Krooninen sairaus

tiivistelmä

Gonadotropiinia vapauttavan hormonin-I (GnRH-I) on herättänyt voimakasta huomiota hormonaalista terapeuttinen työkalu, erityisesti androgen eturauhassyöpää sairastavilla potilailla. Kuitenkin androgeenisäädellyn riippumattomuutta syöpä vaiheissa on tuonut tutkijoita etsimään uusia lääketieteellisiä hoitoja. Aiemmissa raporteissa kehitimme GnRH-II-antagonisti Trp-1 estää proliferaatiota ja edistää autophagic kuoleman eri eturauhassyövän solut, mukaan lukien androgeeni-riippumaton soluja. Olemme edelleen seulotaan monia GnRH-II-antagonistien tunnistamiseksi molekyylien tehokkuutta. Tässä, tutkimme vaikutus SN09-2 kasvuun PC3 eturauhasen syöpäsoluja. SN09-2 vähensi kasvua eturauhassyövän soluissa, mutta ei ollut vaikutusta soluihin, jotka ovat peräisin muista kudoksista. Verrattuna Trp-1, SN09-2 näkyvästi esti eturauhasen syöpäsolujen kasvua, jo pieninä pitoisuuksina. SN09-2 aiheuttama PC3 solukasvuneston liittyi vähentynyt kalvo potentiaalia mitokondriot, joissa antagonisti oli kertynyt, ja lisääntynyt mitokondrioiden ja sytosolin reaktiivisia happiradikaaleja. SN09-2 aiheuttama laktaattidehydrogenaasin levittämistä median ja anneksiini V-värjäytymisen PC3 solun pinnalla, mikä viittaa siihen, että antagonisti stimuloi eturauhasen syöpäsolun kuoleman aktivoimalla apoptoottisia signalointireitteihin. Lisäksi sytokromin c vapautumista mitokondrioita sytosoliin ja kaspaasi-3 aktivaation tapahtui pitoisuudesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. SN09-2 esti myös kasvua PC3-solujen ksenotransplantaatio nude-hiiriin. Nämä tulokset osoittavat, että SN09-2 suoraan indusoi mitokondrioiden ja seurauksena ROS: n syntyminen, mikä johtaa ei ainoastaan ​​kasvun estäminen, vaan myös apoptoosin eturauhasen syöpäsoluja.

Citation: Park S, Han JM, Cheon J, Hwang JI , Seong JY (2014) apoptoottinen kuolema eturauhassyöpäsolujen jonka gonadotropiinivapauttajahormonin-II antagonisti. PLoS ONE 9 (6): e99723. doi: 10,1371 /journal.pone.0099723

Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 helmikuu 2014; Hyväksytty: 18 toukokuu 2014; Julkaistu: 13 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Park et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Basic Research Program (2013R1A2A2A01068295) ja National Research Foundation of Korea (NRF) rahoittama tiede, ICT, ja tulevaisuus suunnittelu ja National R Welfare (0520270-1). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin maligniteetti, jota esiintyy miehen sukuelimiin. Vaikka useimmat eturauhasen syöpiä ovat hitaasti kasvavia, ne voivat aiheuttaa kipua ja vaikeuksia virtsaaminen, ja aggressiivisempi ne todennäköisesti etäpesäkkeitä muualle elimistöön [1]. Maailmanlaajuisesti eturauhassyöpä on kuudenneksi yleisin syy syövän liittyvän kuoleman miehillä [2], ja Yhdysvalloissa, se on toiseksi [3]. Yhteinen hoito edenneen eturauhassyövän on hormonihoidon yhdistettynä sädehoitoon [4]. Päätavoitteena hormonihoidon on poistaa tai vähentää seerumin androgen, potentiaalinen kasvu nautintoaine eturauhassyöpään. Kuitenkin monissa tapauksissa, ensimmäinen regression kasvainten seuraa uudelleen kasvua riippumaton androgeenitason, lisääntynyt aggressiivisuus, ja korkea metastaattinen aktiivisuus [5]. Tästä syystä kehittää tehokkaita lääkkeinä androgeenin riippumaton eturauhassyöpä on kiireellinen ongelma.

hypotalamus-aivolisäke-sukupuolirauhasen akseli, gonadotropiinia vapauttava hormoni-I (GnRH-I), joka syntetisoitiin hypotalamuksen stimuloi aivolisäkkeen gonadotropiinien luteinisoivan hormonin (LH) ja follikkelia stimuloiva hormoni (FSH), joka puolestaan ​​moduloi synteesiä ja eritystä androgeenien, mukaan lukien testosteroni, kiveksestä [6]. Krooninen GnRH-I-agonisti johti alas-säätely GnRH reseptorin aivolisäkkeestä, mikä johtaa merkittävään vähenemiseen verenkierrossa androgeenitason [7]. GnRH-I-antagonistien on myös vähentää seerumin androgeenitason inaktivoimalla GnRH-reseptorin [6], [8]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että hormonivalmisteiden käyttämällä GnRH-I-agonistit ja antagonistit ovat sovellettavissa hyvänlaatuisen eturauhasen liikakasvun ja androgeeniriippuvaisen eturauhasen syöpiä. Lisäksi viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että GnRH-l vaikuttaa suoraan sekä androgeeniriippuvaisten ja androgeeni-riippumaton eturauhasen syöpäsoluja. GnRH-I-agonistit estivät epidermaalinen kasvutekijä tai insuliinin kasvutekijän stimuloimaa eturauhasen syöpäsolujen lisääntymistä, ja indusoi apoptoosin syöpäsoluissa olosuhteissa seerumideprivaatiolle [9], [10]. Nämä vaikutukset olivat ehdotettu välittyvän GnRH-I-reseptorin, joka stimuloi G

i-sidottu signalointi-riippuvaisen apoptoosin aktivaatiosta liittyviä proteiineja, mukaan lukien c-Jun NH

2-terminaalinen kinaasi (JNK) [11 ].

useimmissa selkärankaiset, muut tyyppi GnRH, GnRH-II, on tunnistettu, joka on rakenteellisesti konservoitunut evoluution kaloista nisäkkäisiin [12] – [14]. GnRH-II ilmaistaan ​​paitsi aivoissa mutta myös reuna lisääntymis- ja immuunikudoksissa [15]. Tämä laaja ilmaus malli voi antaa erilaisia ​​fysiologisia toimintoja peptidin. Samanlaisia ​​GnRH-I, GnRH-II kykenee säätelemään lisääntymistä naarailla stimuloimalla eritystä LH ja FSH [16], [17]. Vaikka molemmat GnRHs toimia ihmisen granulosa-luteal soluissa, niillä erilaisia ​​hormonaalisen säätelyn malleja [18], [19]. GnRH-II tuotettu ihmisen T-soluilla stimuloi laminiinireseptori ilmentymisen ja solujen vaeltaminen [20]. Mielenkiintoista on, että GnRH-II-indusoitu laminiinireseptori ilmaisua ei estänyt GnRH-I-antagonisti setroreliksiä, mikä tarkoittaa, että GnRH-II ei ole vuorovaikutuksessa GnRH-I-reseptorin [20]. Viime aikoina olemme ja muut ryhmät tunnistanut GnRH-II-reseptorin ei-nisäkäslajeista. Reseptori sitoutuu GnRH-II suurempi herkkyys ja affiniteetti kuin GnRH-I [21], [22]. Lisäksi GnRH-II-spesifinen reseptori kloonattiin apina ja kutsutaan nisäkkään GnRH-II-reseptorin [23]. Reseptori on erittäin selektiivinen GnRH-II, ja näyttää olevan erilainen kuin GnRH-I-reseptorin suhteen nopean sisäistämisen ligandin vuorovaikutusta ja signalointireittejä. Ihmisellä GnRH-II-reseptorin kaltainen geenit lokalisoitu kromosomeissa 1 ja 14. Vaikka mRNA: t näille geenit ilmentyvät monissa kudoksissa mukaan lukien aivot ja jopa monissa solulinjoissa, ne näyttävät olevan funktionaalinen pseudogeenien johtuu ennenaikaisen lopetuskodonin [24], [25]. Koska toiminnallisen G-proteiiniin kytketty reseptori GnRH-II ihmisen, mikä viittaa muun tyyppisiä sitovien kumppanien solukalvon, kun taas sen toiminnallinen välittäjäaineiden pysyvät vielä tuntematon.

Mielenkiintoista, GnRH-II esittelee kyky inhiboida munasarjasyöpäsoluja sekä syöpäsolujen [26], [27]. GnRH-II on todennäköisesti toimia eturauhasen syöpäsolujen vuorovaikutuksessa tuntemattomien proteiinien, jotka perustuvat edellisessä havaintoon, että radioaktiivisesti GnRH-II kykenee sitomaan erilaisia ​​ihmisen eturauhassyövän soluissa [27]. Tämä sitoutuminen joutuneiden tunnisteettomien GnRH-II, mutta ei GnRH-I. Tämä havainto viittaa siihen, että GnRH-II, voi olla mahdollinen lääke hoitaa eturauhasen syöpiä, vaikka korkean affiniteetin sitoutuminen GnRH-II: n syöpäsolujen näyttää ei ilmentymisen vuoksi tavanomaisen GnRH-II-reseptorin. Viime aikoina olemme kehittäneet uuden GnRH-II-antagonisti, jota kutsutaan trptorelix-1 (Trp-1). Trp-1 pystyy aiheuttamaan kuoleman androgeeniriippuvaisen ja riippumattaman eturauhasen syöpäsolujen taustalla olevien mekanismien, kuten mitokondrioiden seurasi reaktiivisen hapen (ROS) ja autophagy [28].

syntetisoitiin muita GnRH -II antagonisteja verrata Trp-1 vaikutusta ja parantaa kuoleman vaikutusta. Tässä esitämme toisen antagonisti, SN09-2 joka kykenee estämään proliferaatiota ja indusoivat kuoleman ihmisen eturauhasen syöpäsolujen, joilla on suurempi tehokkuus kuin Trp-1. Lisäksi toimintamekanismien kuolemasta ovat eri muodossa Trp-1, ja niihin liittyy aktivointi apoptoottisten reittien.

Materiaalit ja menetelmät

GnRH-II analogeja ja reagenssit

GnRH-II-antagonisti [Ac-D-Nal (2) -D-phe (4CL) -D-Pal (3) -Ser-Phe-D-Lys-Trp-Tyr-Arg-D-ala-NH

2], nimetty SN09-2, ja sen fluoreskeiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoidun muodon syntetisoitiin AnyGen (Gawngju, Korea). Trp-1 [Ac-D-Nal (2) -D-Phe (4CL) -D-Pal (3) -Ser-Tyr-D-Cit-Trp-Tyr-Pro-D-Ala-NH

2 ] syntetisoitiin myös sama yritys [28].

mitokondrion kalvon potentiaalia ilmaisin 5,5 ’, 6,6′-tetrakloori-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine jodidi (JC- 1), MitoTracker, ja 2 ’, 7’-dichlorfluorescein-diasetaatti (DCF-DA) ostettiin Invitrogen (Palo Alto, CA, USA). Soluviljelyalustoissa kuten Dulbeccon modifioitu Eaglen väliaine (DMEM) ja Roswell Park Memorial Institute (RPMI) saatiin Welgene Inc. (Daegu, Korea). Naudan sikiön seerumia (FBS) ja penisilliiniä /streptomysiiniä oli Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Kaikkien reagenssien kuten Hoechst 33342, anneksiini-V, H

2O

2, ja naudan seerumialbumiinia hankittiin Sigma (St. Louis, MO), ellei toisin mainita. Vasta-aineet lohkaistaan ​​kaspaasi-3, ehjä kaspaasi-3, ja sytokromi C ostettiin Cell Signaling Technology (Danver, MA, USA). Anti-β-aktiini-vasta-aineet olivat yhtiöltä Sigma.

Soluviljely

Kaikki solulinjat saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). PC3, LNCaP, DU145, ja DLD1 solulinjoja viljeltiin RPMI 1640, joka sisälsi 10% lämmöllä inaktivoitua FBS: ää, 100 yksikköä penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä 37 ° C: ssa ja kostutetussa 5% CO

2. HeLa-soluja viljeltiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: a samoissa olosuhteissa.

reportterigeenimäärityksessä

CV-1-solut olivat kulttuurin yön yli 24-kuoppalevyille ja transfektoidaan sen jälkeen liposomiin kompleksi, joka sisältää pGL3 /SRE-luc plasmidien kanssa bull sammakko GnRH-II (bfGnRHR-II) tai vihreä apina GnRH-II (gmGnRHR-II). Toinen 48 tuntia myöhemmin solut käsiteltiin GnRH-II (1 nM bfGnRHR-II, 10 nM gmGnRHR-II) ja eri pitoisuus SN09-2 tai Trp-1 6 h pestiin PBS: llä ja solublized lyysipuskurilla. Lusiferaasiaktiivisuus solu-uutteita määritettiin käyttäen standardi lusiferaasianalyysissä järjestelmän BioTek Instrument, Inc. (Winooski, VT). Sen määrittämiseksi, transfektion tehokkuus, lusiferaasiaktiivisuudet normalisoitiin β-gal-aktiivisuuden. Kaikki tiedot on laskettu vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta normalisoitiin käsittelemättömiin ryhmiin.

solunelinkykyisyysmääritys

Solut ympättiin 12-kuoppalevyille kolmena kappaleena (1 x 10

4 solua /hyvin). 24 tunnin kuluttua soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla GnRH-II-antagonistit, liuotetaan 0,1% DMSO: ta 24 tunnin välein, että ilmoitettu määrä päivää. Sitten solut pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), liukenevat trypsiini /EDTA: lla, ja suspendoitiin uudelleen 500 ul: ssa täydellistä kasvualustaa. Trypaanisinisen (0,4%) väriainetta-ilman solut laskettiin käännettyä mikroskooppia (Olympus, Tokio, Japani).

Laktaattidehydrogenaasi vapautumisen määrityksellä

(LDH) aktiivisuus määritys suoritettiin valmistajan ohjeiden (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa). Lyhyesti, PC3-solut ympättiin 12-kuoppaisille levyille 2 x 10

4 solua /kuoppa. Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla SN09-2 5% FBS: ää sisältävällä RPMI 1640: ssa 3 päivää. Elatusaineet siirrettiin Eppendorf-putkiin ja sentrifugoitiin 1 min 5000 rpm: ssä. Sata mikrolitraa kutakin supernatanttia siirrettiin optisesti kirkas 96-kuoppalevylle. Sata mikrolitraa vastavalmistettua Reaktioseokseen lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 30 min 25 ° C: ssa. Absorbanssi näytteiden mitattiin käyttäen 490 nm: n aallonpituudella suodattimen ELISA-lukijalla.

anneksiini V fluoresenssi

Apoptosis PC3-solujen arvioitiin käyttämällä apoptoosin havaitsemiseen kit (Koma Biotech, Soul, Etelä-Korea). Altistumisen jälkeen SN09-2 varten merkitty aikoina tai eri pitoisuuksina, PC3-solut otettiin talteen ja pestiin kylmällä PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen sitoutumispuskuriin, joka käsittää fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoitua anneksiini V-proteiinin ja propidiumjodidilla. Anneksiini V: n sitoutumisen ja PI-värjäyksellä määritettiin virtaussytometria-analyysillä (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Apoptoottiset solut määriteltiin PI-negatiivisia ja anneksiini V-positiivisia.

hoidon jälkeen SN09-2, PC3-solut poly-D-lysiinillä päällystettyihin Pääliliuskat kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 minuutin ajan, pestiin PBS: llä kolme kertaa, ja niitä inkuboitiin Cy3-konjugoidulla anneksiini V: Solut pestiin PBS: llä, ja pian inkuboitiin Heochst33342 (10 ug /ml). Stained soluja tarkasteltiin alle LSM510 -konfokaalimikroskoopilla (Carl Zeiss, Jena, Saksa).

Western blot-analyysi

Solut (5 x 10

4) maljattiin 100 mm ruokia . Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla SN09-2 eri aikoina, korjattu, ja inkuboitiin puskurissa, joka sisälsi 10 mM HEPES (pH7.9), 10 mM KCI, 0,5 mM DTT, ja proteaasi-inhibiittoriseosta (Roche) 30 minuuttia jäillä. Solut hajotettiin Dounce- homogenisaattorilla 20 iskua ja sentrifugoitiin 5900 x

g

10 minuuttia kerätä sytosolifraktion. Saatu pelletit suspendoitiin uudelleen kylmään puskuriin, sonikoitiin kolme kertaa, ja sentrifugoitiin 5900 x

g

10 minuutin ajan, jolloin saatiin raakaa mitokondrioiden proteiineja. Proteiineja kutakin fraktiota (20 ug) pantiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (12% geeli) ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Millipore, Billerica, MA). Membraanit blokattiin 3% naudan seerumin albumiinia ja inkuboitiin sopivia vasta-aineita. Kun oli pesty Tris-puskuroidulla suolaliuoksella, joka sisälsi 0,05% Tween 20, membraaneja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita ja signaalit havaittiin käyttämällä vahvistettua kemiluminesenssia liuosta (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, UK).

solunosasijaintia SN09-2

Kaksi päivää sen jälkeen, kun pinnoitus on poly-D-lysiinillä päällystettyihin peitinlasien 12-kuoppalevyille, PC3-solut käsiteltiin 66 nM MitoTracker 30 minuutin ajan ja sitten 10 mM FITC- SN09-2 10 min ajan 37 ° C: ssa. PBS-pesun jälkeen solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 min ajan. Tumat värjättiin Hoechst 33342. Fluoresenssi signaalit havaittiin konfokaalimikroskoopilla.

mittaus mitokondrion kalvon potentiaalia

Mitokondrioiden kalvojännite mitattiin käyttäen JC-1. Vuonna terveitä soluja, JC-1 muotojen aggregaattien sisällä mitokondriot, tuottaa punaisen fluoresenssin. Kuitenkin aikana mitokondrioiden Depolarisaatio, JC-1 monomeerejä hajanainen koko solun, tuottaa vihreän fluoresenssin. PC3-solut ympättiin poly-D-lysiinillä päällystettyihin kansi liukuu 12-kuoppalevyillä. Hoidon jälkeen 10 uM SN09-2 ja 3 päivää, soluja inkuboitiin PBS: llä, joka sisälsi JC-1 (2,5 ug /ml) 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Solut pestiin, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja niitä tarkkailtiin konfokaalimikroskoopilla. Inkubaation jälkeen JC-1, PC3 solut irrotettiin astian ja haki fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS).

Helmet konjugaation ja avattavan määritys

Helmet konjugaatio SN09- 2 tehtiin kuten edellisissä paperi [28]. Lyhyesti, N-hydroxysunninimide-Sepharose helmiä inkuboitiin SN09-2 kytkentäpuskurissa yön yli 4 ° C: ssa, ja pestiin sitten puskurilla, joka sisälsi 0,1 M Tris-HCl (pH 8,5) ja puskuria, joka sisältää 0,1 M asetaattia (pH 4,5) ja 0,5 M NaCl. Membraanifraktio PC3-solujen eristettiin homogenoimalla ja sentrifugoimalla. Saatu pelletit liuotettiin lyysipuskurissa, joka sisälsi 1% Triton-X 100 ja sentrifugoitiin 20000 x

g

15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantteja sekä SN09-2-konjugoidun Sepharose ja pestiin lyysipuskurilla. Sakat inkuboitiin 50 uM SN09-2 ja supernatantit haettu SDS-PAGE: lla ja Western-blottauksella anti-GPR75-vasta-aineita.

Solunsisäinen ROS

reaktiivisen hapen (ROS) oli mitataan DCF-DA. PC3-solut (1 x 10

5) maljattiin 60 mm: n annoksia, viljeltiin 5% FBS RPMI, ja käsiteltiin SN09-2 3 tuntia. Inkubaation jälkeen 5 uM DCF-DA 30 min ajan 37 ° C: ssa pimeässä, solut pestiin, suspendoitiin uudelleen PBS: ään, ja levitetään sitten FACS-analyysi.

Immunosytokemia

PC3 soluja (4 x 10

4) maljattiin peitinlaseja 12 kuoppalevyillä ja käsittele 10 uM SN09-2 12 tuntia. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 10 min ajan, läpäiseviksi 0,2% Triton-X PBS: ssä, pestiin ja blokattiin 3% BSA: lla PBS: ssa 30 min. Kanin polyklonaalista vasta-aineita lohkaistaan ​​kaspaasi-3 (1:200) ja hiiren monoklonaalinen anti-β-aktiini-vasta-aineita (1:1000) levitettiin soluihin. Aktiivinen kaspaasi-3 ja β-aktiini visualisoitiin inkuboimalla sekä Alexa 594-konjugoitua anti-hiiri ja Alexa 488-konjugoitua anti-kani-vasta-aineita 1 tunti. Sitten solut värjättiin Hoechst 33342 (1 ug /ml) 5 min ajan, asennetaan dioja, ja niitä tarkkailtiin konfokaalimikroskoopilla.

In vivo

kasvua eturauhassyöpäsolujen

Kuusi viikkoa vanhoja koiraspuolisia kateenkorvattomia nude-hiirten (BALB /c-nu) saatiin Harlan (Houston, TX). Hiiriä pidettiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa käytettäessä erikseen tuuletettu altaaseenpanoilmoitukseen järjestelmään. Kaikki koemenettelyt suoritettiin saatuaan hyväksynnän Institutional Animal Care ja käyttö komitean Clinical Research Institute Seoul National University Hospital. PC3-soluja (6 x 10

6) injektoitiin oikeaan kylkeen hiirten. Kymmenen vuorokauden kuluttua solujen injektion, kasvaimet, joiden tilavuus on noin 20-25 mm

3 kehittynyttä useimmissa hiirissä; kasvainten tilavuudet mitattiin joka päivä. Kasvaintilavuudet määritettiin kaksi kohtisuorassa mitat [pituus (

L

) ja leveys (

W

)] ja korkeus (

H

), mitataan Vernier jarrusatulat (jäljempänä kaava on

V

= (π /6) x (

W

×

L

×

H

). tästä lähtien, SN09-2 ( etikkahappoa muoto) liuotettiin 5% N, N-dimetyyliasetamidi (DMA), 10% glyserolia, ja 85% tislattua vettä, joka on biologisesti yhteensopiva liuotin injektoidaan subkutaani- hiiriin 25 peräkkäisen päivän ajan. tuumorin koko kussakin hiiren mitattiin joka päivä. Kuudesta seitsemään hiiriä käytettiin kunkin koeryhmän.

tilastollinen

tiedot analysoitiin käyttämällä PRISM4 ohjelmistoa (GraphPad). Ryhmä keinot verrattiin Studentin

t

testi- tai yksisuuntainen ANOVA seurasi Bonferronin monivertailu.

P

arvo 0,05 hyväksyttiin merkittävä.

tulokset

SN09-2 indusoi eturauhasen syöpäsolun erityinen kuoleman

aiemmin raportoitu, että uusi GnRH-II-antagonisti Trp-1 aiheuttama eturauhasen syöpäsolun kuoleman [28]. Tunnistaa tehokkaammin molekyyli, syntetisoimme 65 analogeja perustuu Trp-1 rakenne ja seulotaan kuolemaansa toimintansa PC3 ja LNCaP ilman myrkyllisiä toimintaa keuhkojen fibroblastien MRC-5. Lopuksi, SN09-2 valittiin mahdollisesti tehokkaan GnRH-II-antagonisti estää eturauhasen syöpäsolujen kasvua. Aiemmissa reportteri tunnistimme Trp-1 on antagonistinen aktiivisuus on GnRH-II [28]. Nykyinen reportterigeenimäärityksessä paljastaa SN09-2 on myös voimakas antagonistinen aktiivisuus GnRH-II myös verrattuna Trp-1 (Fig. 1). SN09-2 tehokkaasti antagonized vaikutus GnRH-II bull sammakko GnRH-II (IC

50 = 0,01 uM) ja vihreä apina GnRH-II (IC

50 = 1,9 uM). Kuitenkin Trp-1 esti aktivointi vain bull sammakko GnRH-II suuri teho (IC

50 = 0,25 uM). Sekvenssit GnRH-II, Trp-1 ja SN09-2 kuvattiin kuviossa. 2A. PC3-solut (androgeenista riippumaton eturauhassyöpä solua) käsiteltiin 10 uM SN09-2 elatusaineissa, jotka sisälsivät eri pitoisuuksia FBS: ää. Alhainen pitoisuus seerumissa (alle 2%) SN09-2 indusoi yli 95% kasvun inhibitio PC3-solujen 4 päivää. Ja jopa korkeampia seerumin, SN09-2 dramaattisesti inhiboi solun kasvua yli 85%, vaikka inhibitio vaikuttaa heikosti seerumissa (Fig. 2B). Hoito SN09-2 4 päivän indusoi 91% ja 88% kasvun eston PC3 soluja 5% ja 10% seerumia olosuhteissa, tässä järjestyksessä. Tämä tulos osoittaa, että SN09-2 säätelee negatiivisesti eturauhassyövän solukasvua seerumin riippumattomalla tavalla. Seuraavaksi eri syövän soluja käsiteltiin 10 uM SN09-2 5% seerumia sisältävässä väliaineessa määrittää eturauhassyövän solu-spesifinen vaikutus GnRH-II-antagonisti. Kolme päivää käsittelyn jälkeen SN09-2 kasvu PC3 ja LNCaP-soluissa merkittävästi vaimentua, ja että DU145-solujen myös inhiboi ≈50%, mikä viittaa siihen, että herkkyys eturauhasen syöpäsolujen SN09-2 voivat olla erilaisia. Kuitenkin, solujen kasvua muista kudoksista, kuten HeLa (kohdunkaulan syöpä) ja DLD1 (paksusuolen syöpä), ei vaikuttanut SN09-2 (Fig. 2C). Vaikka enemmän soluja tulisi testata, nämä tulokset voivat osoittaa SN09-2 on eturauhassyöpä soluspesifisestä kasvua estävä vaikutus.

Joko bfGnRHR-II tai gmGnRHR-II transfektoitiin SRE-luc-reportterin osaksi CV-1-soluissa . Soluja käsiteltiin antagonistien eri pitoisuuden läsnä ollessa GnRH-II (1 nM bfGnRHR-II, 10 nM gmGnRHR-II).

(A) Molecular sekvenssit GnRH-II, Trp-1 ja SN09-2 (B) PC3-soluja inkuboitiin RPMI-väliaineessa, joka sisältää erilaisia ​​pitoisuuksia FBS: ää ja altistettiin 10 uM SN09-2 ja 4 päivää. Määrä elinkelpoisia soluja, laskettiin valomikroskoopilla. (C) PC3, DU145, LNCaP, HeLa, ja DLD1 soluja inkuboitiin 5% FBS-alustaan, joka sisälsi 10 mM SN09-2 tai DMSO 3 päivää. (D) PC3-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla Trp-1 tai SN09-2 ja 3 päivää, ja sitten elävät solut laskettiin valomikroskoopilla. Solujen määrä kussakin ryhmässä verrattiin DMSO-käsitellyssä ryhmässä. CTL: DMSO-käsitelty. (E) PC3-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla SN09-2 varten 3 päivää. Käyttämällä viljelysupernatantit kustakin ryhmästä, LDH-aktiivisuus määritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tiedot ovat keskiarvoja ± keskivirhe *,

p

0,05; **,

p

0,01 vs. kontrolli.

Edellisessä raportissa, osoitimme, että Trp-1 inhiboivat PC3-solujen [28]. Tutkia kasvun inhibition tehokkuus GnRH-II-antagonistit, lisäsimme ne PC3-soluja viljeltiin 5% seerumia ehto 3 päivä. Verrattuna kontrolliryhmiin, sekä antagonistit vaimensi merkittävästi solun kasvun annoksesta riippuvalla tavalla. Lisäksi kaikki ryhmät käsiteltiin eri pitoisuuksilla, solujen kasvu voimakkaammin estää SN09-2 sijaan Trp-1, mikä viittaa siihen, että SN09-2 on todennäköisesti parempi molekyyli kehityksen eturauhassyövän estäjä (Fig. 2D). Estovaikutus solujen kasvuun voidaan korreloida solukuolemaa. Vahvista ajatus, mittasimme LDH-aktiivisuuden solu- viljelyväliaineeseen käsiteltiin eri annoksilla SN09-2. Kuten on esitetty kuviossa. 1E, aktiivisuus lisääntyi kaikissa SN09-2 käsiteltyjä soluja. Tämä tulos viittaa siihen, että SN09-2 kykenee stimuloimaan syöpäsolujen kuolemaan jopa pieninä määrinä. Vaikka suuri annos SN09-2 hieman lisääntynyt LDH-aktiivisuus, aktiivisuus ei korreloi annoksen agonistin, mikä tarkoittaa, että tämä määritys näyttää olevan liian herkkä erottamaan annoksesta riippuvainen aktiivisuus solukuolema.

Mitokondrioiden kertyminen SN09-2

Aiemmissa raporteissa me ja muut ryhmät havaittu, että radioleimattu GnRH-II sitoutuneena eturauhassyöpäsoluihin vuorovaikutuksessa noin 80 kDa proteiinia, jonka henkilöllisyys nimettiin glukoosin säätelemä proteiini 75 (GRP75), joka perustuu nestekromatografia-sähkösumutusionisaatiota-tandemmassaspektrometrian [11], [28], [29]. Mielenkiintoista, meidän avattavassa määritys osoitti myös, että SN09-2 suoraan vuorovaikutuksessa GRP75 (Fig. 3A). Koska GRP75 löytyy pääasiassa mitokondrioissa lopullinen määränpää SN09-2 ei voi olla solun pintaan. Tutkia solunsisäisen sijainnin antagonisti, me merkitty SN09-2 FITC ja lisättiin sen PC3 soluihin 1 uM: ssa 10 min. FITC-SN09-2 signaalia ei nähty solukalvon mutta tuman ympärillä. Kun käsiteltiin MitoTracker väriaine, FITC-signaalin päällekkäin, että väriaineen, joka osoittaa, että FITC-SN09-2 voivat kerääntyä mitokondrioiden (Fig. 3B). FITC-SN09-2 oli tuskin havaittavissa muita solulinjoja, kuten HeLa, MCF7, ja DLD1 (tietoja ei ole esitetty). Mitokondrioiden kertymistä Tämän konjugaatin on aivan samanlainen kuin FITC-konjugoitu GnRH-II: n ja Trp-1, joka oli heikennetty leimaamatonta GnRH-II. Tämä tulos merkitsee sitä, että tuntematon endosytoosin reitti GnRH-II: n ja sen antagonistit voivat esiintyä eturauhasen syöpäsoluja.

Soluja inkuboitiin FITC-konjugoidun SN09-2 ja MitoTracker. Pesun jälkeen solut lyhyesti leimattiin Hoechst33342 (for ydin värjäys). Kuvat on otettu alla -konfokaalimikroskoopilla. Punainen: MitoTracker, Green: FITC-SN09-2, Blue: Hoechst33342

mitokondriovaurioita ja ROS induktion SN09-2 käsiteltyjä soluja

Mitokondriovauriot ajatellaan olevan suoraan liittyvän solujen kuolema [30]. Mitokondrioiden kohdentaa SN09-2 voidaan yhdistää kuolemaan vaikutusta syöpäsolujen kautta toimintahäiriö organellin. Olemme tutkineet sähköinen potentiaali muutos mitokondrion kalvon, joka osoittaa mitokondrioiden toimintaan. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, 3 hoitopäivän PC3-solujen SN09-2 vähentynyt punaisen fluoresenssin intensiteetti ympärille ydin, mutta kasvoi keltainen ja vihreä fluoresenssi yli 80% sytoplasmassa, mikä osoittaa laskua mitokondrion kalvon potentiaali (Fig. 4B). Monissa tapauksissa, mitokondrioiden on edellytys sukupolven sytoplasmisen ROS. Kun PC3-soluja käsiteltiin 5 uM SN09-2, sytoplasminen ROS tasot, mitattuna fluoresenssin fluoroprobe DCF-DA, lisättiin (Fig. 4C). Vaikka geometrinen keskiarvo fluoresenssi oli paljon pienempi kuin mitä nähtiin H

2O

2-käsiteltyjä soluja, arvo voi riittää osoittamaan muuttamista mitokondrioiden toimintaa (Fig. 4D). Lisäksi SN09-2 lisääntynyt sytoplasminen ROS-tasojen annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 4E).

(A) käsittelyn jälkeen 10 uM SN09-2 ja 3 päivää, PC3-solut on peitelaseihin inkuboitiin JC-1, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, lyhyesti värjättiin Hoechst33342, ja niitä tarkkailtiin konfokaalimikroskoopilla. (B) SN09-2-käsiteltyjen PC3 solut irrotettiin maljalta ja lisättiin FACS-analyysiä tutkia fluoresenssin värinmuutoksen. (C) PC3-soluja käsiteltiin SN09-2 3 h inkuboitiin DCF-DA, ja soveltaa FACS-analyysillä (D) Positiivinen kontrolli solunsisäisten ROS. PC3-soluja käsiteltiin H

2O

2 5 minuuttia, merkitty DCF-DA, ja levitetään sitten FACS-analyysi. (E) geometrisia keskiarvoja fluoresenssisignaalit PC3 soluissa, joita käsiteltiin eri pitoisuuksilla SN09-2 on esitetty kaavioita. Tiedot ovat keskiarvoja ± keskivirhe **,

p

0,01 vs. kontrolli.

SN09-2 indusoi solukuolemaa aktivoitumisen kautta apoptoottisten signalointireittien

Mitokondriovauriot ja seurauksena ROS sukupolvi voi edeltää apoptoosin, tyyppi solukuoleman. Määrittämään mekanismit solukuoleman kannustanut SN09-2, me värjättiin PC3-solujen kanssa Cy3-konjugoidulla anneksiini V, joka sitoutuu spesifisesti membraaniin fosfatidyyliseriini. PC3-soluja käsiteltiin 10 uM SN09-2 24 h olivat laajasti värjättiin Cy3-anneksiini V, mikä viittaa siihen, että solut läpikäyvät apoptoottisen muutoksen (Fig. 5A). Kun soluja käytetään FACS-analyysi sen jälkeen, kun värjäämällä FITC-konjugoitua anneksiini V: n ja propidiumjodidilla, useimmat solut olivat FITC-positiivisia, mutta PI-negatiivinen, mikä tarkoittaa, että SN09-2 stimuloi apoptoottisen kuoleman, mutta ei nekroottisen kuoleman. Anneksiini V: värjäys dramaattisesti parantaa 9 h kuluttua 10pM SN09-2 hoitoa ja jatkuvaa, kunnes 24 h (kuvio. 5B). Alle pieninä pitoisuuksina SN09-2, muutaman solut FITC-positiivisia, kun taas useimmat solut käsiteltiin suuria pitoisuuksia (enemmän kuin 5 uM) olivat FITC-positiivisia, mikä viittaa siihen, että SN09-2 on tehokas apoptoosin indusoija eturauhassyövän soluissa (kuvio. 5C). Yhdessä leviämisen seurauksena harvinainen Solujen värjäytyminen käsiteltiin alle 0,5 uM SN09-2 osoittaa, että matalan annoksen antagonisti inhiboi solujen kasvua pikemminkin kuin stimuloiva solukuolemaa.

(A) PC3-soluja käsiteltiin 10pM SN09-2 on peitelaseihin inkuboitiin Cy3-konjugoidulla anneksiini V, ja lyhyesti värjättiin Hoechst33342. Fluoresenssi kuvat otettiin fluoresenssimikroskoopilla. BF: solumorfologiaan alla valomikroskoopilla (B, C) anneksiini V-positiivisia soluja kasvatettiin annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla (B) PC3-solut käsiteltiin SN09-2 kerättiin eri ajankohtina, inkuboitiin FITC-konjugoidun anneksiini V, ja soveltaa FACS-analyysi (C) PC3-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla SN09-2 12 h ennen anneksiini V-värjäyksellä. Tiedot ovat keskiarvoja ± keskivirhe *,

p

0,05; **,

p

0,01 vs. kontrolli.

sytokromin c vapautumiseen peräisin mitokondrioita on varhainen tapahtuma kaspaasiriippuvaisen solukuolemaa. Kun vapautumista sytokromi c: sytoplasmaan, se sitoo apoptoottisten proteaasi aktivoiva tekijä-1 ja prokaspaasi-9 muodostamiseksi apoptosome, joka myöhemmin aktivoi kaspaasi-3 ja -7 vastaa tuhota soluja [31]. Western blot-analyysi osoitti, että SN09-2 stimuloi sytokromi c: n vapautumisen sytoplasmaan on ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla. Eniten sytokromi c: vapautettiin mitokondriot käsitellyissä soluissa, joissa on enemmän kuin 5 uM SN09-2 (Fig. 6A, C), ja sytosolin kylläisyyttä proteiinin suoritettiin 24 h käsittelyn jälkeen (Fig. 6B, D).

(A-D) Western blot sytokromi c on sytosolin ja mitokondrioiden fraktiot (A, C) PC3-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla SN09-2 24 tuntia ja fraktioitiin sytosoliin ja mitokondriot. 20 ug lysaatit kustakin fraktiosta käytettiin SDS-PAGE: lla ja Western blotting anti-sytokromi c: vasta-aineita. (B, D) Solut, jotka käsitelty 10 uM SN09-2 kerättiin eri ajankohtina, ja sitten fraktioida.