Krooninen sairaus

tiivistelmä

Long välissä elementti-1 (L1) on siirrettävissä elementti, joka voi liikkua genomin, joka mahdollisesti johtaa genomiin monimuotoisuutta ja modifioitu geeni toiminto. Vaikka L1 aktiivisuus somaattisten solujen on normaalisti oireettomana läpi DNA: n metylaatio, jotkut L1s aktivoidaan kasvaimissa mukaan lukien peräsuolen syöpä. Kuitenkin miten L1-retrotranspositiossa (L1-RTP) on mukana maha-suolikanavan sairauksia vielä selvittämättä. Oletimme, että L1-RTP somaattisten solujen saattavat osaltaan koliitti-liittyvän syövän (CAC). Tilanteen korjaamiseksi, käytimme kokeellista mallia CAC käyttäen siirtogeenisiä L1-reportteri hiiret kuljettaa ihmisen L1-EGFP reportterigeeni. Hiiret altistettiin toistuvien koliitin aiheutetaan antamalla dekstraaninatriumsulfaatti (DSS) juomaveden kanssa injektion karsinogeeni azoxymethane (AOM). L1-RTP tasot mitattiin kvantitatiivisen polymeraasiketjureaktio kohdistaminen viety uusi toimittaja EGFP erilaisissa kudoksissa ja solutyypeissä, mukaan lukien näytteet saadaan laser mikrodissektion ja solujen lajittelun kanssa virtaussytometrialla. DNA metylaatiotasoilla ihmisen L1 promoottori analysoitiin bisulfiitti pyrosekvensointi. AOM + DSS-hoidetut hiiret osoittivat merkittävästi korkeampi L1-RTP kokonaan paksusuolikudos aikana akuutissa vaiheessa koliitin verrokkiin verrattuna naiiveja hiiriä. L1-RTP tasoilla koko paksusuolen kudoksessa korreloi positiivisesti histologisen vakavuuden koliitti ja aste neutrofiilien tunkeutumista lamina propria (LP), mutta ei kasvaimen kehitystä paksusuolessa. L1-RTP rikastui LP mesenkyymisolujen sijaan epiteelisolujen (EC), myelooisen tai lymfoidisolujen. DNA metylaatiotasoilla ihmisen L1 promoottorialueen osoittivat negatiivista korrelaatiota L1-RTP tasolle. L1-RTP oli poissa eniten kasvaimia löytyy 22 viikon ikäisiä hiiriä. Lopuksi olemme osoittaneet, että L1-RTP indusoitiin hiiren CAC limakalvon mukaisesti akuuttia tulehduksellista vastetta; kuitenkaan retrotranspositiossa ei näytä olevan suoraa merkitystä paksusuolen tulehdus aiheuttama syöpä aloittamista.

Citation: Otsubo T, Okamura T, giwara T, Ishizaka Y, Dohi T, Kawamura YI (2015) retrotranspositiossa Long välissä Nucleotide Element -1 liittyy Colitis mutta ei kasvaimia Hiiren Colitic Cancer malli. PLoS ONE 10 (2): e0116072. doi: 10,1371 /journal.pone.0116072

Academic Editor: Emiko Mizoguchi, Massachusetts General Hospital, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 30 syyskuu 2014; Hyväksytty: 05 joulukuu 2014; Julkaistu: 24 helmikuu 2015

Copyright: © 2015 Otsubo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tämä tutkimus oli osittain tuettu avustuksia ohjelmista Grants-in-Aid nuorten tutkijoiden; Apurahat-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (C); Apurahat-in-tuki tieteellisen tutkimuksen painopistealueisiin alkaen opetusministeriön, Cultures, liikunnan, tieteen ja teknologian; Kansainvälinen yhteistyö Research Apurahat terveysministeriön työ ja hyvinvointi; ja National Center for Global Health and Medicine (21-110, 22-205, 21-129, 23-101, 25-104, 26-110); ja Grant-in-tuki Research terveysministeriön, työ- ja hyvinvointi Japanin (09156296).

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Long välissä elementti -1 (L1) on siirrettävissä elementti, joka voi liikkua genomin aiheuttavan geenin deleetioiden, inversioiden, ja lisäykset, mikä saattaa johtaa genomiin monimuotoisuutta sekä muuttamalla geenien toiminnan [1,2] . L1 on läsnä kaikilla nisäkkäillä mukaan lukien ihmiset ja käsittää noin 17% ihmisen genomin [3,4]. Vaikka L1 aktiivisuus on normaalisti oireettomana somaattisten solujen kautta epigeneettiset mekanismit, kuten DNA: n metylaatio, jotkut L1s aktivoituvat ympäristötekijät kuten syöpää ja tulehdusta edistäviä yhdisteitä [5-8]. Tärkeää on, L1 insertiot havaittiin useita erilaisia ​​ihmisen syövissä, mukaan lukien paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [9-11]. Hypometylaatio CpG saaria L1 5′-UTR on ilmoitettu paitsi syöpiä, mutta myös ihmisen tulehdussairauksien [12,13] mikä viittaa mahdollinen rooli L1 täytäntöönpanolle tulehdustiloja. Tämä mahdollisuus on erityisen tärkeää ruoansulatuskanavan karsinogeneesissä, koska krooninen tulehdus on yksi tärkeimmistä riskitekijöistä maha-suolikanavan pahanlaatuisten kasvainten [14,15]. Kuitenkin miten L1-retrotranspositiossa (L1-RTP) on mukana maha tulehdusta ja maligniteetin vielä selvittämättä. Oletamme, että L1-RTP somaattisten solujen saattavat osaltaan koliitti-liittyvän syövän (CAC). Käsitellä tätä mahdollisuutta, käytimme kokeellista mallia CAC käyttäen karsinogeeniksi azoxymethane (AOM) yhdessä paksusuolentulehduksen indusoinnin mukaan dekstraanisulfaatin natriumia (DSS) juomaveden kanssa siirtogeenisen hiiren L1 toimittaja järjestelmään. Mekanismia CAC malli on tutkittu laajasti käyttäen erilaisia ​​geenin-manipuloitu hiirillä. Esimerkiksi TNF-reseptori 1 (TNFR1) vajausta hiiret osoittivat vähentynyt kasvainten määrä, jotka olivat riippuvaisia ​​puutos TNFR1 niiden hematopoieettisten solujen [16]. Koska alavirran signaalin TNFR1, tumatranskriptiotekijä kappa B (NF-kB) on raportoitu olevan kriittisiä tulehdukseen liittyvä kehittäminen colitic syövän [17]. IL-6 myös edistää kasvaimen kasvua, mahdollisesti aktivoimalla Janus-aktivoitua kinaasi (JAK) ja signaali anturin ja aktivaattori transkription (STAT) 3 väyliä [18-20].

Tässä tutkimuksessa, löysimme että L1-RTP oli positiivisessa yhteydessä vakavuus koliitti. Aktivointi L1 korreloi hypometylaatio CpG saaria L1 5′-UTR. Kuitenkin L1-RTP ei lisääntynyt kasvaimissa tässä mallissa viittaa siihen, että L1-RTP ei merkittävästi osallisena kasvaimen aloittamista tässä CAC mallissa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki kokeet käyttäen hiiret suoritettiin Institutional suuntaviivat hoito ja käyttö Laboratory Animals in Research hyväksyntää Animal Care ja käyttö komitealle Research Institute, National Center for Global Health and Medicine (hyväksyntänumero 14039). Eläimet lopetettiin ketamiini ja ksylatsiini ja joka pyrittiin minimoida kärsimyksen.

Hiiret ja CAC malli

Rivi siirtogeenisiä hiiriä kätkeminen ihmisen L1-EGFP reportterigeeni (

HL1-EGFP

), nimeltään Linja 4, kehitettiin tiloissamme [5] ja käytettiin kaikissa kokeissa. Hiiriä pidettiin spesifisissä patogeenivapaissa olosuhteissa kokeiden aikana. CAC malli protokollat ​​on esitetty kuvassa. 1A. Viikoittain vatsakalvon injektion azoxymethane (AOM, 10 mg /kg, Sigma-Aldrich Japani) aloitettiin 6 viikon iässä ja toistettiin neljä kertaa. Hiiret ravinnotta 12 tuntia ennen AOM injektiota voimistaa syövän kanssa AOM [21]. Hiiret koeryhmän annettiin 3,5% (W /V) dekstraanisulfaattia natriumia (DSS, Sigma-Aldrich Japani) juomaveteen varten 5 päivää 7 viikon iässä, ja tämä käsittely toistettiin neljä kertaa kuukausittain. 22 viikon iässä (kasvain vaihe), paksusuolen kudokset saatiin. Silmin havaittavat kasvaimet leikattiin limakalvon ja analysoidaan erikseen taustasta limakalvolla. Joissakin kokeissa paksusuolen kudokset saatiin 8 viikon ikäisiä hiiriä seuraavat kaksi injektiota AOM ja seitsemän päivän kuluttua lopettamisen DSS hoidon (akuutti vaihe).

(A) Kaavamainen aikataulu AOM + DSS koliitti hiirimallissa. Nuolet osoittavat ajankohtina liittyvä akuutti tulehduksellinen ja kasvaimen vaiheita korjuu paksusuolen kudokset ja /tai kasvaimia. (B) L1-RTP tasot analysoitiin genomista DNA: ta koko distaalisesta paksusuolen kudokset ja /tai kasvaimia. EGFP copy /genomin laskettiin käyttämällä ß-aktiini sisäisenä kontrollina. Näytteet merkitty ”Akuutti AOM + DSS” saatiin aikana akuutin vaiheen paneeli A, ja toiset kerättiin aikana kasvain vaiheessa. AOM + DSS ilmaisee jäljellä paksusuolikudos poistamisen jälkeen näkyvä kasvaimia. Tietoja on esitetty keskiarvona ± SD. P-arvot laskettiin pariton kaksisuuntaisia ​​t-testillä.

kvantifiointi L1-RTP

PCR-määritys genomi-DNA: ta valmistettiin kudoksia ja soluja käyttäen DNA- poistojärjestelmä (QuickGene, Fujifilm, Tokio, Japani). Menetelmä havaitsemiseksi taajuuden L1-RTP: lle PCR-kohdistus retrotranspositioned EGFP kuvattu aiemmin [22]. Analyysiä kasvaimia, yksi satunnaisesti valittu kasvaimen kunkin hiiren suoritettiin DNA: n eristämistä ja L1-RTP analyysi.

Histologinen analyysi ja laser mikrodissektion

Koko paksusuolen kudosten akuutin tulehduksellinen vaihe oli rullalle ja pikajäädytettiin nestemäisessä typessä. Jäädytetyt osat kiinnitettiin kylmällä asetonilla ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla histologista analyysiä. Histologinen pistemäärät asteen crypt menetyksen ja infiltraatiota oli sokeasti kullekin paksusuolen. Crypt tappio arvioitiin suhteellinen lasku epiteelisolujen alueella verrattuna naiivi paksusuolen käyttäen otettu kuva analysoitiin kuva J ohjelmisto (NIH, Bethesda, MD, USA): 0-ei muutosta tai alle 10% laskua naiiveja paksusuolen , 10/01/30% epiteelisolujen menetettiin, 30/02/50%, 3-50-70%, 4-70-90%, 5-yli 90%. Solutunkeutumisen Pisteet: 0-ei muutosta naiiveja paksusuoli, 1 polttovälin tunkeutumisen rajoitu limakalvo, 2-polttoväli tunkeutuminen sekä limakalvon limakalvon alaista kerrosta, 3-hajanainen limakalvon ja limakalvon alaista tunkeutuminen. Pisteet kullekin hiirelle määritettiin summana crypt pisteet ja infiltraatiota pisteet. Neutrofiilikeräytymän määritettiin ydin- morfologia. Joissakin kokeissa genomista DNA: ta saatiin jääleikkeille käyttäen laser mikrodissektion järjestelmä (LMD 7000, Leica, Wetzlar, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

Soluerotus

epiteelisolut (EC ) eristettiin paksusuolen ja käsiteltiin 10 mM EDTA: Hankin tasapainotettuun suolaliuokseen (HBSS, Sigma Aldrich). Lamina propria (LP) soluja (LPC) eristettiin käyttäen Gentle MACS Dissociator (Milteny Biotech, Köln, Saksa) kanssa lamina Propria dissosiaatio Kit hiiri (Milteny Biotech). LPC värjättiin fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) -, R-fykoerytriini (PE) -, tai allofykosyaniini (APC) -leimattua anti-CD3, anti-CD11, anti-CD11 c, anti-B220, anti-Gr-1, tai anti -EpCAM vasta-aineita (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), ja 7-aminoactinomycin D tunnistaa elävät solut ja solut lajitellaan virtaussytometrillä (MoFlo, Beckman Coulter, Tokio, Japani). Solutyyppi lajittelu suoritettiin seuraavien pintamerkkiaineita: T-solut, EpCAM

-CD3

+ CD11b

-CD11c

-; B-solut mukaan lukien B220-plasmaproteiineihin soluja, EpCAM

-B220

+ CD11b

-CD11c

-; dendriittisolujen /makrofagien, seos EpCAM

-CD3

-CD11b

+ soluja, EpCAM

-CD3

-CD11c

+ soluja, ja EpCAM

-CD3

-F4 /80

+ soluja; granulosyytit, EpCAM

-Gr-1

korkea soluja; non-epiteelin ei-hematopoieettisten solujen, EpCAM

-CD3

-B220

-CD11b

-CD11c

-F4 /80

-Gr-1

– soluja.

DNA metylaatiomääritystä

arvioimiseksi metylaatiostatuksen L1, bisulfiitti-pyrosekvensointi suoritettiin PyroMark Q24 pyrosekvensointi kone (QIAGEN, Hilden, Saksa) käyttäen pyro LINE kit (PyroMark Q24 CpG LINE- 1 4 x 24, Cat. no.970042, QIAGEN).

tilastollinen

tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Prism 6 tilasto-ohjelmaa (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, USA) menetelmien osoitettu kuviossa legendoja. Analyysejä varten ero pariasetuksen yksi- tai kaksisuuntainen Studentin t testejä käytettiin. Korrelaatiot testattiin kaksisuuntaisella Pearson laskelmat. Arvot P 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset ja keskustelu

L1-RTP pinta nousi akuutissa vaiheessa koliitin

Kokeelliset protokolla CAC malli on esitetty kuvassa. 1A. Siirtogeenisiä hiiriä kätkeminen ihmisen L1-EGFP reportterigeenin (

HL1-EGFP

) [5], käytettiin kaikissa kokeissa. Tässä mallissa olemme onnistuneesti saatu koolontuumoreissa 22 viikon ikäisiä hiiriä neljän injektioita AOM ja neljä sykliä DSS koliitti. Kolme kaksikymmentäneljä kasvainten havaittiin kussakin paksusuolessa (keskiarvo = 11,5, 11 hiirtä). Käsittelemätön (naiivi) tai hiiret, joita käsiteltiin vain AOM tai DSS ei kehittynyt koolontuumoreissa. Tutkia induktio L1-RTP, ensin saadaan koko paksusuolen kudoksen kunkin ryhmän hiiret aikana kasvaimen vaiheen (22 viikon ikäisiä), tai akuutin vaiheen aikana, kun ensimmäinen annon DSS (8 viikon ikäisiä). Alussa yritettiin havaita soluista, jotka ilmentävät EGFP histologisesti tai virtaussytometrialla; kuitenkin, EGFP ilme ei ollut näkyvissä, luultavasti koska alhainen esiintyvyys L1-RTP. Siksi me määrällisesti taajuus L1-RTP kanssa PCR kohdistus retrotranspositioned EGFP kuten aiemmin on kuvattu [22]. Tuloksena havaittiin, että L1-RTP lisääntyi merkitsevästi akuutin vaiheen aikana on AOM + DSS koliitti ryhmä, mutta ei kasvaimia tai taustalla limakalvon kasvainta kantavien kaksoispisteitä (Fig. 1 B). Induktio L1-RTP ei havaittu hiirillä, joille vain välikorvatulehduksen tai DSS. Nämä tulokset osoittavat, että induktio L1-RTP liittyy akuutti koliitti, mutta ei yllä, kunnes kasvain vaihe, eikä suoraan mukana kasvainten synnyssä tässä koliitti liittyvien kasvainmuoto.

L1-RTP tasot korreloivat koliitti vakavuus mutta ei kasvaimen numeroita

Vaikka L1-RTP oli merkittävästi indusoi akuutin vaiheen CAC mallin tasot induktion osoitti huomattavaa yksilöllisiä eroja (Fig. 1 B). Siksi me tutki vielä suhdetta L1-RTP vaikeusasteen kanssa koliitti. Huomasimme, että histologiset tulokset, koostuu crypt menetyksen ja infiltraatiota, positiivisesti korreloi taajuuden L1-RTP (Fig. 2A). Koska havaitsimme, että histologisesti vaikea tulehdus on tunnusomaista massiivinen infiltraatio granulosyyttien monenlaisia ​​epiteelisolujen menetystä (Fig. 2B), näytteet luokiteltiin läsnäolo tai puuttuminen granulosyyttien tunkeutumisen. Suuntaus kohti korkeampia L1-RTP havaittiin kudoksissa granulosyyttikasvutekijällä tunkeutumisen kuin ilman granulosyytit (Fig. 2C). Vaikka merkittävä L1-RTP ei havaittu kasvaimia, ajattelimme mahdollista, että kasvaimia ehkä kasvanut kloonilaajenemisen L1-RTP negatiivisia soluja, mutta esiintyminen L1-RTP paksusuolen taustalla limakalvon saattanut mahdollistaneet kasvaimia. Siksi tutkimme suhdetta kasvain numeroiden ja taajuus L1-RTP taustalla limakalvolla; kuitenkin, ei ollut merkittävää korrelaatiota näiden kahden tekijän (Fig. 2D). Nämä tulokset esittävät, että L1-RTP indusoituu aikana akuutti koliitti vakavuuden mukaan tulehduksen; kuitenkin, L1 paksusuolessa ei ole voimassa aktivoidussa tilassa akuutin tulehduksen kehittymistä paksusuolen kasvainten toistuvan jaksoja koliitti. Siten L1-RTP ei näytä suoraan mukana paksusuolen kasvain aloittamista.

(EN) koliitti histologinen pistemäärä ja L1-RTP tasot koko distaalisessa paksusuolessa akuutin vaiheen aikana hiiret osoittivat positiivista korrelaatiota. (B) Tyypillinen histologinen kuvia koliitin neutrofiilikeräytymän (vasemmalla) ja ilman neutrofiilikeräytymän (oikealla) on esitetty. Palkki edustaa 100 um. (C) L1-RTP tasot verrattiin välillä paksusuolikudos ilman /neutrofiilien tunkeutumista paksusuolen lamina propriasta akuutin ja kasvaimen vaiheissa. Tietoja on esitetty keskiarvona ± SD. P-arvo laskettiin parittomalla yksisuuntaista t-testillä. (D) L1-RTP taso taustan paksusuolen limakalvolla ja näkyvä kasvain numerot eivät korreloi.

L1-RTP rikastui paksusuolen LP jae akuutissa vaiheessa koliitin

Seuraavaksi halusimme tunnistaa solutyypit, joissa L1-RTP tapahtui paksusuolessa. Olemme erotettiin epiteeli- ja ei-epiteelisoluihin mikrodissektion limakalvokerrokseen paksusuolen aikana saatujen akuutin vaiheen tulehdusta. EC irrotettiin, ja sitten jäljellä oleva limakalvo leikeltiin ja suoritettiin DNA: n uuttaminen (Fig. 3A). Yllättäen, L1-RTP rikastettu ei-epiteelisolujen osa LP (Fig. 3B). Siksi seuraavan kerran yritetty tunnistaa solutyyppejä L1-RTP eristämällä LPC kanssa Kollagenaasikäsittelyn ja solujen lajittelua käyttämällä virtaussytometria. Tämän seurauksena L1-RTP ei havaittu CD3

+ T-solut, B220

+ B-solujen /plasma solujen CD11

+ /CD11 c

+ /F4-80

+ makrofagi /dendriittisolut tai Gr1

+ granulosyytit (Fig. 3C). L1-RTP oli korkea solussa jae, joka oli negatiivinen näille pintamerkkiaineita. Näiden tulosten perusteella, mesenkymaaliset tyypin solujen (MES) ovat todennäköisimmin vastuussa lisääntyneestä L1-RTP aikana akuutin vaiheen koliitti. Toisaalta, taajuus L1-RTP muissa solutyypeissä pysyi alhaisella tasolla. Lisäksi yksityiskohtainen analyysi tunnistaa solutyypit asiakkuutta L1-RTP vielä tutkittava.

(A) edustaja valokuva osio jälkeen mikrodissektion epiteelisolujen (EY, ylhäällä), lamina propria (LP, alhaalla) ja loput kudokset (mukaan lukien submukoosassa ja lihasten kerros) paksusuolen § laserilla mikrodissektion. (B) L1-RTP tasot analysoitiin paksusuolen hankittua, LP, ja submukoosassa plus lihaksen kerros (SM) eristettiin mikrodissektion hiiristä akuutissa koliitti vaiheessa. Suhteellinen L1-RTP arvo normalisoitiin käyttämällä ß-aktiini sisäisenä kontrollina. Kukin kuvaaja osoittaa yksittäisen hiiren. P-arvot laskettiin parittomalla yksisuuntaista t-testillä. (C) L1-RTP tasot tutkittiin eristetyissä hankittua tai lajitella EpCAM negatiivinen-aidatulla kuin EY-jakeet virtaussytometrialla hiiristä akuutin koliitin vaiheessa seuraavasti: T-solut (EpCAM

-CD3

+) , B-solut (EpCAM

-B220

+), makrofagi /dendriittisolut (MO: ssä /DC, EpCAM

-CD11b

+ /CD11 c

+ /F4 /80

+) , Neutrofiilit (EpCAM

-Gr

-1

+) ja muut solutyypit, todennäköisimmin mesenkyymisolujen (MES, EpCAM

-CD3

-B220

-CD11b

-CD11c

-F4 /80

-Gr-1

-). Tasot L1-RTP yhteenkerätystä solufraktiois- saadut neljä hiirtä on esitetty.

DNA: n metylaatio tasot Tg-L1 promoottorin korreloi käänteisesti L1-RTP tasot

Koska DNA metylaatio L1 promoottorin tiedetään estävän retrotranspositioon, olemme tutkineet DNA: n metylaation tasot ihmisen L1 promoottori siirtogeenisiä hiiriä. Valitsimme eri paksusuolen näytteitä naiiveja hiiriä ja hiiret, joilla oli akuutti koliitti plus AOM, poikkeava krypta pesäkkeitä aiheuttama neljä injektiota AOM, EC, ja LPC yhdessä 2-Amino-1-metyyli-6-fenyyli-imidatso [4,5-b ] pyridiini (PhIP) hoidettujen hiirissä (positiivinen kontrolli ihmisen L1-RTP toimittaja [8]), ja mitataan DNA: n metylaatio tasoilla CpG-saarekkeen liittyvät ihmisen L1 käyttäen bisulfiitin pyrosekvensointi n 5’UTR-alueen siirtogeenin. Kuten odotettua, DNA: n metylaatio pinnat olivat korkeat ( 80%) kaikissa näytteissä. Kuitenkin tilastollisesti merkitsevä negatiivinen korrelaatio ei havaittu DNA metylaatiotasoilla ja L1-RTP (Fig. 4) näissä näytteissä. Yllättäen metylaatiotasoilla naiivien L1-RTP hiiret eivät olleet korkeimmat näistä näytteistä, mikä viittaa monipuolinen tasoja DNA metylaatio HL1 promoottorin yksittäisissä naiivi hiirillä.

DNA metylaatiotasoilla Siirtogeenisten ihmisen L1 promoottori analysoitiin bisulfiitti- pyrosekvensointi kanssa alukkeiden kohdistettu vain ihmisen L1 promoottorisekvenssin. Korrelaation ihmisen L1 promoottorin DNA: n metylaation ja L1-RTP tasot analysoitiin käyttämällä koko distaalisen paksusuolen kudoksiin AOM + akuutti DSS koliitti (no label), eristetty paksusuolen EC (EY) tai LP (LP) fraktioista AOM + DSS koliitti, poikkeava crypt foci (ACF) aiheuttama AOM, koko paksusuolen naiivista hiiri, tai 2-amino-1-metyyli-6-fenyyli-imidatso [4,5-b] pyridiini (PhIP) hoidettujen hiirissä (positiivinen kontrolli ihmisen L1-RTP toimittaja [8]). P-arvo määritettiin kaksisuuntaisella Pearsonin laskelma.

Tämä on ensimmäinen raportti, jossa L1-RTP suoraan osoitettiin

in vivo

, antamisen indusoima karsinogeeniksi induktion paksusuolentulehduksen. Tässä tutkimuksessa CAC, me osoitamme, että L1-RTP ei indusoidu epiteelisoluissa tai hematopoieettisia soluja, mutta todennäköisesti on mesenkymaalisten solutyypissä. Lisäksi olemme onnistuneesti mitattuna DNA metylaatiotasoilla ihmisen L1 promoottori tässä hiirimallissa, ja löysi negatiivinen korrelaatio L1-RTP ja DNA: n metylaatio sen promoottorin. Tämä tulos tukee käsitystä, että hypometylaatio L1 liittyy L1-aktivoinnin. Toisaalta, emme löytäneet L1-RTP paksusuolen kasvaimia tai niiden taustalla limakalvon tässä hiiren paksusuolensyöpä malli, vaikka korrelaatio välille on luotu L1-RTP ja syöpää ihmisille kuvatulla äskettäisessä katsauksessa [23]. Sen sijaan, L1-RTP liittyi akuutin tulehduksen. Positiivinen korrelaatio L1-RTP tasolle histologista tulokset ja aste solutunkeutumisen ehdottaa mahdollisen panoksen L1-RTP vakavuuden akuutin koliitin. Tässä mielessä L1-RTP voi olla mukana mekanismi pahenemista tulehdus. Meidän ensimmäinen spekulointia oli, että taajuus L1-RTP kasvaisi aikana tulehdukseen liittyvä kasvainten kehittymiseen. Kuitenkin meidän kaiken kaikkiaan tulokset osoittavat, että L1-RTP on rajallinen suora vaikutus kasvaimien syntyyn. Mahdollisia syitä tähän odottamattomaan tulokseen ovat seuraavat. Ensiksi, meidän

in vivo

järjestelmä ei tunnista hiiren endogeenisen L1-RTP, vaikka havaitseminen RTP ihmisen L1 siirtogeeni oli selvä. Tasot ihmisen L1-RTP paksusuolessa oli yleensä alhainen, ja tämä herkkyys ei saa täsmälleen edustaa endogeeniset retrotranspositiossa hiirillä, jotka voivat vaikuttaa taajuus CAC. Kuitenkin se, että havaitsimme kasvoi L1-RTP akuuteissa koliitin mutta ei kasvaimissa osoittaa, että vaikutus L1-RTP tumorigeneesin on ainakin välillinen. Toiseksi edellinen tutkimus kertoo, että L1 retrotranspositioon oli läsnä esineoplastiset maksassa, mutta ei myöhemmin maksan adenokarsinoomaa [24]. Kirjoittajat väitti, että syövän etenemistä ehkä valinnut menetys kromosomissa, joka sisältää aktiivisen L1. Mikäli CAC, esiintyminen kromosomi menetyksen kasvaimissa voi vähentää taajuus L1-RTP kasvaimissa. Lopuksi tässä hiirimallissa järjestelmä, kasvaimen laajennus rajoittuu limakalvon kerros paksusuolen, ja kasvaimet eivät jatka vaiheissa kuten ihmisen syövissä, jotka osoittavat pahanlaatuinen ominaisuudet ja metastaasit. Siksi tämä ei voi olla sopiva malli tutkinta pitkälle pahanlaatuisten syöpien. Täten tuloksemme osoittavat, että vaikutus L1-RTP aloittamisesta paksusuolen syöpä on rajoitettu tässä CAC mallia; kuitenkin mahdollista roolit L1-RTP kasvainprogression ja etäpesäkkeiden pysyvät määrittelemätön. On arvioitava mahdollisuudet osallistumista L1-RTP pitkälle syöpä vaatisi perustamisesta erimallisia edennyt syöpä kuten pahanlaatuinen kasvain solulinjoissa indusoimalla mutaatioita onkogeenien tai anti-onkogeenien näissä siirtogeenisiä hiiriä.

Äskettäin rooli mesenkymaalisten stroomasolujen eri tulehdustiloja mukaan lukien koliittia on ilmoitettu. Korjaava ja anti-inflammatorisia ominaisuuksia mesenkymaalisten stroomasolujen on testattu erilaisissa eläinmalleissa ja on sovellettu tiettyyn kliinisissä [25]. Erityisesti in AOM + DSS aiheuttama koliitti malli, luuytimestä peräisin mesenkyymikantasoluista osoitettiin olevan anti-syöpää aiheuttavia ominaisuuksia kautta transformoiva kasvutekijä-ß signalointi [26]. Nämä tulokset viittaavat siihen mahdollisuuteen, että L1-RTP, jonka löysimme mesenkyymisolujen, voivat häiritä tulehdusta solujen toimintaa. Lisätutkimuksia mesenkyymisolujen kohdesoluna tyyppinen retrotranspositioon on mielenkiintoista ja saattaa selvittää niiden mahdollinen rooli vaikuttaa koliitti vakavuuteen varhaisessa vaiheessa CAC.

Kiitokset

PL1-EGFP (pEF -06R) rakentaa valmistamiseksi hiiret toimitti ystävällisesti Dr. Eline Tjetske Luning Prak, Clinical Immunology laboratoriossa sairaalan University of Pennsylvania.