Krooninen sairaus

tiivistelmä

solunsalpaajahoidosta syövän rajoittaa vakava, joskus hengenvaarallisia, sivuvaikutuksia, jotka syntyvät toksisuutta herkille normaalit solut koska hoitomuodot eivät ole selektiivisiä pahanlaatuisia soluja. Joten miten ne voidaan selektiivisesti parantaa? Vaihtoehtoiset farmaseuttiset formulaatiot syöpälääkkeet on tutkittu parantamiseksi tavanomaisen kemoterapian hoidossa. Näitä formulaatioita liittyy ongelmia, kuten vakavia myrkyllisiä sivuvaikutuksia terveiden elinten, lääkeresistenssin ja rajoitettu pääsy lääkeaineen tuumorikohdat ehdotti tarvetta keskittyä Kohdekohtaisten lääkeaineiden vapautumisen säätelyssä järjestelmiä. Vastauksena näihin huolenaiheisiin, olemme kehittäneet uuden lääkeaineen, joka perustuu magneettisen punasolujen suunniteltu kanssa virusperäisen piikki fuusioproteiinia. Tämä uusi punasolujen perustuvan lääkeaineen jakelujärjestelmä on potentiaalia magneettisten-ohjattu paikkasidonnainen lokalisointi ja erittäin tehokas fuusio valmiuden kohdennettuja soluja. Tässä osoitamme, että erytro-magneto-HA virosomit lääkeaineen järjestelmä pystyy liittää ja sulake kohdesolujen ja tehokkaasti vapauttamaan terapeuttisia yhdisteitä solujen sisällä. Tehoa syövän huumeiden palveluksessa lisääntyy ja tarvittava annos on 10 kertaa pienempi kuin mitä tarvitaan asianmukaisin menetelmin.

Citation: Cinti C, Taranta M, Naldi I Grimaldi S (2011) Vastikään Suunniteltu magneettinen Punasolut kestävälle ja Kohdennettu toimitus Anti-Cancer terapeuttisten yhdisteiden. PLoS ONE 6 (2): e17132. doi: 10,1371 /journal.pone.0017132

Editor: Steven Ellis, University of Louisville, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 lokakuu 2010; Hyväksytty: 21. 2011; Julkaistu: 23 helmikuu 2011

Copyright: © 2011 Cinti et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

onnistuminen mitään lääketieteellistä hoitoa ei riipu ainoas- farmakokineettistä /farmakodynaamista vaikutusta terapeuttisen aineen, mutta suurelta osin, sen biosaatavuus paikalla toimintaa ihmisen [1] – [4]. Aiemmin vaihtoehtoiset farmaseuttiset formulaatiot syöpälääkkeet on tutkittu parantamiseksi tavanomaisen kemoterapian hoidossa. Tavanomaisissa /nykyinen hoito suun tabletti, kapseli ja injektoitavia formulaatioita käytetään syöpälääkkeiden toimitus. Näitä formulaatioita liittyy ongelmia, kuten vakavia myrkyllisiä sivuvaikutuksia terveiden elinten, vaikeudet kliiniseen annosteluun, lääkeresistenssin ja rajoitettu pääsy lääkeaineen tuumorikohdat ehdotti tarvetta keskittyä päällä erityisiä lääkeaineiden vapautumisen säätelyssä järjestelmiä.

Lääkkeenjakojärjestelmät (DDSs), kuten rasva- tai polymeeri-nanohiukkasia on suunniteltu parantamaan farmakologiset ja terapeuttiset ominaisuudet lääkkeiden parenteraalisesti. Suurin osa DDS tällä hetkellä hyväksytty parenteraaliseen antamiseen kuuluu luokkaan liposomaalisen tai lipidejä pohjaiset formulaatiot tai terapeuttisten molekyylien liittyvät polyetyleeniglykoliin (PEG) [5] – [7]. Vaikka lääkeaineen liukoisuus ei voi olla rajoittava tekijä, kuten polymeeri-lääke-konjugaattien, jossa lääke on kemiallisesti sidottu kantajaan, se voi olla tärkeä näkökohta liposomaalisen DDS. Kantavuus Liposomien ei ole tehokasta hyvin suuria terapeuttisia molekyylejä, kuten proteiineja, erityisesti pieniä liposomiin halkaisijat ovat toivottavia syistä biologiseen jakaantumiseen. Biohajoava nano /mikropartikkelit poly (D, L-laktidi-ko-glykolidi) (PLGA) ja PLGA-polymeerit ovat laajalti tutkittu kantajina valvottua jakelua makromolekyylisten terapeuttisten, kuten proteiinien, peptidien, rokotteiden, geenien antigeenejä ja kasvutekijät . Kirjallisuus mainitsee monia etuja ja haittoja PLGA ja PLGA perustuva jakelu järjestelmät toimittamiseen makromolekyylilääkkeistä [8], [9]. Drug kapselointi, partikkelikoko, lisäaineita formuloinnin aikana, molekyylipaino, suhde laktidi glykolidi osia PLGA ja pinnan morfologia voi vaikuttaa vapauttamista ominaisuudet [10]. PLGA on kielteinen vaikutus proteiinien vakautta valmistuksen ja varastoinnin johtuen ensisijaisesti Happokatalysoidulla luonne sen hajoamisen [11]. Lisäksi, käsittely olosuhteissa, joita käytetään valmistuksessa PLGA lääkeaineen ajoneuvot olla haitallisia vaikutuksia tietyn proteiinin sekundaarirakenteita [12].

Viime vuosina, solupohjaiset jakelujärjestelmiä on myös kehitetty. Käyttö solujen terapeuttinen kantajia on kehittänyt erillisenä käsitteenä ja toimitustapa [13] – [17]. Cell-pohjainen ajoneuvot ovat erityisen houkuttelevia toimittamista bio aineina, joita on vaikea syntetisoida, ovat vähentäneet puoliintumisajat, rajoitettu kudospenetraatio tai inaktivoituu nopeasti, kun suora

in vivo

johdannossa. Koska kysymys tosiasioita, solu-pohjainen jakelujärjestelmä on lukuisia etuja, mukaan lukien pitkittynyt toimitusajat, kohdistaminen huumeita erikoistuneiden solujen osastoihin ja biologinen yhteensopivuus. Käyttö fysiologisen kantoaallon tuottamaan terapeuttisia koko kehon sekä parantaa niiden tehoa minimoiden väistämättä haitallisia sivuvaikutuksia, on houkutteleva näkökulma, jota voidaan soveltaa monissa kliinisissä. Käyttäytymistä verisolujen, kuten antojärjestelmän eri lajia olevien molekyylien (eli proteiineja, mukaan lukien entsyymit ja peptidit, terapeuttiset aineet muodossa nukleotidianalogien, glukokortikoidi analogit), on tutkittu laajalti, koska niillä on useita ominaisuuksia, jotka tekevät niistä ainutlaatuisia ja hyödyllisiä kantajia [18] – [20]. Yhteydessä ekstrakorporeaalisen lääkehoidon, lupaavin lähestymistapa on käyttää autoerythrocytes joilla ainutlaatuinen morfologiset ja fysiologiset ominaisuudet. Soveltaminen punasolujen säiliöinä eri huumeiden vähentää sivuvaikutusten riskiä ja patologisten immuunireaktioiden vastaan ​​kapseloitu aineita ja lisäksi se mahdollistaa muuttamista niiden farmakokineettisiä ja farmakodynaamisia ominaisuuksia vähentää annoksilla ja välein niiden välillä. Tehoa ja turvallisuutta farmaseuttisten aineiden käyttöön punasoluihin on vahvistettu lukuisissa

in vivo

tutkimuksissa [20]. Magneettinen erytrosyytit, jotka johtuvat co-kapselointi lääkkeiden joidenkin ferrofluids, kuten koboltti-ferriittiä ja magnetiittia, on raportoitu suoraan kapseloitu lääkeaine pääasiassa haluttuihin kohtiin kehon avulla, ulkoisen magneettikentän [21] – [23]. Soveltamalla ultraääni aaltojen alueella, jossa magneettisen punasolujen kertyä voi aiheuttaa ajoneuvon tuhoa ja vapauttamaan lääkeaineen elimen tai kudoksen tasolla [24], [25]. Lisäksi lääkeaineen kohdentamiseen, tämä menetelmä on arvioitu induktioon paikallisen iskemian kasvaimia, jotka voidaan näin ollen edistää kasvaimen remission, koska alentunut paikallista veren virtausta [22]. Kuitenkin kyvystä solun harjoittajat voivat tarjota paikkakohtaisia ​​tai kohdistettu annostelu terapeuttisten ole vielä täysin tutkittu. Kehittäminen solun kohdistusstrategioihin entisestään etukäteen solu ajoneuvon sovelluksia, laajentaa sovellettavuutta tämän toimituksen lähestymistavan ja voimistaa hoitotulosten.

Yrittäessään parantaa kohdentamista ja tehokasta vapautumista terapeuttisten yhdisteiden sisäisen solutasolla kohdesolujen, olemme kehittäneet uuden magneettikentän-ohjattu punasolujen perustuvan lääkeaineen jakelujärjestelmä. Kiinnittäminen virus piikki fuusio glykoproteiini on punasolujen ”kalvo ja kapselointi superparamagneet- nanohiukkasten ja huumeiden punasoluihin, olemme tuottaneet uutta punasolujen perustuvan lääkeaineen jakelujärjestelmä, erytro-Magneto-HA virosomit, joilla on potentiaalia magneettinen-ohjattu paikkasidonnainen lokalisointi ja erittäin tehokas fuusio valmiuden kohdennettuja soluja. Läsnäolo virusfuusion glykoproteiinin tekee soveltamisesta ultraääni aalto tarpeetonta indusoimiseksi ”ajoneuvo” tuhoa vapauttamaan terapeuttisten yhdisteiden kohdepaikkaan. Tässä näytämme, miten erytro- Magneto-HA virosomit käyttäytyvät hieman minun vaipallinen virus kyvyssään hyökätä isännän soluihin. Nämä suunnitellut punasolujen pystyvät fuusioituvat sytoplasmaattinen kalvon kohdesoluja hyvin lyhyessä ajassa ja vapauttaa magneettisen nanohiukkasten ja terapeuttista yhdistettä sisällä näitä soluja. Kokonaismäärä on syöpälääke 5-atsa-2-deoksisytidiinin on terapeuttinen vaikutus 10 kertaa pienempi kuin tavanomaisen hoidon, mikä viittaa siihen, että tämä uusi lääkeaineen järjestelmä voi pystyä vähentämään sytotoksisten lääkkeiden vaikutuksia lisäämällä hyötyosuutta terapeuttisten yhdisteiden paikalla ja parannetaan farmakokinetiikkaa. Tämä uusi punasolujen perustuvan lääkeaineen järjestelmä voidaan mahdollisesti soveltaa monissa kliinisissä asetukset, mukaan lukien neoplastiset sairaudet, sairaudet aiheuttama infektio ihmisen tai eläimen viruksia ja sydän- ja verisuonitauteihin.

Materiaalit ja menetelmät

influenssavirus kasvua ja eristäminen hemagglutiniini (HA) glykoproteiinin

influenssavirus saatu allantoisontelon neste 10 päivän ikäisistä sikiön munat (munat saatiin kanan tehtaalta Rooma, Italia) pelletoitiin ultrasentrifugaatiolla ja pelletti suspendoitiin uudelleen okta (etyleeniglykoli) –

n

-dodecyl monoeetteri (C

12E

8) ja jätettiin yön yli, mikä mahdollistaa liukenemisen viruksen kalvo. Suspensio oli huolellisesti homogenisoidaan ja ultracentrifugated pelletoimiseksi alas virusnukleokapsidit. Seuraavaksi virosomien suspension (supernatantti, joka sisälsi HA-proteiini) puhdistettiin ultrasentrifugaatiolla epäjatkuvalla sakkaroosi-gradientilla (50% ja 10% sakkaroosia). Rajapinnassa sakkaroosin kerrokset, HA glykoproteiini tiivisteet. Poistamisen jälkeen tämän kerroksen, HA on dialysoidaan puskuria ja steriloitiin suodattamalla.

Punasolut lyysin ja sisällyttäminen HA glykoproteiinin, super paramagneettinen nanohiukkasten ja 5-atsa-2-dC lääke

punasolujen (RBC: t) saatiin verestä terveiden luovuttajien sentrifugoimalla 1700 rpm: llä 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Juuri kerättyjä RBC pestiin kahdesti fysiologisessa fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (1 x PBS) (1,37 M NaCl, 57 mM KCI, 54 mM Na

2HPO

4, 45 mM KH

2PO

4, pH 7,4 ).

2 x 10

9 RBC lyysattiin 300 ui: aan lyysipuskuria (10 mM TRIS, 0,1 mM EDTA, 1 mM MgCl

2 pH: ssa 7,2) 60 minuutin ajan 0 ° C: ssa . Iso- Sitten palautettiin lisäämällä 65 ui 1 X sulkemisen puskuria (1,37 M NaCl, 57 mM KCI, 54 mM Na

2HPO

4, 45 mM KH

2PO

4, 15 mM MgCl

2 pH 7,4), jota oli täydennetty 0,1 mg 100 nm punainen-leimattua supermagneettinen nanohiukkasten (nano-screenMAG, Chemicell Company), 1 ug HA influenssaviruksen piikki glykoproteiinin, ja 0,38 tai 30,5 ug 5-atsa-2-dC ( Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA).

suspensiota inkuboitiin 45 minuuttia 37 ° C: ssa varovasti sekoittaen. Suljettu RBC (haamuja), joka sisältää HA-fuusioproteiinin lipidikalvo ja molemmat 5-atsa-2-dC ja superparamag- nanohiukkasten sisällä (erytro-magneto-HA virosomien), otettiin talteen sentrifugoimalla 10000 rpm: ssä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Erytro-magneto-HA virosomit pestiin kahdesti 1X PBS: llä sentrifugoimalla 9000 rpm 15 minuuttia 4 ° C: ssa ja suspendoitiin uudelleen 1 x PBS, joka sisälsi 1% FCS: ää.

Kinetics erytro-magneto-HA virosomit fuusio HeLa-solujen kanssa: Spektrofluorimetri analyysi

Erytro-magneto-HA virosomit valmistettiin kuten edellä on kuvattu ja leimattiin lisäämällä Octadecyl rodamiini (R18). Erytro-magneto-HA virosomit /R18 ladattu lisättiin HeLa-soluissa. Yhteensä lipidin erytro-magneto-HA virosomit /R18 kvantitoitiin määrä oktadekyyli Rhodamine (R18) niiden kalvo, joka perustuu siihen, että R18 osuus 15% kokonaispainosta lipidien sitä. Erytro-magneto-HA-virosomit /R18 liuotettiin lisäämällä 0,1% (lopullinen konsentraatio) Triton X-100 PBS: ssä, ja fluoresenssi R18 (eksitaatio 560 nm: ssä ja emissio 590 nm) mitattiin käyttäen alikvootti liuos spektrofluorometrillä Perkin Elmer 650-40), kalibroidaan R18 standardiliuosten, joka sisälsi 0,1% Triton X-100. Aste R18 itse vaimentaa kunkin erytro-magneto-HA virosomit tutkittiin vertaamalla R18 fluoresenssin ennen ja jälkeen liukeneminen erytro-magneto-HA virosomit jossa oli 0,1% Triton X-100 PBS: ssä. Erytro-magneto-HA virosomit lisättiin HeLa-soluissa. Kineettinen erytro-Magneto-HA virosomit fuusio HeLa-solujen kanssa laskettiin% R18 fluoresenssin dequenching (FDQ) käyttäen 560 ja 590 nm eksitaatio ja emissioaallonpituudet vastaavasti. Kontrollina valmistimme R18-leimatun magneettinen punasolujen ilman rekonstruoitu HA-fuusioproteiinin. Kineettinen fuusio näiden magneettisten punasolujen HeLa-solujen kanssa analysoitiin myös.

HPLC-analyysi 5-atsa-2-dC sisällyttäminen erytro- Magneto-HA virosomit

Kemikaalit ja ratkaisuja.

5-atsa-2-deoksisytidiini (5-atsa-2-dC, desitabiinista) ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Ammoniumasetaatti oli Carlo Erba (Milano, Italia). HPLC grade asetonitriili (MeCN) oli Rathburnilta (Walkerburn, UK).

HPLC-analyysi erytro- Magneto-HA virosomit sisältäviä decitabine.

2 x 10

9 erytro- magneto- HA virosomit inkuboitiin 200 ul: lla hajotuspuskuria vapauttaa sisällytetty 5-atsa-2-dC lääkkeen ja sentrifugoitiin 10000 rpm 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantti otettiin talteen ja käytettiin HPLC-analyysiin tai varastoida -80 ° C pakastimessa analyysiin asti.

Kanta liuoksia decitabine pitoisuutena 114, 228, 456 ja 1140 ng /ml, valmistettiin erikseen vesi liuos tai lyysipuskuria ja varastoitiin -80 ° C: ssa analyysiin asti.

piikin pinta-alojen suhde näytteen /5-atsa-2-dC (desitabiini, vakio) käytettiin kvantitointiin. Toteamisraja (LOD) on määritelty kolme kertaa signaali-kohina-suhde. Pienin määritysrajan (LLOQ) määriteltiin analyytin pienin määrä, joka voitaisiin luotettavasti havaita ja toistettavissa tarkkuudella ≤20% ja tarkkuus 80-120%.

instrumentointi.

HPLC-systeemi, joka koostuu Dionex (Sunnyvale, CA, USA) 3000 Ultimate sarja LC kytketty lineaarinen ioni Trap LTQ-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, USA) massaspektrometrin, joka on varustettu sähkösumutus ionilähteen. Tiedot hankittiin ja niitä käsitellään Excalibur 2.1 -ohjelmisto. Yhdisteet erotettiin Gemini C18 (150 mm-2,0 mm ID), ja 3 um hiukkaskoko (Phenomenex, Torrance, CA, USA) suojattu Phenomenex Gemini C18 (4,0 mm-2,0 mm ID), ja 3 um hiukkaskoko vartija patruuna . HPLC-menetelmä gradienttieluointi; liikkuva faasi liuotin A oli vettä 0,1% muurahaishappoa ja liikkuva faasi B oli asetonitriili 0,1% muurahaishappoa. Ensimmäisen liikkuvan faasin koostumus on 92% liuotinta A ja 8% liuotinta B pidetään 2 min. Vuosina 2 ja 9 min prosenttiosuus liikkuvan faasin B nostettiin 35% ja sitten takaisin parafoimaan liikkuvan faasin koostumusta 0,1 min, jossa on kokonaisaika 14 min. Pylväs asetettiin virtausnopeudella 0,2 ml min-1 ja lämpötila 36 ° C. Näyte 10 ui käytettiin kaikissa LC-MS kokeissa. Massaspektrometriin toimi positiivisessa sähkösumutusmoodilla. Capillar lämpötila oli 275 ° C ja spray jännite 4,5 kV käytettiin.

Kasvaimen HeLa-solut hoitoja

Ihmisen HeLa-soluja hankittiin American Type Culture Collection (Rockville, MD).

soluja ylläpidettiin DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 2 mM L-glutamiinia, on jaettu suhteessa 1:04 kahdesti viikossa.

hoitoja, 3 ml soluja tiheydellä 5 x 10

5 ympättiin 6-kuoppaisille mikrotiitterilevyille. Kaksi koesarjaa rinnakkain sekä CLSM (CLSM) ja FACS-analyysiä. Sillä CLSM-analyysi, pohjassa viljelmän levyt on saatettu lasipeitinlevyille, johon solut antaa kasvaa.

24 tunnin kuluttua elatusaine vaihdettiin kanssa väliaineessa, joka sisälsi 2,5 uM 5-atsa 2-dC yksin tai 1 x 10

9 5-atsa-dC-ladattu erytro-magneto-HA virosomit tai puskuri, jossa erytro-magneto-HA-virosomit suspendoitiin uudelleen (supernatantti, kontrolli-2). 30 minuutin kuluttua, 1, 6, 24, 48 ja 96 tunnin inkuboinnin käsiteltyjen ja käsittelemättömien (kontrolli-1)-solut analysoitiin CLSM ja FACS-analyysillä.

CLSM (CLSM) analyysi fuusion tapahtumia erytro- magneto-HA virosomit kanssa kasvainsolujen

tuumorisoluja kasvatettu dioja läsnäollessa 5-atsa-2-dC-ladattu erytro- magneto-HA virosomit pestiin 1 x PBS-puskurissa ja kiinnitettiin 4 % paraformaldehydillä. Solujen tumat vastavärjättiin DAPI ja asentaa mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää väliaineessa. Fluoresenssi ja kirkkaan kentän kuvat saatiin Leica TCS SP5 käänteismikroskooppi järjestelmä, joissa on viisi laserit emittoivat UV näkyvään (405 Diode, Argon, HeNe 543, HeNe 594 ja HeNe 633). DAPI fluoresenssi havaittiin virityksen 405 nm ja emissio 454 nm, kun taas punaisen fluoresenssin supermagneettinen nanohiukkasten heräte 543 nm ja emissio 613 nm.

sy- tofluorimetrisillä analyysi (FACS-analyysi) B

FACS-analyysi suoritettiin HeLa-soluja käsiteltiin 2,5 uM 5-atsa-dC tai 1X 10

9 5-atsa-2-dC-ladattu erytro-magneto-HA-virosomit ja niitä verrataan käsittelemättömiin (kontrolli -1) jälkeen 24, 48 ja 96 tunnin viljelyn. FACS-analyysi suoritettiin myös HeLa käsitelty puskurilla, jossa erytro- HA-virosomit resuspendoitiin voidaan tarkistaa, ettei yhtiöittämättömien 5-atsa-2-dC lääkettä (kontrolli-2). Käsitellyn ja käsittelemättömän solut kiinnitettiin etyylialkoholia ja tumat värjättiin 10 ug /ml propidiumjodidia ja inkuboitiin 100 ug /ml RNaasi 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Ydinvoima DNA sisältöä, joka syrjii solusyklivaiheista, määritettiin virtaussytometrialla käyttäen Becton-Dickinson FACScan CentroII.

Ethics lausuntoja

Tässä tutkimuksessa emme tarvinneet eettisen hyväksynnän jälkeen työ ei liity ihmisen eikä eläinkokeissa.

Tämä tutkimus tehtiin ilman hyödyntämällä luovuttajien ihmisen vapaaehtoinen materiaalista, ihmisverta saatiin verensiirto laukku verestä pankki, näistä syistä emme tarvinneet tietoisen suostumuksen .

tulokset

käyttäytyminen erytro- magneto-HA virosomit

uusi punasolu-pohjainen lääkkeenantojärjestelmä kuvattu tässä mahdollisesti pystyvät lääkkeidenantotapoja kohdistaa kudoksiin kasvattamaan hyötysuhdetta terapeuttisten yhdisteiden paikalla joka aiheuttaa paremman hoitotuloksen mahdollisimman vähän sivuvaikutuksia. Ihmisen erytrosyyttien eristettiin verestä terveen luovuttajan ja käsiteltiin hypotonisella liuoksella indusoida avaamista kalvon huokosiin ja vapauttaa hemoglobiinin. Yhdistelmä, joka sisältää hemagglutiniinin (HA) viruksen piikki fuusioproteiineja, loisteputki superparamagneet- nanohiukkasten ja terapeuttista yhdistettä lisättiin aikana sulkemista tiiviisti ”haamu” punasolujen. Koska suuri affiniteetti kalvoja, hemagglutiniini sitoutuu sytoplasmaattinen kalvo punasolujen taas magneettisia nanohiukkasia (vihreä fluoresenssi) ja huumeiden tunkeutua huokosiin osaksi ”haamu” punasolujen (Fig. 1).

CLSM ( CLSM) kuvia erytro-magneto-HA virosomit kapselointi 100 nm fluoresenssileimattuja supermagneettinen nanohiukkasten (vihreä) ja 5-atsa-2-dC.

Voit tarkistaa tehokkaasti pyydystäminen 5-atsa-2 -DC (desitabiinista) meidän punasolujen perustuvan lääkeaineen jakelujärjestelmä ja määrällisesti saantoa terapeuttisen yhdisteen kapseloitu, suoritimme HPLC-analyysi (Fig. 2). Nestekromatografia /tandem-massaspektrometrialla kvantitointimenetelmä (QTOF /MS) on käytetty, jotta määrällisesti ja tunnistamiseksi 5-atsa-2-dC-isoformit ja niiden hajoamistuotteet fysiologisissa olosuhteissa pH: n ja lämpötilan, kuten aikaisemmin on kuvattu [26], [ ,,,0],27].

(A) huiput 1,14 ng 5-atsa-dC (vakio). (B) Huiput 5-atsa-dC kapseloidaan 2 x 10

9 erytro- Magneto-HA virosomit. RT: retentioaika; AA: piikin pinta-ala lasketaan. (C) Kalibrointikäyrä 5-atsa-dC. Piikin pinta-ala-arvot standardeja suhteutettava kanssa ng /10 ui 5-atsa-2-dC näyte juoksi. Vakioratkaisut käytettiin 1,14, 2,28, 4,56 ja 11,40 ng 5-atsa-dC (musta rhombuses). Harmaa kolmiot esittävät 5-atsa-dC pitoisuuksia tavataan kaksi erytro- Magneto-HA virosomit käytettyjen näytteiden

in vitro

kokeita.

Kuvassa 2 A ja B huiput sekä 5-atsa-2-dC (vakio) ja 5-atsa-2-dC ladattu 2 x 10

9 erytro-magneto-HA virosomit on esitetty. Näytteet seurattiin positiivinen toiminto, jolloin lajien 1 massayksikköä suurempi kuin neutraali molekyylit. Tiedot visualisoitiin uuttamalla ionin kromatogrammit m /z = 229. standardiliuosta (Fig. 2) kaksi piikkiä, jotka vastaavat sekä yhden ladattu β- (I) ja α-muotojen (II) ja 5-atsa-2 -DC (m /z = 229) ovat läsnä. Näytteessä, toinen huippu näkyy lisäksi 5-atsa-2-dC: β- ja α-muotojen (I ja II). Tämä piikki vastaa guanylurea derivaatta (III) (m /z = 219). Kuten aiemmin on esitetty, uutetaan ioni kromatogrammit m /z = 219 (guanylurea johdannaiset, yhden veloitetaan monomeerisiä) eivät ole ainutlaatuisia tunnisteena guanylurea johdannaiset yhdisteiden kanssa m /z = 229 tuottaa myös fragmentit, joilla on m /z = 219, kun visualisoidaan massaspektrometriana- [28]. β-muotojen (I) ja 5-atsa-2-dC: tullut sammutettua C-6-asemassa, ja rengas-avautuu tuottamiseksi renkaan avoimen formyloitua johdannainen, jonka jälkeen menetys muurahaishappoa, joka sitten tuottaa guanylurea johdannaista (III). Deformyloituu jonkin renkaan avoimen formyloitu johdannaisia ​​osaksi guanylurea johdannaiset (III) johtaa menetykseen H-6 protonin kuten muurahaishappoa. Retentioajat (RT) sekä alueen arvot (AA) kunkin piikin on esitetty kuviossa 2 A ja B

määrän määrittämiseksi 5-atsa-2-dC sisältyvät erythrocyte- pohjainen jakelujärjestelmä, 10 ui kutakin standardia ja näytettä injektoitiin HPLC. Eri pitoisuuksia standardia, ulottuen 0114 ng /ul (0,5 uM) 1,14 ngμl (5 uM) 5-atsa-2-dC, valmistettiin ja piikin pinta-ala kustakin 10 ul: n näyte laskettiin HPLC: llä . Piikin pinta-ala-arvot standardien pantiin suhteessa ng 5-atsa-2-dC ja kalibrointikäyrän suunniteltiin (Fig. 2 C). Kuvio 2 on esitetty alue (AA: 660,834) havaittu HPLC: llä, joka vastaa 1,14 ng (0,5 uM) 5-atsa-2-dC: standardiliuos. Eri näytteitä erytro- Magneto-HA virosomit valmistettiin ja eri määriä 5-atsa-2-dC, ulottuen 0,5 ng /ul (2,5 uM) ja 42 ng /ul (200 uM), lisättiin aikana uudelleensuljettava. Arvioida tehokas määrä 5-atsa-2-dC sulkea punasolujen kummankin valmisteen, 2 x 10

9 erytro-magneto-HA virosomit hajotettiin 200 ul lyysipuskuria. Kokonaismäärä lääkkeen sisällytetty 2 x 10

9 erytro-magneto-HA virosomit oli 3,6 ng tai 360 ng, kun 2,5 uM tai 200 uM 5-atsa-2-dC lisättiin punasolujen aikana sulkemisen , vastaavasti (Fig. 2 C). Siksi tehokkuus sisällyttäminen jokaisesta näytteestä oli noin 1%.

testaamiseksi tehokas sisällyttäminen hemagglutiniini (HA) erytrosyyttien kalvoja ja sen fuusioaktiivisuudeltaan arvioimme kinetiikka fuusio meidän suunniteltu erytro- magneetto -HA virosomit kanssa kohdesolujen. Oktadekyyli Rhodamine (R18) merkinnät käytettiin määrittämään fuusio erytro-magneto-HA virosomit HeLa-solujen kanssa. Fuusio on raportoitu% R18 fluoresenssin dequenching (FDQ) käyttäen 560 ja 590 nm viritys- ja emissioaallonpituudet, vastaavasti. Fuusio erytro- Magneto-HA virosomit HeLa-solujen kanssa jälkeen alkaa hyvin lyhyen ajan (muutama minuutti) ja prosenttiosuus fuusio eksponentiaalisesti kasvaa ajan (Fig. 3). Sen sijaan magneettinen punasolujen ilman hemagglutiniini (HA) eivät näytä fuusioaktiivisuudeltaan HeLa-solujen kanssa. Nämä tulokset osoittavat, että viruksen piikki glykoproteiinin (HA) puhdistettu influenssaviruksen ja liuottaa uudelleen magneettinen punasolujen ajoneuvoissa säilyttää fusogeenistä ominaisuuksien kanssa sytoplasmaattinen kalvot kohdesolujen ja annetaan magneettinen punasolujen kyky fuusioitua kohdesoluihin.

5-atsa-2-dC-ladattu erytro- magneto-HA virosomit leimattiin Octadecyl rodamiini (R18) ja inkuboitiin HeLa-solujen kanssa. Fuusio on raportoitu% R18 fluoresenssin dequenching (FDQ) käyttäen 560 ja 590 nm eksitaatio ja emissioaallonpituudet vastaavasti. RBC: 5-atsa-2-dC-ladattu magneettinen punasolujen ilman rekonstruoitu HA-fuusioproteiinin (Control); RBC-HA: 5-atsa-2-dC-ladattu erytro- Magneto-HA virosomit.

vaikutus desitabiinista ladattu erytro- Magneto-HA virosomit tuumorisoluihin

tarkastaa tehokkuutta ja vaikuttavuutta meidän punasolujen perustuvan lääkeaineen jakelujärjestelmä, käsittelimme HeLa kasvainsolujen joko 5-atsa-2-dC yksin tai kapseloidaan erytro- magneto-HA virosomit. 5 x 10

5 kasvainsoluja käsiteltiin joko 1,800 ng 5-atsa-2-dC (2,5 uM), jonka pitoisuus osoitettu olevan terapeuttinen vaikutus

in vitro

, tai 1 x 10

9 erytro-magneto-HA virosomit, joka sisälsi 10 kertaa vähemmän 5-atsa-2dC (180 ng).

sisäänottoa kohdesoluun ja toimituksen terapeuttisen yhdisteen sytoplasmaan tuumorisolujen on kuviossa. 4. hyvin lyhyessä ajassa (30 minuutista 1 tuntiin) on edelleen mahdollista erottaa suunniteltu erytrosyyttien jotka alkavat sulautua kohdesolujen (Fig. 4 A ja B). 6 tunnin kuluttua suurin osa kohdesolujen osoittavat erytro-magneto-HA virosomeihin sytoplasmassa (Fig. 4 C). Erytro-Magneto-HA virosomien, sisäistänyt sisällä ”isäntä” solu, näyttää virus endosomissa. Kalvo erytro-magneto-HA virosomit alkaa fuusioitua kalvo kohdesolun välillä 12 ja 24 tuntia, jonka jälkeen loisteputki nanohiukkasten ja lääke alkaa diffundoitua sisällä syöpäsoluja. 24 tunnin jälkeen kaikki kasvain solut osoittivat voimakasta fluoresenssia sytoplasmassa ja jotkut ovat tyypillisiä morfologia varhaisen apoptoosin. 96 tunnin useimmat syöpäsolujen osoittavat ominainen mikrotumissa morfologia myöhään apoptoosin (Fig. 4 D).

vasemmanpuoleisessa voidaan mallintaa ajoitus ja vaikutusmekanismi erytro-Magneto-HA virosomit, kapselointi 100 nm fluoresenssileimattuja magneettiset nanopartikkelit (vihreä) ja 5-atsa-2-dC. Oikeanpuoleisessa esitetään CLSM kuvia erytro- Magneto-HA virosomit (vihreä) 30 minuutin jälkeen (A), 1 tunti (B), 6 tuntia (C), 24 ja 96 tuntia (D) inkubaation HeLa-solujen kanssa korostettu DAPI värjäytyminen (sininen). (CTRL) Käsittelemättömät HeLa-solut (kontrolli).

tehoa 5-atsa-2-dC saatettu osaksi erytro-magneto-HA virosomit edistää apoptoosia suhteessa vapaa lääke on esitetty kuviossa 5. HeLa-soluja ole hoidettu (kontrolli) ja käsiteltiin 1800 ng 5-atsa-2-dC tai 1 x 10

9 erytro-magneto-HA virosomit sisälsi 180 ng desitabiinista analysoitiin FACS: lla. Kontrolleina arvioimaan mahdollisia toksisia vaikutuksia ajoneuvon yksin soluja, HeLa-soluja viljeltiin myös läsnä puskuriliuoksessa, jossa 5-atsa-2-dC-ladattu erytro-magneto-HA virosomit suspendoitiin (supernatantti) ja erytro -magneto-HA virosomeihin kapselointi ainoastaan ​​fluoresoiva magneto-nanopartikkeleita.

Ctrl (valvonta) käsittelemättömät solut; Atsa: solut käsiteltiin 1800 ng (2,5 uM) 5-atsa-2-dC; Erytro Aza: solut käsiteltiin erytro- Magneto-HA virosomit sisältävän 180 ng 5-atsa-2-dC; Erytro: puretaan 5-atsa-2-dC erytro- Magneto-HA virosomit; Supernatantti: solut käsiteltiin puskurilla, jossa erytro-magneto-HA virosomit suspendoitiin uudelleen (kontrolli 2).

96 tunnin kuluttua oli vain 12,6% käsiteltyjen solujen 1800 ng vapaata 5-atsa 2-dC näkyvät apoptoottista verrattuna 96%: ssa soluista, kun soluja käsitellään 180 ng in erytro- magneto-HA virosomit. Lisäksi 24 tunnin kohdalla merkittävä apoptoosia havaita lääkeaineen antojärjestelmä, kun taas käytännöllisesti katsoen mitään vaikutusta havaittu lääkkeellä yksin. Nämä havainnot viittaavat siihen, että erytro-magneto-HA virosomit jakelujärjestelmä lisää anti-neoplastisia vaikutus 5-atsa-2-dC läpi parantamiseksi lääkkeen hyötyosuutta. Kumpikaan supernatantti, jossa 5-atsa-2-dC-ladattu erytro-magneto-HA virosomit on keskeytetty, eikä erytro-magneto-HA virosomit joka sisältää vain fluoresoivia nanohiukkasten vaikutus solujen proliferaatioon, mikä osoittaa, että erytrosyyttien perustuva lääkeaineen järjestelmä itsessään ei ole myrkyllinen vaikutus soluihin. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että tämä uusi punasolujen perustuva lääkeaineen järjestelmä voi lisätä tehokkuutta ja vaikuttavuutta terapeuttisten yhdisteiden.

Keskustelu

solunsalpaajahoidosta tai sädehoitoa syövän rajoittaa vakava, joskus hengenvaarallisia, sivuvaikutuksia johtuen spesifisyyden puutteen kohdesoluihin yksin. Yksi strategia parantaa spesifisyys on kapseloida terapeuttisia osaksi lääkeannostelun järjestelmä, joka kykenee ohjaamaan terapeuttisten yhdisteiden kohdepaikkaan.

Carrier punasolujen on arvioitu niiden käyttöä lääkeaineen ihmisillä osoittavat, että he turvallisuutta ja tehoa [ ,,,0],29]. Punasolu perustuva jakelu uusia ja perinteisiä lääkkeitä on siis kasvavia etuja lääkeannostelun ja huolehtia monimutkaisista sairauksista, varsinkin kun haittavaikutukset voivat tulla vakavia ongelmia [13], [19], [30]. Äskettäin punasolujen on käytetty kapselointiin antibiootti amikasiini, ja jatkuva vapautuminen ladattu punasolujen yli 48 tunnin ajan osoitettiin, mikä viittaa mahdolliseen käyttöön punasolujen hitaana systeeminen vapauttava järjestelmä antibiootteja. Anto amikacin mukaan ladattu punasolujen rotilla johtaa merkittäviin muutoksiin farmakokineettistä käyttäytymistä antibiootin [31], [32]. Punasolujen perustuva lääkeaineen jakelujärjestelmä on useita etuja: se on erityisen tehokas vapauttaa huumeiden verenkierrossa pitkään (viikkoja), punasolujen on suuri ansastusta kapasiteetti, helposti käsiteltävä ja on kyky mukautua perinteisiä ja biopreparaatit [ ,,,0],18], [30]. Erytrosyytit ladattu ferromagneettisia kolloidin yhdiste voidaan magneettisesti ajaa kohde-elimen /kudoksen avulla, ulkoisen magneettikentän [21] – [23], [33] Lopuksi, käytettävissä on laite, joka sallii kapselointi lääkeaineita autologisiin erytrosyytteihin tekee tämän teknologian saatavilla monissa kliinisissä ja kilpailukykyinen suhteessa muihin lääkeainekuljetussysteemeihin [34].

tässä työssä osoitamme uuden punasolujen perustuvan lääkeaineen jakelujärjestelmä, erytro-magneto-HA virosomien