Krooninen sairaus

tiivistelmä

NEDD9, polttoväli tarttuvuus rakennustelineet proteiinia, on hiljattain ehdotettu säätelemään ja metastaasit joissakin syövän tyyppejä, mutta tuntematon kohdunkaulan syöpä. Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, jos NEDD9 oli mukana etenemisen ja etäpesäkkeiden kohdunkaulan syövän. Koetulokset osoittivat NEDD9 proteiinin yli-ilmennetään kohdunkaulan syövän verrattuna normaaliin kohdunkaulan epiteelin kudoksia. Yliekspressio NEDD9 korreloi histologinen luokittelua, imusolmuke etäpesäke, ja FIGO vaihe kohdunkaulan syöpä. Hiljentäminen NEDD9 johti tyrosiinin defosforylointia FAK ja SRC onkoproteiineja, ja laski solumigraatio ja invaasion kohdunkaulan syöpä SiHa ja HeLa-solut. Yliekspressio NEDD9 johti tyrosiinifosforylaatio FAK ja SRC onkoproteiineja, ja lisääntynyt solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Lisäksi tyrosiinifosforylaatio NEDD9 pieneni merkitsevästi kautta tukahduttamalla tyrosiinifosforylaatiota FAK tai SRC, mikä viittaa positiivista takaisinkytkentäsilmukka tyrosiinifosforylaation välillä NEDD9 ja FAK tai SRC. Lisäksi tuloksemme osoittivat, että hiljentäminen NEDD9 laski vimentiinista ilmaisun ja lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen kohdunkaulan syövän soluja, ja päinvastoin. E-kadheriinin edellytti sääntelyn NEDD9, FAK ja SRC, mutta muuttunut kumpikaan tyrosiinifosforyloitunut eikä koko NEDD9. Tulosten perusteella näyttää, että NEDD9 yliekspressoituu kohdunkaulan syövän kudosten ja solujen, ja yli-ilmentynyt NEDD9 edistää muuttoliikkeen ja hyökkäyksen kohdunkaulankarsinooma soluissa, luultavasti kautta positiivista palautetta silmukka tyrosiinifosforylaation välillä NEDD9 ja FAK tai SRC.

Citation: Sima N, Cheng X, Ye F, Ma D, Xie X, Lü W (2013) yli-ilmentyminen Rakennustelineet Protein NEDD9 Edistää Muuttoliike ja Invasion kohdunkaulan syövän kautta tyrosiinifosforyloitunutta FAK ja SRC. PLoS ONE 8 (9): e74594. doi: 10,1371 /journal.pone.0074594

Leikkaus: Olivier de Wever, Gentin yliopisto, Belgia

vastaanotettu: 19 helmikuu 2013; Hyväksytty: 05 elokuu 2013; Julkaistu: 18 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Sima et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimuksen tukivat National Natural Science Foundation of China (nro. 30801227, 81272862), Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (nro. Y2100403; LY12H16020), National Basic Research Program of China (nro 2009CB521808), fundamentalistinen tutkimus varat Keski yliopistojen Kiinassa ja Zhejiangin maakunnan Program viljely korkean tason Innovative Health Talents. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kohdunkaulan syöpä on kolmanneksi yleisin diagnosoitu syöpä naisilla maailmanlaajuisesti erityisesti kehitysmaissa. Vuosittain noin 529800 naiset kohtaavat tämän sairauden, mikä on 9% koko uusista syöpätapauksista [1]. Vaikka nykyinen hoito strategioita, kuten radikaali kohdunpoisto ja sädehoidon on hyvä kliinisiä tuloksia, lähes 275100 kuolemantapausta ovat johtuvan kohdunkaulan syöpään vuosittain. Lisäksi leikkaus sopii vain alkuvaiheen sairauksien ja sädehoidon aiheuttaa ei-toivottuja sivuvaikutuksia, kuten munasarjojen toimintahäiriö, emättimen stenoosin, radiocystitis ja säteily proktiitin jotka vaikuttavat laatuun potilaan henkeä [2]. Siksi nämä tosiasiat korostavat kiireesti kehittämään tehokkaampia ja uusia terapeuttisia kohteita.

NEDD9 geeni, ensimmäinen tunnistettu hermosolujen esiastesolujen 1992 oli alassäädetty kehittämisen aikana hiiren keskushermoston [ ,,,0],3]. Sen jälkeen tämä geeni havaittiin myös muiden lajien ja kudoksissa. Law ym [4] seulottiin cDNA kirjastosta geenien aiheuttama rihmamaisia ​​hiiva silmikoitumiseen

S. cerevisiae

jotta löydettäisiin kandidaattigeenejä jotka voisivat koordinoida solun signalointi ja morfologia. ”Uusi” geeni tunnistettiin ja määrätty Human Enhancer of filamentaatioon 1 (HEF1). Toinen tutkimusryhmä havaitsi, että uusi 105 kD p130Cas liittyvä proteiini tyrosiinifosforyloituu palkkaamalla β1 integriinien T-lymfosyyteissä ja nimennyt sen lymfosyytti-tyypin Crk liittyvän alustan (CAS-L) [5]. Siten NEDD9 oli kaksi muuta riippumatonta nimiä historiassa. NEDD9 proteiinit säätelevät proteiinikomplekseille valvontaan solusyklin ja apoptoosin, muuttoliike, kemotaksista, ja erilaistuminen [6]. FAK ja SRC olivat sekaantuneet tärkeinä kohteina NEDD9 ja ne fosforyloitiin ja aktivoidaan yhteisesti, joka pidettiin ”ydin sääntelyä prosessi” of NEDD9 [7].

Viimeisten vuosien ajan muuttunut ilmentyminen rakennustelineiden proteiini NEDD9 on tullut edistää syövän etäpesäkkeiden useita syöpätyyppejä, kuten rintasyövän [6,8], glioblastooma [9], melanooma [10], keuhko [11,12] ja pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) [13]. Ei kuitenkaan tutkimuksessa tähän mennessä on selvittää onko NEDD9 liittyy ihmisen kohdunkaulansyövän. Viimeaikaiset raportit ovat viitanneet siihen, että NEDD9 yli-ilmentyy joissakin ihmisen karsinooman kuten melanooman [10] ja HNSCC [13]. Täällä havaittu NEDD9 ilmentymistä ihmisen kohdunkaulansyövän kudosten ja tutkia roolia NEDD9 etenemisessä kohdunkaulan syövän.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille ja kudosnäyte kokoelma

näytteitä kohdunkaula ja imusolmuke kudosten ja kliiniset parametrit 67 kohdunkaulan syöpäpotilailla (38 kohdunkaulan squamous karsinoomia ja 29 adenokarsinoomien), joka leikattiin vuonna 2005 2009 Naisten sairaala, School of Medicine, Zhejiangin yliopistossa, kerättiin ja yksityiskohtaisia ​​tietoja näytettiin taulukossa S1. Lisäksi 22 kohdunkaulan normaali kudosnäytteet verrokkeina olivat peräisin potilaista, joille tehtiin kohdunpoisto vuoksi hyvänlaatuisten gynekologisten sairauksien. Ei potilaat saivat kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen kudokset saatiin. Tutkimus tarkasteli ja hyväksynyt eettinen komitea Naisten sairaala, School of Medicine, Zhejiangin yliopistossa. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta tai heidän huoltajansa.

immunohistokemia

Kaikki kudokset immunohistokemiallinen värjättiin 4-pm: n osia arvioidakseen NEDD9 ilmentymistä näistä näytteistä. Hiiren monoklonaalinen vasta-aine 2G9 vastaan ​​NEDD9 (Abcam, 1: 1000) käytettiin primaarisena vasta-aineena. EnVision

TM havaitseminen pakki käytettiin menettelyt ja 3,3′-diaminobentsidiini (DAB) levitettiin kromogeenina. Kukin jakso pisteytettiin sokeasti semikvantitatiiviseksi määrittämiseen immunohistokemiallisella värjäyksellä intensiteetin patologi. Värjäys intensiteetti pisteytettiin seuraavasti: 0, ei värjäystä; 1, heikko positiivisuus; 2, kohtalainen positiivisuus; ja 3, vahva positiivisuus. Yhdistetty immunohistokemia tulokset saatiin yhteen intensiteetin tulokset kerrottuna solun osa tämän intensiteetin pisteet. Esimerkiksi jos yksilö esti kohtalaisesti värjäytymistä (sijoitettiin 2) 20% soluista ja vahva värjäytyminen (sijoitettiin 3) 30% soluista, komposiitti immunohistokemia tulokset olisivat (2 x 0,2) + (3 x 0,3) = 1,3. Keskiarvosana käytettiin tilastolliseen analyysiin.

Soluviljely

Ihmisen kohdunkaulan syövän solulinjat SiHa (HPV16-positiivisia), CaSki- (HPV16-positiivisia), HeLa (HPV18-positiivisia), C33A (HPV-negatiivinen), ihmisen ei-kasvain keratinosyyttisolulinja HaCaT ja ihmisen alkion munuais- solulinjoissa HEK293 ja HEK293T saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA). Soluja viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM, GIBCO, USA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), kosteutetussa atmosfäärissä 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Immunofluoresenssi

Neljäkymmentä kahdeksan tuntia sen jälkeen, kun pinnoitus lasipeitinlevyille, solut kiinnitettiin 3,7% paraformaldehydillä ja inkuboitiin hiiren monoklonaalisella vasta-aineella 2G9 (1: 200) vastaan ​​NEDD9 primaarisena vasta-aineena. Sen jälkeen, kun huuhtelu kolme kertaa PBS: llä, soluja inkuboitiin vuohen anti-hiiri-vasta-aine konjugoituna Alexa Fluor 647 (Invitrogen), laimennettu 1: 1500 2% BSA: ta sekundaarisena vasta-aineena. Tumat merkitty Hoechest33342 (Sigma).

siRNA: t valmistelu ja transfektio

Kirjallisuuden pohjalta [14] ja ilmainen web-pohjainen työkalu (https://www.dharmacon.com) , kolme paria siRNA: ita on suunniteltu vastaan ​​NEDD9 mRNA: ta. siRNA: t HPV16 E6 /E7 ja E-kadheriinin suunniteltiin kuten aiemmin on kuvattu [15]. Kaikki siRNA-dupleksit (taulukko S2) syntetisoitiin kemiallisesti by GeneChem Co., Ltd (Shanghai, Kiina). Transfektiot suoritettiin 6-kuoppalevyille ja käyttäen Lipofectamine ™ 2000 Transfection Reagent (Invitrogen, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Lentivirusvektorikonstruktit Production

täydellinen koodaava sekvenssi NEDD9 monistettiin PCR plasmideista, jotka sisältävät cDNA-klooni NEDD9 (Origene, USA) ja insertoidaan lentiviruksesta geeninsiirtovektorin pLenti6 /V5-DEST (Invitrogen, USA). Koodaavan sekvenssin lyhyen hiusneula-RNA: iden (shRNAs) kohdistaminen vihreä fluoresoiva proteiini (GFP) tai NEDD9 (taulukko S2) kloonattiin välittömästi sen jälkeen, kun U6 pol III promoottorin osaksi lentivirus geeninsiirtovektorin (Invitrogen, USA). Vektorit myöhemmin pakata lentiviraalinen hiukkasia HEK293T soluissa. Lentivirukset käytettiin infektoimaan kohdunkaulan syövän solujen, kuten aiemmin on kuvattu [16]. Tuotettu Lentiviruksiin titrattiin varastoinnissa ja käsittelyssä valmistajan ohjeiden.

kvantitatiivinen PCR

Yhteensä-RNA: t valmistettiin käsitellyistä soluista käyttämällä TRIzol reagenssia (Invitrogen, USA). Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR (qPCR) suoritettiin käyttäen 7300 Reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosystems) ja suoritetaan SYBR Green väriaine mukaan valmistajan ohjeiden. Oligonukleotidialukkeita syntetisoitiin Sangon Biotech Co., Ltd (Shanghai, Kiina). kuten taulukossa S2. Suhteellinen kvantifiointi mRNA: n ilmentymisen on laskettu 2

-ΔΔCT menetelmällä kuten aiemmin on kuvattu [17].

Western-blotit ja immunosaostus

Western blotit suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [18] . Solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen hajotuspuskuriin proteiinin uuttamalla. Viisikymmentä mikrogrammaa kokonais-proteiinin kustakin näytteestä tehtiin 10% SDS-PAGE-geelielektroforeesilla. Immunosaostukseen, solut hajotettiin 250 ul: aan immunosaostus puskuria. Yhtä suuret määrät proteiinia (300 ug) altistettiin immunosaostus ja sitä seuraava Western blot-analyysi. Kumulatiivinen harmaa taso Western blot bändejä saatiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa (NIH, USA) suhteellisen kvantifioinnin kvantitatiivisen analyysin. Ensisijainen vasta-aineet olivat spesifisiä seuraavista proteiineista: NEDD9 (ab18056) alkaen Abcam, FAK (3285), pFAK (3283), Src (2109), pSRC (2101), Phospho-tyrosiini (9411), vimentiinistä (3932) ja E-kadheriinin (3195) muodossa Cell Signaling, HPV16 E6 (MAB874), E7 (MAB8680) Millipore, GAPDH (sc-59540) ja β-aktiini (sc-1616-R) Santa Cruz. Bändit visualisoitiin käyttämällä ECL Kit (Pierce, USA).

Scratch haavan paranemista määritys

Scratch haavan paranemista määritys suoritettiin määrittämään solujen vaeltamiseen. Solut infektoitiin lentivirus ja 72 h myöhemmin kasvanut täyteen konfluenssiin. Sitten haavat (noin 1 mm leveä) valmistettiin mikropipetin avulla kärki naarmuuntunut läpi kuoppiin. Solu muuttonopeus laskettiin mittaamalla etäisyyden vaelsivat 24 tuntia. Valokuvat otettiin käyttämällä faasikontrastimikroskoopissa (Olympus, Japani) eri ajankohtina jälkeen tyhjästä.

TranswellTM määrityksissä

In vitro soluinvaasiota määritykset suoritettiin Matrigel-pohjainen TranswellTM levyjen oleellisesti kuvanneet aiemmin Pelletier et al [19] pienin muutoksin. 5 x 10

4 Solut siirrettiin Matrigel päällystettyjä ylä- kammioihin 24 kuopan TranswellTM levyille (Corning Costar, Cambridge, MA), jonka huokoskoko 8 pm. Alempi osastot täytettiin väliaineessa, jota täydensi 20% naudan sikiön seerumia. 24 tunnin inkubaation jälkeen ei-siirretyn solujen yläpinnan kalvot raaputettiin hellävaraisesti pois vanutupoilla ja siirrettyjä soluja, jotka olivat tunkeutuneet alapinnan värjättiin kristallivioletilla ja laskettiin. Solumigraation määritykset suoritettiin samalla tavalla, mutta ilman Matrigeliä.

Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa. Aineisto analysoitiin ohjelmistopaketin SPSS 12.0. Yksisuuntainen ANOVA ja Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan tietoja.

p

Arvo alle 0,05 pidettiin huomattavasti tilastollista.

Tulokset

NEDD9 yli-ilmennetään ihmisen kohdunkaulan syövän kudoksissa ja solulinjoissa

Saat vihjeen suhdetta NEDD9 proteiinin ja ihmisen kohdunkaulansyövän, käytimme immunohistokemiallinen analyysi määrittää ilmentymistä NEDD9 proteiinin ihmisen kohdunkaulansyövän kudosten ja analysoi yhdistys NEDD9 ilmaisun kanssa ihmisen kohdunkaulansyövän etenemistä. Olemme havainneet, että NEDD9 proteiini yli-ilmentyy useimmissa kohdunkaulan karsinooman kudoksissa, mutta huonosti ilmentyy normaaleissa kohdunkaulan epiteelin kudosten (kuvio 1A). Lisäksi, NEDD9 proteiini yli-ilmentyy metastaattinen imusolmukkeiden (kuvio 1 B). Lisäksi NEDD9 yliekspressio korreloi histologinen luokka, etäpesäke, ja levinneisyysaste (kuvio 1 C). Lisäksi, kuten on esitetty kuviossa 1D, NEDD9 mRNA yli-ilmentyy neljä yhteistä kohdunkaulan syövän solulinjat (SiHa-, HeLa, C33A ja CaSki) riippumatta HPV-positiivisia tai -negatiivinen mutta suhteellisen huonosti ilmaistuna ihmisen keratinosyyttisolulinja HaCaT ja ihmisen alkion munuaissolulinjasta line HEK293. Western blot-analyysi osoitti, että NEDD9 oli hyvin ilmaistu kohdunkaulan syövän solulinjat, samoin kuin qPCR. Immunofluoresenssilla analyysi osoitti, että proteiini NEDD9 oli yli-ilmentynyt kohdunkaulan syövän solulinjoissa ja jaetaan pääasiassa sytoplasmassa (kuvio 1 E).

(A) immunohistokemiallinen värjäys NEDD9 in squamous kohdunkaulasyöpä (SCC), adenokarsinooma kohdunkaula (AC) ja normaalin kudoksen kohdunkaula. Alkuperäinen suurennos, × 400. (B) immunohistokemiallinen värjäys NEDD9 metastaattisessa vasemmassa ulkoinen suoliluun imusolmukkeet SCC ja metastaattisen oikea obturator imusolmukkeet AC. Alkuperäinen suurennos, × 400. (C) Tilastollinen analyysi osoitti NEDD9 yliekspressio korreloi FIGO vaiheessa histologinen luokittelu ja etäpesäke. (D) Expression of NEDD9 mRNA: ta ja proteiinia, useissa solulinjoissa määritettiin kvantitatiivisella PCR: llä ja Western blot -analyysillä. (E) NEDD9 (punainen) lokalisointi ja ilmaisun arvioitiin immuunifluoresenssivasta analyysissä kohdunkaulan syöpä SiHa-, CaSki-, HeLa, C33A-solut ja ihmisen HaCaT keratinosyyteissä. Solut counter-värjättiin Hoechest33342 (sininen) ja visualisoidaan 60-kertaisella suurennuksella.

Altered ilmaus NEDD9 vaikutteita muuttoliikkeen ja hyökkäyksen kohdunkaulan syöpäsolut

Tunnistaa NEDD9 toiminnon kohdunkaulan syöpäsolut, me pudotti NEDD9 SiHa- ja HeLa-soluissa käyttämällä erityistä siRNA (S: 5 ’GAG ACA CCA UCU ACC AAG U [dT] [dT] 3’, AS: 5 ’ACU UGG UAG elokuu GUG UCU C [ ,,,0],dT] [dT] 3 ’), joka valittiin kolme ehdokkaat qPCR. Kuten on esitetty kuviossa 2A, 2B ja 2C, siRNA osoitti vahvaa häiriöiden vaikutuksia vastaan ​​NEDD9 mRNA: ta ja proteiinia, kohdunkaulan syövän SiHa- ja HeLa-soluissa. Edelleen, yritimme päättää, muuttoliike ja invaasion kohdunkaulan syöpäsolujen olisi heikennetty väheneminen NEDD9 ilmaisun kautta lentivirusta-kuljettaa shRNA. Tulokset siirtokuoppaan määritysten osoittivat, että NEDD9 shRNA kaataa invasiivisia ja muuttavia kykyä kohdunkaulan syövän SiHa ja HeLa-soluja (kuvio 2D ja 2E). Lisäksi tulokset haavan paranemista määritykset osoittivat merkittävästi haavojen hidas sulkemisesta NEDD9 shRNA saaneista vs. kontrolli SiHa ja HeLa-soluista 24 tunnin kuluttua alusta (kuvio 2F, 2G ja 2H). Olemme edelleen määritelty vaikutukset lisääntynyt NEDD9 solun muuttoliikettä ja invaasiota. Lentivirusvektoreita käytettiin yli-ilmentämään NEDD9 on HaCaT-soluissa (kuvio 3A). TGF (5 ng /ml), myös lisääntynyt ilmentyminen NEDD9 on HaCaT-soluissa (kuvio 3B). Tulokset Transwell testi osoitti, että eksogeeninen yliekspressio NEDD9 lisännyt soluinvaasiota ja muuttoliike HaCaT soluja ilman TGF stimulaatiota (kuvio 3C ja 3D).

NEDD9 pudotettiin by siRNA tai shRNAs kohdunkaulan syöpä SiHa ja HeLa-solut. (EN) häiriön vaikutukset varmistettiin kvantitatiivinen PCR SiHa- ja HeLa-soluissa. Expression of NEDD9 tutkittiin Western blotting SiHa- (B) ja HeLa-solut (C). Solut infektoitiin lentivirusvektoreilla, jotka koodaavat shRNA vastaan ​​NEDD9. Tulokset Transwell testi osoitti, että lentiviraalinen toimitus shRNA kohdistaminen NEDD9 johti pienentyneeseen soluinvaasiota (D) ja muuttoliike (E) SiHa ja HeLa-soluissa. Tulokset Scratch haavan paranemista määritys Lisäksi todennettiin, että hiljentäminen NEDD9 vähensivät solujen vaeltamiseen (F, G ja H). Mittakaava, 100 pm. *

P

0.05.

lentivirusvektoreita käytettiin yli-ilmentää NEDD9 ihmisen HaCaT keratinosyyteissä (A). TGF (5 ng /ml), myös lisääntynyt ilmentyminen NEDD9 ihmisen HaCaT keratinosyyteissä (B). Tulokset Transwell testi osoitti, että lentiviraalinen toimitus NEDD9 lisännyt soluinvaasiota (C) ja muuttoliike (D) HaCaT soluja ilman TGF stimulaatiota. Mittakaava, 100 pm.

Keskinäinen sääntelyn välillä NEDD9 ja FAK tai SRC

Lisäksi ilmaisuja FAK ja SRC, kaksi NEDD9 liittyvien proteiinien [4], joissa tautia esiintyy SiHa ja HeLa-solut määritettiin Western blot. Tulokset osoittivat, että ilmaukset fosfo-FAK (Tyr397) ja fosfo-Src (Tyr416), mutta eivät koko FAK ja yhteensä SRC proteiinia, oli merkittävästi vähentynyt seuraavia knockdovvn NEDD9 (kuvio 4A ja 4B). Vuonna yliekspressio kokeissa tyrosiinifosforyloitunut FAK ja SRC sijaan koko FAK ja koko SRC, oli merkitsevästi upregulated kun NEDD9 oli ulkoisesti yli-ilmennetään HaCaT soluissa (kuvio 4C ja 4D). Lisäksi, immunosaostus käytetään sen määrittämiseksi, FAK-estäjä PF-228 (Sigma, 10 uM) tai SRC estäjä PP2 (Sigma, 10 uM) säädellään ilmentymisen NEDD9. Tulokset osoittivat, että ilmentyminen tyrosiinifosforyloitunut NEDD9 sijasta yhteensä NEDD9, väheni huomattavasti, kun FAK tai SRC tukahdutettiin PF-228 tai PP2 SiHa- ja TGFp stimuloiva HaCaT soluissa (kuvio 4E ja 4F). Lisäksi PF-228 (10 uM) tai PP2 (10 uM) vähensi fosforylaatio FAK tai SRC in TGFli stimuloiva HaCaT soluissa (kuvio S1). PF-228 tai PP2 tukahdutetaan invaasion ja kulkeutumista SiHa ja TGFp stimuloiva HaCaT soluissa (kuvio S2). Samoin tulokset Transwell testi osoitti, että sekä estäjät tukahdutetaan solujen invaasion ja muuttoliike kasvoi eksogeeninen yliekspressio NEDD9 on HaCaT-soluissa (kuvio 4G).

(A ja B) ilmentäminen NEDD9 liittyvän onkoproteiineja, FAK ja SRC, tutkittiin Western-blottauksella. Tyrosiinifosforyloitunut FAK ja SRC sijaan FAK ja SRC, olivat huomattavasti alassäädetty kun NEDD9 hiljennettiin SiHa- ja HeLa-soluissa. (C ja D) Lisäksi tyrosiinifosforyloitunut FAK ja SRC merkittävästi voimistunut, kun NEDD9 on ulkoisesti yli-ilmennetään HaCaT-soluissa. (E ja F) tulokset immunosaostus osoittivat, että tyrosiinifosforyloitunut NEDD9 sijaan NEDD9, olivat merkittävästi alassäädetty kun FAK tai SRC tukahdutettiin FAK-estäjä PF-228 tai SRC-estäjän PP2 SiHa- ja TGFp stimuloivia HaCaT soluissa. (G) tulokset Transwell testi osoitti, että lisääntynyt solujen invaasiota ja muuttoliike eksogeeniset yliekspressio NEDD9 hiljennettiin FAK-estäjä PF-228 tai SRC-estäjän PP2 sisään HaCaT soluissa. Mittakaava, 100 pm.

NEDD9 säätelee vimentiinista ja E-kadheriinin kohdunkaulan syöpäsolut

vimentiinista ja E-kadheriinin olivat tärkeitä proteiineja suhteessa soluinvaasiota ja muuttoliike. Western blot-analyysi osoitti, että vimentiinista on alassäädetty ja E-kadheriinin on voimistunut, kun NEDD9 tukahdutettiin shRNA SiHa- ja HeLa-soluissa (kuvio 5A). Lisäksi vimentiinistä säädeltiin voimakkaammaksi ja E-kadheriinin oli alassäädetty kun NEDD9 yliekspressoitiin HaCaT soluissa (kuvio 5B). Tulokset viittaavat siihen, että vimentiinista ja E-kadheriinin osallistuvat säätelevän roolin NEDD9 solun muuttoliikettä ja hyökkäyksen kohdunkaulan syöpäsoluja. Tulokset Transwell testi osoitti, että vähentynyt soluinvaasiota ja muuttoliikkeen aiheuttama shRNA spesifisiä NEDD9 korotettiin transfektoimalla siRNA vastaan ​​E-kadheriinin (kuvio 5C ja 5D). Tulokset vahvistivat lisäksi, että E-kadheriinin oli tukahduttava sääntely proteiinin NEDD9 edistämisessä solujen vaeltamiseen ja hyökkäyksen kohdunkaulan syöpäsoluja. Lisäksi alassäädetty E-kadheriinin kautta yli-ilmentyminen NEDD9 merkittävästi voimistunut nojalla PF-228 tai PP2 vuonna HaCaT soluissa, välin sääteli vimentiinista ilmentyminen oli merkitsevästi alassäädetty (kuvio 5E). Käänteisessä kokeessa ei tyrosiinifosforyloitunut eikä koko NEDD9 merkittävästi muuttunut, kun E-kadheriinin tukahdutettiin siRNA HaCaT soluissa (kuvio 5F).

Expression of EMT markkereita, vimentiinistä ja E-kadheriinin, tutkittiin Western blottauksella. (A) vimentiinista oli alassäädetty ja E-kadheriinin oli voimistunut, kun NEDD9 hiljennettiin SiHa- ja HeLa-soluissa. (B) vimentiinista oli voimistunut ja E-kadheriinin oli alassäädetty kun NEDD9 yliekspressoitiin HaCaT soluissa. Tulokset Transwell testi osoitti, että vähentynyt soluinvaasiota (C) ja muuttoliike (D) shRNA on NEDD9 korotettiin siRNA vastaan ​​E-kadheriinin SiHa- ja HeLa-soluissa. Mittakaava, 100 pm. (E) E-kadheriinin oli voimistunut ja vimentiinista oli alassäädetty nojalla FAK-estäjä PF-228 tai SRC-estäjän PP2 in HaCaT solujen eksogeenisen NEDD9. (F) tulokset immunosaostus osoittivat, että tyrosiinifosforyloitunut NEDD9 ja koko NEDD9 eivät muuttuneet merkittävästi säänneltyjä, kun taas E-kadheriinin tukahdutettiin siRNA HaCaT soluissa.

E6 /E7 onkoproteiinia ei säännellä NEDD9 kohdunkaulan syöpäsolut

on tunnettua, että HPV-E6- ja E7-geenit ovat keskeisiä onkogeenien aloittamista kehittämiseen kohdunkaulan syöpä, mutta vaikutus E6: n ja E7 isännän geenejä, jotka liittyvät syövän etenemisessä on epävarmaa. Thus, havaitsimme mahdollisiin yhteyksiin E6 /E7 NEDD9 in kohdunkaulan syöpäsoluja. Kuitenkin menettämään HPV16 E6 /E7 siRNA ei muuttanut ilmaus NEDD9 in HPV16-positiivisia SiHa ja CaSki soluja (kuva 6A ja 6B), päinvastoin, alas-säätely NEDD9 ei vaikuttanut ilmaus E6 /E7 (kuvio 6C ja 6D). Tuloksemme viittaavat siihen, että NEDD9 on myöhässä molekyyli tapahtuma, joka osallistuu pääasiassa etenemiseen tai etäpesäkkeiden kohdunkaulan syövän.

(A ja B) tulos qPCR ja western blotit osoittivat, että riisto E6 /E7 siRNA ei tehnyt ’t muuttaa ilmaus NEDD9 HPV-positiivisten SiHa ja CaSki soluja. (C ja D) häiriöt NEDD9 ei vaikuttanut ilmaus E6 /E7 SiHa- ja CaSki soluja.

Keskustelu

Vaikka NEDD9 alun perin ensin määritelty yhdeksi uusista geenit ilmaistaan ​​hermo esiastesolujen mutta alassäädetty seuraavat sikiön kehitykseen [3], useat nykyiset tutkimuksissa havaittiin, että NEDD9 yliekspressio, kuten onkogeeniset signalointi poikkeavuuksia, liittyi syövän etäpesäke rintasyövän [6,20,21], glioblastooma [9] , melanooma [10] sekä pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) [13], sekä sidoksissa lääkeresistenssin ruuansulatuskanavan stroomakasvain (GIST) [22]. Viimeaikaiset tutkimukset osoittivat, että NEDD9 säätelee TGF väylän rintasyövän [23,24] ja maksan syöpä [25] ja Wnt signalointia kolorektaalisyövässä [26]. Lisäksi TGFp on voimakas solukierron ihmisen keratinosyyttien HaCaT soluja, mutta se on myös osoitettu edistää hyökkäyksen ja muuttoliike HaCaT soluissa [27,28]. Niinpä käytimme HaCaT solujen mallina opiskelemaan aiheuttaman muuttoliikkeen /invaasion fenotyypin.

Se on todistettu immunohistokemiallisella analyysi että NEDD9 ilmentyi ihmisen keuhkoputkien epiteelissä [29], ihmisen lymfosyyttien nivelreumassa nivelkalvoilla [30 ], rotan aivokuori ja hippokampus neuronien [31], ihmisen luomet ja melanooma [10], hiiren alkion encephalic ja runko hermostoputken [32], ihmisen myöhään alkava Alzheimerin tauti [33], hiiren ja kananpojan alkion hermostopienasta [34] , ihmisen pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC) [13]. Lisäksi immunohistokemiallinen analyysi on myös paljastanut, että NEDD9 yliekspressio korreloi HNSCC ja melanooma eteneminen [10,13]. Kohdunkaulan syöpä on hallussaan kliininen ominaisuus, joka etäpesäke imusolmuke esiintyy yleensä varhaisessa vaiheessa ja esittelee huonoon ennusteeseen. Näin ollen meidän havaita ja verrattiin NEDD9 ilmentymisen immunohistokemiallista analyysiä 67 kohdunkaulan syövän ja 22 kohdunkaulan normaaleissa kudoksissa, sekä kohdunkaulan syövän solulinjat ja ei-kasvain keratinosyyttisolulinja. Tuloksemme paljasti, että NEDD9 proteiinia yli-ilmentynyt useimmissa kohdunkaulan syöpä kudoksiin ja soluihin verrattuna normaaliin epiteelin kudosten ja ei-kasvain keratinosyyteissä. Edelleen olemme huomanneet, että NEDD9 yli-ilmentyminen korreloi imusolmuke etäpesäke, histologinen luokittelua, ja FIGO vaiheessa kohdunkaulan karsinooman potilailla. Tuloksemme olivat samanlaiset kuin Lucas JT, Jr. et al [13] vuonna HNSCC ja Kim M et al [10] melanooman ja viittaavat siihen, että NEDD9 yliekspressio voi liittyä etenemisen ja etäpesäkkeiden kohdunkaulan syövän.

NEDD9 proteiini säästää NH2-terminaalista Src homologia 3 (SH3) domain, joka sitoutuu proteiinia sisältäviä polyproliiniketjut motiiveja kuten FAK. FAK on yksi tärkeimmistä niihin liittyvien proteiinien NEDD9 erityisesti fokaalisen adheesion [4]. Natarajan M et al [9] ajatellut, että NEDD9 toiminut erityinen alavirtaan efektoreita FAK että edistetään glioblastoomasolulinjan muuttoliikettä ja invaasiota. Löysimme tutkimuksessa että NEDD9 ja FAK samalla jaetaan sytoplasmassa HPV16-positiivisia kohdunkaulakarsinooman SiHa soluja (tuloksia ei ole esitetty), mikä viittaa siihen, ehkä joitakin erityisiä yhteyksiä NEDD9 ja FAK. RNA-interferenssi (RNAi) on tehokas työkalu hiljentäminen geenit. Useat tutkimukset [9,10,14,25,34-38] ovat osoittaneet, että tietyt siRNA: t kohdistaminen mRNA NEDD9 geenin osaa alas-säädellä ilmentymistä NEDD9. Tässä käytimme RNAi välineenä tutkia roolia NEDD9 etenemisessä kohdunkaulan syövän. Lisäksi lentivirus geeninsiirtovektorin käytettiin eksogeenisesti yli-ilmentävät NEDD9 tutkimuksessa. Meidän kokeissa, siRNA: t kohdistaminen NEDD9 geenin esti tehokkaasti sekä mRNA: n ja proteiinin ilmentymistä NEDD9. FAK ja SRC olivat sekaantuneet tärkeinä kohteina NEDD9 ja ne fosforyloitiin ja aktivoidaan yhteisesti, joka pidettiin ”ydin sääntelyä prosessi” of NEDD9 [7]. Itse asiassa, toiminnot FAK ja SRC-proteiinien riippuu niiden tyrosiinifosforylaation tiettyjä aminohappotähteitä proteiineissa (esimerkiksi, Tyr416 SRC ja Tyr397 FAK). Niinpä havaitsimme tyrosiinifosforylaatio FAK ja SRC-proteiinin seuraavat säätely alaspäin tai säätelyä NEDD9 ja totesi, että hiljentäminen on NEDD9 johti tyrosiinin defosforylaatiosta sijaan vähentynyt ilmentyminen sekä FAK ja SRC. Mielenkiintoista on, että yli-ilmentyminen NEDD9 johti tyrosiinin fosforylaation FAK ja SRC. Lisäksi olemme myös löytäneet tyrosiini-fosforylaation sijasta ilmaisua NEDD9 estyi, kun tyrosiinia fosforylaatiota FAK tai SRC tukahdutettiin selektiiviset estäjät, kuten PF-228 ja PP2. Monet ryhmät ovat löytäneet NEDD9 on alavirtaan molekyyli FAK ja SRC joka edistää maahanmuuttoa ja invaasio liittyvä signalointi [39,40]. Kuitenkin useat tutkimukset ovat viime aikoina osoittaneet, että NEDD9 todennäköisesti toimi ylävirtaan signaalin FAK ja SRC [6,41]. Jatkuvasti vähentää FAK [6] ja SRC [41] aktivointi on esitetty solujen, jotka ovat peräisin NEDD9 knockout-kannan. Tulosten perusteella näyttää, että voi olla positiivinen takaisinkytkentäsilmukka tyrosiinifosforylaation välillä NEDD9 ja FAK tai SRC. Näin ollen, tyrosiinifosforylaatio oli jatkuvaa vahvisti kautta niin sanottu ”core asetuksen prosessi” ja lopulta muodostavat signaaleja ja metastaasit.

Koska alkuperäisen funktionaalisen analyysin vuonna 1996 [4,5], NEDD9 liittyi maahanmuuttoon , invaasio ja etäpesäkkeiden eri tutkimuksissa. Lain et al. löysivät NEDD9 voisi säädellä solujen polarisaatio [4], joka oli välttämätön vaihe solumigraation. Solumigraation on perusta syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäke. Tähän asti, NEDD9 havaittiin osallistua syövän etäpesäkkeiden glioblastoma [9], melanooma [10], ja rintasyöpä. Tällä hetkellä uskotaan, että NEDD9 proteiini liittyy maahanmuuttoon, invaasio ja etäpesäkkeiden syöpäsolujen [7,42]. Tuloksemme osoittivat, että NEDD9 proteiinia yli-ilmennetään kohdunkaulan syövän kudoksissa metastasiaa. Lisäksi estämällä NEDD9 ilmentymisen RNAi vaimennettu muuttoliike ja invaasion kohdunkaulan syöpäsoluja. Solut, joille epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) menettävät epiteelin morfologia ja hankkia liikkuvia fenotyyppi, jolla on keskeinen rooli syövän eteneminen ja metastaasit [43]. Vimentiinista ja E-kadheriinin olivat tärkeitä biomarkkerit epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT). Western blot-analyysi osoitti, että shRNA vastaan ​​NEDD9 vähentää ilmentymistä vimentiinista ja lisääntyneen ekspression E-kadheriinin ja NEDD9 yli-ilmentymisen ilmentyminen lisääntyy vimentiinista ja alas-säänneltyjen E-kadheriinin, joka on samanlainen kuin raportoitu Tikhmyanova N [21]. Lisäksi alassäädetty E-kadheriinin kautta yli-ilmentyminen NEDD9 merkittävästi voimistunut nojalla estäjän FAK tai SRC. Kumpikaan tyrosiinifosforyloitunut eikä koko NEDD9 merkittävästi säänneltyjä, kun taas E-kadheriinin tukahdutettiin. Tuloksemme viittaavat siihen, että NEDD9 yliekspressio edistää muuttoliikkeen ja invaasion kohdunkaulan syöpäsolujen luultavasti kautta, ainakin osittain, epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) kautta. E-kadheriinin on alavirtaan proteiini NEDD9 ja se voi olla keskeinen modulaattori NEDD9 välittämä syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota.

On hyvin tunnettua, että ihmisen papilloomaviruksen (HPV) -infektio on tärkein etiologinen tekijä kohdunkaulan syöpä [44]. Infektio korkean riskin HPV (HR-HPV), erityisesti HPV-tyypit 16 ja 18, syy-yhteydestä kehittämiseen kohdunkaulan syövän. Lukuisat raportit ovat osoittaneet, että korkean riskin HPV (HR-HPV) kannat erityisesti HPV-tyypit 16 ja 18 ovat onkogeenisiä, joka riippuu viruksen E6 ja E7 oncogenes että tavoite p53 ja pRb kasvain vaimennin proteiinit [45]. Ottaen huomioon E6 /E7, me arveltu, että oli joitakin yhteyksiä E6 /E7 ja NEDD9 alussa tutkimuksessa. Emme kuitenkaan ole muodostettava yhteys E6 /E7 ja NEDD9.