Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tässä tutkimuksessa osoitetaan, onko metformiinin ja ionisoiva säteily (IR) olisi osoittavat parannettu antituumorivaikutukset in säteilyresistenteille p53 puutteesta peräsuolen syövän soluja, keskittyen korjaus väyliä IR aiheuttama DNA-vaurioita. Metformiini aiheutti suuremman väheneminen klonogeeniset selviytymistä sekä entistä säteilylle herkäksi ja tuumorin kasvun p53

– /- kuin p53

+ /+ peräsuolen syövän solut ja ksenograftit. Metformiini yhdistettynä IR-indusoitua kertymistä kasvainsolujen G2 /M-vaiheen ja viivästynyt korjaamiseen IR-indusoidun DNA-vaurioita. Lisäksi tämä yhdistelmä merkittävästi vähentynyt taso p53 liittyvien homologisen rekombinaation (HR) korjaus verrattuna IR yksinään, erityisesti p53

– /- ja peräsuolen syövän soluja, ja kasvaimia. Lopuksi metformiini parantaa radioherkkyyttä indusoimalla G2 /M pidätystä ja vähentää ilmentymistä DNA korjaus proteiineja jopa säteilyresistenteille HCT116 p53

– /- peräsuolen syövän solut ja kasvaimia. Tutkimuksemme tarjoaa tieteellinen perustelut kliinisen käytön metformiinin säteilyherkiste potilailla, joilla on p53-puutteellinen Kolorektaalituumorien, jotka ovat usein vastustuskykyisiä sädehoidon.

Citation: Jeong YK, Kim MS, Lee JY, Kim EH Ha H (2015) metformiinin herkistää säteilylle p53-puutteellinen peräsuolen syövän solut kautta induktio G2 /M pidätys ja estämällä DNA Repair proteiinit. PLoS ONE 10 (11): e0143596. doi: 10,1371 /journal.pone.0143596

Editor: Kerstin Borgmann, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, SAKSA

vastaanotettu: 03 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 06 marraskuu 2015; Julkaistu: 23 marraskuu 2015

Copyright: © 2015 Jeong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: tuettiin seuraavasti: 1. MSK: avustus (50541-2014) päässä tiede, ICT ja Future suunnittelu, Korean tasavalta (http: //www.msip.go.kr); ja 2. HH: National Research Foundation avustukset (2012R1A2A1A0300692) rahoittama Korean opetus-, tiede- ja teknologia. (https://www.nrf.re.kr).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

sädehoito käytetään laajalti lopullisia ja adjuvanttihoitona lukuisten syöpien [1]. Kuitenkin kestävyys sädehoidon on edelleen tärkeä huolenaihe [2]. Eri tekijät, kuten p53-mutaatio [3], yliekspressio DNA korjaukseen proteiineja [4-6], ja kasvaimen mikroympäris- [7, 8] on ehdotettu rooleja radioresistance. Niistä säteilyresistenteille tekijöistä, p53 mutaatio pidetään hyvä ehdokas radioresistance markkereita [9].

tuumorisuppressorin tekijä p53, jolla on keskeinen rooli solun vasteita DNA-vaurioita, edistää solujen eloonjäämistä (solu- sykli pidätys, DNA: n korjaukseen, ja autophagy) alhaisilla tasoilla DNA-vaurioita, kun se indusoi solukuolemaa korkealla tasolla. P53: n mutaatio esiintyy enemmän kuin 50% ihmisen syövissä, mikä lisää merkittävästi solujen resistenssin y säteilyn [10]. Lisäksi p53-mutaation korreloi korkea DNA korjaukseen proteiineja kuten Rad51, jolla on keskeinen rooli DNA homologisen rekombinaation (HR) korjaukseen liittyvän reitin. Lisäksi Rad51 on säädelty lukuisissa syövissä, erityisesti korkealaatuista säteilyresistenteille kasvaimet [11]. HR korjaukseen liittyvän reitin moduloidaan p53 aiheuttama transkription tukahduttamisen

Rad51

geenin ja kumoamisesta Rad51 polymeroinnin DNA [12]. Tästä syystä, radioresistance korreloi yliekspressioon Rad51 [13], kun taas sen downregulation päinvastoin lisää radioherkkyyttä [14]. Siksi lupaava lähestymistapa parantaa tehoa sädehoidon potilailla, joilla on p53 mutantti syöpiä on löytö ja käyttö DNA korjaukseen estäjien kuten säteilyherkistimet.

metformiinin, suullinen biguanidi anti-hyperglykeeminen aine, kuulemma lisää vastauksia säteilylle aktivoimalla ataksia teleangiektasia mutatoitunut (ATM) -adenosiini monofosfaatin (AMPK) -p53 /p21

CIP1, joka johtaa apoptoosin ja inhibition klonogeenisten selviytymisen [15, 16], tietyissä syövissä. Lisäksi metformiinin ja ionisoivan säteilyn (IR) tehosti sytotoksisten vaikutusten IR ihmisen hepatooma solulinjoissa, mikä esti G2 /M-vaiheen ja laski DNA korjaukseen pienentämällä adenosiinitrifosfaatista (ATP) tuotanto [17]. Mielenkiintoista, Buzzai

et al

. [18] kertoi, että metformiini selektiivisesti alentunut solujen kasvua p53-puutosta kasvainsoluihin estämällä autophagy, mutta aktivoidaan autophagy p53 villityypin syöpäsoluja. Lisäksi useat tutkimukset ovat osoittaneet, että metformiini lisää radioherkkyyttä p53-mutantin tai p53 villityypin syöpäsoluja. Tutkimukset ovat myös raportoineet, että metformiini parannettu radioherkkyyttä p53-mutantti [19] ja p53 villityypin syöpäsoluja. Lisäksi toinen tutkimus osoitti, että metformiini indusoi kohtalaisen säteilyltä [20]. Kuitenkin, ei ole selkeää ymmärrystä ero vaikutuksia metformiinin yhdistetään sädehoitoon p53 puutteesta ja p53 villityypin syöpäsoluja.

Siksi tämä esillä olevassa tutkimuksessa tutkittiin, metformiinin yhdistettynä IR lisäisi antituumorivaikutukset in säteilyresistenteille p53 puutteesta peräsuolen syövän soluja. Lisäksi olemme keskittyneet mahdollisesta osallisuudesta korjauksen väyliä IR aiheuttama DNA-vaurioita. Uskomme tiedot voivat osaltaan tarjota tieteellinen perustelut kliinisen käytön metformiinin säteilyherkiste in säteilyresistenteille syövissä.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

metformiini (1- (diaminomethylidene) -3, 3-dimetyyliguanidiinin), kristalliviolettia, ja propidiumjodidia saatiin Sigma-Aldrich Chemical Corp., (St. Louis, MO, USA). Anti-Rad51, anti-Rad52, anti-Leikkauskorjauksessa rajat komplementaatioryhmässä 1 (ERCC1), anti-rintasyöpä 2, varhain alkava (BRCA2), ja anti-fosforyloitu-histoni H3 (Ser10) vasta-aineet ostettiin Abcam (Cambridge , MA, USA). Anti-meioottisen rekombinaation 11 (MRE11), anti-RAD50, anti-p95 /Nijmegenin Murtumaoireyhtymä proteiini 1 (NBS1), anti-BRCA1, anti-cyclinB1, anti-fosfo- solunjakautumisen aikana proteiini 2 homologi (cdc2, Tyr15), ja anti-fosfotyroslinl Checkpoint kinaasi 2 (Chk2, Thr68) saatiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). Anti-p53, anti-Chk2, anti-

β

aktiini, ja (HRP) konjugoitua vuohen anti-kaniini ja anti-hiiri-IgG-vasta-aineita ostettiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Anti H2A histoni perheen jäsen X (H2AX, Ser139) saatiin Millipore (Billerica, MA, USA). Alexa Fluor 488 vuohen anti-hiiri-IgG (H + L), ja Alexa Fluor 594 vuohen anti-kani-IgG (H + L), sekundaariset vasta-aineet hankittiin Invitrogen (Carlsbad, CA, USA). Fluoresenssi kiinnitysväliaine saatiin Dako (Glostrup, Tanska). Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-väliaineessa, naudan sikiön seerumia (FBS) ja antibiootteja (penisilliini ja streptomysiini) saatiin Lonza (Walkersville, MD, USA).

Solulinjat ja soluviljelmä

HCT116 p53

+ /+ paksu- ja peräsuolisyövän soluja saatiin Korean Cell Line Bank (Seoul, Etelä-Korea) ja HCT116 p53

– /- paksu- ja peräsuolisyövän solut ystävällisesti toimittanut Dr. B. Vogelsteinin Johns Hopkins University. HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- soluja viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä ja inkuboitiin ilmakehässä 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Säteilytys

in vitro

kokeissa soluja säteilytetään

137Cs γ-ray source (Atomic Energy of Canada, Ltd., Chalk River, Ontario, Canada) annoksella nopeudella 2,67 Gy /min. Sillä

in vivo

kokeissa hiiriä säteilytettiin käyttäen

60Co γ-ray source (Theratron 780, Atomic Energy of Canada, Chalk River, Ontario, Canada), jonka 0,5 cm halkaisijaltaan bolus kudoksen vastaavaa materiaalia jotta annoksen kertyminen. Lyijyllä este on käytetty suojaamaan normaaleja kudoksia, jos mahdollista.

Vesiliukoinen tetratsolium (WST-1) määrityksessä

sytotoksisuusmääritys, solut ympättiin 96-kuoppaisille viljelylevyille muovi levyihin tiheys 1 x 10

3 solua kuoppaa kohti. Metformiini vaihtelevina pitoisuuksina (0-10 mM) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja soluja inkuboitiin 48 tuntia, minkä jälkeen soveltamalla vesiliukoisen tetratsolium (WST) -1 sytotoksisuuskokeeseen reagenssia (Roche Diagnostics, Laval, Quebec, Kanada) mukaan valmistajan suositusten. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin määrittämällä A450 nm soluviljelyaine lisäyksen jälkeen WST-1: ssa 2 tuntia. Tulokset ilmoitettiin prosentteina optinen tiheys käsittelemätön kontrolli-solut, jotka on nimetty 100% solujen elinkelpoisuuden. Prosenttiosuus sytotoksisuus laskettiin seuraavasti: (1-Aexp /Acon) x 100; jossa Aexp ja Acontrol ovat absorbanssiarvot kokeellisen lääkkeen saaneista ja hallita un käsiteltyjä soluja, tässä järjestyksessä.

klonogeeninen määritys

HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- solut käsiteltiin metformiinia 1-10 mM: ssa 48 h tai 2,5 mM 24 tuntia, minkä jälkeen IR, ja sitten inkuboitiin vielä 24 tuntia. Klonogeenisten Määritys suoritettiin sitten kuten aiemmin on kuvattu [17].

tuumoriksenografteja kateenkorvattomissa hiirissä

Kateenkorvattomiin Balb /c-nude-hiiriin (4 viikon ikäisiä uroksia) saatiin Nara Biotech Co . (Seoul, Korea) ja ylläpidetään laminaarinen ilmavirtaus kaappi erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa. HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- ksenografti hiiri mallit vahvistettiin ihonalainen rokotus 3 x 10

6 HCT116 p53

+ /+ tai p53

– /- solut oikea takajalka. Tuumorin implantaation jälkeen, me seurataan kunto eläinten kerran päivässä ja valmis kipulääkkeet minimoida eläinten kärsimystä. Kun kasvain saavutti tilavuus on noin 100 mm

3, hiiret jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään (n = 5), joka sisältää (a) ohjaus, (b) metformiini, (c) IR, ja (d) seos metformiini ja IR. Metformiini-käsiteltyjen ryhmien (b ja d) injektoitiin (intraperitoneaalisesti) kerran päivässä 250 mg /kg.

Kun kasvaimen tilavuus kontrolliryhmästä saavutetaan 200 mm

3, IR-käsiteltyjen ryhmät (c ja d) käsiteltiin yhdellä 5 Gy osa paikallisten alueiden säteilytys käyttämällä

60Co säteilyttäjällä. Kasvaimen tilavuus (V) laskettiin käyttäen standardin kaavalla: V (mm

3) = π /6 x (pienempi halkaisija)

2 × (suurempi läpimitta). Hiiret lopetettiin hiilidioksidi (CO

2) hengitysteitse, kun keskimääräinen tuumorin tilavuus kontrolliryhmässä oli 1,000 mm

3.

Solusyklianalyysiä

Kun metformiinia (2,5 mM) altistus 24 tunnin ajan, soluja säteilytettiin, inkuboitiin 24 h tai 48 h, otettiin talteen, värjättiin propidiumjodidilla (1 mg /ml), mukaan valmistajan protokollan, ja sitten analysoitiin käyttäen FACScan-virtaussytometrillä (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA). Vähintään 10000 solut laskettiin kullekin näytteelle, ja data-analyysi suoritettiin käyttäen CellQuest-ohjelmaa.

Immunofluoresenssi

immunofluoresenssi suoritettiin määrittämään ydin- jakelu γ-H2AX ja Rad51 in HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- soluihin käyttäen kuva-analyysin kolmen (vihreä /punainen /sininen) fluoresenssikanavan. Soluja kasvatettiin osastoa, dioja 1 päivä ennen säteilytystä tai metformiinin hoitoja. Sen jälkeen kun metformiini (2,5 mM) altistus 24 tunnin ajan, soluja säteilytettiin ja inkuboitiin 1 h tai 24 h. Kaikki käsittelyt suoritettiin kun taas solut pysyivät kiinni dioja. Solut kiinnitettiin (4% paraformaldehydillä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa, PBS, 10 min), permeabilisoitiin (0,5% Triton X-100 PBS: ssä, 10 min), ja inkuboitiin estopuskurilla (4% FBS PBS: ssä, 1 h), ja sitten inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa tai yli 4 tuntia huoneenlämpötilassa primaarisilla vasta-aineilla (1: 100 jokaiselle, anti-γ-H2AX ja anti-Rad51), sitten solut pestiin PBS: llä, niitä inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä, asianmukaiset fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) -leimatuilla sekundaarisia vasta-aineita (1: 500 kukin) ja Alexa Fluor 488 vuohen anti-hiiri-IgG (H + L) ja γ-H2AX (vihreä) ja Alexa Fluor 594 vuohen anti-kani- IgG (H + L) ja Rad51 (punainen). Sitten solut pestiin PBS: llä, värjättiin DAPI (sininen), ja kiinnitettiin dioja fluoresenssi kiinnitysväliaine. Levyjä lopuksi tutkittiin käyttäen Carl Zeiss LSM510 laserkeilauksen mikroskooppi ja kuvia otettiin kiinni kanssa CCD-kamera. Kvantitatiivista analyysiä, γ-H2AX tai Rad51 pesäkkeitä-positiiviset solut laskettiin vähintään 100 solua satunnaisesti otetut kuvat.

immunoblottauksella

soluja tai kasvaimen kudokset lyysattiin radioimmunosaostuskokeella ( RIPA) puskuria ja proteiinit erotettiin käyttämällä natriumdodekyylisulfaattia (SDS) polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGE) ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Membraanit blotteja blokattiin 5% (v /v) kuorittua maitoa PBS: ssa, jossa oli 0,1% Tween 20, inkuboitiin mainituilla vasta-aineilla (1: 1000) ja sekundäärisiä vasta-aineita (1: 1000), ja sen jälkeen kehitetään käyttäen tehostettua kemiluminesenssia western blotting substraattia (Pierce, Rockford, IL, USA) käyttäen ImageQuant LAS-4000 mini (GE, Fairfield, CT, USA). Signaali voimakkuus bändejä mitattiin ImageJ ohjelman (National Institutes of Health, NIH, Bethesda, MD, USA).

immunohistokemia

immunohistokemiallinen analyysi, 4 um kasvainkudossektioista oli de-paraffinized ksyleenillä ja peräkkäin niihin lisätään useita porrastettu pitoisuuksia etanolia. Vähentää epäspesifistä tausta värjäytymisen vuoksi endogeenisen peroksidaasin, levyt blokattiin vetyperoksidia 10 minuutin ajan, ja pestiin neljä kertaa puskurissa. ERCC1 (01:50) ja Rad51 (1: 200) primaaristen vasta-aineiden levitettiin kudokseen dioja, jotka inkuboitiin mukaan valmistajan protokollien, ja pestiin sitten neljä kertaa puskurissa. Levyjä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen edistäjän 20 minuuttia huoneen lämpötilassa, ja pestiin neljä kertaa puskurissa. Sitten HRP polymeeri levitettiin objektilaseille ja väri kehitettiin käyttäen Zymed diaminobentsidiiniä (DAB) järjestelmä (Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA, USA), minkä jälkeen counterstaining hematoksyliinillä. Histologinen pisteet Rad51 ja ERCC1 ilmentyminen määritettiin käyttäen kahta itsenäistä menetelmiä: Prosentuaalinen positiivista värjäytymistä soluissa ja ilmaisun intensiteetin.

Tilastollinen analyysi

Kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM). Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen parametrisen toistuva toimenpide yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA), jota seurasi Tukey rehellisesti merkitsevä ero (HSD) testi käyttäen tilastollista pakettia yhteiskuntatieteissä (SPSS) (versio 18.0, Chicago, IL, USA ). Tilastollinen merkitsevyys asetettiin tasolle

p

0.05.

Ethics selvitys

Kaikki eläinkoe ​​protokollat ​​ja tutkimuksia hyväksyi Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) Korean Institute of säteily- ja Medical Sciences (KIRAMS 2013-57) .

tulokset

metformiinin erilaisesti laski p53-puutosta ja villityypin klonogeeniset solujen selviytymistä

arvioidaan metformiini-p53-riippuvaisen kyky muodostaa klooneja ja sytotoksisuutta ihmisen peräsuolen syövän soluja, me altistuvat HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- solujen vaihtelevien pitoisuuksien 48 tuntia. Metformiini 1, 2,5, 5, ja 10 mM osoitti 86,7 ± 5,9, 73,2 ± 3,8, 45,5 ± 1,1, ja 26,8 ± 2,7% klonogeeniset eloonjäämisasteesta HCT116 p53

+ /+ soluja, ja 77,2 ± 6,9, 35,5 ± 3.6, 13.1 ± 2.1, ja 2,3 ± 0,9% HCT116 p53

– /- solut, vastaavasti (kuvio 1A). Klonogeeniset selviytyminen HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- solut erosivat merkittävästi metformiinin pitoisuuksilla 2,5-10 mM (

p

0,001), ja HCT116 p53

– /- solut olivat herkempiä metformiini aiheuttama klonogeeniset solukuolema kuin HCT116 p53

+ /+ solut. Kuitenkin metformiini ei ollut merkittävää tai ero sytotoksisuutta molemmissa solulinjoissa (kuvio 1 B).

HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- solut käsiteltiin 1-10 mM metformiini 48 h, viljeltiin ja niitä käytetään (A) klonogeenisten ja (B) WST-1 (solujen elinkykyä) määritykset; *

p

0,001 HCT116 p53

+ /+ soluja,

†

p

0,001 HCT116 p53

– /- solut.

§

p

0,001, välillä HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- solut, verrattuna kontrolliin. WST, vesiliukoista tetratsoliumia.

metformiinin alulle korkeammat säteilylle herkäksi p53 puutteesta kuin p53 villityyppisoluilla

arvioimiseksi sädeherkistävä vaikutuksia metformiinin, HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- syöpäsolut käsiteltiin 24 h 2,5 mM seuraa IR, ja sitten poistetaan 24 tunnin kuluttua IR. Elossa jakeet altistuneella 2 Gy säteilyannos (SF2) määritettiin olevan 0,24 ja 0,20 HCT116 p53

+ /+ soluissa (kuvio 2A) ja 0,58 ja 0,43 HCT116 p53

– /- solut ( kuvio 2B), hoidon jälkeen säteilyllä yksin ja metformiini plus säteilyä, vastaavasti. Metformiinin ja IR lyhensi klonogeeniset eloonjäämistä verrattuna IR yksin HCT116 p53

– /- (

p

0,01), mutta ei p53

+ /+ soluja, mikä viittaa siihen, että säteilylle herkäksi oli suurempi HCT116 p53

– /- kuin p53

+ /+ solut.

radioherkkyyttä (A) HCT116 p53

+ /+ ja (B) p53

– /- solut ja ilman altistumista metformiinia (2,5 mM) jälkeen vaihtelevia annoksia

60Co γ-ray säteily mitattiin käyttämällä klonogeeniset määritystä. HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- ksenosiirrettyjä hiiret jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään, mukaan lukien valvonta (Con), metformiinin (Met), ionisoiva säteily (IR), ja metformiinin ja IR (Met + IR). Kuvaajat osoittavat kasvaimen tilavuus (C) HCT116 p53

+ /+ ja (D) p53

– /- ksenograftimallissa; *

p

0.05.

metformiinin esti kasvaimen kasvua p53-puutosta ksenografteissa

vaikutusten tutkiminen metformiinin p53-riippuvainen ja riippumaton kasvaimen kasvua, käytimme pariksi isogeenisiin paksu- ja HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- syöpäsolut. Kun keskimääräinen kasvaimen tilavuus kontrolliryhmässä saavuttaa noin 1000 mm

3 ksenografteissa kasvaimen tilavuuden käsitellyillä hiirillä metformiinin, IR, ja molempia olivat 4,5 ± 0,2, 48,3 ± 6,1, ja 59,0 ± 5,0% pienempi, vastaavasti kuin valvonnan noin 1000 mm

3 HCT116 p53

+ /+ kasvaimissa (kuvio 2C) ja 26,5 ± 1,1, 22,8 ± 2,9, ja 44,3 ± 5,5%: lla for HCT116 p53

– /- kasvaimissa (kuvio 2D).

kasvu ohjaus HCT116-p53

– /- ksenografteissa oli merkittävästi nopeampaa kuin HCT116-p53

+ /+ -ksenografteissa (

p

0,05). Yhdistetty metformiini ja IR hoito esti merkitsevästi kasvaimen kasvua sekä ksenograftimalleja yli IR hoito yksinään teki (

p

0,05). Lisäksi metformiinin parannettu antituumorivaikutukset p53

– /- (

p

0,05), mutta ei p53

+ /+ ksenografteissa taas IR yksinään merkittävästi tukahdutti kasvaimen kasvua p53

+ /+ ksenografteja (

p

0,05).

Metformiini pitkittynyt IR aiheuttama G2 /M pidätys p53-puutosta peräsuolen solujen verrattuna p53 villin tyypin solujen

onko metformiini vaikuttaa IR-indusoidun solukierron kertymistä G2 /M-vaiheen ja osuus G2 /M-faasin soluja, jotka liittyvät läsnä ollessa tai puuttuessa p53, olemme analysoineet solusyklin vaihe jakelu HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- solut. Metformiini yhdistettynä IR merkittävästi kasvattanut G2 /M vaiheessa olevien solujen verrattuna IR yksin HCT116 p53

– /- (

p

0,001), mutta ei p53

+ /+ solujen (kuvio 3A ja 3B).

HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- solut esikäsiteltiin 2,5 mM metformiinin 24 tuntia, ja sitten säteilytetään 6 Gy. Solusyklin mitattuna virtaussytometrialla (A) 24 ja (B) 48 tuntia sen jälkeen, kun IR. (C) Expression of G2 /M tarkastuspiste sääntelyviranomaisten kuten sykliini B1, fosforyloidun cdc2 (Tyr15), fosforyloitu histoni H3 (Ser10), ja fosforyloitu Chk2 (Thr68) mitattiin käyttämällä immunoblottauksen in HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- soluja 48 h säteilytyksen jälkeen. Densitometristä määrällisesti normalisoitiin

β

aktiini. Arvot ovat keskiarvoja ± SEM. kolmesta kokeesta, *

p

0,001. IR, ionisoiva säteily

Vahvista kerääntymisen G2 /M-vaiheessa ekspressiotasot G2 /M-tarkastuspiste säätölaitteet, kuten sykliini B1, fosforyloitu cdc2 (Tyr15), fosforyloitua histoni H3 (Ser10), ja fosforyloitu Chk2 (Thr68) tutkittiin käyttäen immunoblottauksella. Metformiinin ja IR huomattavasti ilmentymistä fosforyloidun cdc2 (Tyr15) verrattuna IR yksin HCT116 p53

– /- muttei p53

+ /+ solut (

p

0,05 ). Lisäksi metformiini plus IR huomattavasti suurentunut ilmentyminen fosforyloidun histoni H3 (Ser10) ja fosforyloitu Chk2 (Thr68) verrattuna IR yksin HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- solut. Lisäksi ilmaus fosforyloidun histoni H3 (Ser10) ja fosforyloitu Chk2 (Thr68) metformiiniryhmässä plus IR ryhmä oli merkittävästi lisääntynyt HCT116 p53

– /- verrattuna p53

+ /+ solut (

p

0,001, kuvio 3C). Yhteenvetona, osoitimme, että metformiini esti solusyklin etenemistä merkittävästi pidentämällä IR aiheuttama G2 /M pidätys HCT116 p53

– /- solut.

metformiinin viivästetty korjaus IR aiheuttama DNA-vaurioita p53- vajaiden solujen verrattuna p53 villityyppisoluilla

Analysoimme vaikutus metformiinin kinetiikkaan DNA-vaurion ja korjata arvioimalla immunofluoresenssivärjäyksellä varten γ-H2AX, merkkiaine DNA-vaurioita; Rad51, merkkiaine DNA: n korjaukseen; ja DAPI-värjätään tuman DNA käyttäen kuva-analyysin kolmen (vihreä /punainen /sininen) fluoresenssikanavan. Metformiini yhdistettynä IR ja IR-alone näytteillä γ-H2AX pesäkkeitä 6 h kuluttua IR taas metformiini yhdistettynä IR säilytti γ-H2AX pesäkkeitä jopa 24 tunnin kuluttua IR. Lisäksi tämä vaikutus oli suurempi HCT116 p53

– /- kuin se oli p53

+ /+

solut (

p

0,001). Kuitenkin 6 ja 24 tunnin kuluttua IR, metformiinin yhdistettynä IR osoitti merkittävää vähenemistä Rad51 pesäkkeitä verrattuna IR yksin, mikä osoitti lisäämistä Rad51 pesäkkeitä. (Kuvio 4A ja 4B). HCT116 p53

– /- solut olivat herkempiä metformiini kuin HCT116 p53

+ /+ solut (

p

0,001). Nämä tulokset osoittivat, että metformiinin ja IR viivästytti korjaus IR aiheuttama DNA-vaurioita enemmän HCT116 p53

– /- kuin p53

+ /+

soluja.

HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- solut esikäsiteltiin 2,5 mM metformiinin 24 tuntia, ja sitten säteilytetään 6 Gy. (A) immunofluoresenssi 6 ja 24 tunnin kuluttua IR osoitti γ-H2AX, merkkiaine DNA-vaurioita; Rad51, merkkiaine DNA: n korjaukseen; ja tuman DNA värjättiin DAPI avulla kuva-analyysi kolmessa (vihreä /punainen /sininen) fluoresenssikanavan. (B) kvantitatiivisen analyysin, γ-H2AX tai Rad51 pesäkkeitä-positiiviset solut laskettiin vähintään 100 solua satunnaisesti otetuissa kuvissa. Arvot ovat keskiarvo ± SEM, *

p

0,001. IR, ionisoiva säteily; γ-H2AX, γ-H2A histoni perheen jäsen X.

Metformiini parantaa radioherkkyyttä vähentämällä DNA: n korjaukseen proteiineja

in vitro

ja

in vivo

Sen tutkimiseksi, metformiini vaikuttaa DNA: n korjaukseen väyliä

in vitro

selvitimme p53 liittyvien HR korjaus proteiineja kuten MRE11-RAD50-p95 /NBS1 monimutkainen, BRCA1, BRCA2, Rad51, Rad52, ja ERCC1 in HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- soluihin käyttäen immunoblottauksella. Kuten kuvassa 5, metformiinin yhdistettynä IR lyhensi MRE11, BRCA2, Rad51, ja ERCC1 proteiinin tasot verrattuna IR yksin HCT116 p53

+ /+ ja erityisesti p53

– /- solut (

p

0,01). Lisäksi metformiinin yhdistettynä IR vähensi ilmaus RAD50 ja BRCA1 verrataan IR yksin HCT116 p53

– /- muttei p53

+ /+ solut (

p

0,01). Mielenkiintoista on, että HCT116 p53

– /- solut, IR yksinään lisäsi merkittävästi BRCA1 ja Rad51 proteiinin tasot kontrolliin verrattuna (

p

0,01), kun taas metformiini yhdessä IR merkittävästi vähentynyt ilmaus BRCA1 ja Rad51 verrattuna IR yksinään (

p

0,01).

HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- solut esikäsiteltiin 2,5 mM metformiinin 24 tuntia , ja sitten säteilytetään 6 Gy. Solut molemmista ryhmistä immunoblotattiin p53 liittyvät HR korjaus proteiineja, kuten MRE11-RAD50-p95 /NBS1 monimutkainen, BRCA1, BRCA2, Rad51, Rad52, ja ERCC1 24 h kuluttua ionisoivan säteilyn (IR). Densitometristä määrällisesti normalisoitiin

β

aktiini. HR, homologinen rekombinaatio; MRE11, meioottisiin rekombinaatio 11; NBSI, Nijmegenin Murtumaoireyhtymä proteiini 1; BRCA, rintasyöpä varhain alkava; ERCC 1, Leikkauskorjauksessa rajat komplementaatioryhmä 1.

Seuraavaksi arvioimme onko metformiini vaikuttaa DNA: n korjaukseen väyliä

in vivo

jonka immunohistokemiallisesti tutkimalla ilmaus Rad51 ja ERCC1 Tuumorinäytteissä . Rad51 ja ERCC1 proteiinin tasot HCT116-p53

– /- kontrolliryhmä kasvaimet olivat korkealla mutta olivat alle toteamis- varten p53

+ /+ kontrolliryhmä kasvaimia. Ekspression IR-indusoidun Rad51 ja ERCC1 oli merkittävästi lisääntynyt HCT116 p53

– /- kasvaimissa verrattuna p53

+ /+ kasvaimia, kun taas metformiini yhdessä IR vähensi proteiinin tasot Rad51 ja ERCC1 in HCT116 p53

– /- verrattuna p53

+ /+ kasvaimet (

p

0,05, kuvio 6A ja 6B). Lisäksi olemme vahvistaneet ilmaus Rad51 ja ERCC1 immunoblottauksella kasvaimen näytteitä

in vivo

tutkimuksessa. IR aiheuttama Rad51 ja ERCC1 ilmentyminen lisää merkittävästi lisääntynyt HCT116 p53

– /- kuin se oli p53

+ /+ kasvaimet (

p

0,05, kuvio 6C). Lisäksi metformiinin yhdistettynä IR merkittävästi vähentynyt ilmentyminen Rad51 vuonna HCT116 p53

– /- kasvaimet (

p

0,05) tasolle verrattavissa p53

+ /+ kasvaimet ( kuvio 6C). Yhteenvetona, osoitimme, että metformiini parantaa kasvaimen radioherkkyyttä vähentämällä DNA korjaukseen proteiinin tasot, erityisesti HCT116 p53

– /- solut ja kasvaimia.

In vivo

, vahvistus (A ) Rad51 ja (B) ERCC1 ilmentyminen HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- tuumorikudoksista analysoitiin immunohistokemiallisesti ja kaaviot osoittavat histologiset pisteet kullekin ryhmälle. (C) Kasvaimen kudokset hajotettiin ja immunoblotattiin Rad51 ja ERCC1. Densitometristä määrällisesti normalisoitiin

β

aktiini. Tiedot ovat keskiarvo ± SEM, *

p

0.05.

Keskustelu

mutaatio tuumorisuppressorigeenin p53 tekijä on tärkeä rooli radioresistance syöpäsolujen [9]. Yli 50% kaikista syövistä on puuttuva tai vaurioitunut p53-geenin ja siksi on taipumus tulla erittäin säteilyresistenteille. Lisäksi p53-mutaatio korreloi korkea DNA korjaukseen proteiineja [10]. Niistä DNA korjaukseen proteiineja, p53 liittyy HR kopiointiin tukahduttamisen

Rad51

geeni ja kumoamisen Rad51 polymeroinnin DNA [12]. Äskettäin sytotoksinen [21-23] ja sädeherkistävä [16, 17, 24, 25], vaikutuksia metformiinin raportoitu eri syöpäsoluissa ottamatta huomioon p53 status. Kuitenkin Buzzai

et al

. [18] osoitti, että metformiini valikoivasti alentunut p53

– /- solut puuttuessa glukoosin tai kiinteä kasvain mikroympäristön. Tässä tutkimuksessa selvitimme kyky metformiinin parantaa IR aiheuttama kasvainten vastainen vaikutuksia säteilyresistenteille p53 puutteesta peräsuolen syövän soluja, keskittyen korjaus väyliä IR aiheuttama DNA-vaurioita.

Ensinnäkin varmistimme, että HCT116 p53

– /- ksenografteissa paitsi kasvoivat nopeammin, mutta myös olivat säteilyresistenteille ja herkempiä metformiini kuin p53

+ /+ -ksenografteja. Metformiini esti kasvaimen kasvua ja voitettu radioresistance in HCT116 p53

– /- ksenograftit. Vaikka metformiinin aiheuttama pitoisuudesta riippuvainen sytotoksisuus sekä HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- solut, tämä vaikutus oli suurempi p53

– /- kuin se oli p53

+ /+ solut. Aikaisemmat tutkimus [24] osoitti, että metformiini aiheuttaman apoptoosin maksasolukarsinoomassa mutta ei normaalissa hepatosyyteissä.

Seuraavaksi tutkimme säteilylle herkäksi mekanismeja metformiinin HCT116 p53

+ /+ ja p53

– /- solut ja ksenograftit. Metformiini yhdistettynä IR raportoitiin äskettäin indusoida hepatoomasolujen yli IR yksinään ei, estämällä DNA: n korjaukseen, jota välittävät kertyminen solujen solusyklin G2 /M-vaiheen ja katoaminen γ-H2AX ilmaisun [17] . Esillä olevat tulokset osoittivat, että metformiinin yhdessä IR esti solusyklin etenemistä merkittävästi pidentämällä IR aiheuttama G2 /M pidätys, ja aiheuttama suurempi DNA-vaurioita kuin IR yksinään teki. Erityisesti HCT116-p53

– /- solut olivat herkempiä metformiini kuin HCT116 p53

+ /+ soluja, mikä viittaa siihen, että metformiini viivästynyt korjaus IR-indusoidun DNA-vaurioita HCT116 p53

– /- solut. Näin ollen, nämä tiedot viittaavat siihen, että metformiini aiheuttama säteilylle herkäksi voi liittyä DNA: n vaurioita ja korjaus polkuja.

kasvaimen p53-proteiinin säätelee DNA: n ekspression korjaus proteiinien ja lukuisat tutkimukset ovat raportoineet, että DNA: n korjautumista proteiinit, kuten Rad51 [26, 27] ja ERCC1 [28] olivat erittäin aktiivisia syöpäsoluissa, joilta puuttuu toimiva p53, mutta vähemmän aktiivisia normaaleissa soluissa ja syövän solulinjoissa ja ehjät p53-toiminto. Meidän

in vivo

tutkimuksissa, ilmaus Rad51 ja ERCC1 at-tasojen ja sen jälkeen IR olivat merkittävästi korkeammat p53

– /- kuin ne olivat p53

+ /+ kasvaimia (kuvio 6 ), joka on yhtäpitävä aikaisempien raporttien [26-28]. Metformiini yhdistettynä IR vähensi proteiinin tasot Rad51 ja ERCC1 p53

– /- kasvaimet tasoille, jotka olivat verrattavissa p53

+ /+ kasvaimia. Lisäksi meidän

in vitro

tutkimukset osoittivat, että metformiinin ja IR vähensi merkitsevästi p53 liittyvien HR korjaus proteiineja, kuten MRE11, RAD50, BRCA1, BRCA2, Rad51, ja ERCC1 verrattuna IR yksin HCT116 p53

+ /+ ja erityisesti p53

– /- solut. Lisäksi IR yksinään lisäsi merkittävästi BRCA1 ja Rad51 proteiinin tasot verrattuna ohjaus HCT116 p53

– /- solut, kun taas metformiini yhdistettynä IR merkittävästi vähentynyt ilmentyminen BRCA1 ja Rad51 verrataan IR yksin HCT116 p53

– /- solut. Näin ollen, nämä tulokset viittaavat siihen, että metformiini parantaa radioherkkyyttä p53

– /- solut ja kasvaimia, jotka ilmentyy voimakkaasti BRCA1, Rad51 tai ERCC1 proteiini-ohjaus ja seuraavat IR-hoidon vähentämällä DNA: n ekspression korjaus proteiineja.