kärki, kun he saavuttivat 90% konfluenssin. Erilaisia ​​kasvutekijöitä, mukaan lukien SDF1, HB-EGF, VEGF

165 ja HGF (25 ng /ml) lisättiin erikseen väliaineen läsnä ollessa tai puuttuessa NCE (100 uM). 24 tuntia myöhemmin, haavan sulkeminen laskettiin. Kuten kuviossa 3A, NCE esti kaikki kasvutekijä välittämää soluvaelluksen SKOV3 solulinjassa. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin A2780 ja C200 solulinjoissa (tietoja ei esitetty). Seuraavaksi arvioitiin vaikutuksen EPM estämisessä GF-välitteisen invaasion SKOV3- soluihin käyttämällä Boyden kammion migraatiokokeessa (BD Bioscience) aikaisemmin kuvatulla [18]. Kuvio 3B osoittaa selvästi, että 100 uM NCE hoito esti merkitsevästi kaikkien kasvutekijän indusoiman invaasion SKOV3- solujen verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Nämä tulokset osoittavat, että NCE on kyky estää maahanmuuttoa ja invaasion munasarjasyöpäsoluja vaikuttamatta solujen lisääntymisen.

. Vaikutus NCE eri kasvutekijöiden välittämän solujen vaeltamiseen tutkittiin käyttäen haavan määritystä kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät. Tulokset on esitetty keskiarvona ± S.D. n = 7. B. tutkia vaikutuksen NCE hyökkäystä, 1 x 10

5 SKOV3- soluja ympättiin ylempään kuopat 100gM NCE FIA kammiossa 500 ul viljelyalustassa. Erilaiset kasvutekijät (EGF, VEGF

165 ja SDF1) (25 ng /ml) lisättiin taustalla media. 24 tuntia myöhemmin, invaasio määritettiin valmistajan ohjeita noudattaen. Tulokset on esitetty keskiarvona ± S.D. kolmen rinnakkaisen. *** P 0,001 kasvutekijän käsitelty verrattuna kontrolliin. $$$ P 0,001 EPM käsitelty verrattuna kasvutekijä käyttämällä kaksisuuntaisella Studentin t-testiä (Prism).

NCE Treatment Heikennettyä tuumorikasvun Human A2780 munasarjasyöpäsolulin- Line Laakeri Nude Mouse Model

vaikutuksen määrittämiseksi NCE

in vivo

nude-hiiret olivat vatsakalvonsisäisesti ruiskutettiin A2780 soluissa. Hiiriä käsiteltiin NCE (0,1 mg /kg kehon paino) annetaan intraperitoneaalisesti joka kolmas päivä asti tutkimuksen lopussa (päivä 30), kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Kuva 4A (ylempi kuva) esittää edustavan valokuva NCE käsitellyn ja käsittelemättömän hiiri joissa A2780 ksenografti lopussa tutkimuksen (päivä 30). Vatsan ympärysmitta, osoitus tuumoritaakka vatsakalvon (Fig. 4B) ja kasvaimen paino (Fig. 4C) on EPM käsitellyissä hiirissä olivat merkitsevästi (p 0,002) pienentää verrattuna hoitamattomiin hiiriin. Keskimääräinen paino irrotettiin kasvaimista oli noin 33% vähemmän NCE (4,56 + 0,345 gm) käsitellyissä hiirissä verrattuna ajoneuvo (PBS) hiirillä (6,79 + 0,53 g) (Fig. 4C). Tämä data osoittaa selvästi, että EPM on kyky rajoittaa munasarjakasvain kasvu

in vivo

kun sitä annettiin jopa hyvin pienellä annoksella (0,1 mg /kg).

. Gross morfologia edustavan hiiren kasvaimia 30. päivänä (n = 6). B. Kumulatiivinen vatsan ympärysmitta lopussa tutkimuksen. C. leikattiin kasvain paino ajoneuvo (PBS) käsiteltiin ja NCE (0,1 mg /kg bd paino; joka kolmas päivä). Tulokset on esitetty keskiarvona ± S.D. Kuuden yksittäisiä eläimiä. Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa.