Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tulehduksellinen suolistosairaus (IBD) on häiriö krooninen tulehdus lisääntynyt alttius peräsuolen syöpä. Etiologia IBD on epäselvä, mutta arvellaan johtua säädeltyyn mukautuva ja synnynnäisen immuunivasteen mikrobi tuotteita geneettisesti herkkien isäntä. Toll-kaltainen reseptori (TLR) signalointia aiheuttama suoliston commensal bakteerit on keskeinen rooli ylläpitää suoliston homeostaasiin, luontaisen immuniteetin ja tehostamiseen suolen epiteelisolujen (IEC) eheys. Kuitenkin rooli TLR2 kehittämisessä kolorektaalisyövän ei ole tutkittu. Hyödynsimme AOM-DSS malli koliitti liittyvän peräsuolen syöpä (CAC) villityypin (WT) ja TLR2

– /- hiirissä. Kaksoispisteet korjattu WT ja TLR2

– /- hiiret käytettiin histopatologia, Immunohistokemian immunofluoresenssilla ja sytokiinien analyysi. Hiiret puutteellisia TLR2 kehittyneet huomattavasti enemmän ja suurempia Kolorektaalituumorien kuin WT valvontaa. Tulosten mukaan paksusuolen epiteelin TLR2

– /- hiiret ovat muuttaneet immuunivastetta ja säädeltyyn leviämisen vakaissa olosuhteissa ja aikana koliitti, mikä johtaa tulehduksellinen kasvun signaaleja ja alttius kiihtyi neoplastisen kasvun. Aikaisintaan aikapisteissä arvioitiin, TLR2

– /- colons osoitti merkittävän kasvun poikkeavaan crypt pesäkkeitä (ACF), jolloin kasvain, joka kehitti aikaisemmin ja kasvoi suuremmaksi. Lisäksi suoliston microenvironment paljastavat merkittävästi korkeampi IL-6 ja IL-17A kanssa samanaikaisesti kasvanut fosfo-STAT3 sisällä ACF. Nämä havainnot osoittavat, että paksusuolen tulehdus, TLR2: lla on suojaava rooli kehittymistä vastaan ​​CAC.

Citation: Lowe EL, Crother TR, Rabizadeh S, Hu B, Wang H, Chen S, et al. (2010) Toll-kaltainen reseptori 2 Signaling suojaa hiiriä iältään kasvainten kehittymistä hiirimallissa Colitis aiheuttama syöpä. PLoS ONE 5 (9): e13027. doi: 10,1371 /journal.pone.0013027

Editor: Kathleen A. Kelly, University of California Los Angeles, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 kesäkuu 2010; Hyväksytty: 30 elokuu 2010; Julkaistu: 27 syyskuu 2010

Copyright: © 2010 Lowe et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Institutes of Health (AI-058128 täydentää MA) ja Donna ja Jesse Garber Endowment (KSM ja MA). Lisäksi, K.S.M. Tällä hetkellä tukee Crohnin ja Colitis säätiö Amerikan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Krooninen tulehdus ja syöpään kietoutuvat, erityisesti suolistossa, kuten nähdään tulehduksellinen suolistosairaus (IBD). IBD on ajatellaan johtuvan erittely on Epiteeliesteen, jonka jälkeen sopimaton vastauksia mikrobien tuotteisiin johtaen krooniseen tulehdukseen geneettisesti herkkien isäntä [1]. IBD liittyy kohonnut riski peräsuolen syöpä ja se on nyt yleisesti uskotaan, että krooninen tulehdus näillä potilailla johtaa neoplastisten muutosta suoliepiteeliin [2]. Oikea suoliston immuniteetti perustuu tasapainoon immunosuppressioon ja sopivasti ajoitettu proinflammatoristen vasteita suojaava tulehdusreaktioita. Proinflammatoristen sytokiinien ja kemokiinien jotka on tuotettu aikana krooninen suolistotulehdus vastauksena commensal bakteerit luoda mikroympäristön joka parantaa solujen proliferaatiota ja eloonjäämistä, ja angiogeneesissä, mikä edistää kasvaimen kehittymisen [3].

suolen epiteelisolujen (IEC) teko koska ensimmäinen puolustuslinja luomalla este mikrobeja vastaan. Luontaiset immuunijärjestelmän reseptorit kuuluvat perheeseen Toll-like-reseptorien (TLR) edelleen auttaa IEC erottaa ystävän vihollinen joukosta monimutkainen miljöö mikrobien. On yhä enemmän todisteita tukemaan merkittävä rooli TLR signaloinnin ylläpito suoliston homeostaasin [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Hiiret ablatoitu TLR2, TLR4, TLR9 tai niiden yhteinen Jatkemolekyylin MyD88, olivat akuutisti alttiita koliitti aiheuttamien kemiallisten colitogen dekstraaninatriumsulfaatti (DSS), mikä johtuu osittain heikentynyt suojaavia vasteita ja prostaglandiini tuotanto [7], [ ,,,0],8], [9], [10], [11]. Antibioottihoito huonontunut DSS-indusoidun koliitin MyD88

– /- hiirissä ja esti epiteelin korjaus, joka osoittaa yleisesti TLR signalointi tarvitaan riittävään IEC uusimista. Todellakin, hoito TLR2 [8] ja TLR9 [12] ligandit aikana DSS annon lievittää krypta vaurioita ja kiiti paranemista. TLR2-commensal signalointi säilyttää epiteelin kestävyys, edistää pikarisolutuottoon musiinieritystä, ja ylläpitää homeostaasiin kuluessa IEC [8], [13], [14], [15]. Lopuksi, koska sen suuntauksia vinossa kohti Th2-vasteet [16], [17], [18], [19] ja parantaa säätelevien T-solujen eloonjäämistä [20], [21], [22], TLR2 signalointi voisi olla tärkeä rooli ylläpitää tukahduttava ympäristön paksusuolessa.

Useat tutkimukset ovat sekaantuneet TLR signaloinnin suolen kasvainten synnyssä. Useamman suoliston neoplasia (Min) hiiriä, menetys MyD88 signalointi vähensi kasvainten lukumäärää ja kokoa viittaa siihen, että MyD88 signalointi edistää kasvaimen kasvua ja etenemistä [23]. Eräässä toisessa mallissa, kasvaimen esiintymistiheys, moninaisuus ja koko pienenivät jälkeen azoxymethane (AOM) ja DSS kohtelun TLR4 oli ablatoitu hiirillä pelkistämällä TLR4 ilmaisun ja signalointi IEC [24], [25]. Lisäksi koliitti ja koliitti liittyvä peräsuolen kasvaimet (CAC) spontaanisti syntyvän IL10

– /- hiirissä, voidaan parantaa, jos hiiret pidetään alkio-vapaissa olosuhteissa [26], tai samanaikaisesti ablatoitu TLR4 [27]. Yhdessä nämä tutkimukset tukevat että CAC kehitys riippuu suolen TLR tunnustamisesta commensal bakteereja. Huolimatta ilmeinen roolit TLR2 IEC homeostaasiin ja parantamiseen suvaitsevaisuuden lamina propriassa microenvironment [28], [29], ei tutkimus on selvitetty roolia että TLR2 voisi olla muutos suolen epiteelisolujen johtaa suoliston kasvaimia.

Tässä osoitamme, että TLR2-hiirillä kehittyy yhä suurempia koolonikasvainten kuin WT-ohjaus hiirillä AOM-DSS hoitoa. Parannettu paksusuolen kasvaimen kehitys on osoituksena varhain merkittävästi lisääntynyt määrä poikkeavan crypt foci (ACF) ja lisääntynyt IL-6, IL-17A, TNFa ja phosphoSTAT3 ilmaisun suoliston mikroympäristössä TLR2

– /- hiirillä verrattuna WT hiirillä. Tuloksemme osoittavat, että TLR2 on tärkeä suojaava tekijä suolen epiteelin homeostaasin ja sisältyy tärkeitä havaintoja aikaisemmin tunnistamaton rooli TLR2 signaloinnin CAC.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

Kaikki kokeet suoritettiin ohjeiden mukaisesti ja hyväksyttyjen käytäntöjen (IACUC # 2838) ja Cedars-Sinai Medical Center Institutional Animal Care ja käyttää komitean ja sijoitettiin häkkeihin erityisten taudinaiheuttajista vapaa olosuhteissa.

Eläimet

Helicobacter-negatiivisia villityypin C57BL /6J ja TLR2

– /- (on C57BL /6J tausta) hiiret saatiin Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

kasvainten (kuvio 1A) B

Colitis liittyvä peräsuolen syöpä (CAC) indusoitiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [30]. Lyhyesti, 6-8 viikkoa vanhoja hiiriin injektoitiin intraperitoneaalisesti (IP) ja 12,5 mg /kg azoxymethane (AOM, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO). 5 päivän jälkeen hiiret saivat 2,5% dekstraanisulfaattia natriumia (DSS; MP Biomedicals, Solon, OH, molekyylipaino 35,000-50,000 kDa) vettä 5 päivää ja sen jälkeen 16 päivää säännöllisen juomavettä. Hiiret altistettiin kaksi DSS sykliä, jonka jälkeen kolmasosa sykli 2% DSS vettä annettiin 4 päivää ja sen jälkeen säännöllisesti vettä 10 päivää. Päivänä 61 post AOM injektion hiiriin injisoitiin IP 100 mg /kg 5-bromi-2-deoksiuridiinia (BrdU, Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO) ja tapettiin 2,5 tuntia myöhemmin. Tarkkailla aikaisintaan transformatiivisia vaiheet CAC, hiiret tapettiin 4 päivää valmistumisen jälkeen ensimmäisen DSS syklin (14 päivän kuluttua AOM). Kliininen taudin kulun seurattiin mittaamiseksi painon, havainnointi verenvuotoa peräsuolesta, ripuli, ja verinen uloste aikana DSS hoidon.

(A) Kaaviokuva CAC mallin. Alkuvaiheen AOM injektion (12,5 mg /kg), DSS annettiin juomavedessä (boxed alueet) ja sen jälkeen säännöllisesti juomavettä. Hiiret tapettiin päivinä 14 tai 61 postitse AOM injektion (Päivä 61: n = 19 WT, n = 21 TLR2

– /- hiiret). (B) Prosentuaalinen painon muutoksen aikana AOM-DSS hoitoa. (C) Hiiren kuolleisuuden AOM-DSS hoitoja. (D) määrä Kolorektaalituumorien hiirtä kohti aiheuttama AOM-DSS hoidon päivänä 61. (E) määrä kasvaimia per hiiri sijaitsee proksimaalisen tai distaalisen kaksoispisteet WT tai TLR2

– /- hiirissä. (F) kokojakauma Kolorektaalituumorien muodostunut WT tai TLR2

– /- hiirissä. (G) Kasvaimen taakan AOM-DSS käsitelty WT tai TLR2

– /- hiirissä. Kaikki testit suoritettiin käyttäen 95%: n luottamusväli. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM. * = P 0,05, ** = p 0,01, *** = p 0,001.

Histologinen analyysi koliitti ja dysplasia

Koko colons huuhdottiin PBS: llä ja flash -frozen Sveitsin rullan suunnan. 7 um leikkeet kerättiin koko syvyys paksusuolen käyttäen kryostaattia ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H (1) Lisääntynyt lymfaattisessa aggregaatit; (2) Cryptitis (neutrofiilien crypt epiteelissä); (3) Crypt paise (neutrofiilit kertyvät sisällä krypta lumenin, joskus crypt repeämä); (4) Haavaumia (tappio limakalvon osien ja läsnäolo granulaatiokudoksen).

laajuus leukosyyttien infiltraatiota pisteytettiin

: (0) None; (1) tunkeutuminen rajoittuu limakalvoon; (2) tunkeutuminen ulottuu submukoosasta; (3) kulkeva laajennus inflitration.

vakavuus leukosyyttien infiltraatiota pisteytettiin lukumäärän perusteella infiltroituvien solujen

: (1) Lievä; (2) Kohtalainen; (3) Vaikea.

Prosenttia osallistuminen paksusuolen pisteytettiin

: (0,25) jos 1-25% paksusuolen oli mukana; (0,50), jos 26-50% paksusuolen oli mukana; (0,75), jos 51-75% paksusuolen oli mukana; (1,00), jos 76-100% paksusuolen oli mukana. Erikseen, olemme myös saada aikaan ”

määrin kuolion

” paksusuolessa seuraavasti: (1) = 25%, (2) = 50%, (3) = 75%, (4) = 100% . Kasvaimet tunnistettiin ja myös pisteytettiin vaikeusaste (adenooma tai karsinooma

in situ

). Tuumoritaakka hiirissä määritettiin alojen summa kaikista kasvaimista hiirtä kohti.

BrdU ja TUNEL värjäys

Kaikki kasvaimet havaita H 0,05, ** = p 0,01, *** = p 0,001.

Tulokset

TLR2-puutos johtaa lisääntyneeseen kehittämiseen koliitti liittyvien paksusuolensyöpä

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että TLR signaloinnin ja yhteisen Jatkemolekyylin MyD88 kriittisesti mukana suolen epiteelisolujen homeostaasiin ja kehittää suoliston kasvaimia [9], [10], [23], [24], mutta rooli TLR2 ei tutkittu laajasti. Jotta voidaan tutkia roolia TLR2 aikana koliitti liittyvän kasvainten synnyssä käytimme vakiintunut malli CAC [4], [24], [30], [31], [32]. WT ja TLR2

– /- hiiret saivat yhden injektion AOM jälkeen annetaan kolme sykliä DSS (kuvio 1A). TLR2

– /- hiirillä oli lisääntynyt sairastuvuus osoituksena lisääntynyt painon aikana hoidon (kuvio 1 B) ja verenvuoto peräsuolesta aikana DSS kohtelun kuin WT-hiirissä (tuloksia ei ole esitetty). Olemme myös löytäneet lisääntyneen kuolleisuuden TLR2 – /- hiirillä verrattuna villin tyypin hiiriin (4,6% WT ja 25% TLR2

– /- hiirille, p 0,05), jossa suurin osa kuolemista tapahtuu pian ensimmäisen aikana DSS (kuvio 1 C). Seuraavaksi tutkimme vaikutus TLR2-vajauksen koliitti liittyvien kasvainten kehittymiseen. TLR2

– /- hiirillä oli korkeampi tuumorikuorma kuin WT hiirillä. Histolopathological tutkimus paljasti merkittävän kasvun määrän kasvainten TLR2

– /- verrattuna WT hiiret (kuvio 1 D). Keskimääräinen kasvaimen määrä per hiiri lähes kaksinkertaistui TLR2-hiirissä verrattuna WT hiiriin (6,1 vs. 3,5, p 0,05). Koska suoliston TLR2 on voimakkaammin ilmaistaan ​​proksimaalisessa paksusuolessa [33], me arveltu, että hiiret puuttuu TLR2 voisi kehittää CAC proksimaalisesti. Itse asiassa ero kasvainten kehittymistä TLR2

– /- verrattuna WT hiirillä oli merkittävintä proksimaalisessa paksusuolessa (kuvio 1 E). Sen lisäksi, että kasvua kasvainten lukumäärää, TLR2-puutos johti myös merkittävästi suurempi määrä suurempia kasvaimia ( 1 mm

2) (p 0,05) (kuvio 1 F) ja korkeampi kasvaintaakkaa (lähes double) TLR2

– /- hiirillä verrattuna WT hiiriin (p 0,05) (kuvio 1G). Nämä tulokset osoittavat, että TLR2-puutos ei ainoastaan ​​paranna kasvain edistäminen mutta myös lisää syövän etenemiseen.

TLR2-puutosta colons olla kehittyneempiä dysplasia ja ß-kateniinin ilmentymisen verrattuna WT colons

ß-kateniinin signalointi on keskeinen merkitys ihmisen suoliston syövän synnyn [34] ja mutaatioita on raportoitu AOM aiheuttama hiiren paksusuolen kasvaimia [30], [31], [35]. Todellakin, voimakkaasti positiivinen soluliman tai ydinaseiden ß-kateniinin värjäytyminen havaittiin transformoitiin kudos WT ja TLR2

– /- hiirissä (kuvio 2B). WT peräsuolen adenoomien (kuvio 2A, B, vasen 2 paneelit) näytetään klassinen putkimaisia ​​rakenteita vääristynyt rauhaset ja maltillinen organisaatio. Kuitenkin TLR2

– /- peräsuolen kasvaimet (kuvio 2A, B, oikea 2 paneelit) näkyy enemmän muuttunut rauhaset alueisiin lisääntyneen epäjärjestystä ja seulamaisessa rakenteita merkitä korkeampaa dysplasiaa (ts karsinooma

in situ)

. Itse asiassa, histologinen analyysi paljasti lähes kaksinkertainen esiintyvyys kehittynyt syöpä

in situ

(0,3 vs. 0,6 tarkoittaa karsinooma in situ per hiiri) TLR2

– /- hiirillä verrattuna WT, joka tiettyjä kehityssuuntia kohti merkitys (p 0,055) (Kuva S1).

histopatologia kaksoispisteitä päivänä 61 AOM-DSS hoitoa. (A) hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,001) (kuvio 3A). Kaksoispisteet alkaen TLR2

– /- hiiret sisälsivät keskivaikea tai vaikea tulehdus, joka ulottui transmurally vaikka tulehdusta WT kaksoispisteet kuten samankaltaisia ​​syvyyksiin, mutta näkyy vain lieviä tai kohtalaisia ​​leukosyyttien (kuvio 3D). Lisääntynyt tulehdus löytyi tänä ajankohtana (päivä 14) TLR2 – /- hiirillä myös korreloi ankarampaa laihtuminen ja lisääntynyt kuolleisuus ensimmäisen kurssin DSS meidän pitkän aikavälin tutkimus (kuvio 1 B-C). WT hiiret edelleen kärsinyt laajempi haavaumia ja nekroosia kuin TLR2

– /- hiirillä (laajuus kuolion paksusuolen 2,5 vs 1,3, p 0,01) (kuvio 3B, D). Sen sijaan, TLR2

– /- hiiret osoittivat merkkejä palautuminen kanssa mukiinia ehtyminen, laajentunut ja hyperchromatic ytimet, ja lisääntynyt ydinvoiman sytoplasman suhde, kaikki alustavat poikkeavan crypt pesäkkeitä (ACF), joiden tiedetään olevan preneoplastisen [36 ] (kuvio 3D, oikea paneeli). Lisäksi havaitsimme samanlainen leviämisen mutta vähensi apoptoosin TLR2

– /- ACF verrattuna WT ACF (kuvio 3E, F), jotka voivat vaikuttaa säilymiseen transformoituneiden solujen. Todellakin, kvantitatiivinen analyysi ACF paljasti merkittävän kasvun ACF in TLR2

– /- hiirillä verrattuna WT hiiriin proksimaalisessa (p 0,001) sekä distaalinen kaksoispisteitä (p 0,01) (kuvio 3C).

pisteytys tulehduksen, kuolion ja ACF päivänä 14 AOM-DSS hoitoa (n = 5 WT ja n = 5 TLR2

– /-). (A) tulehduksellinen tulokset kaksoispisteitä. (B) laajuus paksusuolen kuolion. (C) määrä ACF per hiiri sijaitsee proksimaalisen tai distaalisen kaksoispisteet. (D) H 0,05, ** = p 0,01, *** = p 0,001.

TLR2-puutos on lisääntynyt solujen lisääntymisen ja vähentää apoptoosin aikana varhaisessa CAC kehityksen

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että tunnustaminen commensal bakteerien kautta TLR tarvitaan suolen epiteelin homeostaasiin, jota ohjataan tasapaino leviämisen ja apoptoosin kryptissa [10]. Jotta vertailla suoliston homeostaasin välillä TLR2

– /- hiiret ja WT hiiret, tutkimme epiteelisolujen lisääntymistä BrdU ja apoptoosin TUNEL värjäystä DNA pirstoutuminen paksusuolen crypts. Mielenkiintoista, ennen AOM-DSS havaitsimme vähensi määrää BrdU

+ soluja (kuvio 4A) on huomattavasti lisätty määrä TUNEL

+ -soluista (kuvio 4B) kohti krypta proksimaalisessa ja distaalisessa kaksoispisteet TLR2

– /- hiirillä verrattuna WT-hiirissä. Sen sijaan, kun yksi kierros DSS hoitoa (päivä 14), TLR2

– /- paksusuolen crypts näytetä lisääntynyt BrdU

+ soluja (p 0,001) (kuvio 4A, C) ja väheni TUNEL

+ solujen (p 0,001) (kuvio 4B, D) verrattuna WT hiiriin, osoittaen väärin säädellystä epiteelin homeostaasin TLR2

– /- colons aikana tulehdustiloja. Lisäksi, vaikka BrdU

+ solut ensisijaisesti paikallistettu kantasolujen vyöhyke WT kryptien, jakautuvat solut havaittiin laajennettiin keskelle alueille TLR2

– /- kryptien, jossa epiteelisolut ovat yleensä eriytetty ja ei-lisääntyvän (kuvio 4C). Siksi, koska limakalvon eheyden vaarantunut kaksoispisteet puutteellinen TLR2, kyky IEC noudattaa asianmukaisia ​​selviytymisen ja kuoleman signaaleja on vaarantunut, jolloin sen sijaan säädeltyyn solujen eloonjäämistä. Sen vahvistamiseksi, että varhainen suoliston tuumorigeneesiä TLR2

– /- hiirillä on riippuvainen DSS aiheuttama tulehdus tarkastelimme WT ja TLR2

– /- hiirissä 14 päivän kuluttua kertainjektiona AOM (ei DSS käsittely) kontrolleina. Emme havainneet mitään havaittavaa ACF tai lisääntynyt tulehdus WT tai TLR2-puutteellisia kaksoispisteet näissä kontrollikokeissa (kuva S2), mikä viittaa tärkeyden tulehduksen kehittymiselle kasvaimia yhteydessä TLR2-puutos.

Arviointi proliferaation BrdU värjäys ja apoptoosin TUNEL värjäyksellä läheisten ja etäisten kaksoispisteet hiiristä hoidettiin joko 14 päivän kanssa AOM-DSS hoito (päivä 14) tai käsittelemättömiä hiiriä (päivä 0) (n = 5), BrdU

+ (A) ja TUNEL

+ (B) solut laskettiin ehjä ja hyvin suuntautunut crypts. BrdU

+ solut kvantitoitiin vähintään 20 crypts alueittain 4 eri dioja eläintä kohti. (C) Päivä 14 edustava immunohistokemiallinen värjäys BrdU paksusuolen osissa. Alkuperäinen suurennos 100x. (D) Day 14 edustava immunofluoresenssivärjäyksessä värjäys TUNEL tahrat paksusuolen osissa. Alkuperäinen suurennos 100x. Kaikki testit suoritettiin käyttäen 95%: n luottamusväli. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM. * = P 0,05, ** = p 0,01, *** = p 0,001.

TLR2

– /- hiiret ovat lisänneet IL-6 ja STAT3 aktivoinnin aikana aikaisin suoliston tuumorigeneesin

lisäksi lisääntynyt solujen lisääntymistä ja tulehdusta, havaitsimme huomattavasti seerumin IL-6 TLR2

– /- hiirillä alkuvaiheessa kasvaimen jälkeen alkuperäisen AOM-DSS hoitoa (päivä 14) verrattuna WT-hiirissä (p 0,05) (kuvio 5A). Tärkeää on, että IL-6 edistävät syövän etenemisen tulehdukseen liittyvä kasvain mallit aktivoitumisen kautta STAT3 [37], [38]. Emme havainneet mitään merkittäviä eroja seerumissa muiden proinflammatoristen sytokiinien tai kemokiinien (IL-12p40, IL-1- beeta, MCP-1, KC, ja MIP-2) välillä WT ja TLR2

– /- hiirillä päivänä 14 AOM-DSS hoitoon (tietoja ei esitetty). Havaitsimme lisäksi lisääntynyt IL-6-tuotannon koko paksusuoli hashomogenaattien TLR2

– /- hiirillä päivänä 14 AOM-DSS kohtelun kuin WT hiiriin (p 0,01) (kuvio 5B). Lamina propria mononukleaarisolut (LPMC) eristettiin TLR2

– /- hiirillä käsitelty LPS: llä tuotti lisää IL-6 kuin WT LPMC (p 0,05) (kuvio 5C). Yhdenmukainen lisääntyminen IL-6-tuotannon TLR2

– /- hiirillä varhaisvaiheissa tumorigeneesin, havaitsimme huomattavasti tumakertymään fosforyloidun (aktivoitu) STAT3 (pSTAT3) in TLR2

– /- epiteelin verrattuna WT kaksoispisteitä (kuvio 5E). Kvantifiointi intensiteetti ydinvoiman pSTAT3 ACF paljasti 8-kertainen pSTAT3 ilmaisun TLR2

– /- ACF verrattuna WT ACF päivänä 14 (p 0,05) (kuvio 5F). Lisäksi, vaikka ydin- pSTAT3 ilme sisällä TLR2

– /- ACF rajoittui ehjä krypta epiteelisoluihin (kuvio 5E, oikea paneeli), ydinvoiman pSTAT3 WT ACF esiintyi enimmäkseen lamina propriassa tai abscessed crypts (kuvio 5E, vasen paneeli) . Kvantitatiivinen analyysi pSTAT3 lähtötilanteessa ei paljastanut mitään eroja TLR2

– /- vs. WT hiirillä (kuvio 5F).

Kentät A-C: IL-6-tuotannon WT ja TLR2

– /- hiirillä päivänä 14 AOM-DSS hoito mitattiin ELISA. (A) Seerumin IL-6 (n = 8 WT, n = 9 TLR2

– /-). (B) IL-6-pitoisuus paksusuolen homogenaateissa normalisoitiin proteiinin pitoisuus kudoksissa (n = 3 WT, n = 5 TLR2

– /-). (C) IL-6-erityksen eristetty paksusuolen lamina proprian soluja käsiteltiin LPS: llä (1 ug /ml), 6 h (n = 3-5). (D) Immunofluoresoivat tahroja fosfo-Stat3 paksusuolen kudoksiin WT ja TLR2

– /- hiirillä lähtötilanteessa. Alkuperäinen suurennos 100x. (E) immunofluoresenssivärjäyksellä fosfo-Stat3 paksusuolen kudoksiin WT ja TLR2

– /- hiirissä, joita hoidettiin 14 päivän ajan kanssa AOM-DSS hoito. Ylälevy alkuperäinen suurennos 40x, pohjapaneeli alkuperäinen suurennos 400x. (F) kvantifiointi fosfo-Stat3 intensiteetti mitataan ACF alkaen yli viisi painopiste aloilla vähintään neljä dioja eläintä kohti (n = 5 WT ja n = 5 TLR2

– /-). Kaikki testit suoritettiin käyttäen 95%: n luottamusväli. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM. * = P 0,05, ** = p 0,01, *** = p 0,001.

TLR2

– /- hiiret ovat lisääntynyt T

H17 immuunivasteen aikana CAC kehittäminen

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet T

H17 solujen synnyssä IBD [39] ja paksusuolen kasvaimen kehittymisen [40]. Tutkimme ilmentymistä T

H1, T

H2 ja T

H17 sytokiinien kaksoispisteet WT ja TLR2

– /- hiirillä aikana alkukehitys CAC. Kun havaitsimme tuotannon vähenemiseen IFNg paksusuolen homogenaateista, jotka ovat peräisin TLR2

– /- hiirillä verrattuna WT-hiirissä päivänä 14 (kuvio 6A), havaitsimme huomattavasti korkeampi TNFa tuotannon TLR2-puutosta kaksoispisteet verrattuna WT kaksoispiste (p 0,05) (kuvio 6H), joka on Th1-sytokiinin tiedetään olevan ratkaiseva merkitys CAC kehittämiseen [32]. Emme havainneet mitään tilastollisesti merkittäviä eroja IL-10 (kuvio 6B) tai IL-4 (kuvio 6C) tasot paksusuolen homogenaateissa näillä eläimillä. Sen sijaan havaitsimme yli 2-kertainen nousu IL-17A TLR2

– /- paksusuolen homogenaatit verrattuna WT (p 0,05) (kuvio 6D). Eristetty LPMCs alkaen TLR2

– /- hiirillä myös tuotti yli 7 kertaa enemmän IL-17A verrattuna WT soluja stimuloitiin uudelleen anti-CD3e ja anti-CD28 (p 0,001) (kuvio 6E). Havaitsimme myös merkittävästi lisääntynyt TGF-b in TLR2 puutosta colons verrattuna WT kaksoispisteitä (p 0,05) (kuvio 6F). Lisääntynyt tuotanto TGF-b ‥ IL-6, ja pStat3 vuonna TLR2

– /- hiirillä verrattuna WT edelleen tukee osallistumista T

H17 soluista. IL-23p19 on sytokiini, joka on liitetty ylläpito T

H17-soluja [41]. Havaitsimme, että TLR2

– /- paksusuolen homogenaatteihin ovat merkittävästi pienemmät IL-23p19 Lähtötilanteessa verrattuna WT kaksoispisteitä (p 0,001) (kuvio 6G). Kuitenkin, kun päivänä 14 AOM-DSS hoitoa, IL-23p19 tuotanto lisääntyi merkittävästi vuonna TLR2

– /- kaksoispisteet väheni WT kaksoispisteet (p 0,001) (kuvio 6G), mikä edelleen tukee vuorovaikutus TLR2 ja T

H17 soluista tässä mallissa. Lisäksi verrattuna WT colons päivänä 14 AOM-DSS hoito, TLR2

– /- colons näkyvät huomattavasti paksusuolen TNFa tuotanto (kuvio 6H), tiedetään olevan keskeinen merkitys CAC kehittämiseen [32].