Krooninen sairaus

tiivistelmä

REV3L, katalyyttinen alayksikkö DNA Polymerase ζ (Polζ), on merkittävä rooli DNA vaurionsietokyky mekanismi translesion synteesi (TLS). Rooli

REV3L

vuonna kemosensitiivisyys kohdunkaulan syövän tarvitsee etsintä. Esillä olevassa tutkimuksessa arvioimme ekspressiota Polζ proteiinin parafinoidut kudoksia käyttäen immunohistokemia ja totesi, että ilmentyminen Polζ kohdunkaulan syövän kudoksissa oli korkeampi kuin normaaleissa kudoksissa. Sitten perustettu joitakin kohdunkaulan syövän solulinjoissa

REV3L

tukahduttaminen tai yli-ilmentymisen. Ehtyminen

REV3L

tukahduttaa solujen lisääntymistä ja pesäkkeiden muodostumista kohdunkaulan syöpäsolujen kautta G

1 pidätys, ja

REV3L

edistää solujen lisääntymistä ja pesäkkeiden muodostumista kohdunkaulan syövän solujen edistämällä G

1 vaiheesta S-vaiheeseen siirtymistä. Tukahduttaminen

REV3L

ilmentyminen parantaa herkkyyttä kohdunkaulan syövän solujen sisplatiini, ja yli-ilmentyminen

REV3L

resistenssin sisplatiinia osoituksena muutoksesta apoptoosin hinnat, ja merkittävästi ekspressiotason muutokset anti-apoptoottisten proteiinien B-solulymfooma 2 (Bcl-2), myeloidisolun leukemia sekvenssin 1 (Mcl-1) ja B-solulymfooma-suurikokoisen (Bcl-xl) ja proapoptoottiset Bcl-2-liittyvä x-proteiinin (Bax ). Tuloksemme viittaavat siihen, että

REV3L

on tärkeä rooli säätelyssä kohdunkaulan syövän solujen vaste sisplatiinille, ja siten kohdistaminen

REV3L

voi olla lupaava tapa muuttaa kemosensi- kohdunkaulan syövän potilaille.

Citation: Yang L, Shi T, Liu F, Ren C, Wang Z, Li Y, et al. (2015)

REV3L

, lupaavaan Target säätelyssä Kemosensitiivisyys kohdunkaulan syöpäsoluja. PLoS ONE 10 (3): e0120334. doi: 10,1371 /journal.pone.0120334

Academic Editor: Eric Asselin, University of Quebec Trois-Rivieres, Kanada

vastaanotettu: 28 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 29 tammikuu 2015; Julkaistu 17. maaliskuuta 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: tuettiin National Natural Science Foundation of China (myönnä. 81202050; https://www.nsfc.gov.cn/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kohdunkaulan syöpä on viides yhteinen ja neljäs tappavin syöpä naisilla maailmanlaajuisesti lähes 528000 uutta tapausta ja 266000 kuolemantapausta vuonna 2012 [1]. Kemoterapia on yksi hyödyllinen strategioita järjestelmällinen kohdunkaulan syövän hoitoon. Sisplatiini yksin tai yhdessä muiden kemoterapia-lääkkeet pysyi hallitseva systeeminen hoitomuoto paikallisesti levinneen ja metastasoituneen kohdunkaulansyöpä useita vuosikymmeniä. Kuitenkin resistenssin kehittyminen kemoterapia-aineiden muodostaa merkittävän esteen, joka edistää kasvaimen uusiutumisen, eteneminen, ja varmaan kuolemaan [2].

Vaikka tarkkaa mekanismit eivät ole täysin ymmärretty, tutkimukset ovat osoittaneet, että jotkut DNA vahinkoja pakenee korjaus ja voi viivyttää replikointi koneen olemassaolosta huolimatta DNA korjausmekanismit. Esimerkiksi translesion DNA-synteesin (TLS) mahdollistaa vaurioituneiden solujen loppuun genomin replikaatiota palkata erikoistunutta DNA polymeraaseja pysähtynyt replikointi haarukat [3,4]. TLS polymeraasit edistää ylläpitoon genomisen koskemattomuuden, ja muutoin pysähtynyt DNA replikaatio haarukat voi romahtaa rakenteisiin ja aiheuttaa DNA kaksinkertainen lohkon murtuma (DSB), lisätä näin perimän epävakaisuuden [3]. Samaan aikaan, matala-fidelity DNA-polymeraasit ovat mukana spontaani ja DNA-vaurioita aiheuttama mutageneesi, mikä osaltaan pahanlaatuisiksi [5,6,7]. Aktivointi TLS voi myös edistää hankitun lääkeresistenssin kasvainsoluissa käsitelty DNA: ta vaurioittavien syöpälääkkeiden, ja tämä johtuu Polζ kuuluvat funktionaaliseen ryhmään TLS DNA-polymeraasien on merkittävä rooli ohikulkutie monenlaisia ​​DNA-vaurioita [8,9,10,11].

REV3L

geenin, nisäkkään ortologi Saccharomyces cerevisiaen

Rev3

-geeni, koodaa katalyyttisen alayksikön Polζ [12,13], kun taas REV7L (tunnetaan myös nimellä MAD2L2) vuorovaikutuksessa REV3L kautta erityinen sitova verkkotunnuksen [14,15,16,17].

REV3L

geeni näyttää ilmentyvän sekä normaali- että pahanlaatuinen ihmisen kudoksissa, kun taas sen ekspressiotaso vaihtelee eri normaalissa ja kasvainsoluissa [18,19,20]. Ainutlaatuinen toiminto

REV3L

on epätavallinen etua, koska se kriittinen tekijä pyrittäessä estämään sisplatiinia sytotoksisuuteen. Esimerkiksi kanan DT40 solut puutteellinen

Rev3

osoitti suurempi herkkyys sisplatiinia, verrattuna muihin DNA: n korjautumista tai check-pisteen mutantit [21].

REV3

ehtyminen myös lisää herkkyyttä ja vähentää mutageneesi aiheuttama sisplatiinin hiiren B-solujen lymfoomat ja keuhkosyöpään solut, ihmisen ja hiiren fibroblastisoluissa, ja ihmisen koolonkarsinoomasoluille [22,23,24,25]. Tukahduttamista ilmaus

REV1L

, jäsen Y-tyyppinen polymeraasi perheen joka tukee aktiivisuutta DNA-polymeraasin ζ [13,26], voi merkittävästi hidastavan lääkeresistenssin kehittymisen ihmisen munasarjasyöpäpotilailla soluihin [27]. Lisäksi yksi tutkimuksessa todettiin, että inhibitio

REV3

ilmaisu sinänsä voi aiheuttaa pysyviä DNA-vaurioita ja kasvun pysähtymisen syöpäsoluissa useita keuhko-, rinta-, mesoteliooma, ja paksusuolen kasvainsolulinjoja [28]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että

REV3L

geeni vaikuttaa merkittävästi solujen resistenssin sisplatiinia. Näin ollen, on mahdollista voittaa sisplatiinin vastuksen kautta estämällä

REV3L

.

edellinen tutkimus osoitti, että Polζ ilmaisua voidaan käyttää ennustaja huono ennuste, joka saattaa johtua siitä, että potentiaali chemoradiation vastarintaa kohdunkaulan syöpäpotilailla [29]. Roolit Polζ säätelyssä chemoradiation vastus ja ennustamiseen ennuste pysyy huonosti tunnettu kohdunkaulan syöpä, joka ansaitsee tutkia edelleen. Siksi loimme kohdunkaulan syövän solulinjoissa alassäätö tai ylös-säätely

REV3L

ja arvioitiin niiden herkkyyttä sytotoksisille sisplatiinia ja liittyvät apoptoosin tapahtumia.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka selvitys

Kaikki tutkimukseen liittyy ihmisen osallistujaa hyväksyi eettinen komitea Fudanin yliopiston Shanghai Cancer Center (FUSCC). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta palvelukseen henkilöitä, ja kukin kliininen tutkimus suoritettiin periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistuksen suostumuksen.

Tissue Näytteet ja Solulinjat

Teimme kudossiruina käyttämällä okasolusyöpä näytteitä 123 peräkkäisen kohdunkaulan syöpää sairastavilla potilailla FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics, 2009) vaiheet IB, IIA tai IIB ja 17 potilaalla normaali kohdunkaulan käsiteltiin maaliskuun 2008 maaliskuuta 2009 klo FUSCC. Kudokset histopatologisesti vahvistettiin itsenäisesti kahdella gynekologiset patologit (TXY ja YG). Yksityiskohtaisten kliinisten muodostuminen uutettiin potilaiden sähköisen tietokannan FUSCC, kuten aiemmin on kuvattu [29].

perustettu ihmisen kohdunkaulan syövän solulinjat SiHa-, HeLa, ME180 ja MS751 saatiin American Type Culture Collection ( ATCC). Kaikki soluja ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM, HyClone, Thermo Scientific, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Gibco, Life Technologies, USA), 100 U /ml penisilliiniä (Biowest, Nuaille, Ranska), ja 100 U /ml streptomysiiniä (Biowest, Nuaille, Ranska), ja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO

2.

immunohistokemia Pitoisuus

immunohistokemia (IHC) määritykset olivat suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [29]. 10 × 12 kudos microarray (TMA) tehtiin FUSCC Tissue Bank, kuten aiemmin on kuvattu [30]. IHC suoritettiin 5-pm paksu TMA osia käyttäen vasta-ainetta vastaan ​​Polζ (sc-48814, kanin polyklonaalinen vasta-aine, Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, 1: 100 laimennos) ja ChemMate

TM EnVision

TM /HRP (piparjuuriperoksidaasi),

Kani /hiiri

, havaitseminen pakki (DAKO, Glostrup, Tanska). Tunnettu positiivinen asia näyte sisällytettiin positiivisena kontrollina, ja ensisijainen vasta-aine korvattiin nonimmune hiiri /kanin seerumia varten negatiivisen kontrollin. IHC värjäytyminen pisteytettiin itsenäisesti kahdessa gynekologiset patologit (TXY ja YG) jotka sokaisi potilaalle kliinisissä tuloksissa käyttäen pisteytysjärjestelmää perustuu sekä prosenttiosuus positiivisten kasvainsolujen ja värjäyksen intensiteettiä, kuten aiemmin on kuvattu [31]. Lopuksi arviointi -proteiiniekspressio määritellään negatiiviseksi (≤2 +) ja positiivisen ( 2 + 6+), ja tulokset, jotka olivat uninterpretable takia kudoskatoa tai puutteesta kasvainsolujen, pisteet ei sovellettavissa (N /A) on valittu.

plasmidin muodostaminen ja Cell transfektio

Kaikki alukkeiden käytettiin tutkimuksessa suunniteltiin käyttäen Primer Premier 5 -ohjelmaa. Testaamiseksi mahdollisia toistuvat sekvenssit, alukkeet kohdakkain GeneBank tietokantaan käyttäen BLAST online-työkalu. AutoDimer Ohjelmisto käyttää havaittaessa mahdollisten hiusneularakenteiden ja mahdolliset alukedimeerin yhdistelmiä. Kaikki alukkeet syntetisoitiin Sangon Biotech Co., Ltd (Shanghai, Kiina). Kolme lyhyt hiusneula häiritsevä RNA (shRNA) kohdistaminen

REV3L

suunniteltiin ja kemiallisesti syntetisoitu ja lisätään pBabe /U6 /Puro mukaisen vektorin aiemmin raportoitu menetelmä [32,33]. Valitsimme yhden shRNA kanssa korkeimman inhibition tehokkuutta käyttämällä solulinjoja, joilla on korkea ilmentymisen

REV3L

(Forward-aluke: 5′-GGAGAATAGAACTATGG TGCAAGCCTACGTAGCGTCTGCACCATAGTTCTATTCT CCCTTTTTG-3 ’; Reverse-aluke: 5’-AATTCAAA AAGGGAGAATAGAACTATGGTG CAGACGCTACGTAGGCTTGCACCATAG TTCTATTCTCC-3 ”). PBabe /U6 /Puro vektorin, joka sisältää negatiivisen kontrollin (NC) shRNA (shGFP) saatiin samalla rakennettiin suoraan lisäämällä oligonukleotidista, joka koodaa pientä hiusneula-RNA vastaan ​​vihreää fluoresoivaa proteiinia mRNA (shGFP) osaksi pBabe /U6 /puromysiiniä [32,34]. Retrovirukset ekspressoivat

REV3L

shRNA tai GFP shRNA tuotettiin transfektoimalla pBabe /U6 /sh

REV3L

tai pBabe /U6 /shGFP osaksi Phoenix amfotrooppiset soluihin ja käytetään infektoimaan kohdesolut käyttämällä menetelmää, edellä on kuvattu [32]. Lyhyesti, solut infektoitiin viruksella supernatantit, ja sen jälkeen 24 tunnin elpyminen, solut valittiin puromysiiniä (200 ng /ml) 10-14 päivä vakaan ilmentävien solulinjojen shREV3L tai shGFP. Saadut solut kasvatettiin väliaineessa ilman puromysiiniä ja käytetään edelleen kokeita. Solulinjat, joilla on alhainen ilmaus

REV3L

transfektoitiin pcDNA3.1 /neo-REV3L plasmidi (toimitti Dr. Yoshiki Murakumo, Nagoya University Graduate School of Medicine, Nagoya, Japani) tai pcDNA3.1 /neo negatiivinen kontrolli plasmidin käyttäen Lipofectamine 2000 kohti valmistajan ohjeiden. 48 tunnin kuluttua ja 120 h transfektion jälkeen solut käytettiin lisäanalyysiä.

RT-PCR: llä ja Real-Time PCR

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen, Life Technologies , USA) seuraten valmistajan protokollaa, ja käänteisesti cDNArksi käyttäen PrimeScript

TM RT reagenssipakkauksen (Takara Biotechnology, Shiga, Japani). PCR-tuotteet monistettiin TaKaRa Taq TM reaktioita 30 sykliä (94 ° C, 30 s; 58 ° C, 30 s, ja 72 ° C, 1 min) käyttäen Mastercycler® eprealplex (Eppendorf AG, Hampuri, Saksa) . Viisi mikrolitraa PCR-tuotteita analysoitiin elektroforeesilla 1,5% agaroosigeelillä, joka sisälsi etidiumbromidia ja visualisoitiin UV-valo. Reaaliaikainen PCR suoritettiin Applied Biosystems Prism 7900 järjestelmä (Applied Biosystems, Life technologies, USA) käyttäen ExScipt Syber vihreä QPCR (Takara Biotechnology, Shiga, Japani) seuraavissa olosuhteissa: aluksi denaturointi 95 ° C: ssa 30 s, yksi sykli; 95 ° C 5 s; 55 ° C: ssa 30 s; ja 72 ° C: ssa 30 s, 40 sykliä; seuraa sulamiskäyräanalyysi tarkistaa spesifisyys vahvistusta. Kukin näyte testattiin kolmena kappaleena, ja alukkeita Glyseraldehydi 3-phosphatedehydrogenase (GAPDH) käytettiin rinnakkain reaktiot sisäisenä kontrollina. Kolmen erillisen kokeen tehtiin lopullista analyysejä käyttäen 2

-ΔΔCT suhteellinen kvantitointimenetelmä. Alukeparit on

REV3L

käytettiin 5′-CGCGTCAGTTGGGACTTAAG-3 ’(forward-aluke) ja 5′-ACTATCGCCAACCTCAATGC-3’ (reverse-aluke). Alukeparit on

GAPDH

olivat 5′-GGCCTCCAAGGAGTAAGACC-3 ’(forward-aluke) ja 5′-CAAGGGGTCTACATGGCAAC-3’ (reverse-aluke). Alukeparit on

REV7L

olivat 5′-CTGGAGAAGAATGATGTGGAG-3 ’(forward-aluke) ja 5′-GTGGAGGCTGGGTGATCTCA-3’ (reverse-aluke).

proliferaatiomääritystä ja solunelinkykyisyysmääritys

arvioimiseksi soluproliferaation menoa olemme pinnoitettu 1×10

3 solua kuoppaa kohti 96-kuoppalevyillä 100 ui ylläpitoelatusaine. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japani) käytettiin seuraamaan solujen kasvun 0-7 päivää, ja elävien solujen lukumäärä arvioitiin mittaamalla absorbanssi 450 nm: ssä Microplate Reader (BioTek Instruments, Winooski, VT, USA). Lisääntyminen indeksi laskettiin kokeellinen OD-arvo /ohjaus OD-arvo. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin myös CCK-8. Me pinnoitettu 5×10

3 kohdunkaulan syövän solua per kuoppa 96-kuoppalevyille. Seuraavana päivänä solut käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla syöpälääkkeiden. Solujen elinkelpoisuus mitattiin sitten edellä kuvatulla tavalla. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin neljänä kuoppiin.

Colony muodostumisen määritys

Solut maljattiin alhaisella tiheydellä 500 kuuden kuoppalevylle kolmena kappaleena. Solujen annettiin kasvaa 2 viikkoa ennen kiinnitettiin jääkylmällä metanolilla ja värjättiin kristallivioletilla. Kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa lopullisen analyysejä.

Western-blottaus

Solut lyysattiin lyysipuskurissa, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,05 M EDTA, 1% Triton X-100, 0,1% SDS: ää ja 0,005 x proteaasiestäjäseostabletit). Solulysaatit eroteltiin 10% -15% SDS-PAGE-elektroforeesilla ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Merck Millipore, Darmstadt, Saksa). Membraani blokattiin 5% rasvatonta maitoa PBS-Tween 20: ssa 1 h ajan huoneenlämpötilassa ja inkuboitiin valittu primaarisen vasta-aineen kanssa β-aktiini käytetään sisäisenä kontrollina. Immunoreaktiivisuus havaittiin inkubaation jälkeen piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., PA, USA, 1: 2000-laimennos) käyttäen tehostettua kemiluminesenssia menetelmällä (Thermo Scientific, USA). Vasta-aineet Bcl-2, B-solulymfooma-suurikokoisen (Bcl-xl), myelooinen solu leukemia-1 (Mcl-1), Bcl-2-liittyvä x-proteiinin (Bax), sytokromi-c-, β-aktiini (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA, 1: 1000 laimennos) ja pilkottiin kaspaasi 3 p17-spesifinen vasta-aine (Proteintech, IL, USA, laimennus 1: 1000) käytettiin Western blotting -analyysi. Western blot band tiheys analysoitiin käyttämällä Image J ohjelmisto kohti valmistajan ohjeiden, ja bändi tiheyssuhde kunkin proteiinin P-aktiini laskettiin vastaavasti. Kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin lopullisen analyysejä.

Cell Cycle Analyysi virtaussytometria

Virtaussytometria-solusyklin analyysi suoritettiin käyttäen PI yhden värjäysmenetelmällä. Solut suspendoitiin 1 ml: aan fosfaattipuskuroitua liuosta (PBS) ja kiinnitettiin sentrifugiputkilla 3 ml: ssa absoluuttista etanolia. Soluja pidettiin etanolissa yli yön -20 ° C: ssa. Sitten etanoli-suspendoidut solut sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 2000 rpm: ssä. Solupelletti suspendoitiin uudelleen 5 ml: aan PBS: ää noin 30 s, ja sentrifugoitiin 2000 rpm: ssä 5 min. Solupelletti suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan PI-värjäyksellä solutionand pidetään pimeässä 37 ° C: ssa 10 min. Näyte analysoitiin käyttäen FACScan virtaussytometrialla (BD Biosciences, San Jose, CA, USA).

Apoptoosi analyysi virtaussytometrialla

Kiinnittyneet solut kerättiin ja suoritettiin seuraavat apoptoosin määrityksiä. Solut leimattiin FITC-konjugoidulla anneksiini V: n ja PI käyttämällä anneksiini V-FITC: tä (fluoreseiini-isotiosyanaatti) apoptoosin detektioreagenssipakkaus (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) valmistajan ohjeiden, ja sen jälkeen analysoitiin FACScan-virtaussytometrillä.

immunofluoresenssimäärityksellä

Solut maljattiin tiheydellä 2000 24-kuoppaisilla kammion dioja ja käsiteltiin eri pitoisuuksilla sisplatiinia 24 tunnin ajan. Solut kiinnitettiin MeOH: lla ja tehtiin läpäiseviksi Triton X-100. Sitten soluja salvattiin 1% BSA PBS: ssä 2 tunnin ajan, ja niitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen vasten γ-H

2AX (Biolegend, San Diego, CA, USA, 1: 200 laimennos) yön yli. Lopuksi soluja inkuboitiin AlexaFluor-488 vuohen anti-hiiri-vasta-aineella (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc., PA, USA, 1: 200 laimennos) ja asennettu DAPI. y-H

2AX pesäkkeitä arvioitiin vihreällä fluroscence. Vähintään kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin.

sisplatiini hoidon

Sisplatiini ostettiin Sigma-Aldrich (St.. Louis, MO, USA). Stock pitoisuus sisplatiinin 5 mg /ml. Eri sisplatiinin käytettiin hoitoon kohdunkaulan syövän linjat solunelinkykyisyysmääritys eri aikaan. Ja apoptoosin analyysi, sisplatiini käytti 30%, 50% inhiboiva konsentraatio lasketaan solunelinkykyisyysmääritys.

Tilastollinen analyysi

Kaikki arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± keskivirhe keskiarvon (SEM). Tilastollinen analyysi tehtiin Studentin

t

-testi.

P

arvo alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS versio 19,0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

Tulokset

Polζ merkittävästi erittäin ilmaistaan ​​kohdunkaulan syövän kudoksissa

tutkia eroa ilmentymisen

REV3L

välillä ihmisen kohdunkaulan syövän ja normaalin kohdunkaulan, kudoksen mikrosiru 123 okasolusyöpä kohdunkaulan syövän potilaiden ja 17, joilla on normaali kohdunkaulan saatiin ja Polζ ilmentyminen analysoitiin käyttämällä IHC määritystä (Fig. 1A). Potilaiden ominaispiirteet ja asema Polζ ilmaisun olivat kuvassa. 1B. Niistä 123 kohdunkaulan syövän potilaille, seitsemän (6%) kudoksiin pisteytettiin N /A IHC värjäystä. Yleensä Polζ positiivinen ekspressiota havaittiin 21,7% (25/115) kohdunkaulan syövän kudosten ja 5,9% (1/17) normaalin kohdunkaulan kudoksissa. Myös keskimääräinen Polζ ilmaus oli korkeampi kohdunkaulan syöpä kudoksiin kuin normaalissa kohdunkaulan kudoksissa (IHC värjäytyminen pistemäärä oli 1,72 ja 0,82, vastaavasti;

P

= 0,034) (Kuva. 1A, B).

(A) Polζ-positiivinen (ylempi, vasen paneeli) ja Polζ-negatiivinen (ylempi, oikea paneeli) ilmentyminen kohdunkaulan syövän yksilöt, Polζ-positiivinen (alempi, vasen paneeli) ja Polζ-negatiivinen (alempi, oikea paneeli) ilmentyminen normaaleissa kohdunkaulan kudoksissa. (B) kliininen ominaisuudet ja tila Polζ ilmentymisen kohdunkaulan syövän sekä potilaita, joilla nomal kohdunkaula. Keskimääräinen Polζ ekspressio oli suurempi kohdunkaulan syövän kudosten kuin normaalissa kohdunkaulan kudoksissa. (C) Reaaliaikainen PCR-analyysi

REV3L

mRNA: n ekspression neljässä kohdunkaulan syövän solulinjoissa.

REV3L

ilme oli suurempi HeLa ja SiHa soluissa kuin MS751 ja ME180 soluja. (D) Käänteiskopiointireaktioita PCR-analyysi

REV3L

mRNA ilmaisun lyhyt hiusneula-RNA transfektoidut negatiivisen kontrollin soluissa (shGFP), shREV3L soluja,

REV3L

-overexpressing soluja, ja vektorisäätö soluja.

REV3L

ilmentyminen oli merkittävästi vähentynyt shREV3L soluissa ja nostettiin

REV3L

-overexpressing soluissa verrattuna kontrollisoluihin.

perustaminen kohdunkaulan syövän solulinjoja

REV3L

knockdown tai yliekspressio

tutkia toiminnon

REV3L

ihmisen kohdunkaulan syövän solujen, havaitsimme

REV3L

mRNA: n ilmentymisen useissa kohdunkaulan syöpä solulinjat. Ja sitten me perustaa solulinja malleja geneettisesti manipuloida

REV3L

ilme. Kuten on esitetty kuviossa. 1C,

REV3L

ilme oli korkeampi kohdunkaulan syövän solulinjoissa HeLa ja SiHa kuin ME180 ja MS751. Niinpä tukahdutti

REV3L

ilmentyminen HeLa ja SiHa solulinjoissa vakaa shREV3L transfektiolla (Fig. 1 D). Sen sijaan,

REV3L

ilmentymistä yli-ilmentynyt kohdunkaulan syövän solulinjoissa ME180 ja MS751 verrattuna vektorin kontrolli solut (Fig. 1 D). Niinpä parannettu ilmaus

REV3L

vuonna ME180 ja MS751 soluja. Sääntely

REV3L

geeniekspression pysyviä solulinjoja ei ollut merkittävää vaikutusta REV7L mRNA ekspressiotasot (S1 Kuva).

REV3L

kontrolloi soluproliferaatiota ja solusyklin

ensimmäinen havaittu vaikutus

REV3L

soluproliferaatioon ja solusyklin ja totesi, että

REV3L

ehtyminen tukahdutetaan solujen kasvua tutkinut CCK8 määrityksen (Fig. 2A) ja pesäkemuodostusta verrattuna kontrolli-soluissa (kuvio. 2E). Osa Hela-solua G

1 vaihe kasvoi 63%, kun esto

REV3L

ilmaisu verrattuna 54% valvonta soluissa (Kuva. 2C). Siten esto

REV3L

indusoi G

1 pidätys kohdunkaulan syöpäsoluja. Yliekspressio

REV3L

edistää solujen lisääntymistä (Fig. 2B) ja pesäkkeiden muodostumista kohdunkaulan syövän solujen (Kuva. 2F). Solusyklin analyysi osoitti, että merkittävä väheneminen osa G

1 vaihe havaittiin ME180 soluja jälkeen

REV3L

yliekspressio (80%) verrattuna kontrolli soluja (66%) (Fig. 2D) . Niinpä yli-ilmentyminen

REV3L

edistää G

1 vaiheesta S-vaiheeseen siirtymisen kohdunkaulan syöpäsoluja.

(A) väheneminen on

REV3L

tukahdutti soluproliferaatiota HeLa shREV3L soluja ja SiHa shREV3L soluja. (B) lisääminen

REV3L

edistänyt soluproliferaatiota MS751

REV3L

ja ME180

REV3L

soluja. (C) väheneminen on

REV3L

aiheuttama G

1 pidätys HeLa shREV3L soluissa. (D) lisääminen

REV3L

edistänyt G

1 vaiheesta S-vaiheeseen siirtymisen ME180

REV3L

soluja. (E) kuluminen

REV3L

tukahdutti pesäkkeiden muodostumista HeLa shREV3L ja SiHa shREV3L soluja. (F) lisääminen

REV3L

edistänyt pesäkkeiden muodostumista MS751

REV3L

ja ME180

REV3L

soluja. Tiedot ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ± SEM. *

P

0.05.

REV3L-

ehtyminen herkistää kohdunkaulan syövän solulinjat sisplatiini

REV3L

RNAi käytettiin tukahduttaa ilmaisun

REV3L

onko esto

REV3L

ilmaisu voisi parantaa kemosensitiivisyys ihmisen kohdunkaulan syövän solujen sisplatiinia. Tulokset CCK8 määritysten osoittivat, että sen jälkeen, kun tukahduttaminen

REV3L

, kohdunkaulan syövän solut olivat herkempiä sytotoksista vaikutusta sisplatiinin (Fig. 3A). Solujen apoptoosi analysoitiin käyttämällä anneksiini V-FITC-värjäys. Tulokset osoittivat, että varhainen apoptoottinen hinnat shREV3L HeLa- ja SiHa-solut olivat merkittävästi korkeammat kuin shGFP HeLa- ja shGFP SiHa-soluissa vasteena eri annoksille sisplatiinia 24 h (Fig. 3B, C). 30%, 50%, 70% inhiboiva sisplatiinin HeLa, SiHa

REV3L

tukahduttaminen soluista ja vertailusoluista on esitetty taulukossa 1.

(A) Suppression of

REV3L

confered kohdunkaulan syövän soluja herkempiä sytotoksista vaikutusta sisplatiinin. (B) vastustamisesta

REV3L

osoitti yliherkkyyttä sisplatiinia. Soluja käsiteltiin osoitetuilla sisplatiinin 24 tuntia, mitä seurasi värjäys anneksiini V-fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) ja propidiumiodide (PI) varhaisen apoptoottisia soluja (anneksiini V + PI). Varhainen apoptoottista hinnat

REV3L

-suppression solut olivat merkittävästi korkeampia kuin vektorin ohjaus soluja samoissa olosuhteissa. (C) prosenttiosuus apoptoottisten solujen aiheuttama sisplatiinia. Tiedot ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ± SEM. *

P

0,05, **

P

0.01.

REV3L

yliekspression antaa vastustuskyvyn sisplatiiniin kohdunkaulan syövän solulinjoissa

edelleen vahvistaa vaikutuksen

REV3L

on kemosensitiivisyys ihmisen kohdunkaulan syövän solujen kemoterapia-lääkkeet, tutkimme herkkyys

REV3L

yliekspressio soluissa sisplatiinia. Tulokset osoittivat, että yli-ilmentyminen

REV3L

suoritettu solujen resistenttejä erilaisten annosten sisplatiinin (Fig. 4A).

REV3L

-overexpressing ME180 ja MS751-solut osoittivat väheneminen sisplatiinin aiheuttaman varhaisen apoptoosin (Fig. 4B, C). 30%, 50%, 70% estävät konsentraatiot sisplatiinin MS751, ME180

REV3L

yliekspressio soluista ja vertailusoluista on esitetty taulukossa 2.

(A) yli-ilmentyminen

REV3L

sulatettu kohdunkaulan syövän solujen resistenttejä sisplatiinia. (B) Detection apoptoottisten solujen virtaussytometrialla. Yliekspressio

REV3L

esti indusoiman apoptoosin sisplatiinia. (C) prosenttiosuus apoptoottisten solujen aiheuttama sisplatiinia. Tiedot ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ± SEM. *

P

0.05.

REV3L

aiheuttama chemoresistance välittyy mitokondriot liittyvä apoptoottista reitin

Koska mitokondriot liittyvä apoptoottisen reitin osallistuu soluvaste kasvaimet monia syöpälääkkeet, onko se mukana

REV3L

aiheuttama muutos herkkyydessä sisplatiinin, suoritimme analyysin proapoptoottiset proteiineja (Bax, sytokromi c) ja antiapoptoottisten proteiinit (Bcl-2, Bcl- xl, ja Mcl-1) on vektorisäädön soluihin ja

REV3L

-overexpressing tai poistaminen soluja sisplatiinihoitoon (Fig. 5A, D). Hoidon jälkeen sisplatiinin kanssa 24 tuntia, Bcl-2, Bcl-xl ja Mcl-1 tasot merkittävästi vähentynyt, ja Bax ja sytokromi c pinnat nousivat shREV3L HeLa ja SiHa soluja verrattuna shGFP HeLa- ja SiHa soluja. Johdonmukaisesti käsittelyn jälkeen sisplatiinin kanssa,

REV3L

-overexpressing MS751 ja ME180-solut osoittivat korkeampaa Bcl-2, Mcl-1: n ja Bcl-xL: n ja alhaisempi Bax ja sytokromi c: n, verrattuna vektori kontrollisoluihin . Lisäksi altistumisen jälkeen sisplatiinin (1 umol /l) 72 tuntia, aika riippuva nousu määriä pilkottiin kaspaasi-3 havaittiin HeLa shREV3L soluissa ja väheneminen määrät katkaistun kaspaasi-3 havaittiin MS751

REV3L

solujen kerta-annoksen jälkeen hoito 10 mikromol /l sisplatiinin (Fig. 5C, D). Näin ollen, nämä tulokset viittaavat siihen, että

REV3L

antaa chemoresistance sisplatiinin kautta mitochondria- liittyy apoptoottisen reitin.

(A) ilmentyminen tasolla Bcl-2, Bcl-xl ja Mcl-1 olivat pienempi ja tasot Bax ja sytokromi c olivat korkeammat shREV3L soluissa verrattuna shGFP solujen vasteessa samalle sisplatiinin.

REV3L

-overexpressing MS751 ja ME180-solut osoittivat korkeampaa Bcl-2, Mcl-1: n ja Bcl-xL: n ja alhaisempi Bax ja sytokromi c: n verrattuna vektorin kontrollisoluihin. (B) γ-H

2AX ja p-p53 (PS15) proteiinit korotettiin SiHa shREV3L soluissa ja vähenivät ME180 REV3L soluissa, verrattuna kontrollisolut jälkeen sisplatiinihoitoon. (C) Aika-riippuvaista ekspressiota pilkottiin kaspaasi-3-altistuksen jälkeen kerta-annoksen sisplatiinia (1 umol /l) MS751-soluissa ja yhden annoksen sisplatiinia (10 umol /l) HeLa-soluissa. Ekspressiotasot katkaistun kaspaasi-3-oli pienempi MS751

REV3L

solujen ja suurempi HeLa shREV3L soluissa verrattuna kontrollisoluihin vastauksena sama annos sisplatiinin aika-riippuvaisella tavalla. (D) Normalized kertainen ilmaisun kunkin proteiinin vastaan ​​sisäisen valvonnan proteiinia. Tiedot ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta ± SEM. * P 0.05.

REV3L

rajoittaa DNA-vaurioita hoidon jälkeen sisplatiinilla

määrittämiseksi intensiteetti DNA-vaurioita vastetta sisplatiinihoitoon in

REV3L

yli-ilmentyminen tai poistaminen kohdunkaulan syövän solulinjat, havaitsimme γ-H

2AX (pS139) pesäkkeitä muodostumista käyttämällä immunofluoresenssilla. HeLa ja SiHa soluja puuttuu

REV3L

ilmaisu näytteillä voimakas γ-H

2AX värjäyksen verrattuna shGFP säätökennoja altistumisen jälkeen sisplatiinia (Fig. 6A). Päinvastoin, MS751 ja ME180-soluja, joissa

REV3L

yliekspressio osoitti heikompaa γ-H

2AX värjäyksen verrattuna kontrollisoluihin (Fig. 6B). Analyysi proteiinien osoitti, että γ-H

2AX, ja p-p53 (PS15) proteiinien lisääntynyt SiHa shREV3L soluissa ja laski ME180

REV3L

yliekspressio soluissa, verrattuna kontrollisolujen jälkeen sisplatiinin jälkeen (kuvio . 5B, D).

(A) HeLa- ja SiHa-soluja viljeltiin, kun läsnä on kerta-annoksen sisplatiinia (3 umol /l ja 25 umol /l, vastaavasti) 24 tuntia. HeLa ja SiHa soluja puuttuu

REV3L

ilmaisu näytteillä intenser γ-H

2AX värjäyksen verrattuna shGFP ohjaus solujen altistuksen jälkeen sisplatiinia. (B) MS751 ja ME180-soluja viljeltiin, kun läsnä on kerta-annoksen sisplatiinia (30 umol /l ja 5 umol /l, vastaavasti) 24 tuntia. MS751 ja ME180 soluja

REV3L

yliekspressio osoitti heikompaa γ-H

2AX värjäystä kuin kontrolli soluja. Kvantifiointi γ-H

2AX pesäkkeet tehtiin ja analysoitiin solua kohti. Yli 50 solut laskettiin kussakin solulinjassa.

Keskustelu

Polζ on virhealtista DNA-polymeraasin mukana TLS, joka on ominaista sen kyky pidentää ristiriitaiset aluke-template päiden . Yhtäältä Polζ voi ylläpitää genomin vakautta ja on hyötyä hengissä kun soluja altistetaan DNA-vaurioita [35,36,37,38,39]. Toisaalta, kautta asiakkuutta spontaani ja DNA-vaurion laukaisema mutaatioita aiheuttamalla virheellinen nukleotidin DNA, Polζ edistää kertyminen geneettisiä vaurioita, ja siten voi olla rooli syövän synnyssä ja syövän etenemistä [40,41,42]. Ekspressiotasot

REV3L

-geeni, joka koodaa katalyyttinen alayksikkö on Polζ, vaihtelevat eri syöpätyyppien. Joissakin tutkimuksissa havaittiin, että

REV3L

yliekspressoitui ihmisen glioomissa kudoksissa resektoitiin ennen hoitoa verrattuna normaaliin aivojen kudoksissa [19], epäsuhta korjaus-viallinen, p53 – /- peräsuolen adenokarsinooman verrattuna kontrollisilkkipaperia [43].

REV3L

polymorfismien raportoitiin myös merkittävästi liittyvän keuhkosyövän riskiä ja rintasyövän [44,45]. Kun taas muut tutkimukset havaitsivat, että

REV3L

ilmentymistä vaimentua vuonna paksusuolikarsinoomat riippumattomia kasvaimen [46], mahasyöpä [47], ja keuhkosyöpä [47].