Krooninen sairaus

tiivistelmä

Luonnontuotteet ovat on laajasti tutkittu niiden mahdollisia estämiseksi sekä syövän hoitoon johtuen niiden kyvystä kohdistaa useisiin molekyyli reittejä.

temppeliviikuna

on osoitettu aiheuttavan erilaisia ​​biologisia aktiviteetteja, kuten apoptoosin rintasyövän solulinjoissa. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme raportoivat anti-neoplastisia potentiaali vesiuutteen

F. religiosa

(FR

aq) kuori ihmisen kohdunkaulansyövän solulinjoissa, SiHa ja HeLa. FR

aq muuttaa kasvun kinetiikka SiHa (HPV-16 positiivinen) ja HeLa (HPV-18 positiivinen) soluja annoksesta riippuvaisella tavalla. Se estää solusyklin etenemisen G

1 /S-vaiheeseen SiHa-, joka on tunnettu siitä, että lisääntyminen p53, p21 ja pRb proteiinit, joiden samanaikainen väheneminen ilmentymisen fosfo Rb (ppRB) proteiinia. Toisaalta, HeLa, FR

aq aiheuttaman apoptoosin lisäämällä solunsisäisen Ca

2+ mikä johtaa mitokondrion kalvon potentiaalin vapautumista sytokromi-c ja ekspression lisääntymisen kaspaasin 3. Lisäksi FR

aq vähensi muuttoliikettä sekä hyökkäys kyky sekä kohdunkaulan syövän solulinjoissa mukana downregulation MMP-2 ja Her-2: n ilmentymisen. Mielenkiintoista, FR

aq vähensi ilmentymistä viruksen onkoproteiineja E6 ja E7 sekä kohdunkaulan syövän solulinjoissa. Kaikki nämä tiedot viittaavat siihen, että

F. religiosa

voitaisiin tutkia sen chemopreventive potentiaali kohdunkaulan syöpää.

Citation: Choudhari AS, Suryavanshi SA, Kaul-Ghanekar R (2013) vesiuute

temppeliviikuna

indusoi Cell Cycle pidätys Human Kohdunkaulan syöpä Cell Lines SiHa (HPV-16 positiivinen) ja apoptoosi HeLa (HPV-18 positiivinen). PLoS ONE 8 (7): e70127. doi: 10,1371 /journal.pone.0070127

Editor: Chunhong Yan, Albany Medical College, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 helmikuu 2013; Hyväksytty: 14 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 26 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Choudhari et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat kiitos IRSHA, Bharati Vidyapeeth University ja CSIR tukemisesta tätä työtä. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kohdunkaulan syöpä on toiseksi suurin syy syövän kuolemaan naisten kaikkialla maailmassa [1], [2]. Korkean riskin ihmisen papilloomavirus virusten (HPV), kuten HPV 16, 18, 31 ja 33 ovat johtuneet olevan merkittävimmät riskitekijät kohdunkaulan syövän, joista HPV-16 ja -18 osuus on lähes 70% syövistä [ ,,,0],3]. E6 ja E7 ovat kaksi viruksen onkoproteiineja välttämätöntä kehittämiseen ja ylläpitoon transformoidun fenotyypin kohdunkaulan syöpäsoluja. E6 edistää p53 hajoamisen kautta ubikitiinistä riippuvaisen proteasomireitillä reitin samalla E7 kumppaniaan retinoblastooma (pRb) proteiinia ja häiritsee sen sitoutumisen E2F [4], [5]. Tämä johtaa osaksi menetys Rb /E2F-kompleksit johtavat vapauttaa transkriptiotekijän E2F joka indusoi ilmentymistä solun proliferatiivisten geenien [5].

Vaikka nykyinen hoitomuodot voi parantaa 80-95% varhaisvaiheen ja 60% loco-alueellisesti edenneisiin syöpiin, toistuvat ja etäpesäkkeitä edelleen merkittävä ongelma [6]. Äskettäin täydentävä ja vaihtoehtoinen lääketiede (CAM) on saamassa suosiota chemopreventive lähestymistapa hallintaan sekä syövän uusiutumisen [7], [8]. Yli 60% tällä hetkellä käytössä syöpälääkkeitä ovat alun perin peräisin luonnollisista lähteistä, kuten kasveista, merieliöiden ja mikro-organismit [9]. Erilaisia ​​tieteellisiä tutkimuksia, myös meidän, ovat ehdottaneet potentiaalia lääkekasvien kuten syöpälääkettä ehdokkaiden [10], [11]. Olemme äskettäin raportoitu syöpää estävän potentiaalin

kassiakaneli

(kaneli) kohdunkaulan syövän [12].

temppeliviikuna

L. perhe Lauraceae, on laajasti käytetty perinteisen lääketieteen eri sairauksia. Sen eri osat on käytetty lääkkeellisesti eri muodoissa sekä yhdessä muiden yrttien [13], [14]. Se on osoitettu olevan erilaisia ​​biologisia vaikutuksia [14], mukaan lukien haavan paraneminen [15], anti-bakteeri [16], kouristuksia [17], anti-diabeettinen [18], [19], anti-inflammatoriset [20] , asetyylikoliiniesteraasi estävä aktiivisuus [21] ja ahdistuneisuutta toimintaa [22]. Asetoni ote

F. religiosa

lehdet on osoitettu aiheuttavan apoptoosia rintasyövän solulinjoissa [14].

Olemme äskettäin raportoitu antioksidantti ja sytotoksista aktiivisuutta

F. religiosa

kuori kohdunkaulan syöpäsolut [23]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet oletetun molekyylimekanismi taustalla antineoplastisen potentiaali vesiuutteen

F. religiosa

(FR

aq) kuoren kohdunkaulan syöpä. Tuloksemme viittaavat siihen, että Ficus estää niiden kasvun kohdunkaulasyövän solulinjoissa, SiHa- ja HeLa, indusoimalla solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin, vastaavasti. Mielenkiintoista, FR

aq vähensi ilmaus virus- onkoproteiineja E6 ja E7, siten viittaa mahdollisesta terapeuttisesta

F. religiosa

kohdunkaulan syövän.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

Kudosviljelytutkimusten plasticware hankittiin BD Biosciences (CA, USA) ja Axygen Scientific Inc ( CA, USA). Dulbeccon Modified Eagles Medium (DMEM) jauhe, penisilliiniä ja streptomysiiniä saatiin Invitrogen /Gibco (Grand Island, NY, USA). Naudan sikiön seerumia (FBS), 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-diphenylthiazolium bromidia (MTT), FCCP, ionomysiini ja JC-1 hankittiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO ). Ensisijainen vasta-aine p53 (DO-1), p21 (187), kaspaasi-3 (H-277), cyto-c (7H8), Her-2 (F-11), pRb (C-15), ppRB (SER 807/811), HPV16 E6 /18 E6 (C1P5), HPV16 E7 (ED17), HPV18 E7 (N-19) tai tubuliinin (B-7) ostettiin Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA, USA ). Anneksiini V-FITC apoptoosin kit # 3 ostettiin Invitrogen (CA, USA). Kaikki muut yhteiset reagenssit hankitaan Qualigens Fine Chemicals (Mumbai, Intia).

Vesipohjaisen Ote

temppeliviikuna

(FR

aq) ja alustava Phytochemical Tutkimukset

kuori Ficus

religiosa

L. kerättiin Pune District, Maharashtran, Intia ja se oli todennettu kuten aiemmin on kuvattu [23]. Seteli näyte (MPCC 2417) autenttista kasvilajien talletettiin kasvio lääkekasvien Conservation Center (MPCC), Pune, Maharashtran, Intia. Kuori punnittiin, jauhettu ja uutettu kahdesti tislattuun veteen kuumassa vedessä linko kuten aiemmin on kuvattu [23], [24]. Saatu uute sentrifugoitiin 13000 rpm: ssä 15 min poistamiseksi hiukkasia. Supernatantti oli edelleen steriloida suodattamalla käyttäen Swiney suodatin (huokoskoko, 0,45 pm), ja saatu suodos varastoidaan erinä -80 ° C: ssa käyttöön asti. Saanto kuivattu uute on saatu lähtöaineena raakamateriaali oli 8,6% (w /w). Juuri valmistettu FR

aq uute laadullisesti esiintyminen testataan flavonoidien, fenolit, saponiinit, tanniinit ja hiilihydraatit käyttäen standardimenetelmiä analyysin [25].

Cell Culture

Ihmisen kohdunkaulan sinoomasolulinjoja, SiHa (HPV-16), HeLa (HPV-18) ja C33A (HPV-negatiivinen) saatiin National Center for Cell Science (NCC), Pune, Maharashtran, Intia. Soluja kasvatettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, 2 mM L-glutamiinia ja antibiootteja (100 yksikköä /ml penisilliiniä ja streptomysiiniä). Soluja inkuboitiin kostutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa 37 ° C: ssa.

Cell Growth Analysis

Testi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [12]. Lyhyesti, SiHa ja HeLa-solut ympättiin tiheydellä 1 x 10

5 ja 1,5 x 10

5 solua /ml, vastaavasti, 24-kuoppalevyille kolmena kappaleena. Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla FR

aq (0-80 ug /ml) 24, 48 ja 72 tuntia. Solut kerättiin talteen ja laskettiin elinkykyisyyden käyttäen trypaanisinivärin syrjäytymisen menetelmän [12], [26].

Cell Growth in Yksikerroksinen

Testi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [12]. Lyhyesti, SiHa ja HeLa-solut maljattiin istutustiheyteen 1 x 10

3 solua /ml 6-kuoppaisille levyille. 24 tunnin kuluttua solut altistettiin eri pitoisuuksia FR

aq (0-80 ug /ml), jota seurasi inkubaatio 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa yhden viikon läsnä uutteen . Tätä seurasi vahvistamisesta pesäkkeet 4% paraformaldehydillä ja värjäämällä 0,5% kristalliviolettia. Pesäkkeet kuvattiin Sony DSC-S75 Cyber-shot-kameroiden.

Solun kasvu Soft Agar Pitoisuus

Testi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [12], [26]. Lyhyesti, SiHa ja HeLa-soluja (5 x 10

3 solua /ml) yhdessä eri pitoisuuksien FR

aq (0-80 ug /ml) sekoitettiin 0,35%: isessa (DNA grade, GIBCO BRL) täydellinen DMEM 40 ° C: ssa ja geeliytyi huoneenlämpötilassa 20 min ajan aikaisemmin hyytelöity kerros 0,5% agaroosia täydellisessä väliaineessa 6-kuoppaisille levyille. Inkuboinnin jälkeen kaksi viikkoa, pesäkkeet laskettiin 10 eri alojen käyttäen Axiovert 200 M mikroskooppi (Carl Zeiss, Saksa) ja laskettiin keskiarvo.

haavan paraneminen Pitoisuus

Molemmat SiHa ja HeLa-solut ympättiin tiheydellä 4 x 10

5 /ml 24-kuoppaisille levyille ja annettiin tarttua yli yön 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa. Seuraavana päivänä solut ilman ravintoa seerumin 6 tuntia, minkä jälkeen lisättiin täydellistä elatusainetta tai ilman FR

aq (0-80 ug /ml). Keinotekoinen haava tehtiin sisältävät levyt käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen kanssa 10 ui mikropipetin kärjen ja haavan annettiin parantua 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa. Kuvat 0 h sekä 16 h vangittiin avulla Axiovert 200 M mikroskoopilla. Keskimääräinen laajuus haavan arvioitiin mittaamalla leveys haavan käyttämällä ImageJ 1.44p [27].

Matrigel transmembraaniaktivaattori Invasion Pitoisuus

invaasio tutkimuksia, 24-kuoppaisen BioCoat matrigeeliä Invasion Chambers (BD Bioscience, Bedford, MA) käytettiin [28]. SiHa ja HeLa-solut (5 x 10

4) kanssa tai ilman FR

aq hoidon (0-80 ug /ml) siirrostettiin seerumittomassa elatusaineessa ylempään hyökkäyksen kammioihin ja annettiin tunkeutua koko Matrigel- pinnoitettu kalvo 24 tuntia. Väliaine, joka sisälsi 10% FBS: ää lisättiin alempaan kammioon, joka toimi Chemo houkutinta. 24 tunnin inkubaation, ei-tunkeutuvat solut poistettiin päällekkäin kalvon märillä vanupuikoilla; tunkeutuvat solut pohjaan kiinnitetyn kalvon kiinnitettiin 4% formaliinia, ja värjättiin käyttäen 0,5% kristalliviolettia. Solumäärät laskettiin kymmenen random korkean tehon (× 20) kenttiin Axiovert 200 M mikroskooppi (Carl Zeiss, Saksa) varustettu Sonyn Cyber-shot 3,3 megapikselin kamera.

gelatiinitsymografialla

MMP-2: n elatusaine määritettiin gelatiinitsymografialla kuten aiemmin on kuvattu [12]. Lyhyesti, SiHa ja HeLa-solut ympättiin tiheydellä 4 x 10

5 solua /ml 6-kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä yön yli 37 ° C: ssa, 5% CO

2-inkubaattorissa. Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla FR

aq (0-80 ug /ml) valmistettiin seerumittomassa elatusaineessa ja inkuboitiin 24 tuntia. Seuraavana päivänä elatusaine kerättiin talteen ja sentrifugoitiin 14000 rpm 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa poistamiseksi solujätteen. Esikäsitelty väliaine valvonnan solut sekä solut, joita käsiteltiin FR

aq kerättiin ja väkevöitiin Centricon YM-30 putkia (Millipore, MA). Näytteet, jotka sisältävät yhtä paljon koko proteiinien, sekoitettiin näytepuskuriin (2% SDS, 25% glyserolia, 0,1% bromifenolisinistä ja 60 mM Tris-HCI, pH 6,8) ja sille suoritettiin ei-pelkistävissä olosuhteissa on 7,5% SDS polyakryyliamidigeelillä, joka sisälsi gelatiinia (0,5 mg /ml). Elektroforeesin jälkeen geeli pestiin 0,25% Triton X-100, ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa puskurissa, joka sisälsi 150 mM NaCl, 100 mM CaCI

2, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 1% Triton X- 100, 0,02% NaN

3. Geeli värjättiin värjäysliuoksen kanssa (0,1% Coomassie Brilliant Blue R-250 40% isopropanolia), ja väri poistettiin 7% etikkahappoa. Gelatinolyyttinen aktiivisuus detektoitiin unstained bändejä vasten sinistä taustaa. Kvantifiointi bändejä ohjaus ja käsiteltyjen näytteiden suoritettiin densitometrinen analyysi Alpha Imager käyttäen Alpha Helppokäyttöinen FC ohjelmisto, Alpha Innotech.

Immunoblottausmääritys

HeLa- ja SiHa solut maljattiin istutustiheyteen 4 × 10

5 solua /ml 6-kuoppaisille levyille ja annettiin tarttua yön yli 37 ° C: ssa CO

2-inkubaattorissa. Seuraavana päivänä solut altistettiin eri pitoisuuksia FR

aq (0-80 ug /ml) ja inkuboitiin 24 tuntia. Inkuboinnin jälkeen solut kerättiin trypsinisaatiolla, pestiin 1 x PBS: llä ja proteiini uutettiin, kuten aiemmin on kuvattu [12]. Lyhyesti, solupelletit suspendoitiin uudelleen 60 ui lyysipuskuria, joka sisälsi 50 mM Tris (pH 7,4), 5 mM EDTA, 0,5% NP40, 50 mM NaF, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 0,5 ug /ml leupeptiiniä (Pro-puhdasta Amersco , Solon, USA), 1 ug /ml pepstatiinia (Amresco, Solon, USA), 150 mM NaCl, 0,5 ug /ml aprotiniinia (Amersco, Solon, USA) ja proteaasiestäjäseostabletit (Roche, Lewes, UK) ja inkuboitiin jäillä 1 h ajoittain sekoittaen. Uute sentrifugoitiin 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa 12000 rpm. Sytokromi-c vapautumista, sytosolisia ja mitokondrioiden fraktiot valmistettiin, kuten aiemmin on kuvattu [29]. Proteiini arvioitiin käyttämällä Bradfordin reagenssia (Biorad Laboratories Inc., CA, USA). Sama määrä proteiinia, ladattiin joko 10% tai 12% (E6-proteiinin) SDS-polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin elektroforeettisesti Amersham Hybond-P PVDF-kalvolle (GE Healthcare, UK) in natriumfosfaattipuskuria (pH 6,8). Membraani blokattiin 5% BSA: TST ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli primaarisen vasta-aineen vasten p53, p21, kaspaasi-3, cyto-c, Her-2, pRb, ppRB, HPV16 E6 /18 E6, HPV16 E7, HPV18 E7 tai tubuliinin (Santacruz, CA, USA), jonka 1:500 laimennus. Kalvo pestiin TST ja inkuboitiin toissijaisen IgG HRP-konjugaattia klo 1:5000 laimennus. Proteiinit visualisoitiin kemiluminesenssin (Amersham ECL Advance western blotting havaitseminen pakki, GE Healthcare, UK) ja tiheysmittaus analyysi suoritettiin skannattujen immunoblottauksella Kuvien Image J geeli analyysin työkalu.

Arvio solukierron pysähtymisen

solusyklin analyysi, HeLa-, SiHa- ja C33A solulinjat maljattiin istutustiheyteen 5 x 10

5 solua /kuoppa 6-kuoppaisille levyille ja annettiin tarttua 24 h ajan 37 ° C: ssa CO

2-inkubaattorissa. Seuraavana päivänä solut käsiteltiin FR

aq (0-80 ug /ml) 24 tuntia. Solut kerättiin trypsinisaatiolla ja kiinnitettiin jääkylmällä 70% etanolilla -20 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Pesun jälkeen 1 x PBS: llä, solut käsiteltiin RNAasi A: ta (100 mg /ml) huoneen lämpötilassa 30 minuuttia ja värjättiin PI (20 ug /ml). Värjätään solut analysoitiin DNA-PI fluoresenssi käyttäen virtaussytometriä (FACS Calibur, BD). Vähintään 10000 tapahtumaa laskettiin näytettä kohden; Aineisto analysoitiin FACS Calibur-cell Quest -ohjelmistoa (Becton Dickinson) ja osuudet solujen G

0 /G

1, S-vaiheessa ja G

2 /M vaiheiden solusyklin.

arvio apoptosis

lukumäärän määrittämiseksi apoptoosin alaisten solujen upon FR

aq hoito, HeLa-, SiHa ja C33A maljattiin istutustiheyteen 5 x 10

5 solua /hyvin 6-kuoppaisille levyille ja niiden annettiin kasvaa yön yli 37 ° C: ssa CO

2-inkubaattorissa. Seuraavana päivänä soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla FR

aq (0-80 ug /ml) ja inkuboitiin 24 tuntia. Solut värjättiin anneksiini V-FITC mukaisesti valmistajan ohjeiden (anneksiini V-FITC apoptoosin kit # 3, Invitrogen, Grand Island, NY). Kaikkiaan 10.000 tapahtumaa hankittiin ja dual parametri pistekuvaajan FL2-H (X-akseli; PI fluoresenssi, lineaarinen asteikko) vs. FL1-H (Y-akseli; anneksiini V-FITC-fluoresenssia, linearscale) rekisteröitiin. Aineisto analysoitiin käyttämällä FACS CaliburCell Quest -ohjelmistoa (Becton Dickinson).

Analyysi mitokondrion kalvon potentiaali (Δψm) B

Virtaussytometria-analyysi suoritettiin soluissa käyttäen JC-1 väriaine kuten aikaisemmin on kuvattu [12]. HeLa-solut maljattiin istutustiheyteen 5 x 10

5 solua /kuoppa 6-kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä yön yli 37 ° C: ssa CO

2-inkubaattorissa. Seuraavana päivänä solut käsiteltiin FR

aq (0-80 ug /ml) 24 tuntia. Tämän jälkeen keräämällä solut, pesemällä kahdesti 1 x PBS: llä, jonka jälkeen inkuboitiin tuoreen elatusaineet sisältävät JC-1 väriainetta (2,5 ug /ml) 30 min ajan 37 ° C: ssa pimeässä. Värjätään solut pestiin kahdesti jääkylmällä 1 x PBS: llä, suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan 1 x PBS: ää ja analysoitiin Δψ

m

virtaussytometrialla. FCCP (10 uM) käytettiin positiivisena kontrollina. Vähintään 10000 tapahtumien laskettiin näytettä kohti, ja fluoresenssin intensiteetit mitattiin 527 nm (vihreä) ja 590 nm (punainen).

Detection solunsisäisen kalsiumin käyttäen Fluo-3 /AM

HeLa-solut maljattiin istutustiheyteen 5 x 10

5 solua /kuoppa 6-kuoppaiselle levylle ja annettiin kiinnittyä yön yli. Seuraavana päivänä solut käsiteltiin FR

aq (0-80 ug /ml) 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa 5% CO

2. Inkubaation jälkeen solunsisäistä Ca:

2+ tasot analysoitiin virtaussytometrialla, kuten aiemmin on kuvattu [12]. Lyhyesti, solut ladattiin 5 uM Fluo-3 /AM (Sigma, St. Louis, MO) ja 100 ug /ml Pluronic F127 (Sigma, St. Louis, MO) in sentrifugiputkeen ja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 1 tunnin ajan pimeässä. Solut suspendoitiin uudelleen sen jälkeen, kun 20 minuutin välein sen varmistamiseksi, jopa värjätä loading. Solupelletit pestiin kaksi kertaa 0,9% suolaliuoksella ja suspendoitiin uudelleen 3 ml: aan Hankin tasapainotettua suolaliuosta (HBSS) FACS-putkiin. Ionomysiinillä (30 uM) käytettiin positiivisena kontrollina. Fluoresenssivoimakkuudet mitattiin 525 nm: ssä FACS Calibur (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) saamiseksi perustason lukemat. Tarkoittaa kanavan fluoresenssi-intensiteetit laskettiin käyttäen CellQuest-ohjelmaa.

Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja toistettiin vähintään kolme kertaa, ja tiedot on esitetty keskiarvona ± SD. Tilastollinen analyysi tehtiin kanssa SigmaStat 3,5 ohjelma (Systat Software, Inc.) käyttäen yksisuuntaista ANOVA α = 0.05.

Tulokset

Ficus moduloi kasvukinetiikat Kohdunkaulan syöpä Cells

Olemme aiemmin raportoitu, että

F. religiosa

näytteillä merkittävä hapettumisenestopotentiaali sekä sytotoksisuutta kohdunkaulan syövän solulinjoissa, HeLa ja SiHa [22]. Perustuen se, valitsimme ei-sytotoksisia pitoisuuksia FR

aq (0-80 ug /ml) SiHa (HPV-16) ja HeLa (HPV-18) meidän määrityksissä. Havaittiin, että FR

aq vähensi solujen kasvu annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. SiHa-, FR

aq vähensi solujen kasvua 80 ug /ml pitoisuuden mukaan ~4.78- (p = 0,008), ~4.72- (p = 0,001) ja ~3.42-kertaisesti (p = 0,053) 24, 48 ja 72 h, vastaavasti, verrattuna käsittelemättömään kontrolliin soluja (kuvio 1A). Samoin, 80 ug /ml: n konsentraation FR

aq, HeLa-solut osoittivat ~5.53- (p≤0.001), ~5.94- (p = 0,010) ja ~6.37-kertaisesti (p = 0,001) laskua solukasvun 24, 48 ja 72 tuntia, vastaavasti, verrattuna käsittelemättömiin kontrollisoluihin (kuvio 1 B). Tämä tuki lisäksi pesäkkeenmuodostus ja pehmeä agar analyysit, joissa annoksesta riippuvaista väheneminen pesäkkeiden havaittiin sekä kohdunkaulan syövän solulinjat (kuvio 1C ja D, vastaavasti). Mielenkiintoista, 80 ug /ml pitoisuus, FR

aq merkittävästi vähentänyt pesäkkeiden HeLa (~4.97 kertainen, p≤0.001) ja SiHa (~2.95 kertainen; p≤0.001) verrattuna niiden käsittelemätön kontrolli soluja ( Kuva 1 D). Siten Ficus säännelty kasvukinetiikat kohdunkaulan syövän solujen merkittävällä tavalla. Negatiivisena kontrollina, otimme C33A (HPV negatiivinen) solulinjassa ja analysoi sytotoksisuutta FR

aq siinä. Ficus ei aiheuttanut sytotoksisuutta jopa 160 mikrog /ml pitoisuus C33A soluissa, mikä oli samankaltainen kuin SiHa- ja HeLa (kuva S1). Kuitenkin suurempina pitoisuuksina, FR

aq aiheuttamaa sytotoksisuutta kaikissa kolmessa solulinjoissa, jossa HeLa ja C33A-solut osoittivat samanlaisia ​​solumyrkkyvaikutuksessa.

SiHa (A) ja HeLa (B) käsiteltiin FR

aq (0-80 ug /ml) 24-72 tunnin ajan, ja elävien solujen lukumäärä laskettiin käyttämällä trypaanisinivärin syrjäytymisen menetelmällä. Data edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) kohdunkaulan syövän solulinjat (SiHa- ja HeLa) käsiteltiin FR

aq (0-80 ug /ml) viikon ajan. Pesäkkeet värjättiin kristallivioletilla ja valokuvataan. Kokeet toistettiin kolme kertaa. (D) Sekä SiHa ja HeLa (5 x 10

3) yhdessä FR

aq (0-80 ug /ml) kasvatettiin pehmeä agar kahden viikon ajan. Pesäkkeet laskettiin vähintään 10 eri alueilla ja keskimääräinen kunkin on piirretty. Tiedot edustaa keskiarvo ± SD viiden itsenäisen kokeen.

Ficus indusoi G

1 vaiheen pysähtymisen SiHa- ja muuttaa Expression solusykliä säätelevien proteiinien

analysoimiseksi mekanismi takana Ficus säätelyyn kasvun kinetiikka kohdunkaulan syöpäsoluja, tutkimme solusyklin jakautumisen SiHa-, HeLa ja C33A. Virtaussytometria-analyysi osoitti, että läsnä oli FR

aq, SiHa osoittivat kasvua G

1 väestöstä vähenevät samanaikaisesti S-vaiheessa annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 2A). Mielenkiintoista, 80 ug /ml pitoisuus, lisääntyi prosenttiosuuden solujen G

1 vaihe (59,88-72,33%) ja samanaikainen väheneminen S vaiheessa väestöstä (+15,98-+8,50%, p 0,050). Toisaalta, HeLa, oli merkittävän kasvun sub-G

0 väestöstä (3,65-87,38%, p 0,001), mikä osoittaa apoptoottinen väestö (kuva S2). Mielenkiintoista on, että ei-toksisilla annoksilla, FR

aq ei vaikuttanut kasvuun HPV negatiivinen C33A-soluja (kuvio S2).

SiHa-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla FR

aq (0- 80 ug /ml) 24 tuntia. (A) Tehostettu kertyminen solujen G

1 vaihe, jossa on samanaikainen väheneminen S-vaiheessa väestö havaittiin hoidon jälkeen Ficus (merkitty histogrammit). Western blot osoittaa ekspressiotasot p53 ja pRb (B) sekä p21 ja ppRB (C). Tubuliinia käytettiin latauskontrollina. (D, E) densitometrinen analyysi western blot, joka osoittaa kertainen muutos proteiinin tasot upon FR

aqtreatment. Bändit kvantitoitiin densitometrillä skannaaminen ImageJ 1.44p (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij). Tiedot edustaa keskiarvo ± SD kolmen erillisen kokeen.

tutkittiin mekanismia G

1 /S faasin pysähtymisen SiHa arvioimalla ilmaus G

1 tarkistuspisteen proteiineja, kuten p53, pRb, fosfori Rb (ppRB) ja p21. Oli merkittävä lisäys p53 (kuvio 2B ja D) sekä sen alavirran efektorin, p21 (kuvio 2C ja E) sen jälkeen kun solut FR

aq. Ilmentyminen pRb analysoitiin koska defosforyloitiin pRb tiedetään muodostavan komplekseja E2F tukahduttaa transkription soluproliferatiivisten geenien [30]. FR

aq, lisäsi merkittävästi ekspressiota pRb (kuvio 2B ja D), jossa on samanaikainen lasku tasot ppRB (kuvio 2C ja E) annoksesta riippuvalla tavalla. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Ficus indusoi G

1 /S pidätys SiHa ilmentymistä moduloimalla solusyklin säätelyproteiineja.

Ficus indusoi apoptoosia HeLa kautta lisääntyminen Cyt c ja kaspaasi 3 Expression

Huomasimme, että HeLa, Ficus hoito johti osaksi lisääntyminen solujen osa-G

0 vaiheen, osoittaa apoptoottisten populaation (kuva S2). On värjäämällä anneksiini V-FITC, solut oli annosriippuvainen nousu sekä alussa sekä myöhään apoptoottista solu- populaation (kuvio 3A). Mielenkiintoista on, että 80 ug /ml FR

aq pitoisuus oli ~4.4-kertainen (p≤0.050) ja ~5.5-kertainen (p≤0.050) lisäystä sekä alussa sekä myöhään apoptoottiset solupopulaatio, vastaavasti, verrattuna käsittelemättömiin kontrollisoluihin. Toisaalta, ei apoptoosia havaittiin FR

aq käsitelty SiHa tai C33A soluja (kuvio S3).

(A) edustaja FACS piktogrammeilla käsiteltyjen solujen FR

aq (0-80 ug /ml) on esitetty. Prosenttia anneksiini V-positiivisia (varhainen-apoptoottisia soluja, oikeanpuoleiseen alanurkkaan) ja anneksiini V /PI-double-positiivisia soluja (myöhäinen-apoptoottisia soluja, oikeasta yläneljänneksestä) on osoitettu. (B) virtaussytometrianalyysin nopean kalsiumin vapautumista HeLa-soluissa hoidon jälkeen FR

aq (0-80 ug /ml) on osoitettu. Ionomysiini käytettiin positiivisena kontrollina. Data edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (C) FACS-analyysi seuraavasti JC-1-värjäys HeLa osoitti muuttaminen mitokondrion kalvon potentiaalia jälkeen FR

aq (0-80 ug /ml) käsittely käsittelemättömään kontrolliin verrattuna soluihin. Data edustaa keskiarvoja ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (D) Western blot osoittaa ilmentymisen sytokromi c: sytosolisista osa. Tubuliinia käytettiin latauskontrollina. (E) Yhteensä proteiini eristettiin ja analysoitiin p53 ja kaspaasi 3 immunoblottauksella. Tubuliinia käytettiin latauskontrollina. (F ja G) densitometrinen analyysi western blot, joka osoittaa kertainen muutos proteiinin tasoja. Bändit kvantitoitiin käyttämällä ImageJ 1.44p (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij).

Tutkimme Ca

2+ signalointi mekanismi käsitellyissä soluissa FR

aq ja havaittiin, että se indusoi annoksesta riippuvan nousu solunsisäisen kalsiumin tasoa (kuvio 3B). Ionomysiini käytettiin positiivisena kontrollina. Mielenkiintoista on, että kasvu solunsisäisen kalsiumin johtivat häiriöitä mitokondrion kalvon potentiaali (Δψm), joka havaittiin lasku punaisen fluoresenssin intensiteetin, värjäyksen jälkeen solut JC-1 väriainetta (kuvio 3C). Oli ~ 3-kertainen väheneminen punaisen fluoresenssin intensiteetti (p≤0.001) 80 ug /ml: n konsentraation FR

aq. FCCP käytettiin positiivisena kontrollina tutkimuksessa. Mitokondrion kalvon Depolarisaatio liittyi annoksesta riippuva nousu sytosolin sytokromi c (kuva 3D ja F), joka oli liitetty ekspression lisääntymisen kaspaasi 3 ja p53 (kuvio 3E ja G). Nämä tulokset osoittavat, että Ficus aiheuttaman apoptoosin HeLa kautta mitokondrioiden riippuvaisen reitin.

Ficus Vähennykset Invasion ja muutto SiHa- ja HeLa

Haavan paranemista koe suoritettiin sekä solulinjoissa ja havaittiin, että Ficus esti migraation sekä SiHa (kuvio 4A) ja HeLa (kuva 4B) annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla verrattuna käsittelemättömään kontrolliin soluja. 16 tunnin kuluttua, käsittelemätön SiHa ja HeLa-solut pystyivät peittämään ~82% haavan, kun taas 80 ug /ml FR

aq hoitoa, solut peitetään haava ~ 33% (p 0,001 ) ja 22% (p 0,001), vastaavasti (kuvio 4C). Tällä tietyllä annostuksella, Ficus vähensi invasiivisia kyky sekä SiHa- ja HeLa mukaan ~2.45- (p≤0.001) ja ~3.8-taitoksia (p≤0.001), vastaavasti, verrattuna käsittelemättömiin kontrollisoluihin (kuvio 4D).

analyysi soluvaelluksen SiHa (A) ja HeLa (B) käsiteltiin FR

aq (0-80 ug /ml) mitattiin haavan paranemista määrityksessä. Ylempi paneeli koko kuva esittää haavan tehty 0 h. Alempi paneeli esittää solujen kulkeutumista vastaa ajetun matkan 16 tuntia. (C) Graafinen esitys haavan SiHa- ja HeLa-soluissa 16 tunnin kuluttua FR

aq hoito on osoitettu. Arvot olivat edustettuina prosentuaalinen haavansulkemiseen ja ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (D) Cell invaasiomääritys osoittaa solujen prosenttiosuus tunkeutuneet kenttää kohti läsnä ollessa tai puuttuessa FR

aq. Tunkeutuneet solut laskettiin kymmenen satunnaisesti kentät ja arvot on ilmaistu keskiarvona ± SD kolmesta itsenäisestä kokeesta. (E) gelatiinitsymografialla osoittaa downregulation MMP-2: n ilmentymisen FR

aq (0-80 ug /ml) käsiteltiin SiHa ja HeLa. (F) Western blot-analyysi osoittaa laskua Her-2: n ilmentymisen SiHa- ja HeLa käsiteltiin FR

aq (0-80 ug /ml). Tubuliinia käytettiin latauskontrollina. (G) densitometrinen analyysi western blot, joka osoittaa kertainen muutos HER-2-proteiinin tasot SiHa- ja HeLa. Bändit kvantitoitiin densitometrillä käyttämällä ImageJ 1.44p (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij).

On tunnettua, että lisääntynyt ilmentyminen MMP: iden kasvainkudoksissa liittyy syöpään solumatriisimo- hajoamista, invaasio sekä etäpesäkkeiden [31]. Havaitsimme, että FR

aq merkittävästi alassäädetty ilmentymistä MMP-2 sekä SiHa ja HeLa-soluja (kuvio 4E) verrattuna käsittelemättömään kontrolliin soluihin.

HER2 /

neu

on raportoitu parantaa metastaattista potentiaalia syöpien soluja [32], ja korreloi positiivisesti MMP-2: n ilmentymisen [33]. Olemme havainneet, että FR

aq vähentynyt ilmentyminen Her-2: n annoksesta riippuvalla tavalla sekä SiHa- ja HeLa (kuvio 4F ja G). Tiedot viittaavat siihen, että Ficus vähensi muuttoliikettä sekä hyökkäys kohdunkaulan syöpäsolujen ilmentymistä moduloimalla Her-2 ja MMP-2-proteiineja.

Ficus Vähentää ilmentäminen viruksen onkoproteiineja E6 ja E7

Koska Ficus osoitti merkittäviä antineoplastisia potentiaalia sekä HPV16 (SiHa) ja HPV 18 (HeLa) positiivinen solulinjat, tutkimme ilmentymisen virusproteiineja E6- ja E7-käsitellyissä ja käsittelemättömissä soluissa. Havaittiin, että FR

aq vähensi merkitsevästi ilmaus E6 ja E7 onkoproteiineja sekä SiHa- ja HeLa (kuvio 5A ja B, vastaavasti). 80 ug /ml FR

aq pitoisuus, ilmaus E6- ja E7-proteiinit väheni ~3.0- (p≤0.001) ja 3,7-taitoksia (p≤0.001), vastaavasti, SiHa (kuvio 5A ja C) ja ~3.2- (p≤0.001) ja 4,0-taitoksia (p≤0.001), vastaavasti, HeLa verrattuna käsittelemättömiin kontrollisoluihin (kuvio 5B ja D). Näin ollen, Ficus vähentynyt ilmentyminen viruksen onkoproteiineja E6 ja E7, jotka voimistaa sen terapeuttista merkitystä syövän asetuksessa.

ilmentymisen E6: n ja E7 onkoproteiineja määritettiin immunoblottauksella E6- ja E7-vasta-aineiden SiHa (A) ja HeLa (B) käsiteltiin FR

aq (0-80 ug /ml). Tubuliinia käytettiin latauskontrollina. Densitometrinen analyysi western blot, joka osoittaa kertainen muutos E6- ja E7-proteiinin tasot upon FR

aq hoitoa SiHa (C) ja HeLa (D). Bändit kvantitoitiin densitometrillä käyttämällä ImageJ 1.44p (Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA, https://imagej.nih.gov/ij).

Keskustelu