Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tauti suuntautunut toiminnallinen analyysi epigenetic tekijöitä ja niiden sääntelymekanismeille poikkeavien hiljentäminen on edellytys parempaa diagnostiikkaa ja hoitoa. Silti tarkat mekanismit ovat vielä epäselviä ja monimutkaisia, joihin vuorovaikutuksesta useiden efektorien kuten nukleosomi paikannus, DNA: n metylaatio, histoni variantit ja histonimodifikaation. Olemme tutkineet epigeneettiset hiljentäminen monimutkaisuus tuumorisuppressorigeeniä

Cadm1

hiiren keuhkosyöpään kantasolujen linjoja, joilla promoottori hypermetylaation liittyy transkription repression, mutta enimmäkseen vastannut demetyloivan lääkehoitoon. Sen jälkeen ennustamiseen nukleosomin kantoja ja transkriptiotekijän sitoutumiskohtien pitkin

Cadm1

promoottori, suoritimme yhden molekyylin kartoitus DNA metyylitransferaasi

M.Sss

I, joka paljasti hiljainen promoottorit korkea nukleosomin käyttöasteen ja tukkeuman transkriptiotekijän sitoutumiskohtia. Lisäksi

M.Sss

I karttoja promoottoreita vaihteli ja eri keuhkosyövän solulinjat. Kromatiinin analyysi micrococcal nukleaasilla myös ilmoittanut vaihtelut nukleosomissa paikannus on vaikutuksia sitoutumiseen transkriptiotekijöiden lähellä nukleosomin rajoja. Kromatiinin immunosaostus osoitti, että histoni variantteja (H2A.Z ja H3.3), ja vastakkaiset histonimodifikaation markkaa (H3K4me3 ja H3K27me3) kaikki colocalized samassa nukleosomiin kantoja, joka muistuttaa epigeneettiset plastisuus alkion kantasoluja. Kaikkiaan epigeneettiset hiljentäminen monimutkaisuutta promoottorialueen

Cadm1

ei määritä ainoastaan ​​DNA hypermetylaation, mutta korkea nukleosomi käyttöaste, muuttunut nukleosomin paikannus, ja ”kaksivalenssinen” histonimodifikaation, todennäköisesti myös osaltaan transkription tukahduttaminen tämän geeni keuhkoissa syöpäsoluja. Tuloksemme auttaa määrittelemään hoitointerventio strategioiden epigeneettiset huumeita keuhkosyöpään.

Citation: Reamon-Buettner SM, Borlak J (2012) Ruotiminen Epigeneettiset hiljentäminen monimutkaisuus Hiiri Keuhkosyöpä vaimennin Gene

Cadm1

. PLoS ONE 7 (6): e38531. doi: 10,1371 /journal.pone.0038531

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 22 syyskuu 2011; Hyväksytty: 7. 2012 Julkaistu: 6. kesäkuuta, 2012

Copyright: © 2012 Reamon-Buettner, Borlak. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat tiede ja kulttuuri, Niedersachsenin, Saksa 25A 5-7251-99 /00. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on edelleen yleisin kuolinsyy, mutta molekyylitason mekanismeja taudin ovat suurelta osin tuntemattomia. Monet tutkimukset osoittavat nyt, että geneettiset ja epigeneettiset muutokset kuten syyllisiä [1]. Epigeneettiset tapahtumat ovat periytyviä muutoksia geenien ilmentyminen ilman muutoksia ensisijainen DNA-sekvenssin. Ne ovat tärkeitä normaalin kehityksen ja erilaistumisen, mutta kun väärään johtaa sairauksiin, erityisesti syöpään [2]. Tästä huolimatta monet prosessit johtaen geenien voidaan kumota epigeneettiset huumeita, joka tarjoaa toivoa hoitoa ja terapiaa [3]. Epigeneettisenä maisema hiljentäminen on kuitenkin monimutkainen, johon vuorovaikutus suurten efektorien kuten nukleosomi paikannus, DNA: n metylaatio, histoni variantteja, histonimodifikaation ja ei-koodaavat RNA: t [4]. Miten nämä efektorit vuorovaikutuksessa toisiinsa vaikuttaa geenin ilmentymisen ja aiheuttaa sairauksia jää epäselväksi.

DNA pakataan monimutkainen nukleoproteiini rakenteen ytimen solun kutsutaan kromatiinin, ja perus toistuvan yksikön kromatiinin on tiedossa kuten nukleosomi, rakenne ja toiminta, jotka ovat vielä selvitetty [5]. Jokainen nukleosomissa koostuu Oktameerinen histoni ydin (kaksi kappaletta kutakin H2A, H2B, H3 ja H4), jonka ympärille noin 147 emäsparia DNA kääritään 1,65 superkierremuodosta kierrosta. Nukleosomi paikannus on keskeinen rooli chromatin korkeammat taitto ja geenisäätelyn [6] – [8]. Nukleosomit voi vaikuttaa transkriptioon moduloimalla saatavuutta DNA säätelyproteiineihin ja transkription koneita, mikä geeniaktivaatioon tai tukahduttaminen. Nukleosomissa paikannus voi puolestaan ​​vaikuttaa useat tekijät, kuten DNA-sekvenssi mieltymykset, DNA: n metylaatio, histoni variantteja, ja histoni posttranslational muutoksia [6]. Lisäksi nukleosomi asemointi poikkeaa nukleosomiin käyttöaste, joka ei ota huomioon nukleosomiin alkaa edellyttäen, että tietty emäsparin sisällä nukleosomiin [7].

tekemä muutos DNA: n metylaatio tapahtuu kovalenttisen lisäämällä metyyliryhmä asentoon 5 sytosiiniosan renkaan, luoden 5-metyylisytosiini. DNA: n metylaatio on tunnettu epigeneettiset hiljentäminen mekanismi ja liittyy erilaisissa biologisissa prosesseissa ja sairaudet (arvioita, [4], [9]). Tet (1011 translokaatio) proteiinit voivat muuntaa 5-metyylisytosiinin (5mC) osaksi 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) [10], [11], ja viime aikoina myös osaksi 5-formylcytosine (5FC) ja 5-carboxylcytosine (5caC) [12] . DNA: n metylaatio saattaa estää geeniekspressiota estämällä transkription aktivaattoreita sitomasta DNA-kohteeseensa tai rekrytointi metyyli-CpG-sitova domeeni (MBD) proteiineja, jotka puolestaan ​​rekrytoivat histoni kulkuun ja chromatin-remontin kompleksit metyloiduksi sivustoja [4]. CpG metylaatio voi myös edistää tukahduttaminen geenin aiheuttamalla kompaktimpi ja jäykkä nukleosomissa konformaatio [13].

nisäkkäiden DNA metylaatio koneet välittyy DNA metyylitransferaaseja (DNMTs), joka vahvistaa ja ylläpitää DNA: n metylaatio kuviot. DNMT1 tarvitaan ylläpitämään DNA metylaation, kun taas

de novo

metyylitransferaasit DNMT3A ja DNMT3B kohdistaa uusia metyloitumattoman DNA sivustoja (tarkistettavaksi, [14]). Nukleosomit voi vaikuttaa DNA: n metylaatio, mutta toistaiseksi tutkimukset osoittavat vastakkaisia ​​tuloksia. Joko DNA metyylitransferaasien valikoivasti kohdistaa nukleosomi sitoutuneen DNA [15], tai nuk- tehdä suojaa metylaatio [16]. Lisäksi nukleosomit sisältävä metyloitua DNA vakauttaa de novo DNA metyylitransferaasien 3A /3B (DNMT3A /3B) mahdollistaa vähän vapaa DNMT3A /3B olemasta tumaan [17]. Vakauttaminen DNMT3A /3B on nukleosomeissa metyloituja alueilla edelleen edistää leviämistä DNA: n metylaation ja siten varmistaa uskollinen epigenetic perintö. CpG metylaatio voi olla myös selvä vaikutus proteiiniin sitoutumisen kun se on läsnä sisällä nukleosomaalisten tausta [18].

nukleosomaalisten histones voidaan vaihtaa histoni variantteja, ja niiden sisällyttäminen voi vaikuttaa nukleosomin paikannus, ja siten geenin toimintaa (tarkistetaan [19]). Synteesi kanoninen histonien on kytketty DNA-replikaation S-vaiheessa, kun taas histoni variantit syntetisoidaan koko solusyklin aikana. Lisäksi toisin kuin kanoninen histones joiden päätehtävänä on genomin pakkaukseen ja geenisäätelyn, ei-kanoninen histones on ratkaiseva rooli erilaisia ​​prosesseja, kuten kromosomi erottelu, transkription säätelyyn, ja DNA: n korjaukseen. Näistä histoni variantteja on H2A variantti H2A.Z, joka on erittäin konservoitunut aikana eukaryoottisia evoluution [20], [21]. Histoni variantti H2A.Z eroaa merkittävästi H2A useita aminohappoja ja edullisesti paikantuu geenin promoottorit nisäkässoluissa, jossa se on jaettu useille nukleosomeihin ylävirtaan ja alavirtaan transkription aloituskohdasta [22]. Toinen hyvin säilynyt histoni variantti on H3.3, muunnelma, joka poikkeaa kanonisen H3 muutamalla aminohapposubstituutioita, ja todettiin rikastettu koko geeni ruumiin puhtaaksi geenien promoottori alueiden aktiivinen ja passiivinen geenejä, ja säätelyelementit. Tämä vaihtoehto on myös kerääntyy hiljainen lokuksen pericentric kromatiinin ja telomeerit [23].

Lisäksi korvaaminen histoni variantteja, aminohappotähdettä N-terminaalinen hännät histonien (kanoninen sekä variantit), voidaan muuttaa eri kovalenttisella translaation jälkeisiä modifikaatioita (PTMs) ja muodostavat perustan epigeneettiset sääntelyn kromatiinirakenteeseen ja geenien toiminnan [24]. Tärkeämpää on ylikuulumisen välillä histonimodifikaation muiden epigeneettisellä sääntelyviranomaisten vahvistaa tai kumota toimintoja muutoksia. Tällaiset PTMs, joita ovat muun muassa asetylaatio, metylaatio, ja fosforylaatio, olla suora rooli vaikuttaa kromatiinirakenteeseen, tai ne voivat edustaa merkkejä tai signaaleja tunnistaa lukijat histonimodifikaation, määrittää löysä tai tiivis kromatiinin [25]. Häiriöiden histonimodifikaation normaalissa sääntelyprosessit on löydetty sairauksien, kuten syövän kehittymisen ja etenemisen. [26]

CADM1

(adheesiomolekyyli 1) on kasvaimia estävä geeni tunnistettiin non -Pieni keuhkosyöpä (NSCLC), mutta myös osallisina muissa ihmisen syöpäsairauksia [27], [28]. Osoitimme aikaisemmin, että

Cadm1

tukahdutettiin hiiren keuhkosyöpään kantasolujen linjat, ja geenin ilmentyminen korreloi voimakkaasti promoottori hypermetylaation [29]. Mutta sen jälkeen, kun hoidon demetyloiva aineen 5-atsa-2-deoksisytidiini (5-atsa-dC), suurin osa solulinjat eivät reagoi viittaa osallistumista lisäksi epigenetic hiljentäminen tapahtumia. Tämä nykyinen tutkimuksen tavoitteena oli ymmärtää epigeneettiset maisemien johtaa transkription tukahduttamisen

Cadm1

samalla hiiren keuhkosyöpään progenitorisolujen, ja lopulta saada mekanistinen oivalluksia epigeneettiset vaiennettaisi tuumorisuppressorigeeneille yleisesti ja vastaus epigeneettiset huumeita. Käyttämällä bioinformatiikan välineitä, ennustimme nukleosomin kantoja ja transkriptiotekijän sitoutumiskohtien pitkin

Cadm1

promoottori. Suoritimme tiukkaa yhden molekyylin kartoitus kromatiinin kanssa DNA metyylitransferaasi,

M.Sss

I määritellä nukleosomiin käyttöasteen ja tukos transkriptiotekijän sitoutumiskohdista. Kanssa alukepaneelia kuulustella keskelle, sekä vasen ja oikea raja ennustettujen nukleosomien, me analysoitiin ero nukleosomissa asemointi MNase pilkottua chromatin ja ChIPed DNA kanoninen histoni H2A, histoni variantit H2A.Z ja H3.3, sekä histonimodifikaation, H3K4me3 ja H3K27me3. Kaikkiaan keuhkosyöpä soluilla useita epigeneettisellä hiljentäminen tapahtumia, jotka auttavat määrittelemään hoitointerventio strategioita.

Tulokset

Cadm1

Promoottori hypermetylaation korreloi Transkription repressio

Tämä ja edellinen tutkimus [29], todettiin, että

Cadm1

promoottori CpG hypermetylaation korreloi transkriptionaalisen sorto keuhkosyövän solulinjat perustettiin yhden, spontaanisti transformoituja keuhko- kasvainsolujen

c-Myc

ja

c-Raf

double-siirtogeenisiä hiiriä. CpG-metylaation yksittäiset kloonit oli heterogeeninen sisällä ja välillä 10 eri keuhkosyövän solulinjat. Tämä edellinen tutkimus osoitti myös, että metylaatio CpG: t ytimessä sitoutumiskohtien transkriptiotekijöiden SP1, SP3, ja Zf5 kumottu DNA-proteiineihin. Lisäksi hoito demetyloiva aineen, 5-atsa-2-deoksisytidiini (5-atsa-dC) palautettu

Cadm1

geeni-ilmentymisen, mutta toistaiseksi vain kaksi solulinjoissa, mikä viittaa siihen lisäksi epigeneettinen hiljentäminen tapahtumia. Todellakin, vertaamalla DNA: n metylaation käsittelemättömissä ja atsa-käsitelty keuhkosyövän solulinjassa A2C12 vastaavien uudelleen ilmentymisen

Cadm1

osoitti, että suurin osa 69 CpG: t analysoitiin promoottorialueen olivat vielä metyloitu atsa-käsiteltyjen A2C12. Näin ollen, käsittelemällä 5-atsa-dC yksin ei voi palauttaa geenin ilmentymisen kaikissa keuhkosyövän solulinjoja tai demetyloimiseksi promoottorialueen

Cadm1

ja nämä havainnot johtivat meidät epäillä ylimääräisiä kerroksia epigeneettisten hiljentämisen paikallaan. Tutkimme lisäksi

Cadm1

promoottori ja siten saada tietoa laajuudesta epigeneettiset hiljentäminen monimutkaisuutta eri keuhkosyövän solulinjat.

nukleosomin Paikannus Ennusteet ja Merkintöjen pitkin

Cadm1

Promoottori alue

Voit selvittää CpG metylaatio saattaa vaikuttaa nukleosomissa käyttöaste johtaa epigeneettiset äänenvaimennusjärjestelmän, kuten aikaisemmin on esitetty [30], käytimme bioinformatiikan välineitä ennustaa nukleosomiin kantoja, ja käsinkirjoittaa

Cadm1

promoottorialueen. Käyttämällä nukleosomissa paikannus ennuste perustuu genomisen DNA-sekvenssin (Segal, katso materiaalit ja menetelmät), me joka sijaitsee vähintään viiden mahdollisimman nukleosomissa kantoja noin 1000 emäsparin kohti transkription aloituskohdasta (TSS) ja translaation aloituspaikasta (ATG). RefSeq TSS (NM_001025600.1) sijaitsee -21 ATG. Ennustettu nukleosomit nimetään mielivaltaisesti suhteessa ATG, koska Nuc 1 (-1011–865), Nuc 2 (-697–551), Nucl 3 (-417–271), Nucl 4 (-230–84 ) ja nuc 5 (-41-106). Sitoutumiskohdat ennustettujen sekvenssispesifisiä transkriptiotekijöiden sijaitsevat rajoilla tai näissä nukleosomeihin, ja erittäin keskitetty nukleosomit eniten vieressä TSS (kuvio 1A). Monet CpG: t ovat sisäpuolella nukleosomit, erityisesti sisällä CpG-saarekkeen, että promoottorialueen

Cadm1

(kuvio 1 B). 1000 emäsparin alueen kattaa viisi fragmentteja kokoa 124-349 emäsparin käytimme analysoida CpG-metylaation bisulfiitti-käsitelty perimän DNA varsinkin yhdessä DNA metyylitransferaasi-pohjainen yhden molekyylin chromatin (MAP-IT) määritys (kuvio 1 C , taulukko S1). Tutkimuksen aikana muita nukleosomi paikannusalgoritmit tuli saataville (esim NuPOP, ICM, katso materiaalit ja menetelmät) ja vertailu osoitti päällekkäisyyttä ennustukset joukossa kolme menetelmää (kuvio 1 D). Kuitenkin asema kolmen nukleosomeja (nimetty Nuc 1, 3, 4) näytti olevan enemmän tai vähemmän yhdenmukainen.

(A) asema viittä analysoitu nukleosomeja (sininen suorakaide) ja sitoutumiskohtiin transkriptiotekijöiden. Nukleosomit mielivaltaisesti numeroitu alkaen kaukaisin (esimerkiksi Nuc 1) kohti RefSeq transkription aloituskohdasta (TSS) ja translaation aloituspaikasta ATG, jotka molemmat sijaitsevat nukleosomissa 5 (nuc 5). Nukleotidinumerointi kanssa +1 vastaa A ATG. (B) Ennustettu nukleosomeihin ja sijainti CpG: t (pystyraitoja) ja CpG-saarekkeen pitkin

Cadm1

promoottori. (C) Viisi fragmenttia, joka kattaa analysoitu CpG: t in bisulfiitti saaneilla genomi-DNA- ja ennustettu nukleosomeissa. (D) Mahdollinen nukleosomissa kannat kolmesta eri algoritmeja.

Yhden molekyylin Kromatiini kartoitus

Cadm1

promoottorialueen

M.SssI

paljastaa korkea nukleosomin Käyttöaste vuonna Keuhkosyöpä solut

seuraava suoritti yhden molekyylin chromatin kartoitus

Cadm1

promoottorialueen. Olemme hyödynnettiin footprinting strategia, joka mahdollistaa kromatiinirakenteeseen kartoitus metyloimattoman CpG-saarekkeiden käsittelemällä eristetty ytimet DNA: n metyylitransferaasit, erityisesti CpG-spesifisten DNA-metyylitransferaasin (

M.Sss

I), jonka jälkeen genominen bisulfiitti sekvensoimalla yksittäisten jälkeläisten DNA-molekyylit, [31], [32]. Tämä menettely kutsua kuin metylointi-pohjainen yhden promoottorin analyysi (M-SPA), on myös kuvattu metyylitransferaasi saavutettavuus protokolla yksittäisten mallien (MAP-IT) [33]. Pohjimmiltaan CpG: t tullaan metyloida

M.Sss

I, bakteeri sytosiini C5 metyylitransferaasi, ellei CpG: t estetään nukleosomeissa tai DNA sitovia proteiineja. Tätä nukleosomi lokalisointi määritellään alue noin 147 emäsparia, joka on saavuttamattomissa

M.Sss

I.

CpG: t sisällä

Cadm1

promoottorialueen normaali keuhko ovat olennaisesti metyloitumattomia ja geeni ilmentyy. Käsittelimme kromatiinin normaalin keuhkojen

M.Sss

I ja analysoitiin suojattu (metyloitumaton) CpG: t pitkin promoottorialueen

Cadm1

, erityisesti niitä, jotka kuuluvat ennustetun nuk- tai transkriptiotekijän sitoutumiskohtia. Käytimme bisulfiitti alukkeita, jotka monistavat viisi fragmentteja, joista kolme päällekkäin, ja ne kattavat 69 CpG: t -944-41 suhteessa translaation aloituskohta ATG (katso kuvio 1 C, taulukko S1).

M.Sss

I hoitoon ”paljaalla” genomista DNA toimi kontrollina. Käyttämällä DNA: n metylaatio kuvion ”paljaalla” genomi-DNA: ta ja normaalin keuhkokudoksen viitteenä, olemme analysoineet kromatiinin keuhkojen kasvain, keuhkosyövän solulinjat, ja 5-atsa-dC-käsitelty keuhkosyövän solulinjassa hieman geenin uudelleen ilmentymisen. Saada tietoa eri tilannekuvia

Cadm1

promoottori, vertasimme DNA metylaation riippumattomien

M.Sss

I hoitoja saman solulinjoissa.

metylointi tehokkuutta M .SssI pitkin Cadm1 promoottorialueen ”paljaalla” genomista DNA valvontaa.

metylointi tehokkuus

M.Sss

olin ensin määritettiin ”alaston” hiiren genomista DNA: ta. Metylointi tehokkuus keskimäärin 21 klooneja kunkin fragmentti vaihteli 51-91% (kuva S1). Parhaan tehokkuuden saatiin kahden lähimmän fragmentit ympäri TSS, eli MFRA ja TSFR1 91%. Metyloitumaton CpG: t näillä fragmentit olivat enemmän tai vähemmän satunnaisia. Tämä ero metylaatio hyötysuhde voi olla osoitus siitä, että promoottorialue läheisyydessä TSS oli herkempi DNA: n metylaatio. Edellisessä analyysissä, metylaatio indeksin fragmentti TSFR1 joka sisältää TSS antoi selkein korrelaatio transkription tukahduttaminen. Kaiken metylaatio viidessä fragmentteja, 106 klooneja ja 1478 CpG: t oli 76%. Käyttämällä samaa protokollaa, myös määrittää metylointi tehokkuutta ”kuorettoman” genomi-DNA, joka on eristetty keuhkosyövän solulinjassa (A2Cl2), joka sisälsi jo ennen CpG metylaatio. Kaiken metylaatio viidessä fragmentteja, 31 klooneja ja 416 CpG: t oli 98%, mikä osoittaa luotettavuutta määritystä.

M.SssI chromatin kartta normaalien keuhkojen.

Analysoimme M.SssI karttaa chromatin eristettiin yhdeksän yhdistetyistä normaalista keuhkoista. For fragmentti BFR (255 emäsparia, 6 CpG: t -944–837), suurin osa klooneista osoitti venyttää metyloitumattoman CpG: t (kuva S1), erityisesti sellaisia, jotka sijaitsevat ennustettu nukleosomissa (Nuc 1) (kuva S2). For fragmentti 1FR (279 emäsparia, 10 CpG: t, -682–531), useat kloonit osoittivat myös venyttää metyloimatonta CpG: t, monet kuuluvat ennustettu nukleosomissa (nuc 2) (kuva S3). Nämä tulokset viittaavat nukleosomeihin käyttöaikaa.

Seuraavien kolmen päällekkäisiä palasia ympäri TSS (mREW1, MFRA, TSFR1) ja alueella, jolla useat transkriptiotekijän sitoutumiskohdista löytyisi (katso kuvio 1A), The kuviot useimmissa klooneja osoitti puuttuessa nukleosomin käyttöaste, vaan viittaavia sitoutumista transkriptiotekijöiden tai muita proteiineja, joita tarvitaan sääntelyä. Fragment mREW1 (124 emäsparia, 14 CpG: t, -456–341) monistetaan metylaatiospesifistä alukkeita (kolme CpG: t sekä eteen- että taaksepäin-alukkeita). Tämä fragmentti sisältää ennustettu sitoutumiskohtia transkriptiotekijöitä, esimerkiksi PPARg, ER, ETF, jossa CpG: t näissä sitoutumiskohdat olivat enimmäkseen metyloitumaton useissa klooneja, ehdottaa niiden sitoutumista ja mahdollinen rooli transkription säätelyyn

Cadm1

. Ennustettu ETF sivusto on sisällä nukleosomissa (nuc 3), kun taas PPARg on rajalla Nuc 3, ja voidaan helposti vaikuttaa koskevat muutokset nukleosomiin käyttöasteen ja liukuva (kuva S4).

katkelma MFRA (222 emäsparia, 27 CpG: t, -396–180) on myös vahvistetaan metylaatiospesifistä alukkeita (5 CpG: t eteenpäin pohjamaali, 6 CpG: t in käänteinen aluke). Tämä fragmentti kattaa ennustettu nukleosomi (nuc 3), ja osittain, että toisen (nuc 4) (kuvio S5). Se sisältää kaksi sitoutumiskohtaa varten SP1 jotka sijaitsevat tai vasemmalla rajalla Nuc 4. CpG: t on SP1 sitoutumiskohdat at -224 ja -211 olivat käytössä monissa omaavien kloonien nukleosomissa-vapaa malli. Tämä tulos tukee edelleen, että SP1 voi todellakin olla rooli säätelyssä

Cadm1

. Oli 2 15 kloonien kuitenkin joka osoitti pitkä venytys CpG suojan sisällä ennustettu nukleosomissa (nuc 3), mikä osoittaa nukleosomi muodostuminen tässä osassa edistäjä

Cadm1

.

fragmentti TSFR1 (345 bp, 37 CpG: t, -302 +41) monistetaan alukkeilla, jotka sisältävät kolme CpG: t on forward-aluke, ja kaksi CpG: t on reverse-aluketta (kuvio 2). Aikaisemmat tulokset osoittivat, että metylointi indeksin saatu tämä fragmentti korreloivat erittäin kanssa transkription repression verrattuna muihin fragmentit analysoitiin

Cadm1

promoottorialueen. Se sisältää sitoutumiskohtia SP1 Zf5, ja muut ennustettu transkriptiotekijöiden. Kuului myös ovat RefSeq transkription aloituskohdasta (TSS), translaation aloituspaikasta, ATG sekä vähintään kahden ennustetun nukleosomeissa (nuc 4 ja Nuc 5). Ei ollut pitkä venytys metyloimatonta CpG: t, lukuun ottamatta 3 15 klooneja, joissa suurin osa suojatun CpG: t kuuluvat ennustettu nukleosomissa (nuc 4). Näissä kloonit ilman näkyvää täyttöaste Nuc 4, ennustettu nukleosomi (nuc 5) jos RefSeq TSS sekä ATG alueet sijaitsevat, näytti ole läsnä myös, johdonmukainen avoimen kromatiinin, joka liittyy transkription. Lisäksi -224 CpG sitoutumiskohdan SP1 ja -192 CpG Zf5, olivat usein metyloimattoman, tukea niiden sitoutumisen promoottorialueen

Cadm1.

(A) metylaatiovyöhykkeiden klooneja hoidon jälkeen CpG-spesifisen DNA metyylitransferaasi (

M.Sss

I) ja pisteytys 32 CpG: t (-271-+24 CpG: t, TSFR1 fragmentti) in ”alasti” hiiri-tail genomista DNA: ta, ja chromatin yhdeksän yhdistettiin normaalista keuhkoista, kolme yhdistettiin kiinteitä keuhkotuumoreita, ja seitsemän eri keuhkosyövän solulinjoja, joilla on vähän tai ei lainkaan

Cadm1

geeniekspressiota. Kuviot saatiin Bisma missä siniset laatikot edustavat metyloimatonta CpG: t (= suojattu), kun taas punaiset laatikot, metyloituja CpG: t. Keuhkojen kasvaimet ja keuhkosyövän solulinjat, CpG-metylaatio saattaa olla sisäsyntyinen ja /tai

M.Sss

I hoitoon. (B) Huomautukset analysoiduista

Cadm1

promoottorialue (CpG: t, oletetun sitoutumiskohtia keuhko-spesifisten transkriptiotekijöiden, ennustettu nukleosomit), ja vastaava sekvenssi-yhteydessä DNA-metylaation on esitetty (A). Venytys suojattujen CpG: t erityisesti sisällä ennustettu nukleosomiin 4 oli usein monissa 84 klooneista saatujen keuhkosyövän solulinjoissa.

Yhteenvetona

M.Sss

I metylaatio kartta havaittu kloonien normaalin keuhkojen ehdotti muodostumista ennustetun viiden nukleosomit pitkin promoottorialueen

Cadm1

. Kuviot löytyy kolme fragmenttia (mREW1, MFRA ja TSFR1) ympärille TSS, jossa kolme nukleosomeissa (nuc 3, Nuc 4, ja Nuc 5) sijaitsevat, osoitti puuttuminen nukleosomin käyttöaste monissa klooneja. Kuitenkin sitoutumiskohtien transkriptiotekijöiden kuten SP1 ja Zf5 osoitti suojaa, mikä viittaa niiden rooli transkription säätelyyn

Cadm1

. Sen sijaan, että kaksi nukleosomit kauempana TSS (NUC1: nä ja nuc 2), ilman näkyvää nukleosomi remontin näytti tapahtuvan kuin useimmat kloonit vain näytteillä pitkiä metyloitumattomien CpG: t.

M.SssI chromatin kartta keuhkojen kasvain.

Analysoimme

M.Sss

I kartta kromatiinin eristetty kolmesta yhdistettyjen kiinteiden keuhkokasvaimia c

-Raf

siirtogeenisiä hiiriä.

Cadm1

vielä ilmaistu näissä kasvaimissa (ei esitetty). Koska endogeeninen CpG metylaatio keuhkotuumoreita, vain seurausta metyloimatonta CpG: t (ts suojattu) jälkeen

M.Sss

I hoidon tulkittiin. Kuitenkin kuviot kloonit ehdotti muodostumista vähintään kolme nukleosomit (NUC1: nä, Nuc 2, Nuc 3) (kuviot S1, S2, S3, S5). Tällä fragmentti TSFR1, jossa Nuc 4 ja Nuc 5 asuvat, ei ollut pitkä venytys metyloitumattoman CpG: t pitkin fragmentti osoittaa nukleosomiin käyttöaste, mutta 18 yksittäiset CpG sivustoja osoittivat suojan (kuva 2). Todellakin, 13 19 kloonia samaa kaavaa. Niistä ominaisuuksia näiden yhteinen malli sisältää lähes metylaation kahdessa SP1 sitoutumiskohtia (-224, -164 CpG: t), samoin kuin Zf5 (-192, -190, -188 CpG: t). Hoito kromatiinin peräisin keuhkojen kasvain näyte ei osoittanut läsnäoloa nukleosomaalisten käyttöaste analysoidaan klooneja fragmentti TSFR1. Kuitenkin tämä tulos perustui yhdistettiin keuhkokasvaimia joka riitti jonkin verran

Cadm1

. Lisäksi keuhkojen kasvain koostuu monista solutyypeistä mukaan lukien ei-syöpä niitä, jotka ehkä ovat vaikuttaneet havainnot esitetään kuvassa 2. Kuitenkin tasolla yksittäisten kasvainsolulinjojen, selkeitä eroja nukleosomaalisten paikannus havaittiin kuten alla.

M.SssI chromatin karttoja eri keuhkosyövän solulinjat.

suorittaa

M.Sss

I kartoitus 10. keuhkosyövän solulinjat vaihtelevalla

Cadm1

promoottori hypermetylaation ja transkription tukahduttaminen, sekä keuhkosyöpä solulinja käsiteltiin 5-atsa-dC. Samanlaisia ​​keuhkojen kasvain, koska endogeenisten CpG metylaatio keuhkosyövän solulinjat, vain kuviot metyloimatonta CpG: t (ts suojattu), kun

M.Sss

I hoidon katsottiin. Analysoimme karttoja yksittäisten solulinjojen (kuva S6, S7) sekä kollektiivisesti. Kuten aiemmin mainittiin, analysoimme myös kuvioita ”paljaalla” genomi-DNA: n keuhkosyövän solulinjassa (A2C12), joka endogeenisesti metyloitu (katso kuva S1C). Lisäksi vahvistaa tulokset ja määritellä malleja eri tilannekuvia

Cadm1

promoottori, olemme sitoutuneet kaksi hoitoa tutkimuksissa joissakin solulinjoissa (kuvio S6). Tässä kuvaamme kollektiivinen

M.Sss

I kartat löytyy keuhkosyövän solulinjoja, joilla on vähän tai ei lainkaan

Cadm1

geeniekspressiota.

fragmentti BFR, venyttää vähintään kolmen metyloimattoman CpG: t havaittiin monia klooneja. Nämä kolme sivustoja -944, -924, -903 CpG: t, jotka sijaitsevat sisällä Nuc 1 ja näin, mikä viittaa täyttöaste tämän nukleosomin (kuva S2). Sillä fragmentti 1FR, joskin klooneja että näytetään venyttää vähintään kolmen metyloitumattoman CpG: t ehdottaa nukleosomiin käyttöaste (nuc 2), useimmat kloonit olivat erittäin denaturoidulla CpG: t ja lähde tämän metyloinnin voisi olla sekä sisäsyntyinen ja koska

M .Sss

I käsittelyä (kuva S3).

fragmentti mREW1, useimmat 98 kloonit olivat erittäin metyloitua, lukuun ottamatta kahta CpG: t on -423 ja -408. Nämä kaksi CpG: t ovat ennustettu sitovan sekvenssin transkriptiotekijöiden (PPARg, ER), ja ovat rajalla Nuc 3 (kuva S4). Suojaaminen nämä kaksi CpG sivustot voivat olla niin transkriptio sitova ja nukleosomin liukuva. EMSA tulokset ehdottivat, että PPARg sitovat

in vitro

että

Cadm1

promoottori Ydinvoimalla otteet keuhkosyövän solulinjaa (A2C12), mutta ei normaalissa keuhko (kuva S8), ja voi olla rooli keuhkosyövän.

fragmentti MFRA oli viisi kloonia, joukossa 86 kloonien lähes mitään metylaatio ehdottaa nukleosomiin käyttöaste (nuc 3) (Kuva S5). Joukossa oli myös CpG sivustoja, jotka osoittautunut alhaiseksi metylaatio, erityisesti SP1 sitoutumiskohdat at -224 ja -211, joka sijaitsee rajalla nukleosomiin (nuc 4) (Kuva S5). Siten suojan keuhkosyövän solulinjoissa -224 ja -211 voi johtua sekä SP1 sitova ja nukleosomi käyttöasteen.

fragmentti TSFR1, suurin osa 84 klooneista pitkiä metyloitumattoman CpG: t ehdottaa korkea nukleosomissa käyttöaste (nuc 4 ja nuc 5) ympärille TSS (kuva 2). Yksi laastari suojaa näkyi CpG sivustoja -224–188; toinen laastari oli -174–90. Sitoutumiskohdat SP1 ja Zf5 sisällä laastari metyloimattomien CpG: t ilmaisee tukkeuman vuoksi nukleosomi käyttöaikaa. Tämän oletuksen tueksi on nukleosomin käyttöaste, samalla venyttää unmethylation havaittiin käsittelyn jälkeen chromatin on keuhkosyövän solulinjaa (GA7) kanssa

M.Cvi

PI (GPC metylaasi), ja jossa metylointi CpG sivustoja (= endogeeninen CpG metylaatio) teki (tuloksia ei ole esitetty).

Keuhkosyöpä solulinja (A2C12) käsittelyn jälkeen 5-atsa-dC.

solulinja A2C12 vastaa 5-atsa-dC käsitteleminen

Cadm1

uudelleen ilme. Kuitenkin aste uudelleen ilmentymisen vaihtelee hoidon hoitoon. Analysoimme

M.Sss

I kartta 5-atsa-dC-käsitelty A2C12, jotka osoittivat lievää

Cadm1

geenin uudelleen ilmentyminen ja verrattuna ei-käsitellyn A2C12 ja normaali keuhko (kuva 3 ). Sillä fragmentti BFR, jotkut kloonit nyt osoitti venyttää metyloitumattoman CpG: t, ja tämä tulos viittaa nukleosomissa käyttöaste (Nuc 1). Sillä fragmentti 1FR, kolme kloonia osoitti myös osuuksilla metyloitumattoman CpG: t osoittamaan nukleosomiin käyttöaste (nuc 2).

(A) Sijainti viidestä fragmenttien analysoitu

Cadm1

promoottorialueen, jotka kattavat 69 CpG: t -944-+41 suhteessa translaation aloituspaikasta, ATG. CpG: t edustavat raidat. (B-D) metylointi kartat normaalin keuhkojen ja A2C12; siniset laatikot edustaa metyloimatonta CpG: t (= suojattu), kun taas punaiset laatikot, metyloituja CpG: t. Fragmentit esittelyyn suhteessa niiden sijainti so BFR ja TSFR1. CpG: t ytimessä sekvenssin SP1 ja Zf5 sitoutumiskohdat on merkitty nuolilla. (D) jälkeen 5-atsa-dC hoitoa ja lievää geeni uudelleen ilme, jotkut kloonit muistuttavat kaavoja kuin normaalissa keuhkoissa (esim TFSR1, liitteenä), ehdottaa nukleosomi remodeling (häätö) geenien ilmentyminen.

seuraavassa kolme fragmenttia kohti TSS (mREW1, MFRA, TSFR1), jotkin klooneista kaavoja samanlainen normaali keuhko, joka ilmaisee kuvioita liittyy häädetään nukleosomeihin ja aktiivinen transkriptio. Sillä fragmentti mREW1, kuusi klooneja muistutti malleja kuin nukleosomin käyttöasteen ja transkriptiotekijöiden sitoutumisen katsottuna normaalissa keuhkossa. Sillä fragmentti MFRA oli vain neljä kuvioita havaittu: 7/21 täydellinen puuttuminen metylaation; 12/21 samalla kuviolla ja kloonit näytti olevan parhaillaan uusittu tai nukleosomissa häädetään; ja 2/21 välillä. Kaksi Sp1 sivustot olivat käytössä kaikissa klooneja. Siten SP1 sitova kloonien kanssa häädetty nukleosomeihin, päätelmä suostuu hyvin meidän aiempien EMSA tulokset [29]. Sillä fragmentti TSFR1 useita klooneja muistutti malli löytyy normaaleissa keuhkoissa osoittaa puuttuessa nukleosomin mutta transkriptiotekijän sitova. Tämä tulos viittaa siihen, chromatin remontin jälkeen 5-atsa-dC hoitoa.

kokonaistulos M.SssI kartoitukseen.

Yhteenvetona

M.Sss

I kartoitus normaalissa keuhkojen tukee muodostumista vähintään viisi nukleosomeissa ennustetussa asemiin promoottorialueen

Cadm1.

oli klooneja näyttämään pitkiä metyloimattomien CpG: t näissä tehtävissä, erityisesti kahdessa nukleosomit (nuc 1, nuc 2) ylävirtaan TSS.