Krooninen sairaus

tiivistelmä

Epigeneettiset sääntelyn geenien liittyy yhteensovittaminen DNA: n metylaation ja histonimodifikaation säilyttää transkription tila. Nämä kaksi ominaisuutta ovat usein häiriintyneet maligniteetti niin että kriittiset geenit periksi inaktivaatiota. 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC) on aine, joka estää DNA metyylitransferaasi, ja valtavat mahdollisuudet kuin hoitoa syöpään, mutta laajuus sen tehokkuuden vaihtelee suuresti kasvaintyypeille. Edellinen todisteet viittaavat ilmentymistilanne jälkeen 5-atsa-dC altistumista ei voida selittää DNA metylaatiostatus yksin.

Tavoite

pyrittiin selvittämään kromatiinin muutoksia mukana lyhyen ja pitkän aikavälin geeni uudelleenaktivointi seuraavia 5-atsa-dC altistumista. Kaksi peräsuolen syövän solulinjoissa, HCT116 ja SW480, käsiteltiin 5-atsa-dC ja sitten kasvatettiin huumeeton media mahdollistaa DNA uudelleen metylaatio. DNA: n metylaatio ja chromatin muutoksia arvioitiin bisulfiitin kanssa sekvensointi ja Kromatiini immunosaostuksella analyysi.

Tulokset

Lisääntynyt H3 asetylaatio, H3K4 tri-metylaatio ja menetys H3K27 tri-metylaatio liittyi uudelleenaktivointi. Hypermetyloitunut geenit, jotka eivät osoittaneet lisääntynyttä asetylointi ilmennettiin tilapäisesti 5-atsa-dC hoidon jälkeen palataan aktiiviseen tilaan. Kolme uudelleen geenit, CDO1, HSPC105 ja MAGEA3, olivat vielä ilmaistu 10 päivää post 5-atsa-dC hoito ja näytetään lokalisoitu hypometylaatio transkriptionaalisella aloituspaikan ja myös lisääntynyt rikastuminen histoni H3 asetylointi.

Johtopäätökset

Nämä havainnot viittaavat siihen, että hypometylaatio yksinään riitä aktivoida vaiennetaan geenejä ja että lisääntynyt histoni H3 asetylointi yhdessä kaikkien lokalisoitu hypometylaatio mahdollistaa pitkän aikavälin palautuminen näistä epigeneettiseltä vaiennettu geenejä. Tämä tutkimus viittaa siihen, että yhdistettyä DNA metyylitransferaasi ja histonideasetylaasi estäjät voivat tukea pitkän aikavälin aktivoituminen vaiennettu geenien.

Citation: Mossman D, Scott RJ (2011) Long Term transkriptiota Uudelleenaktivointimaksu epigeneettiseltä Silenced geenien peräsuolen syövän solut Vaatii DNA hypometylaatio ja Histoni asetylointi. PLoS ONE 6 (8): e23127. doi: 10,1371 /journal.pone.0023127

Editor: Michael Freitag, Oregon State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 joulukuu 2010; Hyväksytty: 12 heinäkuu 2011; Julkaistu: 04 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Mossman, Scott. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat varoja NBN Telethon, Newcastlen yliopistosta ja Hunter Medical Research Institute. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ihmisen genomi sisältää noin 3 miljardia emäsparia DNA [1], jotka vaativat strategista pakkaus pienikokoiseksi, mutta dynaamisen rakenteen. Kondensaatio saavutetaan ylikeloutumista on ~147 emäsparin DNA ympäri oktameeriä histoni-proteiinien (kaksi kopiota H2A, H2B, H3 ja H4), jolloin muodostuu nukleosomi [2], joka estää tahattoman geenin ilmentymisen ja lisää riippuvuutta transkription aktivaattoreita [ ,,,0],3]. Transkription repression voidaan välittää DNA metylaatio ja avustaa laajoja muutoksia on erittäin konservoituneita lysiini jäämiä häntiä histoniproteiineista. Lysiini asetylaatio helpottaa transkriptio heikentämällä yhdistyksen histoni ja DNA [4] ja sallii transkriptiotekijän sitova [5]. Lysiini metylaatio on monimutkaisempi, ja voi liittyä sekä aktiivinen että tukahdutettu alueiden DNA: ta, ja se voi olla läsnä mono-, bi-, ja tri-metyloitujen muotojen [6]. Esimerkiksi trimethylation histoni H3 lysiinin 4 (H3K4me3) on aktiivinen mark [7] samalla metyloinnin H3K9 ja H3K27 ilmestyy kopioinnin suhteen hiljainen geenipromoottorit [7], [8].

Aberrant epigeneettisellä hiljentäminen geenien voi aloittaa maligniteetti ja usein näyttää lisäksi geneettisiä muutoksia, edistää taudin etenemistä eri muodoissa syövän [9], [10], [11]. Lisäksi poikkeava hypometylaatio esikasvaintekijöiden voi johtaa niiden aktivointi [12], [13] Alennettu ilmaus lukuisia geenien johtuu epigeneettiset äänenvaimennusjärjestelmän korreloi huonon ennusteen monissa muodoissa maligniteetin kuten keuhko [14], melanooma [15] , rintojen [16], mahan [17] ja paksusuolen [18]. Harvoissa tapauksissa soma laajuinen mono-alleelinen metylaatio MLH1 on osoitettu syntyä kautta iturataan lähetyksen [19]. Lisäksi periytyviä kopioluvun vaihtelut voivat aiheuttaa transkription lukea läpi ja in-

cis

metylaatio kun vieressä avain geeni [20]. Nämä mekanismit tarjoavat selityksen sille, miksi jotkut perheet ovat suurempi riski taudin kehitykseen huolimatta ei tee taustalla geneettinen mutaatio ratkaisevan geenejä. Yksilöt tällaisessa perheet voivat hyötyä varhaisen havaitsemisen poikkeavien epigenetic tavaramerkkien geenien kohonnut tietyn sairauden. Kanssa kasvava tietoisuus epigeneettiset poikkeavuuksia tauti, torjua nämä muutokset metyylitransferaasin estäjien, kuten 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC) näyttäisi olevan mahdollisesti tehokas hoito. Todellisuudessa tämä hoito ei tehoa tietylle kasvaintyypeille [21], jotka voivat johtua aktivoida geenien palataan vaiettu tilan hoidon päätyttyä.

Olemme aiemmin tunnistettu aktivoiduttua lukuisten geenien kolorektaalisyöpä solulinjoissa hoidon jälkeen demetyloiva agentti 5-atsa-dC [22]. Poistettaessa huumeiden ja kymmenen päivän kasvun, joitakin näistä geeneistä pysyi ilmentyy voimakkaasti, mikä viittaa siihen, käänteinen transkription tilan näiden geenien. Vaikka vähennetään 5-atsa-dC, muutokset DNA metylaatio ei korreloinut ekspressiotasoja ryhmässä geenejä analysoidaan, mikä osoittaa muita epigeneettiset muutokset olivat säätelevät kopiointia. Geenit valitaan analysoitavaksi tutkittiin johtuen niiden osallistumista eri kasvaintyypeissä ja mahdollista käyttöä biomarkkereina näissä kasvaimissa [23], [24], [25], ja /tai vuoksi vahvan uudelleen ilmaisua ja malli geenien ilmentyminen seuraavien 5-atsa-dC kolorektaalisyövässä soluissa [22]. CDKN2A valittiin nimenomaan koska se on usein tukahdutettu kolorektaalisyövässä kasvaimissa [26]. Nämä geenit voivat edustaa tärkeää geenien epigeneettinen kehittämiseen useita kasvaintyypeissä. Tässä tutkimuksessa olemme ominaista muutoksia DNA: n metylaation ja kromatiinin valtio, joka mahdollistaa joko lyhyellä tai pitkällä aikavälillä aktivoituminen ilmaisun seuraavista 5-atsa-dC altistumista.

Methods

Cell Culture

kolminkertaiset viljelmät HCT116 ja SW480-soluja kasvatettiin DMEM-väliaineeseen, jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 37 ° C: ssa ja 5% CO

2. Soluja käsiteltiin 5-atsa-2′-deoksisytidiini (Sigma-Aldrich), kuten aiemmin on kuvattu [22]. DNA ja RNA uutettiin käsittelemättömät solut, 5-atsa-käsitellyt DC-solut (72 h hoidon), ja 4 ja 10 päivän kuluttua hoidon lopettamisen (päivä 4 ja 10 uudelleen metylaation). Solut on alun perin saatu ATCC ja ne todennetaan käyttäen Identifiler DNA-tunnistus Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Global metylaatio

Global metylaatio oli arvioitiin kuten aiemmin on kuvattu [22]. Lyhyesti, 50 ug DNA: ta digestoitiin entsymaattisesti nukleaasilla P1 (US Biological, Swampscott, MA, USA), jota seuraa kromatografinen erotus Varian Star Kromatografia työasema Supelcosil LC-18-DB kolonnia (Sigma-Aldrich). Absorbanssi seurattiin 278 nm: ssä ja piikkien pinta-alat olivat määrällisesti Star arvioija Software (Varian, Palo Alto, CA, USA). 5-metyylisytosiinin pitoisuus ilmaistiin prosentteina koko sytosiini allas korjauksen jälkeen sukupuuttoon yhteistyössä efficients.

bisulfiittimodifiointi Sequencing

DNA muutettiin kahtena käyttäen Qiagen Epitect Bisulfiittikonversio Kit ( Qiagen, Valencia, CA, USA) käyttäen 2 ug fenoli-kloroformilla puhdistettu DNA. Näytteet eluoitiin 30 ul: aan eluointipuskuria ja alikvootti laimennettiin 1:03 ennen PCR: ää ja säilytettiin 4 ° C: ssa, kun taas jäljellä oleva osa säilytettiin -20 ° C: ssa. CpG-saarekkeiden ympärillä transkription aloituskohdasta geenien olivat kohteena PCR-analyysi käyttäen alukkeita taulukossa S1. Sekvenssointireaktiot suoritettiin kaksinkertaisina ja analysoitiin ABI 3730 sekvensserin. Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen Sequence Scanner ohjelmisto (Applied Biosystems). Prosenttiosuus metylaatio kussakin CpG määritettiin jakamalla sytosiini piikin yhdistetyllä korkeudet sytosiini ja tymiini huiput kuten aiemmin on kuvattu [27].

Real Time PCR-analyysi geenin ilmentymisen

RNA muunnettiin cDNA käyttäen Superscript II (Invitrogen) ja satunnaisia ​​alukkeita (Promega) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Reaktiot suoritettiin kolminkertaisina käyttäen alukkeita luetellaan taulukossa S1, 2 x SYBR Green (Applied Biosystems) ABI PRISM 7500 PCR kone (Applied Biosystems). C

T arvot määritettiin automaattisesti Sequence Detection Software versio 1.4 ja lopulliset laskelmat ilmaistiin kertainen eroja verrattuna B-aktiini käyttäen ΔΔC

T -menetelmä. Geenit kanssa havaitsematta ilme oli osoitettu C

T arvo 40. Virhepalkkien ilmaisun luvut keskivirheen.

Kromatiini Immunosaostaminen (chip) ja analyysi

Lyhyesti, silloittaminen DNA proteiinia ja solulyysi suoritettiin käyttäen EZ-Magna siru Kit (Upstate /Millipore) mukaan valmistajan ohjeiden. Sonikoimalla suoritettiin käyttämällä 8 x 30 sekunnin jaksoa 60% duty cycle jäähauteessa ja näytteet jäähdytettiin edelleen 30 sekunnin välillä sonikaatiosyklit. Kromatiini Immunosaostus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [28] pienin muutoksin. Vasta-aineet saatiin Upstate (Catalog numerot, a-H3Ac 06-599, α-H3K4me3 07-473, α-H3K9me3 17-625, α-H3K27me3 17-622) lukuun ottamatta Rabbit IgG ei-spesifistä vasta-ainetta Santa Cruz Biotechnology (Kataloginumero SC2027). Vasta-aine määrään reaktio määritettiin alustavissa kokeissa ja oli 5 ui varten α-asetyyli H3, 5 ui varten α-H3K4me3, 4 ui varten α-H3K9me3, 4 ui varten α-H3K27me3. 5 ui Rabbit IgG lisättiin negatiivisesta kontrollinäytteestä. Cross yhteydet purettiin lisäämällä 20 ui proteinaasi K: n (Promega) ja inkuboitiin 62 ° C: ssa 3 h ravistellen. Talteen DNA puhdistettiin sitten käyttäen PCR siivota (Qiagen, Valencia, CA, USA).

Reaaliaikainen PCR-analyysi immunosaostettiin kromatiinin

DNA kvantifioitiin käyttäen DNA: n kvantitointi System (Promega ) mukaan valmistajan ohjeiden ja mittaukset tehtiin käyttäen TD 20/20 luminometriä (Turner Designs, Sunnyvale, CA, USA). Reaaliaikaisen PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen 200 ρg DNA-templaatin kanssa SYBR Green 2 x perusseosta (Applied Biosystems) ja alukkeita, jotka on lueteltu taulukossa S1. Reaktiot suoritettiin kolmena kappaleena ja suoritettiin käyttäen ABI PRISM 7500 PCR kone (Applied Biosystems). C

T arvot määritettiin automaattisesti Sequence Detection Software versio 1.4 (Applied Biosystems) ja lopullinen arvot ilmaistiin prosentteina tulon fraktion. Virhepalkkien chromatin muutos luvut keskivirheen.

Tilastollinen analyysi

Standardipoikkeamat laskettiin ja T-testiä käytettiin vertaamaan ekspressiotasot ja histonimodifikaation tasoilla huumeiden käsitellyissä soluissa vastaan ​​käsittelemätöntä solut.

P

-arvot alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Perimän DNA Metylointi 5-atsa-dC hoito

Global metylaatio laskivat seuraavat 5-atsa-dC käsittely 53% ja 59% vuonna HCT116 ja SW480 solulinjoissa vastaavasti (kuvio 1). Tämä on merkittävä lasku verrattuna soluihin, jotka olivat mock käsitelty jota ei tapahtunut demetylaatio (HCT116 p-arvo = 0,003, SW480 p-arvo = 0,017). Jatkuva inkubointi solujen vielä kymmenen päivän kuluttua hoidon lääkkeettömän mediassa sallittu DNA uudelleen metylaatio ja genomista nousivat, mutta ei palaa samalle tasolle kuin havaittu ennen hoitoa tänä aikana.

Perimän metylaatio laskivat merkittävästi sekä solulinjoissa seuraavat 5-atsa-dC altistumista. Genominen metylaatiotasoilla oli vähitellen palautuu seuraavan kymmenen päivän lääkkeetön kasvu missä ne lähestyvät ennalta lääkehoidon tasolle.

Gene Erityiset metylaatio ja uudelleen ilmaisutapoja 5-atsa-dC hoito

Käyttämällä genomin laaja ilmaisu paneelit olemme aiemmin tunnistettu malleja geenien ilmentymisen seuraavista 5-atsa-dC hoito [22]. Samat geenit jälleen tarkasteltu tässä tutkimuksessa, jotta luonnehdinta histonimodifikaation. Tässä kokeessa ilmentyminen määritettiin kvantitatiivinen PCR ja geenit sitten jakaa viiteen luokkaan; ”Aina-ilmaistaan” (lauseke havaitaan kaikkina ajankohtina), ’säädelty ”(kaksijakoinen ilmentymisen jälkeen 5-atsa-dC hoito), pitkän aikavälin uudelleen” (havaitsematta käsittelemättömissä soluissa, mutta ilmaisi hoidon jälkeen, sillä sekä neljä ja kymmenen päivän kuluttua lääkealtistuksen (perustuu C

T-arvo 40 huomaamaton transkriptien)), ”lyhyen aikavälin uudelleen” (sama kuin ”pitkän aikavälin uudelleen” lukuun ottamatta päivä neljän ja /tai kymmenen ilmaisu, joka oli oltava 100-kertainen yläpuolella käsittelemättömät solut), tai ”muu” (muu malli geenien ilmentymisen).

kolme geeniä, jotka otettiin uudelleen käyttöön vain lyhyen ajan ( CXCL6 ja ZFP3 vuonna HCT116-soluissa ja CDKN2A in SW480-solut) olivat kaikki hypermetyloitunut poikki testattiin alueella niiden CpG saaria. Ekspressiokuviota näiden geenien oli selvästi erilainen toinen kahdessa solulinjassa; täällä, nämä geenit osoittivat hyvin vähän tai matala metylaation transkription aloituskohdasta (TSS) ja oli joko ilmaisseet jatkuvasti tai tuli sääteli (kuva 2). Geenit, jotka jäivät ilmentyy voimakkaasti jälkeen reaktivaatio (CDO1, HSPC105, MAGEA3) näkyy ainutlaatuinen metylaatio profiilit ja esillä hypometyloidut CpG sivuston vieressä transkription aloituskohdasta (TSS), kuten kuviossa 3. CpG-saarekkeen erityinen demetylaatio hoidon jälkeen oli 10- 15% korkeintaan ,, siis vain käsittelemättömiä metylaatiovyöhykkeiden on esitetty kuviossa 2 ja 3. tiedot neljässä aikapisteessä on esitetty kuviossa S1 varten MAGEA3-geeni, jolla oli suurin liittyvän geenin väheneminen DNA: n metylaation. Eräs esimerkki suora sekvensointi kromatogrammit MAGEA3 on esitetty kuvassa S2.

A – CXCL6 CpG-saarekkeen metylaation; Lyhyen aikavälin v aina-ilmaistuna. (B) – SW480-soluissa näkyy hypometylaatio ja CXCL6 ilmaistiin kaikkina ajankohtina. (C) – Yhtenäinen hypermetylaatiota HCT116-solulinjaa liittyy lyhyellä aikavälillä aktivoituminen ilmaisua. D, E, F – CDKN2A CpG Island metylaatio; Lyhyen aikavälin v vakio ilme. SW480-soluissa näyttää CDKN2A hypermetylaation ja tilapäisesti uudelleen ilmaistuna, kun taas HCT116-soluissa CDKN2A on -50% metyloitu CpG sivustoja lähellä TSS, ja ilmaistiin kaikkina ajankohtina. Tähdellä merkitsevät merkittävää muutosta verrattuna käsittelemättömiin soluihin. G, H, I – ZFP3 CpG Island metylaatio; Lyhyen aikavälin v sääteli ilme. SW480 solut osoittivat hypometylaatio at CpG sivustoja lähellä TSS ja ilmentyminen sääteli jälkeen 5-atsa-dC hoitoa. ZFP3 pysyy hypermetyloitunut HCT116-soluissa ja tilapäisesti uudelleen 5-atsa-dC hoitoa. J – Merkittävät muutokset histonimodifikaation käsittelemättömiin soluihin verrattuna (p 0,05).

A, B, C – CDO1 CpG Island metylaatio; Pitkällä aikavälillä v lyhyellä aikavälillä ilmaistu. Sekvensointi analyysi paljasti CpG sivustoja lähellä TSS vuonna SW480-soluissa on alhaisempi metylaatio ja näytetään pitkäaikaisen ilmentymisen verrattuna HCT116-solut, jotka ovat tasaisesti hypermetyloitunut klo CDO1 ja kokenut sääteli kuvio ilmaisun. D, E, F – HSPC105 CpG Island metylaatio; aina-ilmaisi v pitkällä aikavälillä ilmaistu. SW480-solulinja näkyy lokalisoitu hypometylaatio klo TSS ja voi pysyä ilmaista kymmenen päivää hoidon jälkeen. HCT116 solulinja hypometyloidut klo HSPC105 promoottori ja on jatkuvasti ilmaistu. G, H, I – MAGEA3 CpG Island metylaatio; aina-ilmaisi v pitkän aikavälin uudelleen ilmaistu. SW480-soluissa esiintyy paikallisia hypometylaatio klo TSS ja ilmaistaan ​​kymmenen päivää hoidon jälkeen. HCT116-solut osoittavat -50% metylaation TSS ja MAGEA3 ilmaistaan ​​kaikkina ajankohtina. J – Merkittävät muutokset histonimodifikaation käsittelemättömiin soluihin verrattuna (p 0,05).

Genes määritetty olevan ”aina ilmaistu” näkyy enintään 50% metylaation TSS mikä viittaa mono-alleelinen metylaatio, ja jopa geenien näkyy vaihtelevia metylaation. MLH1-geeni ilmennettiin molemmissa solulinjoissa ja metylaatio ei havaittu TSS liittyy CpG-saarekkeen (tuloksia ei ole esitetty). Kääntäen, variantti DICER1 ei ilmoitetaan joko solulinjassa milloin tahansa vaiheessa määritettynä mikrosiruanalyysillä ja puuttuminen sen ilmentyminen varmistettiin kvantitatiivinen PCR. DICER1 ei ole liitetty CpG-saarekkeen, siis bisulfiitti sekvenssianalyysi ei suoritettu. CDKN2A ilmaistiin HCT116 ja osoitti osittaista metylaatio klo TSS. Vastaava alue SW480 soluissa hypermetyloitunut ja ilme oli luokiteltu lyhyen aikavälin uudelleen käsittelyn jälkeen.

Jatkuva inkubointi solujen lääkkeettömän mediassa sallittu uudelleen metylaatio DNA, joka palasi alkuperäiseen tasolle promoottori CpG-saarekkeiden . Geenien ilmentyminen ei välttämättä vaikuta paluu promoottorin metylaation kuitenkin, ja ilmaus CDO1, HSPC105 ja MAGEA3 geenien SW480-soluissa edelleen korkealla kymmenen päivän kuluttua 5-atsa-dC hoitoa. Nämä geenit näkyvät ainutlaatuinen CpG-saarekkeen metylaation että ominaisuus hypometyloidut CpG sivustoja vieressä TSS. Kuten metylaatiotasoilla at promoottori CpG saarilla ei heijasta geenien ilmentymistä tutkittiin, pyrimme tutkimaan malleja histonimodifikaation kulloisellakin CpG-saarekkeiden, jotka voivat selittää korkeita ilmentymisen.

Kromatiini muutokset jälkeen 5-atsa-dC altistuminen

Kromatiini Immunosaostaminen ja q-PCR osoitti, että histoni H3Ac ja H3K4me3 olivat piirteitä liittyy ilmaistuna geenejä, kuten GAPDH ja MLH1 ja tukahdutettu geenejä liittyi H3K9me3 ja harvemmin H3K27me3 jotka poissa konstitutiivisesti ilmentyvien geenien .. ChIP tulokset on esitetty yhteenvetona kuviossa 2 ja 3, joissa p-arvot on lueteltu taulukossa 1. erityisiä muutoksia, kromatiinin muutoksia on esitetty kuvioissa S3, S4, S5, S6.

muutokset chromatin proteiineja seuraavat 72 tuntia altistuksen olivat riippuvaisia ​​geenin ilmentymisen aseman. Geenejä suurempi ekspressio hoidon jälkeen kasvoi H3K4me3, kun taas H3Ac vasta liittyvät geenit aktivoidaan pidempään. Yleensä tukahduttavaa H3K27me3 merkit vähenivät hoidon jälkeen, lukuun ottamatta CXCL6 geenin. Vertailu histonimodifikaation lyhyellä aikavälillä uudelleen geenien paljasti ohimenevä lisääntyminen histoni H3K4me3 ja vähentynyt tai vakaa taso trimetyyli-histoni H3 lysiinin 9 ja 27. Siitä huolimatta, transkriptio näiden geenien kymmenen päivää käsittelyn jälkeen oli vastaavassa käsittelemättömiin soluihin. Suurin yksittäinen ilmeinen ero lyhyen ja pitkän aikavälin uudelleen geenit oli H3Ac muutos. Geenit katsotaan pitkän aikavälin uudelleen ”paljasti kasvua H3Ac, vaikka ei aina päästä tilastollista merkittävyyttä, käsittelyn jälkeen jatkuivat kymmenen päivän kuluttua lääkehoitoa. Siellä oli myös suuntaus pitkällä aikavälillä uudelleen ilmaisi geenien, joissa lasku H3K27me3 havaittiin Ylös geenien (CDO1 in HCT116-soluissa ja ZFP3 in SW480) ja geenit, jotka olivat aina ilmaistuna osoitti voitto aktiivinen chromatin merkkien ja tappiota tukahduttavia histonimodifikaation jälkeen 5-atsa-dC altistumista.

keskustelu

epigeneettisellä geenien toiminnan säätelystä välittyy DNA: n metylaation ja histonimodifikaation. Muuttamalla DNA metylaatio ja ylös-geenin ilmentymisen säätelemiseksi voimme tunnistaa kuvioita muutoksen histoni proteiinin muunnoksia, jotka seuraavat pitkän ja lyhyen aikavälin uudelleenaktivointi epigeneettiseltä vaiennettu geenejä. Erityistä merkitystä tämän tutkimuksen oli näennäinen transkription säätely ylöspäin vaiennettu geenien näkyy alle 15% DNA demetylaation, jossa histoni muutokset todennäköisesti osallisena geeniekspression säätelyssä näissä tapauksissa.

Euroopan vaikutus DNA: n metylaatio geenien ilmentymisen

Riippumatta ekspressiokuvion aikana lääkehoitoa, missä määrin metylaation erityisesti CpG-saarekkeiden pysyi suhteellisen muuttumattomana verrattuna genomista tasolle sen jälkeen, kun 5-atsa-dC altistumista. Tämä havainto on tehty aikaisemmin, jossa metylaatio toistosekvenssien omiaan edistämään tämän ristiriidan [22], [29]. Toinen tutkimus osoitti, että DNA: n metylaatio korotukset edistäjiä kuin ilmaisi geenien kun estyy doksisykliini on tet-reagoiva promoottori järjestelmää [30]. Konstitutiivisesti geenejä hypometyloidut molemmissa alleeleissa, tai esillä CpG-saarekkeen metylaation 50%, mikä osoittaa mono-alleelinen metylaatio, kuten CDKN2A geeni HCT116-soluissa, kuten aiemmin on esitetty [31]. Lievä demetylaation promoottorin CpG-saarekkeiden indusoitiin 5-atsa-dC, mutta ilmentyminen ei välttämättä rajoittaa joissakin geenejä, kun metylointi palasi alkuperäiseen tasolle. Korkea ilmaus pitkän aikavälin uudelleen geenejä näytti olevan riippuvainen ennestään hypometylaatio klo TSS riippumatta siitä viereisen CpG sivustot olivat hypermetyloitunut. Tämä tulos osoittaa, kuvio metylaation sijasta yleisen tason metylaation kautta CpG saari on tärkeää uudelleen aktivoiva vaiennetaan geenien kautta vuorovaikutus muiden epigenetic tekijöihin. Hypometyloidut CpG sivustot hypermetyloitunut promoottorit on tunnistettu aiemmin onkostatiini M-reseptorin geeni [27], mutta vaikutus tämän hypometylaatio transkriptioon ei ole tutkittu. Miksi ilmaus pitkällä aikavälillä uudelleen geenit eivät esiinny käsittelemättömistä soluista, jotka näkyvät lähes identtinen metylaatiokuvion voidaan selittää muutokset muutostöitä histoniproteiineista.

Vaikutus histonimodifikaation geenien ilmentymisen

Katsaus tekijöistä, geenin ilmentyminen saavutettiin kokoamista CpG-saarekkeen sekvensointi ja chromatin immunosaostuksella tuloksia. Kun aktivoituminen lukuisten geenien ja luokittelu ilmaisun, voisimme erottaa geenien perusteella metylaation ja kromatiinin muutoksia läsnä. Ennen hoitoa, transkriptionaalisesti aktiivinen geenit oli ominaista korkeampi tukahduttavia muutoksia ja alhaiset aktivoivan markkaa. Käsittelemällä 5-atsa-dC oli yleensä kasvoi tasoihin H3K4me3 ja H3K9me3, kun taas H3Ac lisääntyi vain joitakin geenejä. Vähennysten H3K27me3 tapahtunut geenien Aluksi näkyvissä tämä piirre. Mitä tulee kromatiinin muutoksia, se oli aikana lääkkeettömän kasvukausi että histoni asetylaatio tuli eniten erottuva piirre välillä lyhyen ja pitkän aikavälin uudelleen geenejä. Pitkäaikainen uudelleen geenipromoottorit tuli yhä liittyy asetylaatio histoni H3 avustamalla geeniaktivaatioon kattavat kuitenkin vain merkittäviä määriä kymmenen päivän lääkkeettömän kasvua. Väliaikaisesti aktivoitu geenit eivät houkutella tämä muutos huolimatta lyhyen ajan ilmaisun. Vaikuttaisi siis siltä, ​​että käyttöönotto H3 Asetylaatiosta ratkaiseva tekijä kääntää transkription asemaltaan epigeneettiseltä vaiennettu geeni, joka avustaa lokalisoitu DNA hypometylaatio. Lukuun ottamatta H3K27me3 klo CDKN2A vuonna SW480-soluissa, pitkäaikaisia ​​muutoksia epigeneettiset muutoksia ei havaittu tilapäisesti uudelleen geenien.

säätely ylöspäin nöyrä ilmaisi geenien liittyi lisääntynyt H3 asetylaatio ja H3K4me3, kuten ZFP3 geenin SW480-soluissa. Metylointi profiileja kuten tämä voi olla merkki välimuoto aina-ilmaisi geenien ja pitkällä aikavälillä uudelleen geenejä. Co olemassa aktiivinen ja tukahduttavia merkit voivat sallia rajoitettu määrä transkription, mikä viittaa siihen, valvontaa näiden geenien ilmentymistä on riippuvainen tasapaino molempien muutoksia.

geenit tutkittiin tässä tutkimuksessa, roolit histoni H3 asetylaatio ja H3K27me3 olivat ilmeisiä kuin aktivoimalla ja tukahduttaa merkkien vastaavasti, mutta vaikutus H3K4me3 ja H3K9me3 eivät näyttäneet riitä muuttamaan geenin ilmentymistä pitkällä aikavälillä. Sen jälkeen 5-atsa-dC altistuminen, H3K9me3 oli usein kasvanut ilmaistuna geenejä, jotka on samaa viimeaikaiset havainnot, että se voidaan myös kytkeä geeniaktivaatioon [29], [32], [33]. Samoin H3K4me3 joka liittää aktiivisen genomin alueita löydettiin aktiivinen geenit, vaikkakin alentuneen tason. Havainnot tämänkaltaiset korostavat dynaamista luonnetta chromatin ja mahdollisesti ehdottaa välimuoto sorron samanlainen kahdenarvoista chromatin ympäröivään kehityshäiriöitä geenejä [34] tai vaikutuksen viereisen chromatin joka on havaittu johtuen vaihteluista leikkaussuunnassa tehokkuuden aikana ultraäänen avulla.

yhdistäminen DNA: n metylaatio, kromatiinin muutoksia ja geenin ilmentyminen

kuviot ilmentymisen uudelleen aktivoitu ja sääteli geenejä voidaan pitkälti selittää yhdistelmällä promoottorin metylointianalyysi ja chromatin immunosaostuksella määrityksissä. Havainnoimalla ja vertailu pitkän ja lyhyen aikavälin uudelleen geenit, tuloksemme osoittavat, että geenit, joiden paikallinen hypometylaatio klo TSS ovat todennäköisesti lisääntyä histoni H3 asetylointi ja pysyvät ilmaisi jälkeen 5-atsa-dC altistumista. Lisäksi havaitsimme, että tietty geeni ilmentyminen uudelleen ilman suurta muutosta siihen liittyvien CpG-saarekkeen metylaation ja tämä oli riippumaton lähellä hypermetylaation samassa CpG-saarekkeen.

tapahtumaketju mukana epigeneettisellä uudelleenaktivointi on ehdottanut Litt

et al.

[35]. Kirjoittajat toteavat, että aktivoituminen HPRT-geenin vaaditaan hemi-demetylaation promoottori, ”avaaminen” kromatiinin rakenteen, transkriptiotekijän sitova ja kokoamisen transkription monimutkainen ennen synteesin HPRT RNA. Perustuen meidän kokeita, voimme laajentaa tämän tiedon esittämällä vähäiset demetylaation aiheuttama 5-atsa-dC ja lisääntynyt H3K4me3 sallii transkription aloituksen. Rooli H3K9 trimethylation ei ole selvä, vaan saattaa liittyä uudelleenaktivointi joissakin tapauksissa. Menetys tukahduttavia merkkien kuten H3K27me3 voi myös lisätä transkriptio. Vaikka ei käsitellä tässä, on mahdollista MBD2 sitova voi hävitä tässä vaiheessa joka ei enää estää histoni liasetyylitransferaasi alueelta [36]. Transkriptio pitkittyy, jos lisääntynyt asetylaatio histoni H3 tapahtuu, muuten ilme on ohimenevä ja geenien ilmentymisen on todennäköisesti palaa aktiiviseen tilaan.

metyylitransferaasi estäjät hoidossa kasvainten

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet geenejä käytettiin tässä tutkimuksessa periksi metylaation muiden pahanlaatuisten kasvainten, kuten tiettyjen muotojen rintasyövän [24] ja munasarjojen [37] syöpä. Siksi uudelleenaktivointi kuvattu tässä tutkimuksessa ei voida rajoittaa peräsuolen syöpä, mutta myös muissa elimissä, joissa kääntyminen epigenetic tukahduttaminen voi olla terapeuttista hyötyä. Teho 5-atsa-dC hoitona rajoittuu tiettyihin kasvaintyypit kuitenkin mikä aiheuttaa myönteisen tuloksen 5-atsa-dC hoitoa ei tunneta. Sen menestys, voi kuulua metylaatiokuvion at hetkellä YK-tunnistettuja kohdegeenien ja huumeiden kykyä aktivoida vaiennetaan geenien pidemmän aikaa. Siksi tulokset viittaavat siihen, että tukahdutettua geenit näyttämällä lokalisoitu TSS hypometylaatio voidaan ottaa uudelleen käyttöön, jossa yhdistetty metyylitransferaasi /histonideasetylaasi estäjä hoitoa. Lisääntynyt asetylointi hypermetyloitunut transkription aloituspaikkoja, jotka johtavat pitkän aikavälin uudelleenaktivoinnista antiproliferatiivinen geenit voivat olla hyödyllisiä kasvainten hoidossa, kun nämä ovat tiedossa. Tämä mekanismi olisi lisäksi raportoitu synergistinen apoptoottisen vaikutuksen metyylitransferaasiestäjiä ja histonideasetylaasi inhibiittorit [28], [38].

Johtopäätös

analyysi kromatiinin on promoottorin geenien tämä tutkimus osoittaa, että nykyiset hypometylaatio seuraavat (mutta ei välttämättä aiheuttama) 5-atsa-dC hoito, aids histoni H3 asetylaatio, joko suoraan tai välillisesti. Yhdistelmä hypometylaatio CpG sivustoja TSS ja H3 asetylointi johtaa vakaa aktivoituminen geenien tutkittu täällä. Tulokset Tämän tutkimuksen esiin epigeneettisiä ominaisuuksia, jotka on muutettava suhteessa käänteisen transkription tilan geenien sairauden hoidossa. Strategisempi lähestymistapa johtaa kehitystä epigeneettiset hoitojen sijasta käyttöön epigeneettiset modifioivan lääkkeitä sytotoksisia hoitoja.

tukeminen Information

Kuva S1.

metylointi MAGEA3 vuonna SW480 soluissa, joita käsiteltiin 5-atsa-dC. Bisulfiitti sekvensointi PCR suoritettiin kunakin ajankohtana ja piirrettiin näyttää muutokset ennen ja jälkeen 5-atsa-dC hoito, The MAGEA3 geeni osoitti suurinta demetylaation kaikkien geenien määritettiin, jossa laskua 10-15% useissa CpG sivustoja lähellä TSS-geeni.

doi: 10,1371 /journal.pone.0023127.s001

(TIF) B Kuva S2.

Metylointi klo MAGEA3 transkription aloituskohdasta. A – promoottori metylaatio ympäri MAGEA3 CpG-saarekkeen. Punainen palkki osoittaa alueen esitetyn sekvenssin B ja C. B – Metylointi klo MAGEA3 TSS in SW480-soluissa. Suora sekvensointi bisulfiitin PCR-tuotteiden aiheuttaa kaksi C ja T piikit CpG sivustot, ja edustavat metyloitu ja metyloitumattomien alleelien vastaavasti. CpG sivuston vieressä TSS osoittaa suurempi osuus T alleelien (edustaa metyloitumattoman sytosiinin) osoittaa hypometylaatio, kun taas lähellä CpG sivustoja osoittavat lisääntynyt sytosiini huiput ja korkea metylaatiotasoilla. Nuolet osoittavat CpG sivustoja, boxed T: n osoittavat asema ei-CpG sytosiini ja alleviivattu sekvenssi edustaa transkription aloituskohdasta. C – CpG sivustoja HCT116-solulinjaa ovat yli 50% metyloituja.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0023127.s002

(TIF) B Kuva S3.