Krooninen sairaus

tiivistelmä

Flavonoidit ja flavonoidi johdannaiset, joilla on merkittävä biologisia ja farmakologisia vaikutuksia, kuten antitumor ja tulehdusta toimintaa, on käytetty laajalti ihmisten terveydenhuollossa. Suunnitella tehokkaampi flavonoidi antituumoriaine, me muuttunut flavonoidi selkärankaan vaihdot piperatsiinin ja metoksiryhmät syntetisoimaan uusi flavonoidi johdannainen, LZ-207. Syövän vastainen vaikutus LZ-207 vastaan ​​HCT116 koolonkarsinoomasoluissa ja pohjimmainen mekanismi tämän vaikutuksen tutkittiin tässä tutkimuksessa. Erityisesti, LZ-207 esillä estäviä vaikutuksia kasvuun ja elinkelpoisuuteen useissa ihmisen paksusuolen syövän solulinjat ja indusoi apoptoosia HCT116-soluissa sekä in vitro että in vivo. LZ-207 käsittelyä tukahdutti myös tumaansiirtymiseen NF-KB: n ja fosforylaation IKB ja IKKα /β annoksesta riippuvaisella tavalla sekä HCT116-solut ja ihmisen akuutin monosyyttileukemia THP-1-soluissa. Lisäksi, LZ-207 vähensi myös eritystä pro-inflammatorinen sytokiini interleukiini-6 (IL-6) LPS-indusoidussa THP-1-soluissa, ja tämä vaikutus vahvistettiin transkription tasolla. Lisäksi LZ-207 inhiboi merkittävästi HCT116-solujen lisääntymisen, joka oli aikaansaama LPS-indusoidun THP-1-solujen yhteisviljelmässä järjestelmä. Nämä havainnot selvitetty joitakin mahdollisuuksia molekyylimekanismeja estämiseksi tulehdus perustuva paksusuolen syöpä käyttäen juuri syntetisoidun flavonoidi LZ-207 ja viittasi mahdollisuuteen kehittää edelleen uusia terapeuttisia aineita johdettu flavonoideja.

Citation: Sun J, Li F, Zhao Y, Zhao L, Qiao C, Li Z, et al. (2015) LZ-207, juuri syntetisoidun Flavonoidi, indusoi apoptoosia ja estää tulehdus liittyviä Colon Cancer estämällä NF-KB: n signalointireitin. PLoS ONE 10 (5): e0127282. doi: 10,1371 /journal.pone.0127282

Academic Editor: Dominique Delmasissa UMR INSERM U866, FRANCE

vastaanotettu: 10 joulukuu 2014; Hyväksytty: 13 huhtikuu 2015; Julkaistu: toukokuu 29, 2015

Copyright: © 2015 Sun et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Science Technology Major Project (No.2012ZX09304-001), Project ohjelma valtion Key Laboratory of Natural Lääkkeet, Kiina Pharmaceutical yliopisto (nro JKGZ201101, SKLNMZZ201210, SKLNMZZCX201303 ja SKLNMZZJQ201302, G140042), Program for Changjiang Tutkijat ja Innovative Research Team University (IRT1193), National Natural Science Foundation of China (nro 91029744).

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Jokaisessa vuonna yli 600000 ihmistä kuolee peräsuolen syöpä (CRC) ja 1,25 miljoonaa ihmistä on diagnosoitu tämä sairaus. Kirurginen poisto syövän toiminta on perinteinen hoito kaikissa CRC; Kuitenkin monet potilaat ovat leikkaushoitoon kasvaimia ja siirry kehittää etäpesäkkeitä [1]. Siksi uusia terapeuttisia aineita hoidettaessa CRC tarvitaan pikaisesti.

Kertyvät todisteet ovat osoittaneet, että tulehdus on kriittinen osa syövän etenemisen [2]; infektio-, kroonista ärsytystä ja tulehdus voi olla suuri riski alueilla kehittyä syöpä. Läheinen yhteys tulehduksellinen suolistosairaus (IBDs) ja paksusuolen syöpä on ehdotettu vuodesta 1925 ja on edelleen vahva tapaus todistaa suhde tulehdus ja syöpään [3, 4]. Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että proinflammatoristen tekijöiden synnynnäisen ja adaptiivisen immuunijärjestelmän, mukaan lukien IL-6 [5] ja TNF-α [6], voitaisiin edistää kehitystä ja kasvua paksusuolen neoplasia. NF-KB: tä, joka on yksi monista loppupään tavoitteiden TNF-reseptori 1 aktivointi, on todennäköisesti merkittävä rooli koliitti liittyvien kasvainten synnyssä, koska poikkeava NF-KB: n aktivaatio havaittiin 50% paksusuolen ja paksusuolen tulehdus liittyvät kasvaimet ja hiiri tutkimuksissa [7]. Yhdessä nämä havainnot viittaavat pakottavia rooli tulehduksen paksusuolen karsinogeneesissä.

Natural flavonoidit ovat yleisiä ihmisten ruokavaliossa ja kasveja, sisältävät kaikki sitrushedelmät, mustikka, persilja, sipuli, musta tee, vihreä tee, punainen viini ja banaaneja [8]. Nämä yhdisteet ovat alhaisen molekyylipainon aineisiin, jotka perustuvat yhteiseen kolmen renkaan rakenne eri vaihdot [9]. Koska Ranskan paradoksi jätti vaikutelman, että suuri osa Ranskan harvemmin sydänsairaus liittyvän maan korkea punaviiniä kulutuksen flavonoidien punaviini on tullut keskittyä syövän tutkimuksissa [10]. Mahdollinen hyödyllisiä ominaisuuksia flavonoideja sisältävät hapettumisen, ateroskleroosia torjuvaa, tulehduksia, antitrombogeenisina, antiosteoporotic, ja antiviraaliset vaikutukset [10]. Äskettäin antituumorivaikutukset flavonoidien on myös tunnustettu [11]. Monet flavonoidit, kuten kversetiini [12], silymarin [13] ja luteoliini [14], aiheuttavat antituumorivaikutuksia eri syöpäsolulinjoja, mikä viittaa siihen, että nämä flavonoidit ovat lupaavia aineita syövän ehkäisyä ja takaa jatkotutkimuksia. Flavonoidit ovat fenyylisubstituoitu chromones (bentsopyraanijohdannaisia), jotka koostuvat 15-hiilen perusrunko (C6-C3-C6) (kuvio 1A), jossa on kroman (C6-C3) ydin (bentso rengas A ja heterosyklinen rengas C) ja fenyyliryhmä (aromaattisen renkaan B) normaalisti substituoitu 2-asemassa [15]. Viime vuosina, wogonin, joka on flavonoidi, on saanut kasvavaa huomiota sen tuumorin vastaista toimintaa hepatooma [16], rintasyöpä [17], mahasyöpä [18], kohdunkaulan karsinooma [19], ja leukemia [20, 21] . Monet wogonin johdannaisia ​​on syntetisoitu on parempi vesiliukoisuus ja druggability, ja jotkut näistä syntetisoitiin johdannaisia ​​ovat osoittaneet mahdollisia antituumorivaikutukset. Esimerkiksi, LYG-202, joka on wogonin johdannainen, indusoi apoptoosia ihmisen maksasyövän HepG2-soluihin indusoi ROS-mitokondriot-reitin [22]. LYG-202 indusoi myös solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin paksu- ja HCT116-solujen kautta sääntely p53 ja p21WAF1 /CIP1 [23]. Toinen wogonin johdannainen, LW-214, on voimakas antituumorivaikutus ihmisen rintasyövän MCF-7-soluihin alaspäin säätäminen Trx-1 ja aktivoimalla JNK-reitin, lopulta asiakkuutta mitokondrio-välitteisen apoptoosin [24]. Tässä työssä olemme keskittyneet LZ-207, joka on äskettäin syntetisoitu flavonoidi, jonka rakenne on samanlainen kuin wogonin. Metoksiryhmä in LZ-207 on substituoitu 6′-asemassa, ja piperatsiini substituutio tapahtuu 7′-asemassa (katso kuvio 1 B). Nämä substituutiot parantaa vesiliukoisuus (taulukko 1) ja druggability LZ-207 verrattuna muihin flavonoidi perheenjäseniä. Siksi olimme kiinnostuneita tarkasteltaessa antituumorivaikutukset LZ-207 koliitti liittyvien syöpien ja paljastaen vuorovaikutukset tulehdussolujen ja syöpäsoluja. Tässä asiakirjassa, tutkittiin kasvua estäviä vaikutuksia LZ-207 HCT116-soluissa ja estäviä vaikutuksia LZ-207 tulehduksellisten prosessien THP-1-monosyyteissä. Tutkimme myös estäviä vaikutuksia LZ-207 tulehduksellisen vasteen esiin viljelemällä HCT116-solujen LPS-indusoidun ihmisen monosyyttien THP-1-soluissa.

(A) kemiallinen rakenne 15-hiilen flavone selkäranka. (B) Kemiallinen rakenne LZ-207 (C

26H

32N

2O

6, MW = 468,5421).

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

LZ-207 (puhtaus 99%), joka saatiin tri Zhiyu Li (Kiina Pharmaceutical yliopisto, Kiina), liuotettiin DMSO: hon 0,1 M kantaliuoksena ja säilytettiin -20 ° C: ssa. LZ-207 oli juuri laimennettiin soluviljelyalustaa eri lopulliset pitoisuudet ennen kutakin koetta. Lopullinen DMSO-konsentraatio ei ylittänyt 0,1%, ja ei ollut vaikutusta solun kasvuun ja erilaistumiseen.

Lipopolysakkaridit (LPSs), 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) ja 4 ’, 6-diamino-2-fenyyli-dihydrokloridi (DAPI) ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Anneksiini V-FITC apoptoosin detektioreagenssipakkaus, kemiluminoiva sähkövoimaan shift-määritys (EMSA) kit ja ihmisen IL-1β: n ja IL-6 entsyymi-immunologinen määritys (ELISA-pakkauksia), hankittiin Bender MedSystems Co., Ltd. (Burlingame, CA, USA), Beyotime Biotekniikan instituutti (Nanjing, Kiina), ja KeyGen Biotech Co., Ltd (Nanjing, Kiina), tässä järjestyksessä.

Ensisijainen β-aktiini-vasta saatiin Boster Biotekniikka, Ltd . (Wuhan, Kiina) ja käytettiin 1: 20000 laimennos. Ensisijainen Akt, Bax, kaspaasi-3, kaspaasi-8, kaspaasi-9, ERK, IκBα, NF-KB: n, JNK, p38, p-Akt, p-ERK, p-JNK, p-p38-vasta-aineita saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) ja olivat kaikki käytettiin 1: 500 laimennus. Ensisijainen Bcl-2, IKKα /β, PARP, p-IKKα /β, p-IκBα vasta-aineet saatiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA) ja olivat kaikki käytettiin 1: 1000 laimennus. IRDye 800-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineet on saatu Rockland, Inc. (Philadelphia, PA, USA) ja sitä käytettiin 1: 15000 laimennos.

Soluviljely

Ihmisen paksusuolen HCT116-solut, ihmisen peräsuolen syövän SW1116 ja HT29, ihmisen napalaskimon endoteelisolujen HUVEC-solut, ihmisen normaalit keuhkojen fibroblasteista MRC5 soluja ja ihmisen akuutti monosyyttileukemian THP-1-solut hankittiin solusta pankin Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). HCT116, HT29, SW1116, HUVEC, MRC5 ja THP-1-soluja viljeltiin joko McCoyn 5A-väliaine tai DMEM-elatusainetta (Gibco Invitrogen Corporation, NY, USA). Kaikki alustat täydennettiin 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS) (Gibco, Invitrogen Corporation, NY, USA), 100 U /ml bentsyyli- penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä, pH 7,4, ja soluja pidettiin CO

2-inkubaattorissa (Thermo Forma, Thermo Fisher Scientific, Inc., MA, USA) kanssa kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2 37 ° C: ssa [25, 26].

solunelinkykyisyysmääritys

SW1116-soluissa, HT29, HCT116-soluja HUVEC-solut, MRC5-solut ja THP-1-soluja maljattiin 96-kuoppaisille levyille 100 ui sopivaa väliainetta optimaalinen tiheys. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla LZ-207 ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 24, 48 ja 72 tuntia. Sen jälkeen, 20 ui MTT-liuosta (5 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 vielä 4 tunnin ajan. Sitten supernatantit heitettiin pois, ja 100 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Levyjä ravisteltiin 2 min varmistamiseksi yhteensä liukoisuuden formatsaanikiteet, ja solujen elinkyky määritettiin perustuen mitokondrioiden muuntaminen MTT formatsaaniksi. Absorbanssi (A) mitattiin 570 nm: ssä käyttäen Universal Microplate Reader (EL800, BioTek Instruments Inc.). Esto suhde (%) ja eloonjäämisaste (%) laskettiin käyttäen seuraavia yhtälöitä:

Käsitellyt ja A

Ohjaus olivat keskimääräiset absorbanssiarvot kolme rinnakkaista kokeissa hoidetusta ja ohjaus ryhmiä, vastaavasti.

IC

50, joka on konsentraatio, joka aiheutti 50%: n inhibition solujen elinkelpoisuuden, laskettiin käyttäen logit-menetelmällä [24].

DAPI-värjäyksellä määrityksessä

Cell tumat visualisoitiin DAPI-värjäyksellä, joka emittoi sinistä fluoresenssia sitoutumisen AT alueille DNA, havaitsemiseksi morfologisten näyttöä apoptoosin. Jälkeen LZ-207 käsittelyä varten 24 h, HCT116 solut kiinnitettiin kylmällä 4% paraformaldehydillä 30 minuutin ajan, pestiin kaksi kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), ja sitten läpäiseviksi 0,3% Triton X-100: ssa 20 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Pesun jälkeen kahdesti PBS: llä, soluja inkuboitiin DAPI (1 ug /ml) 10 minuutin ajan ja sitten havaittiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (Olympus, Japani), jossa on huippu eksitaatioaallonpituudella 340 nm [27].

anneksiini V /PI-kaksois- fluoresenssi

Apoptosis-välitteistä kasvainsolun kuoleman tutkittiin käyttäen kaksinkertaista värjäystä menetelmä, FITC-leimattu anneksiini V /PI-Apoptosis Detection Kit mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. HCT116-solut McCoyn 5A-alustassa, joka sisälsi 10% FBS: ää viljeltiin 6-kuoppaisille levyille mukava tiheys 24 tuntia. Jälkeen LZ-207 (5, 10 tai 20 uM) hoitoa vielä 24 tuntia, solut kerättiin, pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä, ja sitten suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan sitoutumispuskuria. Seuraava, 5 ui anneksiini V: n ja 5 ui PI lisättiin peräkkäin kuhunkin putkeen, sekoitettiin varovasti ja pidettiin jäillä 10 minuutin ajan pimeässä. Tietojen hankinta ja analysointi suoritettiin käyttäen Becton Dickinsonin FACS Calibur virtaussytometrillä kanssa FlowJo 7 ohjelmisto eksitaatio /emissio 488/530 nm. Vasemmassa alaosassa fluorocytograms (An-, PI) edustaa normaalit solut, oikea alaosa fluorocytograms (An +, PI) edustaa alussa ja puolivälissä apoptoottisia soluja, ja oikea yläosa fluorocytograms (An +, PI +) edustaa myöhään apoptoottisia soluja [28, 29].

mitokondrio transmembraaninen potentiaali (ΔΨm) arviointi

mitokondrio transmembraaninen potentiaali (ΔΨm) muutokset voidaan osoittaa JC-1, fluoresoivaa väriainetta KEYGEN JC-1 Apoptosis Detection Kit (Kiina). Jälkeen LZ-207 (5, 10 tai 20 uM) hoitoa 24 h, HCT116-solut kerättiin, pestiin PBS: llä, suspendoitiin uudelleen JC-1 toimi puskuria. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa, 5% CO

2 30 minuutin ajan, solut pestiin kahdesti inkubaatiopuskurissa ja analysoitiin virtaussytometrialla ja ohjelmiston FlowJo 7 asetukset FL1 (FITC, vihreä) ja FL2 (PI, punainen [30]).

valmistaminen mitokondrioiden ja solulimafraktiot

mitokondrioiden ja sytosolisia fraktioita solut valmistettiin käyttäen KEYGEN mitokondrioita eristyspakkausta (Kiina) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Jälkeen LZ-207 (5, 10 tai 20 uM) hoitoa 24 tuntia, HCT116-solut kerättiin, pestiin PBS: llä, suspendoitiin uudelleen kylmään hajotuspuskuriin ja homogenoidaan jäävettä tiukka survin. Sitten solut siirrettiin keskipitkän puskuria ja sentrifugoitiin 10 min 4 ° C: ssa (1200 g). Supernatantti kerättiin ja sentrifugoitiin jälleen 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa (7000 g), jolloin saatiin mitokondrioita (pelletti) ja sytosolin (supernatantti) fraktioiden. Mitokondrioita ja sytosolin jakeet HCT116-soluja säilytettiin -80 ° C: ssa [31].

Immunofluoresenssi

HCT116-solut ympättiin lasipeitinlevyille 6-kuoppalevyillä 24 tuntia ja käsiteltiin LZ -207 (5, 10 tai 20 uM) tai ilman LPS: ää (10 ug /ml) vielä 24 tunnin ajan. Sitten solut huuhdeltiin kolme kertaa PBS: llä 5 minuutin ajan kutakin, kiinnitettiin kylmällä 4% paraformaldehydillä 30 min ajan, huuhdeltiin kolme kertaa PBS: llä 5 minuutin ajan kutakin, läpäiseviksi 0,3% Triton X-100: ssa 20 minuutin ajan, blokattiin 5 % BSA 60 min ja inkuboitiin ensisijaisen NF-KB: n vasta-ainetta (laimennettu 1: 200) yön yli 4 ° C: ssa. Huuhtelun jälkeen kolme kertaa PBS: llä, joka sisälsi 0,01% Tween 80: ssa 5 min kukin solut värjättiin FITC-leimatun sekundaarisen vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (1: 100) 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan pimeässä. Sitten solut huuhdeltiin kolme kertaa PBS: llä 5 minuutin ajan kutakin, ja värjättiin DAPI. Kuvat otettiin kiinni Olympus FV1000 -konfokaalimikroskoopilla [32].

valmistaminen kokosolulysaateista ja sytosoliset ja tumaekstrakteilla

Lyhyesti, soluja viljeltiin noin 80-90% konfluenssiin ja käsiteltiin LZ-207 ilmoitettuina pitoisuuksina kanssa tai ilman LPS: ää (10 ug /ml) 24 tuntia. Koko solulysaatit valmistettiin, kuten aiemmin on kuvattu [33]. Ydin- ja soluliman proteiinin uutteet valmistettiin käyttäen Nuclear /sytosoliin fraktiointi Kit mukaisesti muunnetun valmistajan protokollan mukaisesti. Kun oli pesty kahdesti PBS: llä, solut kerättiin putkiin PBS: llä raaputtamalla solukaapimella ja sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 4 ° C: ssa (600 g). Sitten, poistimme supernatantti, suspendoidaan uudelleen solupelletti kanssa soluliman uuttamalla ja inkuboitiin tätä suspensiota jäillä 15 minuutin ajan, jota seurasi 15 min sentrifugoimalla 4 ° C: ssa (14000 g). Supernatantti (solulimafraktio) siirrettiin varovasti puhtaaseen, pre-jäähdytetty putki ja säilytettiin -80 ° C: ssa myöhempää käyttöä varten. Sitten sama tilavuus sytosolin uuttopuskuria lisättiin pellettiin uudelleen, ja sama toistettiin kuten edellä, paitsi että supernatantti heitettiin pois viimeksi. Ydin- Pelletti suspensoitiin uudelleen ydin- uuttopuskuria, pidettiin jäissä 30 min, ja sitten sentrifugoitiin 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa (12000 g). Supernatantti (tumaproteiiniuutetta) siirrettiin varovasti puhtaaseen, pre-jäähdytetty putki ja säilytettiin -80 ° C: ssa [33].

EMSA

HCT116 solujen tuman proteiinit uutettiin, kuten on kuvattu aiemmin. EMSA suoritettiin käyttäen ei-radioaktiivista (biotiinileimattu) gel shift assay mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, oligonukleotidikoettimia syntetisoitiin, hehkutettu, ja leimattu käyttäen biotiini 3′-päästä DNA-merkinnät (Pierce). Noudattamalla valmistajan protokollan, valmistetut DNA-proteiini-kompleksit erotettiin 6% ei-denaturoivalla polyakryyliamidigeelillä 0,5 x Tris-boraatti-EDTA-puskuriin 380 mA: ssa 1 tunti ja siirrettiin sitten nailonkalvolle. Lopuksi geeli siirtyminen biotiini-leimattua DNA visualisoitiin kemiluminesenssin käyttäen Bio-Rad infrapuna-järjestelmä ja kemiluminesenssi EMSA kit [34].

Western blot-analyysi

kokosolulysaateista ja soluliman ja ydinvoiman otteita käsitellyistä soluista valmistettiin kuten edellä on kuvattu, ja proteiinipitoisuus mitattiin käyttämällä BCA-määrityksellä, jossa on Varioskan multimode mikrolevyspektrofotometrillä (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) 562 nm: ssä. Yhtä suuret määrät proteiinia, näytteet valmistettiin, erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosalle (NC) kalvoja. Membraanit blokattiin 1% BSA: ta PBS: ssä 37 ° C: ssa 1 tunti ja sitten inkuboitiin ilmoitetuilla primaaristen vasta-aineiden yön yli 4 ° C: ssa, jonka jälkeen inkuboitiin IRDye 800-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Detection suoritettiin käyttäen Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Inc., Lincoln, NE, USA). Kaikki blotit stripattiin ja uudelleenseulottiin polyklonaalista anti-β-aktiini-vasta-aine, sen varmistamiseksi, yhtä suuri kuormitus proteiinien [35].

Cytokine kvantifiointiin ELISA

Ihmisen IL-6 ja IL-1β ELISA käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden määrittää ilmaisun eritetyn IL-6 ja IL-1β sytokiinien supernatanteissa käsiteltyjen THP-1-soluissa. THP-1-soluja käsiteltiin LZ-207 (5, 10 tai 20 uM) tai ilman LPS: ää (10 ug /ml). Kukin koe toistettiin kolme kertaa. Sytokiini tasot on ilmaistu pg /ml. Sytokiinit ei havaittu tuoreen viljelemiseksi käytetty näihin soluihin [36].

RNA ja kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qPCR) määritys

Yhteensä RNA käsiteltiin THP-1-soluissa uutettiin käyttäen fenoli /kloroformi menetelmällä TRIzol reagenssia (Invitrogen). Käänteistranskriptio (RT) suoritettiin käyttäen yhtä suuria määriä mRNA: ta, ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qPCR) suoritettiin seuraavasti Takara kitin (Takara, Takara Bio Inc., Otsu, Shiga, Japani). cDNA kerättiin myös reaaliaikaiset kvantitatiiviset käänteistranskriptio-PCR: llä (qRT-PCR), joka suoritettiin käyttäen Chromo4instrument (Bio-Rad, Berkeley, CA, USA), jossa SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, CA, USA). Suhteellinen määrä kohde-mRNA määritettiin käyttäen vertailevaan kynnysarvon (Ct) menetelmä normalisoimalla kohde-mRNA: Ct-arvoja, jotka arvot β-aktiinin (△ Ct) [37]. Alukesekvenssit olivat seuraavat:

IL-6-sense: 5′-TGTAGTGAGGAACAAGCCAGAG-3 ’;

IL-6-antisense: 5′-TACATTTGCCGAAGAGCC-3′;

IL-1β-sense: 5′-AGGCTGCTCTGGGATTC-3 ’;

IL-1β-antisense: 5′-GCCACAACAACTGACGC-3′;

β-aktiini-sense: 5′-CTGTCCCTGTATGCCTC T-3 ’;

β-aktiini-antisense: 5′-ATGTCACGCACGATTTCC-3′

Co-viljelmä HCT116-solujen THP-1-soluissa

HCT116-solut ympättiin 6-kuoppaisille maljoille 4 x 10

4 solua per kuoppa, ja annettiin kasvaa noin 80% konfluenssiin. THP-1-solut kerättiin sentrifugoimalla (600 g 10 min ajan, pestiin ja suspendoitiin uudelleen lopulliseen konsentraatioon 2 x 10

5 solua /ml) ja lisättiin HCT116-soluissa. Sitten co-kulttuurin järjestelmä jätettiin käsittelemättä, aktivoitu LPS: llä, tai käsiteltiin LZ-207 yhdessä LPS. 24 tunnin jälkeen yhdessä viljelemisen järjestelmä lopetettiin, ja soluviljelyaine poistettiin. HCT116-solut pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä (pH = 7,4), ja solujen elinkyky mitattiin käyttäen MTT-määrityksiä yllä kuvatulla tavalla [38, 39].

Kasvaintenvastainen vaikutukset HCT116 nude-hiirten ksenograftien

eläin koe suoritettiin pohjalta normaalitoiminnalle menettely perustettu valtion Food and Drug Administration (SFDA) Kiinassa. Kateenkorvattomiin BALB /c-nude-hiiriin, naispuolinen, 35-42 päivää vanha paino vaihtelee 18-22 g saatiin Shanghai Institute of Materia Medica, Kiinan tiedeakatemia. Kyseisen taudinaiheuttajan vapaa nude-hiiriä nostetaan valvotusti ympäristössä (23 ± 2 ° C, 55 ± 5% kosteus, 12 h valo + 12h pimeä /vrk) ja syötetään vakio laboratorio ruokaa ja vettä. 1 x 10

6 HCT116-soluja injektoitiin oikeaan axilla kunkin nude-hiirten perustaa eläinmallissa. 12 päivän jälkeen, mikrometriä satulat käytettiin määrittämään kasvaimen kokoa. Nude-hiirissä, joilla on samankaltaisia ​​kasvaimen tilavuus valittiin satunnaisesti jaettu 5 ryhmään: 0,9% suolaliuosta kontrolliryhmässä (12 nude-hiirissä), 5-Fu 30 mg /kg positiivinen ryhmä (6 nude-hiirtä), LZ-207 20 mg /kg ryhmän ( 6 nude-hiirissä), LZ-207 10 mg /kg ryhmässä (6 nude-hiirissä) ja LZ-207 10 mg /kg ryhmässä (6 nude-hiirissä). Nude hiiret saivat laskimonsisäisesti joka kolmas päivä. Kasvaimen tilavuus ja kehon paino mitattiin myös joka kolmas päivä. 21 päivän hoidon jälkeen, kaikki nude hiiret lopetettiin, perifeeristä verta kerättiin; kasvaimet poistettiin ja painotettu; sydämen, maksan, perna, keuhkot ja munuaiset erotettiin. Kasvaimen tilavuus (TV) laskettiin käyttäen seuraavaa yhtälöä: TV (mm

3) = D /2 x d

2, jossa D ja d ovat pisin ja lyhin halkaisijat kasvaimen vastaavasti [27].

tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta (SD) kolmesta rinnakkaisesta kokeissa, jotka suoritettiin rinnakkain tavalla, ellei toisin mainita. Kaikki tiedot vertailut tehtiin Studentin

t

-testaukset ja katsottiin tilastollisesti merkitsevä *

P

0,05 ja **

P

0,01.

Tulokset

LZ-207 inhiboi kasvainsolujen elinkelpoisuuden

MTT määrityksiä käytettiin vaikutuksen tutkimiseksi eri pitoisuuksien LZ-207 solujen elinkykyä kasvainsolulinjojen (SW1116, HT29 ja HCT116-solut), hyvänlaatuiset solulinjat (HUVEC ja MRC5 soluja) ja THP-1-soluissa. Jälkeen 48 tunnin hoito, LZ-207 esti elinkelpoisuuden SW1116, HT29, ja HCT116-soluissa (kuvio 2A), jossa IC

50-arvot 25,1 ± 0,86, 39,5 ± 1,13, ja 13,2 ± 1,49 uM ( Kuva 2B). Kuten on esitetty kuviossa 2C, HCT116-solut osoittivat ajasta ja annoksesta riippuva herkkyys LZ-207. IC

50-arvot 24, 48 ja 72 h LZ-207 hoidot HCT116-soluja 19,81 ± 0,75, 14,58 ± 0,42, ja 9,32 ± 0,50 uM (kuvio 2D). Siksi HCT116-solulinja valittiin kaikissa myöhemmissä kokeissa, joissa käytettiin 5, 10 ja 20 uM LZ-207 hoitoja 24 h. Kolme annoksia LZ-207 osoitti myös, mitään selvää vaikutusta eloonjäämisaste hyvänlaatuinen solujen ja THP-1-solut, joita käytetään yhdessä viljelemisen järjestelmän alla.

(A) estävä vaikutus 48 h hoito LZ-207 SW1116, HT29 ja HCT116-soluissa. (B) IC

50-arvot 48 h hoidon LZ-207 SW1116, HT29 ja HCT116-soluissa. (C) HCT116-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla LZ-207 24, 48 ja 72 tuntia. (D) IC

50-arvot 24, 48 ja 72 h LZ-207 hoitoja HCT116-soluissa. (E): n eloonjäämisluku 48 h hoidon LZ-207 HUVEC ja MRC5 soluja. (F): n eloonjäämisluku 48 h hoidon LZ-207 THP-1-soluissa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD (n = 3).

LZ-207 indusoi apoptoosia HCT116-soluissa

morfologia HCT116-solujen ankarasti muuttunut sen jälkeen, kun 24 tunnin hoidon LZ-207. Sen tutkimiseksi, LZ-207 indusoi apoptoosin HCT116-soluissa, DAPI värjäys havaitsemiseen käytettiin ydin- muutoksiin. Fluoresenssimikroskopia osoitti, että valvonta solut tasaisesti värjättiin sininen fluoresenssi, osoittaa tyypillistä homogeeninen jakautuminen kromatiinin että nucleolus. Sitä vastoin, HCT116-solut käsiteltiin LZ-207 emittoiman kirkkaampi fluoresenssi, joka osoittaa varhaisen apoptoosin koska kromatiinin kondensaatio ja nucleolus pyknosis (kuvio 3A).

HCT116-soluja käsiteltiin 5, 10 tai 20 uM LZ-207: ssa 24 tuntia. (A) morfologisia muutoksia on nucleolus havaittiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (400 x). Soluja tutkittiin läsnäolo apoptoottisten kappaleiden ja ydinvoiman pyknosis. (B) anneksiini V /PI kaksinkertainen värjäys määrityksessä HCT116-solujen.

Y

akselilla esitetään PI-leimatun väestö, ja

X

akselilla näkyy FITC-leimattu anneksiini V-positiivisia soluja. (C) apoptoottiset hinnat HCT116-solujen aiheuttama LZ-207. (D) Western blotting-analyysi PARP, Bax, Bcl-2, prokaspaasi-3, prokaspaasi-9, ja prokaspaasi-8 HCT116-soluissa käsitelty LZ-207. (E-G) Densitometri analyysi edustaa suhteellista kertaluokkamuutos proteiiniekspressiossa. (H-I) muutos ΔΨm havaittiin käyttämällä JC-1-värjäys ja analysoitiin virtaussytometrialla in LZ-207 käsiteltiin HCT116-soluissa. (J-K) Western blot-analyysi Sytokromi c mitokondrioita ja sytosoliin LZ-207 käsiteltyjen HCT116-soluissa. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD (n = 3). *

P

0,05, **

P

0,01, merkittävä ero verrattuna kontrolliryhmään.

LZ-207-indusoidun apoptoosin HCT116-soluissa vahvistettiin edelleen käyttäen anneksiini V /PI-värjäyksen määrityksissä. Hoidon jälkeen 5, 10 tai 20 uM LZ-207: ssa 24 tuntia, varhainen apoptoottinen hinnat ohjaus ja käsiteltiin HCT116-soluja 4,35, 10,21, 14,76, ja 22,14%: lla, ja myöhäinen apoptoottiset hinnat olivat 3,76, 9,75, 21,78, ja 26.79%: lla (kuvio 3B ja 3C). Nämä tulokset osoittivat, että LZ-207 käsittely indusoi sekä varhaisen ja myöhäisen apoptoosin konsentraatio-riippuvaisella tavalla.

Western blotit osoittivat, että proteiini tason katkaistun PARP kasvoi kasvavilla pitoisuuksilla LZ-207, kun taas proteiinin taso ehjää PARP väheni, mikä vahvistaa kyky LZ-207 apoptoosin osana tuumorin vastaisen vaikutuksen HCT116-soluissa (kuvio 3D ja 3E). Olemme myös havainneet, että Bcl-2: n ilmentymisen jälkeen vähentynyt HCT116-soluja käsiteltiin LZ-207: ssa 24 tuntia, kun taas Bax ilme kasvoi, mikä johtaa huomattavaan kasvuun Bax /Bcl-2-suhde (kuvio 3F). Olemme lisäksi havainneet, että prokaspaasi-3 ja prokaspaasi-9 ilmentyminen väheni merkittävästi, kun LZ-207 käsittelyä, mikä osoittaa, että tämä mitokondrioiden reitti voi olla mukana LZ-207: n indusoiman apoptoosin (kuvio 3G). Aikana mitokondriot välittämän apoptoosin, Depolarisaatio mitokondriaalisen transmembraanisen potentiaali (ΔΨm) mukana vapauttamalla sytokromi c mitokondrion sytosoliin, mikä laukaisee kaspaasiriippuvaisen apoptoosin. Oli ilmeistä vihreän fluoresenssin lisäys JC-1 monomeerien LZ-207 käsiteltyjen HCT116-soluissa, mikä osoittaa Depolarisaatio mitokondriaalisen transmembraanisen potentiaali (ΔΨm) (kuvio 3H ja 3I). Huomasimme myös, että ilmaus Cyt-c väheni mitokondrioita taas lisääntynyt sytosoliin LZ-207 käsiteltyjen HCT116-soluissa (kuvio 3J ja 3K). Samaan aikaan lievä hajoaminen prokaspaasi-8 ehdotti, että voitaisiin ulkoista apoptoosireitin saattaa myös korreloivan LZ-207-aiheuttaman apoptoosin (kuvio 3G).

Estovaikutus LZ-207 LPS-indusoidun NF-KB p65 aktivaatio HCT116-soluissa

NF-KB-perheen transkriptiotekijöiden säätelee useiden geenien ekspressiota, mukaan lukien tulehdukseen liittyvien geenien. Siten dysregulaatio NF-KB: n signalointi on merkki syövän kehitystä. Käyttämällä immunofluoresenssilla konfokaalimikroskopia (kuvio 4A), havaitsimme, että LZ-207 käsittely esti NF-KB p65 tumaansiirtymiseen sisään HCT116-soluissa. Me määrällisesti määrä NF-KB: n p65 ydinvoiman osa LZ-207-käsiteltyjen HCT116-solujen kautta Western blot-analyysi, ekspression ydin- NF-KB: n lisääntynyt 10 ug /ml LPS: ää käsittely HCT116-soluissa, kuten on esitetty kuviossa 4B ja 4C; kuitenkin, tämä LPS-indusoidun NF-KB-tumaansiirtymiseen tukahdutettiin LZ-207 käsittelyä. Käyttäen EMSA määritykset, olemme myös osoittaneet, että LZ-207 tukahdutetaan LPS-indusoidun NF-KB: n DNA: ta sitovaa aktiivisuutta annoksesta riippuvalla tavalla HCT116-soluissa (kuvio 4D).

HCT116-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman LZ- 207: n läsnä ollessa LPS: llä 1 tunnin ajan. Eristämisen jälkeen ydin- ja sytoplasminen uute, (A) NF-KB: n p65-tasot määritettiin immunofluoresenssilla, ja (B-C) NF-KB: n p65: n translokaatio mitattiin kautta Western blotting. (D) LZ-207 tukahdutetaan LPS-indusoidun NF-KB: n DNA: ta sitovaa aktiivisuutta pitoisuudesta riippuvaisella tavalla, kuten havaitaan kautta EMSA-määritystä. (E-H) Western blot analyysi fosforylaation IKB ja IKK in HCT116 käsiteltyjen solujen kanssa tai ilman LZ-207: n läsnä ollessa LPS: llä 1 tunnin ajan. Tiedot esitetään keskiarvona ± SD (n = 3). *

P

0,05, **

P

0,01, merkittävä ero verrattuna kontrolliryhmään.

Koska NF-KB: n aktivaation tulosta nopeasta fosforylaation, ubikitinaation ja lopulta proteolyyttisen hajoamisen lKB, tutkimme vaikutus LZ-207 ilmentymistä fosforyloitua IκBα LPS-indusoidussa HCT116-solujen Western blotilla. LZ-207 inhiboi merkittävästi IκBα fosforylaatio kontrolliin verrattuna, mutta ei vaikuttanut IκBα proteiinin ilmentymiseen (kuvio 4E ja 4F). Koska IKB hajoaminen riippuu ensisijaisesti IKK aktivointia, seuraava, tutkimme vaikutus LZ-207 IKK aktivointia ja totesi, että LZ-207 merkittävästi tukahdutti LPS-indusoidun IKKα /β fosforylaation HCT116-soluissa (kuvio 4G ja 4H).

LZ-207 inhiboi signalointireitteihin ylävirtaan NF-KB: HCT116-soluissa

solut aistivat muutoksia ympäristössään aktivaation kautta signaalitransduktioreaktioteiden että suora biokemialliset ohjelmia välittävän lisääntymistä ja selviytymistä. Mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) perhe ja Akt signalointireitteihin voi säädellä näitä perustavaa laatua solun prosesseja induktion IKK-riippuvainen NF-KB: n aktivaation. Olemme tutkineet ilmentymistä tekijöiden ylävirtaan NF-KB: n aktivoitumisen, mukaan lukien p38 MAPK, ERK1 /2, JNK ja Akt jälkeen LZ-207 käsittely LPS-indusoidussa HCT116-soluissa. Kuten on esitetty kuviossa 5A ja 5B, LZ-207 esti LPS-indusoidun fosforylaation p38 MAPK, ERK1 /2, JNK ja Akt, kun taas ekspressiotasot p38 MAPK, ERK1 /2, JNK, ja Akt ei muutettu.

HCT116-soluja käsiteltiin kanssa tai ilman LZ-207: n läsnä ollessa LPS: llä 1 tunnin ajan. (A) Western blotting-analyysi p38, p-p38, ERK, p-ERK, JNK, p-JNK, Akt, p-Akt-proteiinia ilmentyminen. *

P

0,05, **

P

β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. *

P

0,05, **

P

*

P

0,05, **

P

*

P

0,05, **

P

*

P

0,05, **

P