Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä edelleen johtava syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti, ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) osuus on noin 80% koko keuhkosyöpää. Käyttö myrkytön ruokavalion phytochemicals voidaan pitää kemoterapeuttinen strategia hallintaa NSCLC. Tässä me raportoimme, että viinirypäleen siementen proanthocyanidins (Gmailin sponsoroimia mainoksia) indusoivat apoptoosia NSCLC-solujen, A549 ja H1299,

in vitro

joka välittyy lisääntyneen ekspression pro-apoptoottisen proteiinin Bax, vähentynyt ilmentyminen anti-apoptoottisten proteiinien Bcl2 ja Bcl-xl, mitokondrioiden kalvon potentiaalia, ja kaspaasien aktivaatio 9, 3 ja poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP). Esikäsittely A549 ja H1299-solujen kanssa kaspaasi-3-estäjällä (Z-DEVD-fmk) merkittävästi estivät Gmailin sponsoroimia mainoksia indusoiman apoptoosin näiden solujen vahvisti, että Gmailin sponsoroimia mainoksia indusoiman apoptoosin välittyy kaspaasien aktivaatio-3. Hoidot A549 ja H1299 solut Gmailin sponsoroimia mainoksia johti lisääntymiseen G1 pidätykseen. G0 /G1 vaiheen solusyklin tiedetään ohjata sykliiniriippuvaisten kinaasien (Cdk), sykliinistä riippuvaisen kinaasin estäjät (Cdki) ja sykliinejä. Meidän western blot-analyysit osoittivat, että Gmailin sponsoroimia mainoksia indusoima G1 solusyklin pysähtymisen sen välittämien lisääntyneen ilmentymisen Cdki proteiinien (CIP1 /p21 ja Kip1 /P27), ja samanaikaisesti lasku tasot Cdk2, Cdk4, Cdk6 ja sykliinejä. Edelleen, anto 50, 100 tai 200 mg Gmailin sponsoroimia mainoksia /kg hiirillä suun kautta letkuruokinnalla (5 d /viikko), inhiboitui merkittävästi kasvua

sc

A549 ja H1299 keuhkojen tuumoriksenografteja kateenkorvattomissa nude-hiirissä, jotka liittyi induktion apoptoottisen solukuoleman, lisääntyneen ekspression Bax, vähentää ilmentymistä anti-apoptoottisten proteiinien ja kaspaasi-3: -tuumoriksenografti soluissa. Tietojen perusteella saatujen eläinten tutkimuksessa ihmisen ekvivalenttiannos on Gmailin sponsoroimia mainoksia laskettiin, mikä tuntuu kohtuuhintaisia ​​ja saavutettavissa. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että Gmailin sponsoroimia mainoksia voivat edustaa potentiaaliseksi terapeuttiseksi aineeksi ei-pienisoluinen keuhkosyöpä.

Citation: Singh T, Sharma SD, Katiyar SK (2011) rypäleen Proantosyanidiinit apoptoosia, jonka menettäminen mitokondrion kalvon Mahdolliset Ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Cells

In vitro

ja

In Vivo

. PLoS ONE 6 (11): e27444. doi: 10,1371 /journal.pone.0027444

Toimittaja: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 elokuu 2011; Hyväksytty 17. lokakuuta 2011; Julkaistu: 08 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Singh et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat varoja Veterans Administration Merit Review Award (SKK). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä edelleen johtava syy syöpään liittyvät kuolemat Yhdysvalloissa ja kaikkialla maailmassa [1]. Yksi kolmesta syöpään liittyvien kuolemien johtuu keuhkosyöpä, ja synkkä 5 vuoden pysyvyys on noin 14% on osoittanut mitään parannusta kolmen viime vuosikymmenen ajan [2], [3]. Pienisoluinen keuhkosyöpä ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) osuus 90% kaikista keuhkosyövässä. NSCLC vastaa noin 80% kaikista keuhkosyöpään ja sisältää levyepiteelikarsinoomia, adenokarsinoomien, ja iso-solukarsinoomat [4], [5]. Vaikka yhdistelmä kemoterapiaa ja sädehoitoa voidaan parantaa selviytymisen potilaiden, useimmat potilaat kuolevat sairauden etenemisen usein johtuvat hankittu tai luontainen resistenssi kemoterapeuttisia lääkkeitä [6]. Siksi tutkimisen ja kehittämisen tehokkaampaa terapeuttisia aineita ja hoitoja, jotka voivat kohdistaa molekyylejä kasvaimen kasvuun liittyvien ja apoptoosin vastus johtaa parempiin tuloksiin potilailla, joilla on keuhkosyöpä.

Natural kasvituotteet tarjota lupaavia uusia vaihtoehtoja kehittämään tehokkaampia kemoterapeuttisen strategioita syöpien eri elinten. Rypäleiden siemenet proanthocyanidins (Gmailin sponsoroimia mainoksia) ovat lupaavia phytochemicals jotka ovat tulehdusta [7] ja antioksidantti ominaisuuksia [8] – [10], ja näyttävät vähäinen myrkyllisyys laboratorioeläimillä [9], [10]. Gmailin sponsoroimia mainoksia ovat helposti pois rypäleiden siemenet, sivutuotteena viinirypälemehun ja viinin teollisuuden, ja ovat sekoitus usean polyfenolisia komponentteja, jotka muodostavat dimeerit tetra- ja oligomeerit /polymeerit monomeeristen katekiinit ja /tai (-) -epicatechins, kuten aiemmin on kuvattu [9], [10]. Uskomme, että ainakin jotkin aineosat Gmailin sponsoroimia mainoksia toimivat synergistisesti ja ne voivat tarjota parempia kemoterapeuttisia vaikutuksia kuin yksi osatekijä.

Aikaisemmin olemme osoittaneet, että ruokavalion täydentäminen Gmailin sponsoroimia mainoksia kanssa AIN76A verrokkiruoalla johti annoksesta riippuvainen kasvun eston A549 ja H1299 NSCLC -tuumoriksenografti kateenkorvattomissa nude-hiirissä, ja kasvua estävä vaikutus Gmailin sponsoroimia mainoksia on NSCLC ksenograftikasvaimissa oli mukana parantaminen insuliinin kaltaista kasvutekijää sitova proteiini-3 ja anti- angiogeenisten vaikutuksia kasvaimen mikroympäristöihin (11). Toisessa tutkimuksessa, meillä on myös raportoitu, että Gmailin sponsoroimia mainoksia estävät leviämisen ja apoptoosia NSCLC-solujen

in vitro

ja

in vivo

tuumoriksenografteja, joka liittyi niiden inhiboivia vaikutuksia oksygenaasi 2 ilmaisun ja tuotanto sen prostaglandiinin metaboliitin, PGE

2 (12). Sitä vastoin merkittävä soluproliferaation inhibointi ja apoptoosin induktio normaaleissa ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen jälkeen Gmailin sponsoroimia mainoksia hoidon identtisissä olosuhteissa ei havaittu [11], [12]. Huolimatta anti-syöpää aiheuttavat vaikutukset Gmailin sponsoroimia mainoksia on NSCLC-soluja, tarkka mekanismi inhiboiva vaikutus NSCLC solujen kasvuun ja apoptoosin Gmailin sponsoroimia mainoksia ei ole hyvin ymmärretty. Esillä olevassa tiedonannossa, teki laajan tutkimuksen mekanismi vastuussa eston keuhkosyövän solujen lisääntymisen ja apoptoosin avulla A549 ja H1299 solulinjoja kuin

in vitro

soluviljelymalli ja

in vivo

-tuumoriksenografti malli. Tutkia

in vivo

vaikutus Gmailin sponsoroimia mainoksia on -tuumoriksenografti kasvua, Gmailin sponsoroimia mainoksia annettiin hiirille letkulla suun kautta 5 päivää /viikko. Me raportoimme, että Gmailin sponsoroimia mainoksia aiheuttama apoptoottisen solukuoleman NSCLC-solujen välittyy modulaatiot, että ekspressiotasot pro- ja anti-apoptoottiset proteiinit, mitokondrion kalvon potentiaalin ja kaspaasi-3: aktivaatioreaktioteissä. Gmailin sponsoroimia mainoksia myös tarkistanut vapautetuilla solusyklin etenemisen ja niihin liittyviä sääntelyn proteiinien NSCLC soluissa. Niinpä meidän tutkimukset antavat käsityksen mekanismi, jonka Gmailin sponsoroimia mainoksia apoptoosia näissä soluissa. Lisäksi meidän tulokset antavat vakuuttavia perustelut farmakologinen aktiivisuus Gmailin sponsoroimia mainoksia ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut.

Materiaalit ja menetelmät

Reagenssit, kemikaalit ja vasta

Gmailin sponsoroimia mainoksia tässä tutkimuksessa käytetyt saatiin Kikkoman Corporation (Noda, Japani). JC-1 mitokondrion kalvon Mahdolliset Detection Kit, ja Anti-OxPhos Complex IV alayksikön IV (Cox IV) hankittiin Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Cell Death Detection ELISA Kit saatiin Roche Diagnostic Corporation (Indianapolis, IN). Ensisijainen vasta-aineet hankittiin seuraavasti: vasta-Bcl-2, Bcl-xl, Bax, kaspaasi-9, pilkottiin kaspaasi-9 ja -3, anti-poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) ja β-aktiini hankittiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA); vasta-sytokromi C, Smac /DIABLO, sykliini D1, sykliini D2, sykliini E CDK2, Cdk4, Cdk6, CIP1 /p21, Kip1 /P27 ja toisen vasta-aineet, piparjuuriperoksidaasi-sidottu anti-hiiri-immunoglobuliini G ja kaniinin vastainen immunoglobuliini G olivat saatu Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Kaspaasi-3-spesifinen estäjä (z-DEVD-fmk) hankittiin Calbiochem (San Diego, CA). ApoTarget Kit spesifinen kaspaasi-3: n aktiivisuuden määritys saatiin BioSource International, Inc. (San Diego, CA). Hamin F-12, RPMI 1640, penisilliiniä, streptomysiiniä ja trypsiini /EDTA saatiin Cellgro (Herndon, VA). Tehostetun kemiluminesenssin western blotting tunnistus reagenssit hankittiin Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ).

Soluviljely ja solulinjat

Ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat, A549 ja H1299, ja normaaleja ihmisen keuhkoputken epiteelisolujen hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). A549 ja H1299 solulinjoja viljeltiin yksikerrosviljelminä Hamin F-12 ja RPMI 1640 elatusaineessa, vastaavasti, jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (Hyclone, Logan, UT), 100 ug /ml penisilliiniä, ja 100 ug /ml streptomysiiniä ja pidettiin inkubaattorissa, jossa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% CO

2 37 ° C: ssa. Gmailin sponsoroimia mainoksia liuotettiin pieneen määrään dimetyylisulfoksidia [DMSO pitoisuus on enintään 0,1% (v /v)], joka lisättiin sitten loppuun soluviljelyalustaan ​​ennen lisäämistä Subkonfluentit solut (60-70% konfluentteja). Solut, jotka käsitelty vain vehikkelillä (DMSO, 0,1% media) toimi kontrollina.

Analyysi apoptoottisen solukuoleman ELISA

Soluja käsiteltiin Gmailin sponsoroimia mainoksia 48 tuntia ja sen jälkeen talteen. Gmailin sponsoroimia mainoksia indusoiman apoptoosin määritettiin käyttämällä Cell Death Detection ELISA Kit (Roche Diagnostics, Palo Alto, CA), joka määrittää sytoplasminen histoni-liittynyt DNA-fragmentit muodossa mononucleosomes tai oligonukleosomeja, seuraten valmistajan ohjeita.

kaspaasi-3-aktiivisuus määritys

kaspaasi-3: n solulysaateista mitattiin käyttämällä kolorimetristä proteaasimäärityksessä ApoTarget Kit (BioSource International, Inc., CA) seuraten valmistajan protokollaa. Lyhyesti, A549 tai H1299-soluja käsiteltiin Gmailin sponsoroimia mainoksia (20, 40, 60 ja 80 ug /ml) 48 tuntia. Sen jälkeen solut otettiin talteen käyttämällä lyhyitä trypsinaatiolla ja solulysaatteja valmistettiin seuraten valmistajan protokollaa. Näytteet solulysaateista (100 ug proteiinia per näyte) sekoitettiin reaktion puskuria ja 200 umol /l substraattia (DEVD-pNA kaspaasi-3), ja inkuboitiin 3 tuntia 37 ° C: ssa pimeässä. Absorbanssi mitattiin sitten 405 nm: ssä ja näytteen lukemien lasketaan vähentämällä absorbanssi nollanäytteet.

DNA solusyklin analyysi

Sub-konfluentteja soluja (50-60%) käsiteltiin vaihtelevia pitoisuuksia Gmailin sponsoroimia mainoksia täydellisessä elatusaineessa 48 h ajan. Sitten solut kerättiin, pestiin kylmällä PBS: llä, ja käsiteltiin solusyklin analyysi, kuten aikaisemmin on yksityiskohtaisesti kuvattu [13], [14]. Lyhyesti, solut (1 x 10

5) suspendoitiin uudelleen 50 ul: kylmässä PBS: ssä, johon 450 ui kylmää metanolia lisättiin, ja soluja inkuboitiin sitten 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Soluja sentrifugoitiin 1100 rpm: llä 5 minuuttia; pelletti pestiin kylmällä PBS: llä, suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan PBS: ää, ja inkuboitiin 5 ui RNaasia (20 ug /ml lopullinen pitoisuus) 30 minuuttia. Soluja inkuboitiin propidiumjodidilla (50 ug /ml) jäissä 1 tunnin ajan pimeässä. Solusyklin jakautumisen solujen määritettiin sitten FACSCalibur väline (BD Biosciences, San Jose, CA) varustettu CellQuest- 3.3 ohjelmiston Fluoresenssi soluerotte- (FACS) kone Core Facility UAB Kattava Cancer Center.

Immunosaostaminen ja western blot analyysi

hoidon A549 ja H1299 solujen Gmailin sponsoroimia mainoksia, solut kerättiin, pestiin kylmällä PBS: llä ja lyysattiin jääkylmällä hajotuspuskuria täydennetty proteaasinestäjät, kuten yksityiskohtainen aiemmin [12], [13]. Immunoblottausta sytokromi

c

, smac /DIABLO ja Cox IV, mitokondrioiden ja sytosolisia fraktiot valmistettiin soluista ja proteiinit erotettiin 10% Tris-glysiini-geeleissä ja siirrettiin nitroselluloosakalvolle. Sen jälkeen, kun esto ei-spesifisiä sitoutumiskohtia, kalvo inkuboitiin halutun primaarisen vasta-aineen 4 ° C: ssa yön yli. Sitten membraania inkuboitiin asianmukaisten peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen ja immunoreaktiiviset juovat visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssi- reagenssit. Kukin kalvo kuorittiin ja uudelleen tutkittiin anti-β-aktiini-vasta-aine, joka takaa tasapuolisen proteiinimäärän.

Cdk-estäjän (Cdki) -Cdk sitoutumismääritys, A549-soluja käsiteltiin ajoneuvon tai 60 ug /ml Gmailin sponsoroimia mainoksia 48 h, pestiin jääkylmällä PBS: llä, ja koko solulysaatit valmistettiin, kuten aiemmin on kuvattu [13]. Alikvootit, jotka sisältävät 200 ug proteiinia hyväksyttiin proteiini A /G-plus agaroosihelmiin (Santa Cruz, CA). CIP1 /p21 ja Kip1 /p27-proteiinit immunosaostettiin kokosolulysaattien käyttämällä spesifisiä vasta-aineita sen jälkeen, kun oli inkuboitu 8 tuntia, minkä jälkeen lisättiin proteiini A /G-plus agaroosi-helmiä (50 ui, Santa Cruz, CA) ja sitä jatkettiin inkuboimalla yön yli 4 ° C. Immunosaostumat pestiin, ja sen jälkeen suoritettiin Western blot-analyysi käyttämällä Tris-glysiinigeelejä seurasi immunoblottaus käyttäen Cdk2-, Cdk4 ja Cdk6 vasta-aineita.

määritys mitokondrion kalvon potentiaalia

muutos mitokondrion kalvon potentiaalia keuhkosyöpäsoluissa hoidon jälkeen Gmailin sponsoroimia mainoksia määritettiin virtaussytometrialla käyttämällä fluoresoivia lipofiilinen kationinen koetin JC-1 (5,5 ’, 6,6′-tetrakloori-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine jodidi) Detection Kit ohjeiden valmistajan, ja kuten on kuvannut meitä aiemmin [13], [14]. JC-1 kertyy valikoivasti sisällä ehjä mitokondrioita muodostamaan multimeeri J-aggregaattien säteilevät fluoresenssia valoa 590 nm: ssä. Monomeerinen muoto säteilee valoa 527 nm virittämisen jälkeen 490 nm: ssä. Siten väriaineen väri muuttuu oranssista vihreäksi riippuen mitokondrion kalvon potentiaalia, ja voidaan analysoida FACS vihreillä fluoresenssia kanavalla 1 (FL1) ja oranssi päästö kanavalla 2 (FL2).

Eläimet ja -tuumoriksenografti tutkimus

Nainen atyymisissä karvattomia hiiriä (4-5 viikkoa vanhoja) hankittiin National Cancer Institute (Frederick, MD), joka sijaitsee mukaisesti Institutional Animal Care ja käyttää komitean suuntaviivoja, ja varustettu steriloitu AIN76A ruokavalion ja vesi

halun

. Kaikki hiiret pidettiin standardeissa olosuhteissa 12 tunnin pimeä /12 tunnin valo sykli, jonka lämpötila on 24 ± 2 ° C, ja suhteellinen kosteus 50 ± 10%. Eläin protokollaa käytetään tässä tutkimuksessa hyväksyi Institutional Animal Care ja käyttö komitea University of Alabama at Birmingham, ja hyväksytty eläinten Protocol Number on: 101109267.

Voit selvittää

in vivo

tehoa Gmailin sponsoroimia mainoksia ihmisen keuhkosyöpä -tuumoriksenografti kasvua, eksponentiaalisesti kasvavia A549 ja H1299-soluja (2 x 10

6) on sekoitettu 01:01 suhdetta Matrigel (Becton Dickinson, Bedford, MA), ja 100 ui suspensio, joka sisälsi 2 x 10

6 solua injektoitiin sc oikeaan kylkeen kunkin hiiren. 24 tunnin kuluttua hiiret jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään (n = 10). Koe-eläimiä käsiteltiin oraalisesti letkuruokinnalla 50, 100 tai 200 mg Gmailin sponsoroimia mainoksia /kg ruumiinpainoa /päivä 100 ul: ssa PBS: ää viisi päivää viikossa (maanantaista perjantaihin) alkaa yhden päivän kuluttua kasvainsolun istutuksen. Kontrollihiiret saivat yhtä suuri tilavuus PBS: ää. Koe lopetettiin 58 päivää tuumorisolujen inokulaation jälkeen. Kasvaimen kasvua seurattiin 2-kertaa viikossa. Ruumiinpaino /hiiri ja ruokavalion kulutus /hiiri kirjattiin säännöllisesti koko kokeen ajan. Eläimiä seurattiin myös, jos he sairastuvat tai kärsimystä (puute normaali hoitotuotteita ja välttelykäyttäytyminen) koko kokeen ajan. Päättyessä Kokeen koko kasvaimen massa otettiin talteen, punnittiin, ja osa kasvaimen käytettiin valmistettaessa kasvaimen lysaatit analysoida ekspressiotasoja eri kiinnostavien proteiinien ja jäljelle jäänyt osa on käytetty immunohistokemiallista analyysia varten.

immunohistokemiallinen havaitseminen PCNA-positiivisten ja TUNEL-positiivisten solujen

Five-pm paksu tuumorisektioiden poistettiin parafiini ja niihin lisätään luokiteltujen sarjojen alkoholeja. Seuraavat nesteytystä, antigeenin haku prosessi suoritettiin sijoittamalla objektilasit 10 mM natriumsitraatti, pH 6,0 95 ° C: ssa 20 minuuttia, mitä seurasi 20 minuutin jäähdytyksen. Leikkeet pestiin PBS: ssä ja ei-spesifisiä sitoutumiskohtia blokattiin 1% BSA: ta, 2% vuohen seerumilla PBS: ssä ennen inkubointia anti-PCNA-vasta-aineita 2 h huoneen lämpötilassa. Pesun jälkeen leikkeitä inkuboitiin biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 45 min, minkä jälkeen HRP-konjugoitua streptavidiinia, pesu PBS: llä, inkuboimalla diaminobentsidiini substraattina, ja counterstaining hematoksyliinillä. Apoptoottista solukuolemaa kasvainkudoksissa havaittiin käyttäen terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasia välittämää dUTP nick-end merkinnät (TUNEL). Numerot PCNA-positiivisia ja TUNEL-positiivisia soluja havaittiin ja laskettiin valomikroskoopilla. Tulokset esitetään useita positiivisia soluja x 100 /Solujen kokonaismäärä.

Tilastollinen

tulokset

in vivo

tutkimukset edustavat vähintään 2-3 erillisen kokeen. Tilastollinen merkitys ero valvonnan ja Gmailin sponsoroimia mainoksia hoidetuissa ryhmissä laskettiin Studentin t-testiä (Sigma Stat 2,03, Jandel Scientific, San Rafael, CA). Kaikki määrälliset tulokset esitetään keskiarvona ± SD. Vuonna -tuumoriksenografti tutkimuksessa tilastollista merkitystä ero valvonnan ja Gmailin sponsoroimia mainoksia hoidetuissa ryhmissä määritettiin ANOVA seurasi Bonferronin t-testi, ja kussakin tapauksessa P 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

NSCLC-solut ovat herkkiä Gmailin sponsoroimia mainoksia indusoiman apoptoosin

Olemme osoittaneet, että hoito A549 ja H1299 NSCLC-solujen eri pitoisuuksilla Gmailin sponsoroimia mainoksia estää kasvua tai proliferaatiota mahdollisuuksia näiden solujen annoksesta ja ajasta riippuva tavalla. Gmailin sponsoroimia mainoksia indusoi myös apoptoottisen solukuoleman näiden solujen pitoisuutena riippuvaisella tavalla [11], [12]. Gmailin sponsoroimia mainoksia aiheuttama apoptoosin A549 ja H1299 solujen käsittelyn jälkeen 48 tuntia käyttäen FACS-analyysiä on esitetty kuviossa 1A. Kuitenkin tarkka mekanismi, anti-apoptoottisen vaikutusten Gmailin sponsoroimia mainoksia vastaan ​​NSCLC-soluja ei ole selvästi ymmärretty. Siksi tutkimusta tehtiin määrittää tarkkaa mekanismia mukana apoptoottisen solukuoleman NSCLC solujen käsittely Gmailin sponsoroimia mainoksia.

(A)

In vitro

hoidossa A549 ja H1299 solujen Gmailin sponsoroimia mainoksia indusoi apoptoosia annoksesta riippuvalla tavalla. Apoptoottisen solukuoleman analysoitiin FACS-analyysiä, ja yhteenlaskettu osuus apoptoottisten solujen A549 ja H1299 solut tiivistää keskiarvo ± SD, n = 3. Merkittävä ero versus muut Gmailin sponsoroimia mainoksia käsiteltyihin kontrolleihin:

*

P

0,05;

¶

P

0,01;

†

P

0,001. (B) käsittely A549 ja H1299-solujen Gmailin sponsoroimia mainoksia johtaa annoksesta riippuvaa ilmentyminen vähenee anti-apoptoottisten proteiinien Bcl-2 ja Bcl-xl ja lisäävät ilmentymistä pro-apoptoottisen proteiinin, Bax, määritettynä western blot-analyysi. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen tulokset olivat samanlaiset.

Gmailin sponsoroimia mainoksia ekspression vähentämiseksi anti-apoptoottisten proteiinien Bcl-x L- ja Bcl-2 ja lisäävät ilmentymistä pro-apoptoottisen proteiinin Bax A549 ja H1299-solut

proteiinit Bcl-2-perheen on tärkeä rooli apoptoosin säätelyyn toimimalla promoottorit (

esim

., Bax) tai estäjien (Bcl-2 tai Bcl-xl ) solukuoleman [15] – [17]. Western blot -analyysiä käyttämällä havaittiin, että hoitoa A549 ja H1299-solujen Gmailin sponsoroimia mainoksia 48 tuntia aiheutti annoksesta riippuvainen tasojen aleneminen anti-apoptoottisten proteiinien Bcl-x L- ja Bcl-2, ja lisää tasojen pro-apoptoottisen proteiinin, Bax, verrattuna apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään soluissa (kuvio 1 B). Näin ollen, käsittely näiden keuhkosyövän solut Gmailin sponsoroimia mainoksia voi muuttaa proteiinin tasot keskeisten jäsenten Bcl-2-perheen tavalla, joka suosii kasvua suhteessa Bax: Bcl-2, joka voi edistää herkkyyttä syöpäsolujen GSP aiheuttama apoptoosin [15].

Gmailin sponsoroimia mainoksia aiheuttaa mitokondrion kalvon potentiaalia ja myöhemmin parantaminen vapautumisen sytokromi c: ja Smac /DIABLO NSCLC soluissa

mitokondrion kalvon potentiaalia on yhdistetty aloittamiseen ja aktivointi apoptoottisten prosessin soluissa [15], [16]. Vapauttamista sytokromi c: ja smac /DIABLO mitokondrioista sytosoliin edistää kaspaasien aktivaatio ja sen jälkeen johtaa apoptoottisen solukuoleman. Tutkia vaikutuksia Gmailin sponsoroimia mainoksia tämän prosessin A549 ja H1299-soluja, sytosolisia ja mitokondrioiden fraktiot valmistettiin soluista, jotka oli käsitelty Gmailin sponsoroimia mainoksia 48 tuntia. Tulokset Western blot-analyysi osoitti, että hoito Gmailin sponsoroimia mainoksia johti annoksesta riippuva nousu sytokromi c: ja Smac /DIABLO release sytosoliin ja vastaavasti vähentää tasojen sytokromi c: ja Smac /DIABLO mitokondrion jakeet molemmissa A549 ja H1299-solut (Fig. 2A ja 2B), mikä viittaa siihen, menetys mitokondrion kalvon potentiaali Gmailin sponsoroimia mainoksia käsittelyä näissä soluissa. Blotit riisuttu ja uudelleen koetettiin anti-COX IV vasta sulkea pois mahdollisuutta ristikontaminaation mitokondrioiden ja solulimafraktiot. Läsnäolo COX IV ei havaittu solulimafraktiot.

(A B) immunoblottausmääritys sytokromi

c

ja Smac /DIABLO käyttäen soluliman ja mitokondrioiden jakeet valmistettu A549 ja H1299 soluissa hoidon konsentraatiot Gmailin sponsoroimia mainoksia 48 tuntia. Blotit riisuttu ja uudelleen koetettiin anti-COX IV-vasta tasapuolisen mitokondrioiden Proteiinilisäyksen sekä sulkea pois ristikontaminaation mitokondrioiden ja solulimafraktiot. (C) hoito A549 ja H1299 solujen Gmailin sponsoroimia mainoksia indusoi mitokondrion kalvon potentiaalia. -Soluja käsiteltiin osoitetulla annoksella Gmailin sponsoroimia mainoksia 48 tuntia. JC-1 väriaine-värjättyä solua analysoitiin virtaussytometrialla, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Tiedot edustavat kahta erillistä koetta, joissa samat havainnot.

varmistamiseksi edelleen, että Gmailin sponsoroimia mainoksia aiheuttaa mitokondrion kalvon potentiaalia, käytimme kationinen lipofiilinen väriaine, JC-1, joka kertyy sisällä mitokondriot on potentiaali riippuvaisesti. On häiriöitä mitokondrion kalvon potentiaalia, fluoresenssiemissiota JC-1 väriaine muuttuu punaisesta vihreäksi. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia lisäämisen jälkeen ja Gmailin sponsoroimia mainoksia, A549 ja H1299-solut otettiin talteen, inkuboitiin JC-1 väriainetta ja fluoresenssiemissio analysoitiin virtaussytometriaa käyttämällä. Kuten kuviossa 2C on esitetty, GSP hoitoon A549 ja H1299-soluja johti annoksesta riippuva nousu määrä vihreää fluoresenssia-positiivisia soluja, kuten on esitetty alaoikealla (LR) neljänneksessä FACS histogrammin. Yhdessä nämä tutkimukset osoittavat, että Gmailin sponsoroimia mainoksia hoito apoptoosia sekä A549 ja H1299 keuhkosyöpä solut hajottamalla mitokondrion kalvon potentiaalia.

Gmailin sponsoroimia mainoksia aktivoituvat caspases ja PARP sekä A549 ja H1299 solujen

vapautuminen sytokromi

c

ja Smac /DIABLO sytosoliin aktivoi prokaspaasi 9. apoptosome ja johtaa aktiiviseen kaspaasi-9 pilkkominen ja pilkkominen kaspaasi-3 [18] – [20]. Kaspaasi-3 myöhemmin johtaa apoptoottisen solukuoleman pilkkomalla laajan kirjon kohdeproteiinien, mukaan lukien PARP. Niinpä määritettiin myös apoptoosin induktion A549 ja H1299-solujen Gmailin sponsoroimia mainoksia välittyy aktivointi prokaspaasi-9, kaspaasi-3 ja PARP-proteiineja. Treatment of A549 ja H1299-solujen Gmailin sponsoroimia mainoksia 48 tuntia aiheutti annoksesta riippuvainen väheneminen kaspaasi-9 lisäten samalla pilkkominen kaspaasien-9, kaspaasi-3 ja PARP-proteiinien verrattuna vehikkelillä käsiteltyjen solujen (kuvio 3A ). Gmailin sponsoroimia mainoksia aiheuttama kaspaasi-3 A549 ja H1299-solujen lisäksi määritettiin käyttäen kolorimetristä kaspaasi-3: n aktiivisuuden määritys. Hoitoa sekä A549 ja H1299 keuhkosyövän solut Gmailin sponsoroimia mainoksia 48 tuntia johti merkittävästi suurempi (p 0,05; p 0,001) kaspaasi-3: n aktiivisuuden annoksesta riippuvaisella tavalla, kuin on havaittu, että apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään soluissa (kuvio 3B).

(A) käsittely A549 ja H1299-solujen kanssa Gmailin sponsoroimia mainoksia määrää vähennetään kaspaasi-9, kun taas lisää aktivoinnin /pilkkominen kaspaasi-9, kaspaasi-3, ja PARP annoksesta riippuvalla tavalla. Soluja käsiteltiin vaihtelevilla Gmailin sponsoroimia mainoksia (0, 20, 40, 60 ja 80 ug /ml) 48 h, minkä jälkeen solut otettiin talteen, solujen lysaatit valmistettiin ja alistettiin western blot-analyysi tunnistaa kaspaasi-9, pilkotaan kaspaasi-9, kaspaasi-3 ja PARP. Edustava blot on esitetty kolmesta itsenäisestä kokeesta samanlaisin tuloksin. (B) Kaspaasi-3: n aktiivisuuden in solulysaatteja näytteistä Paneeli A mitattiin käyttämällä kolorimetristä proteaasimäärityksessä (ApoTarget Kit). Gmailin sponsoroimia mainoksia hoidon A549 ja H1299 solujen lisää toiminnan kaspaasi-3 annosvasteisesti. Merkittävä ero verrattuna ei-Gmailin sponsoroimia mainoksia testiryhmässä

¶

P

0,01 ja

*

P

0,001. (C) vaikutus Gmailin sponsoroimia mainoksia (60 ja 80 ug /ml), apoptoosiin A549 ja H1299-soluja määritettiin 48 tunnin kuluttua on poissa tai läsnä ollessa 60 umol /l kaspaasi-3-estäjällä (Z-DEVD-fmk) . Sisällön apoptoottisten solujen määritettiin käyttäen solukuolemaan havaitseminen ELISA kit, jotka on esitetty materiaalit ja menetelmät. Soluja käsiteltiin z-DEVD-fmk estivät Gmailin sponsoroimia mainoksia indusoiman apoptoosin A549 ja H1299-soluissa. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen eri hoitoryhmien yhteenveto ja tulokset on esitetty keskiarvona ± SD kahdesta kokeiden toisto. Merkitsevän eston kaspaasi-3-estäjällä versus Gmailin sponsoroimia mainoksia yksin käsiteltyjä soluja,

*

P

0,001. CI = kaspaasi-3-estäjällä, C = kontrolli, ilman mitään käsittelyä.

Hoito kaspaasi-3-estäjällä (Z-DEVD-fmk) estää Gmailin sponsoroimia mainoksia indusoiman apoptoosin sekä A549 ja H1299-solujen

varmistamiseksi edelleen, että Gmailin sponsoroimia mainoksia aiheuttama kaspaasi-3 on osallisena induktioon apoptoottisen solukuoleman A549 ja H1299 ihmisen keuhko- syöpäsoluja, me määritetään, onko Gmailin sponsoroimia mainoksia indusoiman apoptoosin A549 ja H1299-soluissa vaikutti lisäämällä kaspaasin-3-spesifinen estäjä (z-DEVD-fmk). A549 ja H1299 soluja oli käsitelty Gmailin sponsoroimia mainoksia tai ilman z-DEVD-fmk (60 mikromol /l) 48 tuntia. Solut kerättiin ja solukuolemaa määritettiin käyttäen Cell Death Detection ELISA kit ohjeiden valmistajan. Kuten kuviossa 3C (vasen paneeli), hoito A549-solujen Gmailin sponsoroimia mainoksia pitoisuuksina 60 ja 80 ug /ml johti 31% ja 49% apoptoosin tai solukuolema vastaavasti verrattuna 6,5% ei-Gmailin sponsoroimia mainoksia-käsiteltyjen kontrollisolujen . Hoito A549-solujen Gmailin sponsoroimia mainoksia (60 tai 80 ug /ml) läsnä ollessa z-DEVD-fmk johti vain 14% ja 17% apoptoosin, vastaavasti, jotka selkeästi osoitti, että läsnä on kaspaasi-3-spesifisen inhibiittorin merkittävästi esti Gmailin sponsoroimia mainoksia aiheuttama apoptoottisten solujen kuoleman (

P

0,001) A549-soluja. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin, kun H1299-soluja käsiteltiin Gmailin sponsoroimia mainoksia läsnä ollessa tai poissa ollessa z-DEVD-fmk, kuten on esitetty kuviossa 3C (oikea paneeli). Nämä tulokset osoittavat, että Gmailin sponsoroimia mainoksia indusoiman apoptoosin sekä A549 ja H1299 ihmisen keuhkosyövän soluja liittyy kaspaasi-3.

Gmailin sponsoroimia mainoksia indusoivat G1-vaiheen solusyklin pysähtymisen NSCLC-solujen

Based alustavien tutkimusten jossa havaittiin voimakas kasvua estävä vaikutus Gmailin sponsoroimia mainoksia on NSCLC-soluja, me sitten määritettiin mahdollinen mekanismi anti-proliferatiivista aktiivisuutta Gmailin sponsoroimia mainoksia, jotka voivat johtaa apoptoottisen solukuoleman. Tätä tarkoitusta vaikutusta Gmailin sponsoroimia mainoksia solusyklin etenemisen A549 ja H1299-soluja määritettiin sen jälkeen, kun hoidon Gmailin sponsoroimia mainoksia 48 tuntia. Kuten esitetty kuviossa 4, (paneelit A-D), hoito A549-solujen Gmailin sponsoroimia mainoksia johti merkittävään suurempi määrä soluja G1-vaiheessa kaikilla käytetyillä pitoisuuksilla: 20 ug /ml: lla (58,3%,

P

0,05), 40 ug /ml: lla (67,9%,

P

0,001) ja 60 ug /ml: lla (75,5%,

P

0,001) verrattuna ei -GSPs käsiteltiin kontrolli (52,7%). Kuten kuviossa 4 (vasen paneelit A-D), annosriippuvainen vaikutus Gmailin sponsoroimia mainoksia G1 pidätys A549-soluja oli pitkälti kustannuksella solujen S-vaiheessa minimaalinen muutos G2-M-solupopulaation verrattiin vahinkoa -GSPs-käsiteltyjen kontrollisolujen (paneeli A). Samanlaisia ​​vaikutuksia Gmailin sponsoroimia mainoksia G1 vaiheen pysähtymisen todettiin myös H1299 soluissa (kuvio 4, oikea paneelit A-D). Tulokset solusyklin jakelu kullakin annoksella Gmailin sponsoroimia mainoksia on koottu myös paneeli E, mikä osoitti merkittävän pidätyksen A549 ja H1299 solut G0-G1 vaiheen jälkeen Gmailin sponsoroimia mainoksia hoidon.

Soluja käsiteltiin joko vehikkelillä ( 0,1% DMSO väliaineessa) tai 20, 40 ja 60 ug /ml annosta Gmailin sponsoroimia mainoksia täydelliseen alustaan. 48 tunnin kuluttua hoidon jälkeen solut otettiin talteen ja hajotettiin RNaasi. Solujen DNA värjättiin propidiumjodidilla ja virtaussytometria-analyysi suoritettiin analysoida solusyklin jakautumisen, niin kuin kohdassa Materiaalit ja menetelmät. (A-D) Cell cycle jakauma A549 (vasemmanpuoleiset paneelit) ja H1299 (oikea paneeli) solujen hoidettaessa erilaisia ​​pitoisuuksia Gmailin sponsoroimia mainoksia. (E) Tiedot solusyklin jakautumisen koottiin yhteen ja esitetään keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tilastollisesti merkitsevä versus muut Gmailin sponsoroimia mainoksia käsitellyn kontrolliryhmän,

¶

P

0,05 ja

*

P

0,01.

Gmailin sponsoroimia mainoksia pienentää ilmaukset G1 säätelyproteiineilla CDK ja sykliinien NSCLC soluissa

Tutkimukset ovat osoittaneet, että CDK ja sykliinejä keskeisessä asemassa ovat säätelyssä solusyklin etenemisen [21], siksi määritti Gmailin sponsoroimia mainoksia on proteiini tasoilla CDK ja sykliinit joita säätelee negatiivisesti Cdki (CIP1 /p21 ja Kip1 /p27) aikana G1 vaiheessa solusyklin etenemisen. Kuten on esitetty kuviossa 5 (paneeli A), hoito A549-solujen Gmailin sponsoroimia mainoksia johti merkittävään vähenemiseen ilmentymisen Cdk2, Cdk4 ja Cdk6 annoksesta riippuvalla tavalla 48 h kuluttua Gmailin sponsoroimia mainoksia hoidon. Vahva vähentäminen CDK havaittiin annoksilla 40-80 ug /ml pitoisuuksia Gmailin sponsoroimia mainoksia. Samoin vähentynyt selvästi Sykliini D1, D2 ja E havaittiin annoksesta riippuvalla tavalla. Identtiset vaikutus Gmailin sponsoroimia mainoksia havaittiin myös, kun H1299-soluja käsiteltiin Gmailin sponsoroimia mainoksia ja samoissa olosuhteissa (kuvio 5A, oikea paneeli).

soluja käsiteltiin joko vehikkelillä (0,1% DMSO väliaineessa) tai Gmailin sponsoroimia mainoksia (20 , 40, 60 ja 80 ug /ml) 48 h ja sen jälkeen talteen, solujen lysaatit valmistettiin ja sitten SDS-PAGE ja sen jälkeen Western blot-analyysi, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät.