Krooninen sairaus

tiivistelmä

maitorasvaglobulista – EGR – tekijä VIII (MFGE8), jota kutsutaan myös lactadherin, on erittyvä proteiini, joka sitoutuu solun fosfatidyyliseriiniin ja a vp 3 ja a vp 5-integriinejä. Ihmisen ja hiiren soluja, jotka ilmentävät näitä integriinit, kuten endoteelisolut, fagosyytit ja jotkut kasvaimet, MFGE8 /lactadherin on osoitettu edistävän eloonjäämistä, epiteelin ja mesenkymaalitransitioon ja fagosytoosin. Protumoral toiminta MFGE8 on siten todettu muutaman tyyppisiä ihmisen syövissä, mukaan lukien melanooma, alatyyppi rintasyöpiä, ja virtsarakon karsinooma. Estämällä toiminnot MFGE8 voisi siten edustaa uutta tällaista hoitoa ihmisen syövissä. Tässä osoitamme immunohistokemia kokoelma ihmisen munasarja- syöpiä, jotka MFGE8 yli-ilmennetään 45% näistä kasvaimista, ja me vahvistaa, että se on nimenomaan yli-ilmentyy triple-negatiivinen alatyypin ihmisen rintasyöpiä. Olemme perustaneet uuden

in vitro

määrityksissä mitata vaikutusta MFGE8 eloonjäämiseen, tarttuvuus ja kulkeutumista ihmisen munasarja- ja triple-negatiivinen rintasyöpä solulinjoissa. Näitä määrityksiä käyttäen, voimme tunnistaa uusia MFGE8-spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tehokkaasti estetty nämä kolme kasvaimen edistävät vaikutukset MFGE8. Tuloksemme viittaavat siihen tuleva käyttö MFGE8-estävien vasta-aineiden uutena syöpälääkkeen terapeuttisia alaryhmissä munasarjasyövän, ja triple-negatiivinen rintasyöpä potilailla.

Citation: Tibaldi L, Leyman S, Nicolas A, Notebaert S, Dewulf M, Ngo TH, et ai. (2013) Uudet estäviä vasta-aineita estää Adhesion, Migration and Survival of munasarjasyöpäsoluja, Korostus MFGE8 potentiaaliseksi terapeuttiseksi Target of Human munasarjasyöpäpotilailla. PLoS ONE 8 (8): e72708. doi: 10,1371 /journal.pone.0072708

Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korean tasavalta

vastaanotettu: 18 tammikuu 2013; Hyväksytty: 15 heinäkuu 2013; Julkaistu: 16 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Tibaldi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Institut Curie, INSERM, Association pour la Recherche contre le Cancer, palkinnon päässä Fondation de France, ja kahden vuoden yhteistyö sopimus Institut Curie, INSERM, ja ThromboGenics NV, Leuven, Belgia (www.thrombogenics.com) . ThromboGenics NV ehdotti strategiaa vasta-sukupolvi, suoritetaan hiirillä immunisaation tarkistanut spesifisyys uuden anti-ihmisen MFGE8 vasta, sekvensoitiin niiden vaihtelevia alueita, ja osallistui suunnitteluun testien valintaan johtoon ehdokas vasta-aineita.

Kilpailevat edut: kirjoittajat lukenut lehden politiikan ja ovat seuraavat ristiriitoja: osa tätä työtä tuettiin rahoitus Clotilde Théry joukkueen lukien Lorenzo Tibaldi palkka yhteistyönä välinen sopimus Institut Curie, INSERM, ja ThromboGenics NV, Belgia. Shirley Leyman, Sofie Notebaert, To Hoa Ngo ja Claudia Zuany-Amorim työskentelee ThromboGenics NV. Kansainvälinen PCT-hakemus kattaa kuvattujen vasta, yhteisesti omistama ThromboGenics NV, Institut Curie ja INSERM, on jätetty numerolla PCT /EP2013 /056057. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaalien kanssa korkeakoulujen laboratorioiden.

Johdanto

kehittyä täysimittainen kasvain, solu on paitsi hankkii solu-autonominen ominaisuudet leviämisen ja kestävyys ohjelmoidun kuoleman, mutta myös vahvistaa vuorovaikutusta sen mikroympäristölle mahdollistaa sen jatkuva leviäminen, ja välttää sen poistaminen [1]. Fibroblastit, endoteelisolut muodostavat verisuonten, ja immuunijärjestelmän solujen kaikissa vaihto-signaalien kanssa transformoitujen solujen suoraan ligandi-reseptori-vuorovaikutusten kautta sekä liukoisia tekijöitä ja ekstrasellulaarisen kalvovesikkelejä, jotka toimivat tietyllä etäisyydellä kasvainsoluja. Kasvaimet voivat siis erittää kasvutekijöitä toimii autokriinisellä tavalla ylläpitämään niiden selviytymistä, mutta myös parakriinisesti toisaalta soluihin niiden mikroympäristön.

maitorasvaglobulista – EGR – tekijä VIII (MFGE8), jota kutsutaan myös lactadherin, on yksi näistä erittää tekijöitä pleiotrooppinen mahdollisia toimintoja. Alun perin kloonattiin suuri proteiini maidon rasvapallosten [2,3], naudan, ihmisen (MFGE8) ja hiiren (Mfge8) proteiinien on osoitettu sisältävän kaksi erillistä funktionaalisia domeeneja: EGF-kaltaisten domeenien, mukaan lukien RGD-sisältävät sekvenssin sitova että avP3 ja a vp 5 integriinit, ja tekijä VIILn kaltaisten (tai discoidin) domainit sitoutumisen fosfolipidit (fosfatidyyliseriini ja fosfatidyylietanoliamiini). MFGE8 /Lactadherin on siten sidottu ei-kovalenttisesti lipideihin solunulkoiseen vesikkelit, ja on vuorovaikutuksessa ilmentäviä kohdesoluja a vp 3/5-integriinejä. MFGE8 sitoutuminen endoteelisoluihin on osoitettu edistävän VEGF-riippuvaa eloonjäämistä ja angiogeneesissä [4], sekä fagosytoosin apoptoottisten solujen [5]. Hiiren, Mfge8 edistää fagosytoosin apoptoottisten solujen makrofagien [6], ja vääristää niitä erittää tolerogeenistä sytokiineja [7]. Joitakin itse kasvainsoluihin, MFGE8 osoitettiin indusoivan epiteelisolujen ja mesenkymaalitransitioon [8,9], ja /tai lisätä vastustuskykyä lääkkeen indusoiman apoptoosin [10,11].

Kaikki nämä tulokset korostavat MFEG8 kuten lupaava kohde estäjiä, jotka voitaisiin kehittää rajoittamiseksi syövän etenemiseen. Tietyntyyppisissä ihmisen syövissä, pro kasvaimen rooli MFGE8 on osoitettu, joka perustuu korkean yli-ilmentymisen aikana syövän etenemiseen ja /tai analysointiin hiirimalleissa: nämä syövistä ovat rakkosyöpä- (oman työn [12]), melanooma [8], ja triple-negatiivinen alatyyppiä rintasyövän [13]. Kuitenkin joissakin muissa syövissä, kuten hormoni-reseptori (HR) ja /tai HER2-ilmentävät ihmisen rintasyöpää, [13], MFGE8 ei ole yli-ilmennetään, ja se näyttää sen sijaan estää kasvaimen etenemistä. Siten synnyttää uusia työkaluja estämään pleiotrooppisten toimintoja MFGE8 sekä tunnistaa oikean ihmisen syövän tavoitteet tällaisia ​​välineitä, on tehtävä samanaikaisesti, jos toivomme tehostamisvälineenä uusia hoitoja.

Täällä analysoimalla MFGE8 ilmaisun suurten taulukoiden ihmisen kasvainbiopsioissa, ja perustamalla uusia toiminnallisia määrityksiä mitata vaikutuksia MFGE8 ja uusien MFGE8-estäviä vasta-aineita fysiologiaa syöpäsolujen tunnistimme munasarjasyövän ja vahvisti triple-negatiivinen rintasyöpä kuin lupaavia kohteita jotka voisivat hyötyä MFGE8 estäviä hoitoja.

tulokset

MFGE8 yli-ilmentymisen munasarjasyöpiä

aiemmassa työssä käyttäen julkisesti saatavilla olevaa mRNA ekspressiotietojen koottu oncomine verkkosivuilla (

www.oncomine.org

), havaitsimme merkittävää voimistumista

MFGE8

geeniä transcriptomic tasolla osajoukko ihmisen syövissä, mukaan lukien munasarjojen serous adenokarsinoomat [12]. Koska tarvitaan uusia hoitoja tämä syöpä, joka usein esitetään jo pitkällä, päätimme tutkia edelleen roolit MFGE8 munasarjojen syöpä. Vahvista havainto

MFGE8

mRNA yli-ilmentymisen proteiinitasolla käytimme kaksi kasvaimen mikrosiruja syntyy talon, joka sisältää 50 koepalat munasarjasyöpä potilaiden kaikki laadut ja tyypit (taulukko S1). Immunohistokemia havaita MFGE8 näissä kasvaimissa suoritettiin käyttämällä aikaisemmin kuvatulla kaniinin polyklonaalista anti-MFGE8 vasta-aine [4], ja analyysi värjäykset suoritettiin patologi. Kuten aikaisemmin ilmoitettiin [4,12], MFGE8 havaittiin verisuonten läsnä kasvaimet (nuoli kuvassa 1a). Lisäksi MFGE8-positiivisia kasvainsoluja itse havaittiin useita koepaloja. Kuten on esitetty kuviossa 1a, yleinen ekspressiotaso proteiini oli vaihteleva yksittäisten kasvainten, jotka vaihtelevat poissa (0), on erittäin vahva kasvaimen koko (3). Sijoitus kasvaimet mukaan tason MFGE8 proteiinin (kuva 1b) osoitti, että 45% (22/48) ilmentyy voimakkaasti MFGE8 (taso 2-3). MFGE8-yli-ilmentävät kasvaimet olivat kaikki asteet (1-3, kuva 1b), kaikenlaisten, ja erilaisten metastasoituneen tila (taulukko S1), mikä MFGE8 yliekspressio ei voitu käyttää joko ennustetyövälineenä tai diagnostinen merkkiaine munasarjasyöpä. Suuri osa kasvainten yli-ilmentävät MFGE8 kuitenkin, sai meidät tutkimaan edelleen sen arvo terapeuttisena kohteena munasarjojen syöpien.

(a) Esimerkkejä Ihmisen MFGE8 immunohistokemia munasarjasyövän kohdat näytetään: mitään värjäytymistä kasvainsolujen (pisteet 0), mutta MFGE8-positiivisten endoteelisolujen (musta nuoli) vasemmassa paneelissa. Alueet heikon ilmentymisen (w) ja keskipitkän ilmaisun (m) MFGE8 samassa jaksossa, mikä sijoittui pisteet 2 keskellä paneelissa. Vahva MFGE8 lauseke (t) koko kasvain, rankattu pisteet 3 (oikea paneeli). (B) pisteytys MFGE8 ilmentymisen (y-akseli) 48 munasarjojen tuumoribiopsioissa Institut Curie potilaat, funktiona kasvaimen (x-akseli). Tilastollisesti merkittävää eroa ei havaittu jakautuminen kasvaimissa yliekspressoivat MFGE8 (pisteet 2-3) tai (0-1) palkkaluokkaan 2 verrattuna asteen 3 kasvaimia.

kehittäminen in vitro määrällisesti vaikutukset MFGE8 on munasarjasyöpäsoluja

Koska MFGE8 on osoitettu erilaisissa solutyypeissä kuten jotkut kasvainsolut, tarttuvuuden edistämiseksi, selviytymistä ja /tai epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon mahdollisesti johtaa maahanmuuttoon, voimme perustaa uusi

in vitro

määrityksissä mittaamaan nämä fysiologiset tulokset yhteydessä munasarja-. Useimmissa tutkimuksissa näitä vaikutuksia MFGE8 syyksi sen sitovat avp3 ja /tai a vp 5-integriinien kohdesoluihin. Jotta voidaan valita solulinjoja vaikutuksen arvioimiseksi anti-MFGE8 hoitoja, ensin analysoidaan mRNA: n ilmentymisen taso

MFGE8

ja sen reseptorien kokoelman ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa. Julkinen tulokset Broad-Novartis Cancer Cell Line Encyclopedia käytettiin tähän tarkoitukseen (https://www.broadinstitute.org/ccle/home). Niistä 38 kasvainsolulinjojen (kuva 2a), vain 5 ei ilmaissut

MFGE8

yläpuolelle luotettavuustasolla ((MAS5 ”Poissa” lippu, joka vastaa Affymetrix U133plus2.0 lauseke signaali (Log

2 ) vähemmän kuin 6,1 tämän probeset). me vahvisti MFGE8 proteiinin erittymisen ELISA-analyysi väliaine kahden mRNA-ilmentäviä solulinjoja: SKOV-3 ja IGROV-1, ja tunnistimme toisen munasarjasyövän solulinja, pais- 3 [14], joka ei ole erittävät havaittavia määriä MFGE8

in vitro

(kuvio 2b). 38 kasvainsolulinjoja ilmaistuna koodaavat geenit av (

ITGAV

, ilmaisu-signaali yllä 10 useimmissa tapauksissa, tuloksia ei ole esitetty), ja β5 integriini ketjut (

ITGB5

, kuvio 2c). Sitä vastoin Affymetrix signaalin β3 integriiniketjun (

ITGB3

) oli vain lähellä luottamusta tasolla (lauseke signaalin = 4,8 tämän probeset) useimmissa solulinjoissa (23/38 = 60,5%), mukaan lukien SKOV-3 ja IGROV-1, mikä viittaa siihen, vähän tai ei lainkaan ekspressiota tämän integriinin. virtaussytometrillä, kuitenkin, sekä SKOV-3 ja IGROV-1 näkyy avP3 lisäksi a vp 5 pinnallaan, kun taas Shin-1 näytetään vain a vp 5 (kuvio 2d). Meillä on siis Valitsimme SKOV-3 solulinja edustavana esimerkkinä suuri osa munasarjasyövän solulinjoissa (keskipitkällä ja korkea

MFGE8

, havaittavissa

ITGB3

ja

ITGB5

), ja yksi alttiita reagoimaan MFGE8, koska se ilmaistaan ​​tunnetun reseptoreita MFGE8, kehittää funktionaalisia

in vitro

määrityksissä.

(a) analyysi mRNA: n ekspression tasojen ( log

2 (Affymetrix U133plus2.0 signaali)) on

MFGE8

yleisillä tuloksia microarray tietojen laajojen-Novartis Cancer Cell Line Encyclopedia. Ilmaisu kynnys, jonka takana se voidaan pitää kohinaa (MAS5 ”puuttuminen” lippu tila, geeni ei ilmenny) on 6,1 tälle probeset. Mustat nuolet osoittavat SKOV-3 ja IGROV-1-solulinjat. (B) kvantifiointi MFGE8 ELISA in SKOV-3, IGROV-1 ja Shin-3 väliaine (24 h). Erittyvää MFGE8 ilmaistaan ​​ng /ml per 10

6 soluviljelmässä. Keskiarvo kahdesta kokeesta + SD. (C) analyysi mRNA ekspressiotasoja (Log

2 (Affymetrix U133plus2.0 signaali)) on

ITGB3

(punainen) ja

ITGB5

(vihreä) yleisillä tulokset microarray data laajojen-Novartis Cancer Cell Line Encyclopedia. Ilmaisu kynnys, jonka takana se voidaan pitää kohinaa (MAS5 ”puuttuminen” lippu tila, geeni ei ilmenny) on 4,8, että

ITGB3

probeset. (D) FACS-analyysi a vp 3 (ylempi paneeli) ja a vp 5 (alempi paneeli) integriinit ilmentyminen pinnalla SKOV-3, IGROV-1 ja Shin-3-soluja. Spesifistä vasta-ainetta (sininen viiva). Isotyyppikontrolli (punainen viiva).

Olemme kehittäneet 3 tyyppisiä määrityksiä tutkimaan vaikutuksia MFGE8 tarttumiseen, maahanmuuttoa ja selviytyminen syöpäsoluja. XCELLigence järjestelmä (ACEA Biosciences), laite mahdollistaa reaaliaikaisen mittauksen solusitoutumisen alustaan, käytettiin määrittämään lyhyen aikavälin tarttumista ihmisen rekombinantti MFGE8 (kuva 3a-e), ja pitkän aikavälin siirtokuoppaan siirtymistä MFGE8 vuonna läsnäolo vasikan sikiön seerumia (FCS 0,1%) (kuvio 3f-h). Klassinen fluoresenssiin perustuva kvantifiointi solujen määrä käytettiin arvioimaan pitkän aikavälin elinkelpoisuuden nälkään olosuhteissa (kuvio 3i, j).

(a-e) Analyysi tarttumista SKOV-3 MFGE8 käyttäen xCELLigence järjestelmää . (A) Esimerkki solun indeksi (CI), kuten ajan funktiona, on PBS: ää tai ihmisen MFGE8 (huMFGE8), kun läsnä on anti-huMFGE8 tai kontrolli-lgG. Sininen ja punainen pystyviivat osoittavat ajankohtina laskemisessa käytetyt rinne arvoja. (B) Adhesion of SKOV-3 MFGE8, verrattuna PBS: llä (Ctrl), kvantitoitiin kulmakertoimen arvon välillä 0 ja 2 tuntia. (C) inhibitio tarttuvuus 5 ug /ml MFGE8 10 ug /ml anti-huMFGE8 (hMc3) tai negatiivinen kontrolli (Rituksimabi, Ritux). (D) Vaikutus tarttumiseen 5 ug /ml MFGE8 (Ctrl) polyklonaalista anti-huMFGE8 seerumia (1/100), joka on spesifinen RGD-domain (anti RGD), C1 domain (anti C1) tai RGD domeenin hiiren Mfge8 (anti-hiiri-RGD). (E) inhibitio tarttuvuus 5 ug /ml MFGE8 (Ctrl) anti-a vp 3 ja /tai -αvβ5 integriinin vasta-aineet (5 ug /ml kutakin). (F-g) Analyysi migraatio SKOV-3 käyttäen xCELLigence. Solut ympättiin ylemmässä kammiossa, ja MFGE8 ja vasta alemmassa kammiossa CIM-levyjen. (F) Esimerkki solun indeksi (y-akseli) funktiona ajan (x-akseli), samanlaisissa olosuhteissa kuin (a). Sininen ja punainen pystyviivat osoittavat ajankohtina laskemisessa käytetyt rinne arvoja. (G) annos-riippuvainen vaikutus MFGE8 SKOV-3 muuttoliike, verrattuna PBS (Ctrl), kvantitoitiin kulmakertoimen arvon välillä 0 ja 18 tuntia. (H) esto siirtyminen 5 ug /ml huMFGE8 mukaan 10 ug /ml anti-huMFGE8 hMc3, verrattuna negatiiviseen kontrolliin (Ritux). (I-j) Survival määritystä SKOV-3 viljeltiin 96 tunnin ajan, kun läsnä oli 0,1% seerumia. Solujen määrä on määrällisesti fluoresenssi mielivaltaisina yksikköinä (A.U.) verrattuna kontrolliin vastaavassa tilassa 100%. (I) annosriippuvaisesti vaikutus MFGE8 SKOV-3 selviytymisen. 100% = perustason of A.U. puuttuessa eksogeenisen MFGE8 (Ctrl). (J) inhibitio eloonjäämisen että läsnä oli 10 ug /ml huMFGE8, jonka 10 ug /ml hMc3 tai negatiivisen vasta-aine. 100% = perustason of A.U. läsnä ollessa MFGE8. Tiedot edustettuina Box-ja-viikset esittävät graafisesti pienin (alempi virhepalkin), 25

persentiilin-mediaani-75

persentiilin ja maksimi (ylempi virhepalkin) arvoja. N = 4 (paitsi 3j: N = 5). *** = P 0,001; ** = P 0,01; * = P 0,05 verrattuna Ctrl = PBS 3b, g; ja 0,312 ug /ml MFGE8 in 3i; tai Ctrl = MFGE8 vuonna 3c, d, e, h, j ..

xCELLigence laite mittaa muutokset impedanssin aiheuttamien soluihin, kun he kohtaavat elektrodit kattavat pohjalle kulttuurin mikrokuoppa (ePlate ). Taso impedanssi signaali on verrannollinen solujen lukumäärä ja intensiteetti niiden vuorovaikutusta substraatin, ja tämä signaali voidaan siten muuntaa mielivaltai- solun indeksin arvo (kuvio 3a, f). Tehokkuutta solun sitoutuminen lasketaan kulmakerroin impedanssin havaittiin kahden ensimmäisen tunnin kuluttua solujen ymppäämisen (kuva 3a-e). Mitata tarttuvuus SKOV-3 MFGE8, rekombinantti ihmisen MFGE8 pinnoitettiin xCELLigence mikrokuoppia, olosuhteissa samanlaisia ​​kuin olimme aiemmin käytetty analysoimaan sitoutumisen ihmisen endoteelisolujen MFGE8 [4]. Kuvio 3b esittää, että MFGE8 sallitaan sitoutumisen solujen alustaan ​​annoksesta riippuvalla tavalla. Testasimme vaikutuksia on aiemmin kuvattu spesifisten vasta-aineiden ihmisen MFGE8 tässä määrityksessä: kaniinin seerumia tuotettu laboratoriossamme, tunnustetaan vastaavasti joko RGD-sisältävät integriiniä sitova domeeni [4] tai discoidin C1-domeenin ihmisen MFGE8 (C. Théry, julkaisematon data), ja humanisoidun version MC3 monoklonaalinen vasta-aine on kuvattu CERIANI et al [15], (hMc3) [16], on myös tunnustaa integriiniä sitova domeeni MFGE8. Sekä hMC3 vasta-aineella (kuvio 3c), ja kaniinin anti-RGD domeeni (kuvio 3d) inhiboi voimakkaasti soluadheesiota, ottaa huomioon, ettei ohjaus humanisoitu vasta-aine (Ritux, kuvio 3c), eikä kanin anti-C1 domain seerumia, eikä kanin seerumi että RGD-alueen hiiren Mfge8 (anti C1 tai anti hiiri RGD, kuvio 3d) esti sitä. Lopuksi estäviä vasta-aineita on a vp 3 tai a vp 5 inhiboivat, ja niiden vaikutukset olivat lisäaineen (kuvio 3e). Siten tarttuvuus SKOV-3 MFGE8 välittää vuorovaikutus avp3 /5-ilmentävien solujen kanssa RGD sisältävien domeenin MFGE8.

xCELLigence laite oli seuraava käytetään elektrodi päällystetty Boyden kammio mikrokuoppia ( CIM levyt), joka voidaan mitata impedanssin tuotetun siirron jälkeen solujen alemmalle puolelle 8 um huokosia suodatin erottaa ylemmän alemmasta kammiosta (kuvio 3f). Kyky solujen siirtyä kohti MFGE8 sisältävän alemman osaston, kun läsnä on samanlainen pieni määrä FCS molemmissa osastoissa (0,1%), laskettiin kulmakerroin solun indeksi välillä 0 ja 18 tunnin jälkeen solujen kylvö on ylempi kammio (kuva 3f-h). Kuvio 3g ja 3h käy ilmi, että MFGE8 indusoi SKOV-3 muuttoliike annoksesta riippuvaisella tavalla, ja että, kuten adheesion määritys, hMC3 inhiboivat spesifisesti tätä vaikutusta.

Kolmannessa määrityksessä mitattu vaikutus MFGE8 eloonjäämiseen of SKOV-3 soluja viljellään nälkään olosuhteissa (0,1% FCS). Läsnäolo MFGE8 indusoi annoksesta riippuvan lisäys SKOV-3 selviytymisen, havaittavissa neljä päivää sen jälkeen ymppäämällä (kuvio 3i), joka, vaikka ei ole kovin vahva, oli toistettavissa. Tämä vaikutus on erikseen estänyt MFGE8-erityinen hMC3 vasta-aineella (kuvio 3j).

Generation uusien anti-MFGE8 monoklonaalisia vasta-aineita anti-kasvain ominaisuuksia

Validoida uusi vankka ja toistettavissa

in vitro

määrityksissä välineinä tunnistaa uusia MFGE8 salpaajien käytimme niitä seuloa suuri joukko uusia anti-MFGE8 vasta-aineilla immunisoimalla meidän Mfge8-hiirillä [4,17] rekombinantti MFGE8. Kaikissa määrityksissä, koeolosuhteista verrattiin kasvatettujen solujen läsnä ollessa MFGE8, pidetään 100%: n signaali. Monoklonaalisia vasta-aineita näyttämällä spesifinen sitoutuminen ihmisen MFGE8

in vitro

, eikä sitoutuminen muihin proteiineihin, joilla on yhteisiä rakenteellisia domeeneja (ts vitronektiiniin ja tekijä VIII) testattiin SKOV-3 adheesiomäärityksellä. Eri vasta-aineet näytetään eri inhiboivia vaikutuksia tässä kokeessa. Kuvio 4a esittää esimerkkejä tuloksista aloitusnäyttö (suoritettu kerran) 10 ehdokasta. Valitsimme viisi vasta-aineita, jotka näytetään toiminta on samanlainen kuin viite-vasta-hMc3, kun käytetään 50 tai 10 ug /ml.

(a) Vaikutus 10 uuden anti-MFGE8 vasta-aineita (10 tai 50 ug /ml) on tarttumista ja MFGE8 (adheesiomääritystä), verrattuna hMC3. 100% tartunta vastaa 5 ug /ml MFGE8 pinnoite ilman vasta-aineita (ctrl). Esimerkki seulonnan kokeissa, suoritettiin kerran kutakin 40 uutta vasta-aineita. Mustat nuolet osoittavat vasta-aineita, valittiin lisäkarakterisointia varten. (B) annos-vaste-vaikutus 5 on valittu vasta-aineiden, verrattuna hMC3 on adheesiomäärityksellä. (C) annos-vaste-vaikutus 5 on valittu vasta-aineiden, verrattuna hMC3 siirtymien määrityksessä. 100% muuttoliike vastaa 5 ug /ml MFGE8 ilman vasta-aineita. (D) annos-vaste-vaikutus 5 on valittu vasta-aineiden, verrattuna hMC3 selviytymisen määrityksessä. 100% selviytymisen vastaa 10 ug /ml yhdistelmä-DNA-MFGE8 ilman vasta-aineita. Rasia ja viikset kuvaajat kuviossa 3. N = 4 (paitsi (c) 215A9 -10 ug /ml, ja 311A7 -0,625 ug /ml: N = 3 ja hMc3: N = 2; (b) ja 215A9 -5μg /ml: N = 2). *** = P 0,001; ** = P 0,01; * = P 0,05 verrattuna alimpaan vasta-aineen pitoisuus (0,5 tai 0,625 ug /ml) kunkin yksittäisen vasta-aineen 4b, c, d.

tehokkuuden määrittämiseksi nämä 5 ehdokasta, vähenee määrät vasta-aineen 50-0,5 ug /ml, käytettiin adheesiomääritystä (kuvio 4b). Kun läsnä on 10 ug /ml hMc3 tai kaikki kloonit paitsi 346B6, alle 20% solujen tarttuvuudesta havaittiin. Kun kyseessä on 346B6 10 ug /ml, 40% solujen tarttuvuudesta havaittu (mediaani 4 mittaukset). Kun läsnä on 0,5 ug /ml kolmen kloonin (416H9, 399A12 ja 311A7), 60% solun tarttumisen havaittiin, kun taas 90% tarttumista saatiin hMc3 tässä pitoisuudessa.

Kun testattiin annoksesta vaste asetus migraatiokokeessa (kuvio 4c), kaikki vasta-aineet vähenivät muuttoliikkeen käytettynä korkein pitoisuus (20 ug /ml). Kaksi kloonia (416H9, 399A12) laski merkittävästi siirtyminen, kun sitä käytetään 2,5 ug /ml.

Lopuksi, vasta-aineet testattiin eloonjäämisen määrityksessä, kun läsnä on 10 ug /ml MFGE8 (= 100% selviytymisen kuviossa 4d). 346B6, vähiten tehokas klooni kahdessa muussa määrityksissä ei laskenut eloonjääminen missä tahansa pitoisuudessa, kaksi muuta indusoi korkeintaan 30%: n inhibition (= 70% solujen eloonjäämistä signaali pysyi), kun käytetään korkeimmalla pitoisuus (2154A9 ja 311A7), kun taas kaksi viimeistä (416H9 ja 399A12) olivat yhtä tehokkaita kuin hMc3, ja laski solujen määrä on alle 50% MFGE8-alone käsitellyt solut (= 50% eloonjääminen).

käyttö yhdessä kolmesta toisiaan täydentävästä määrityksiä mahdollistaa siten selkeä valinta 2 vasta, ulos 40, mahdollisesti tehokkaimmista keinoista samanaikaisesti estää tarttumista, muuttoliike ja selviytyminen MFGE8- ja a vp 3/5-ilmentävien munasarjasyöpäpotilailla.

vaikutus MFGE8 ja MFGE8 Kyseessä voi vasta-aineiden muihin munasarjakarsinoomasolut

Sen määrittämiseksi, ovatko tulokset saatiin SKOV-3 oli tyypillinen muille munasarjasyöpäsolulinjoihin, teimme samat kolme määritykset käyttäen IGROV-1 ja Shin-3, joka, kuten kuvassa 2, joko ilmaistaan ​​MFGE8 ja a vp 3/5 integriinien tasoisena SKOV-3 (IGROV-1), tai ei ilmaista MFGE8 tai avp3 integriini (Shin-3). Kolme vasta edustaja kolmenlaisia ​​tehokkuutta havaittiin SKOV-3 käytettiin tässä: 399A12, 311A7 ja 346B6, vastaavasti korkean, keskitason ja alhaisen esto tehokkuutta. Vuonna xCELLigence-pohjainen adheesiomäärityksellä (kuva 5a, b), Shin-3 antoi 20-kertaa pienempi impedanssi signaali kuin SKOV-3 tai IGROV-1 (vertaa kaltevuus arvot kuvassa 5b ja 5a), mutta kuten SKOV-3 , adheesio kasvoi molemmissa solulinjoissa, kun läsnä oli 5 ug /ml MFGE8, ja inhiboi annoksesta riippuvalla tavalla, että 3-vasta-aineita. Vuonna migraatiokokeessa (kuvio 5c, d), jossa SHIN-3 näytetään nopeudella muuttoliikkeen samanlainen SKOV-3 ja IGROV-1, kolme vasta-aineet myös inhiboivat MFGE8 riippuvainen kulkeutuminen IGROV-1 ja Shin-3 annoksesta -riippuvaisella tavalla, ja samalla korkea-, keski- ja alhainen tehokkuus kuin SKOV-3. Sen sijaan, eloonjäämisen määritys (kuvio 5e, f) osoitti erilaista vaikutusta MFGE8 kolmesta solulinjoissa: Shin-3 ei ole mitään elonjäämisetua läsnä ollessa MFGE8, eikä vaikutusta MFGE8-estävien vasta-aineiden tähän määrityksessä, kun taas IGROV-1 käyttäytyi kuin SKOV-3.

(a-b) adheesio IGROV-1 (a) ja Shin-3 (b) ja 5 ug /ml MFGE8, verrattuna PBS: llä, kvantifioidaan käyräarvon välillä 0 ja 2t. Vaikutus kolmen valitun vasta-aineiden toimitetaan kahtena annoksena (2,5 ja 10 ug /ml) on MFGE8-päällystettyihin kuoppiin on myös esitetty. (C-d) IGROV-1 (c) ja Shin-3 (d) migraatiokokeessa ja 5 ug /ml MFGE8 kuten kuviossa 3-4, ja esto vasta-paneeleissa a ja b tarttuvuuden. Rinteet arvot lasketaan välillä 0 ja 18 tuntia. (D-e) IGROV-1 (d) ja Shin-3 (e) -eloonjäämiskoe läsnä ollessa 10 ug /ml MFGE8, kuten kuviossa 3-4, ja inhibitio 2,5 tai 10 ug /ml vasta-aineita. 100% selviytymisen vastaa 10 ug /ml MFGE8 ilman vasta-aineita. Rasia ja viikset kuvaajat kuviossa 3. N = 4 (paitsi (b): 399A12 -2,5 ug /ml, 346B6 -10 ug /ml, 311A7 -10 ug /ml: N = 3, kohdassa (e, f) PBS: ssä ja MFGE8: N = 5, on (f) MFGE8 + 311A7: N = 3). *** = P 0,001; ** = P 0,01; * = P 0,05, verrattuna Ctrl = MFGE8.

MFGE8 yli-ilmentymisen kolminkertainen negatiivisen rintasyövän

Lopuksi onko uusi MFGE8-salpaajien kuten vasta tunnistettu edellä voitaisiin käyttää hoidettaessa muita kasvaimia, analysoimme MFGE8 ilmentymistä immunohistokemiallisesti meidän kokoelma rintojen kasvainbiopsioissa syntyvät potilaista hoidettiin Institut Curie (taulukko S2). MFGE8 oli voimakkaammin ilmaistu joilla on pitkälle edennyt laadut rintasyövän (kuva 6a), ja tarkemmin sanottuna triple-negatiivinen HR /HER2- alatyypin näistä syövistä (jotka ovat enemmistönä Asteen 3): 13/20 = 65 % triple-negatiivinen koepaloja näkyy MFGE8 tasoilla rankattu 2 tai 3, kun taas vain 5/36 = 13,8% hormonin reseptorin (HR) ja /tai HER2 kasvaimia näytössä tasot 2 tai 3 MFGE8 ilmaisun (kuva 6b). Nämä havainnot vahvistavat näin ollen tulokset julkaisi äskettäin Yang ja kollegoja [13].

(a-b) pisteytys MFGE8 ilmaisun, analysoitiin immunohistokemiallisesti kuten kuviossa 1, 59 rinta- kasvainbiopsioissa Institut Curie potilaat, funktiona kasvaimen (a) tai fenotyypin suhteen Hormon-reseptorin (HR) tai HER2 lausekkeen (b). ***: P = 0,0001 jakeluun kasvainten yliekspressoivat (pisteet 2-3) tai (0-1) MFGE8 väliin luokka 2 vs. asteen 3 kasvaimet (a), tai välillä HR + /HER2- versus triple-syöpäkasvain ( b). (C) analyysi mRNA ekspressiotasoja (Log

2 (Affymetrix U133plus2.0 signaali)) on

MFGE8

yleisillä tuloksiin Affymetrix microarray tietojen laajojen-Novartis Cancer Cell Line Encyclopedia kuten kuvassa 2 . Musta nuoli osoittaa MDA-MB-231-solulinja (HR /HER2- kolminkertainen negatiivinen fenotyyppi) valitaan myöhemmissä kokeissa. (D) kvantifiointi MFGE8 ELISA: lla MDA-MB-231 elatusaine (24 h). Erittyvää MFGE8 ilmaistaan ​​ng /ml per 10

6 soluviljelmässä. Keskiarvo kahdesta kokeesta + SD. (E) FACS-analyysi a vp 3 (vasen paneeli) ja a vp 5 (oikea paneeli) integriinin ekspressioon pinnalla MDA-MB-231-soluja. Spesifistä vasta-ainetta (sininen viiva). Isotyyppikontrolli (punainen viiva). (F) MDA-MB-231 adheesiomäärityksellä on 5 ug /ml MFGE8, kuten kuviossa 3-5, ja esto 10 ug /ml hMC3, edustettuina kaltevuus arvojen välillä 0 ja 1 tunti. (G) MDA-MB-231 migraatiokokeessa ja 5 ug /ml MFGE8 kuten kuviossa 3-5, ja esto 10 ug /ml 215A9-vasta-aineen. Data edustettuina kaltevuus arvot lasketaan välillä 0 ja 18 tuntia. (H) MDA-MB-231 -eloonjäämiskoe läsnä ollessa 10 ug /ml MFGE8, kuten kuviossa 3-5, ja esto 10 ug /ml 399A12. 100% eloonjääneitä vastaa 5 ug /ml MFGE8 ilman vasta-aineita. Rasia ja viikset kaavioita kuten kuvassa 3. N = 4 (paitsi (g): PBS N = 6, MFGE8 + 215A9 N = 5, ja (h): ctrl N = 6, MFGE8: N = 5) . ***: P 0,001, **: P 0,01, verrattuna Ctrl = MFGE8.

Tasaisen, analyysi Broad-Novartis Cancer Cell Line Encyclopedia ekspressiotietojen rintasyövän solulinjat osoittivat ilmaus

MFGE8

yläpuolelle luotettavuustasolla (Log

2 Affymetrix U133plus2.0 signaalin MAS5 ”poissa” lippu = 6,1 varten

MFGE8

) useimmissa triple-negatiivinen rintojen soluja (24/29 = 82%), kun taas vain 2/23 = 9% HR ja /tai HER2 + solujen ilmaista geenin (kuva 6c). Lopuksi testasimme vaikutuksia MFGE8 ja estävien vasta-aineiden tarttumiseen, maahanmuuttoa ja selviytyminen triple-negatiivinen MDA-MB-231-solulinja, joka erittää MFGE8 ja ilmaisee avp3 ja a vp 5 integriinit kuten SKOV-3 ja IGROV-1 (kuvio 6d, e). Kuten kuviossa 6f-h, MDA-MB-231 näytetään MFGE8 aiheuttama tartunta (kuvio 6f), muuttoliike (kuvio 6g), ja eloonjääminen (kuvio 6h). Lisäksi anti-MFGE8 vasta näkyy samankaltaisia ​​vaikutuksia MDA-MB-231, koska he tekivät SKOV-3-soluissa.

tulokset vahvistavat näin ollen MFGE8 kuin lupaava kohde vasta-strategiapeli, jonka tavoitteena on estää kasvaimen kasvu triple-negatiivinen rintasyöpiä.

keskustelu

tässä esitetyt tulokset korostavat uudentyyppinen syövän mahdollisena kohteena MFGE8-esto hoitomuodot: munasarjasyöpäpotilailla. Lisäksi kuvaamme uusia määrityksiä sovitettavissa laajamittainen seulonta, sekä syöpäsolun linjat eri kudoksista peräisin, mikä mahdollistaa tunnistamaan hyödyllisin MFGE8-salpaajien voidaan seuraavaksi käyttää prekliinisissä

in vivo

kasvaimen kasvua määrityksissä.

yhdistetty analyysi 3 fysiologisia vaikutuksia MFGE8 /lactadherin kasvainsoluihin, eli tarttuvuus, muuttoliike ja selviytymistä, antoi meille mahdollisuuden sijoittua 5 eri MFGE8-spesifisten vasta-aineiden, ja niitä voidaan verrata viittaus vasta-hMc3. MC3 kuvattiin 30 vuotta sitten sen kyky sitoutua kiertävän rintarauhasen epiteelisolujen antigeenejä syöpäpotilailla [18]. Pian sen jälkeen, kun osoitettu estävän kasvua ihmisen rinta- kasvaimia Nude-hiirissä joko yksin [15], tai tehokkaammin, kuten konjugaatti

131I [19]. Tunnistama antigeeni MC3 kloonattiin MFGE8 (tuolloin nimeltään BA46) muutamaa vuotta myöhemmin [3], ja epitooppikartoitus tunnistaa RGD sisältäviä EGF verkkotunnus kuin kohde MC3, kun taas toinen vasta-aine, MC8 tunnustettu epitoopin C2 domain eikä näytä antituumorivaikutus

in vivo

[20]. Meidän kolme määrityksissä, MC3 tehokkaasti esti vaikutukset rekombinantti MFGE8, mikä viittaa siihen, että RGD domain ja sen vuorovaikutusta a vp 3/5 integriinit vaaditaan tarttuvuus, maahanmuuton siirtokuoppaan, ja solujen eloonjäämistä. Koska havaitsimme, että keskuudessa kaksi anti-MFGE8 kani antiseerumit, vain yksi tunnustaa RGD verkkotunnuksen lohkojen tarttuvuus, voimme sulkea pois myös muiden domeenien MFGE8 tämäntyyppisessä toiminnon. Mutta emme voi sulkea pois, että maahanmuutto ja selviytymistä voitaisiin myös välittyvän muunlaisia ​​yhteisvaikutuksia MFGE8 kanssa kohdesolun, mahdollisesti kautta toisen reseptorin, kuten ehdotettiin siittiöiden sitoutuminen munasolun välittämä SED1 (toinen nimi MFGE8) [21].