Krooninen sairaus

tiivistelmä

A novel toiminto sideaine Arl kaksi (Bart) molekyyli haiman syöpäsoluissa on raportoitu. Bart estää invasiivisuus haimasyövän soluja sitoutumalla Ca

2 + -riippuvaisen, fosforyloitu, guanosiini (GTPaasi) kalvo fuusioproteiinia, annexin7 (ANX7). Kasvain vaimennin toiminto ANX7 raportoitiin aikaisemmin perustuu sen ennustetekijöiden merkitys ihmisen syövissä ja syöpä-altis hiiren fenotyyppi

ANX7

(+/-). Edelleen tutkimus osoitti, että BART-ANX7 kompleksi kuljetetaan kohti solujen ulokkeet siirryttäessä soluihin, kun Bart tukee sitoutumisen ANX7 on proteiinikinaasi C (PKC) isoformin PKC-a. Viimeaikaiset tutkimusten mukaan fosforylaatio ANX7 PKC merkittävästi voimistaa ANX7 aiheuttama fuusio fosfolipidivesikkelien; Kuitenkin nykyinen tietojen mukaan BART-ANX7 kompleksi vähentää PKC-a-aktiivisuutta. Kaatamalla endogeenisen Bart ja ANX7 lisää aktiivisuutta PKC-a, ja erityisiä estäjät PKC-a merkittävästi kumota invasiivisuus aiheuttama Bart ja ANX7 knockdown. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Bart myötävaikuttaa säännellä PKC-a-aktiivisuutta sitoutumalla ANX7, mikä vaikuttaa invasiivisuus haiman syöpäsoluja. Näin ollen, on mahdollista, että Bart ja ANX7 voivat selvästi säädellä alavirran signalointia PKC-a, joka on mahdollisesti merkitystä solujen invaasiota toimimalla anti-invasiivisen molekyylejä.

Citation: Taniuchi K, Yokotani K, Saibara T (2012 ) Bart Estää Haimasyöpä Cell Invasion PKC-a-inaktivointi kautta Sitoutuminen ANX7. PLoS ONE 7 (4): e35674. doi: 10,1371 /journal.pone.0035674

Editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 tammikuu 2012; Hyväksytty: 19 maaliskuu 2012; Julkaistu: 19 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Taniuchi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Grant-in-Aid alkaen terveysministeriön, työ- ja hyvinvointi Japanin. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

sideaineena Arl kaksi (Bart) molekyyli on liukoinen 19-kDa: n proteiini puhdistettiin alun perin naudan aivoista ja tunnistettu sitomispartnerin ADP-ribosylaatio factor-, kuten 2 (ARL2) [1]. Sitominen BART on ARL2 on korkea affiniteetti ja riippuvainen sitoutuminen GTP ARL2 [1]. Erillisiä toimintoja on päätellä havainnoista, että ARLs ei ole biokemiallisia tai geneettisiä toimintoja ominaisuus ADP-ribosylaatio tekijöiden (ARF: iä), vaikka 40%: sta 60%: n aminohapposekvenssi-identtisyys ARF: ien ja ARLs [2]. ARL2 on liitetty säätelijänä mikrotubulusdynamiikan ja taitto [3], mutta sen toiminta on edelleen suurelta osin tuntemattomia. Olemme aiemmin raportoitu, että sääntely BART transkription jälkeinen muutos

kautta

solunsisäisen CD24 sitoutumisen G3BP stressi rakeina myötävaikuttaa eston ja metastaasit haiman adenokarsinooma (PDAC) solut [4]. N-terminaalista G3BP edistää transkription jälkeisen sääntelyn Bart [5]. Lisäksi tutkimus osoitti, että Bart vähentää invasiivisuuden PDAC soluissa inhiboimalla ARL2-välitteinen väheneminen aktiivisuus Rho GTPaasi-proteiini RhoA [6]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että Bart on merkitystä eston PDAC invasiivisuus.

ANX7 on jäsen anneksiini perheen kalsiumista riippuvan fosfolipidin sitovia proteiineja ja koodaa Ca

2 + aktivoitujen GTPaasi.

ANX7

(+/-) hiirten on Ca

2 +: sta riippuvainen hormonitoimintaa sekretorisen vikoja [7]. ANX7 fosforyloituu PKC, joka lisää merkittävästi sitoutumisen ANX7 fuusioituneita fosfolipidivesikkelien in kromafiinisoluissa [8]. Aktivoitu PKcs aiheuttaa eritystä MMP-9, johtaa aktivointi MMP-2, downregulate TIMP-1 ja TIMP-2 eritystä, ja lisätä MT1-MMP solun pinnalla [9]. Näin ollen, ANX7 voi olla yksi niistä tekijöistä, jotka liittyvät PKC-riippuvaista eritystä cascade. Lisäksi ANX7 on hiljattain kuvattu tuumorisuppressorigeenin eturauhassyövän, mistä on osoituksena heterotsygoottisuuden menetys ja vähentynyt ANX7 proteiinin ilmentymisen suuri osa arkistoidut etäpesäkkeitä [10]. ANX7 esittelee monia biologisia ja geneettisiä ominaisuuksia tuumorisuppressorigeeniä ja on myös osallisena syövän synnyn kautta diskreetti signaalireittien, joihin muut tuumorisuppressorien, DNA-korjaus- ja apoptoosiin liittyvien geenien [10], [11]. Nämä raportit ovat ehdottaneet, että ANX7 soittaa useita eri tehtäviä mukana eksosytoosilla, tuumorisuppressiogeeneksi ja syövän syntymistä.

PKC on perheen seriini /treoniini kinaasien mukana sellaisten signaalien, kuten Ras signaalia, solujen lisääntymisen ja eriyttäminen [12], [13]. PKC perhe koostuu ainakin 12 isoformit eri kudosten ekspressiokuvioiden, substraattispesifisyydet ja subsellulaarisista lokalisoinneissa jotka liittyvät erikoistuneita solun toimintoja, kuten solujen lisääntymisen, erilaistumisen, ja apoptoosin [14]. Ovat perinteinen PKCS (α, β1, β2 ja γ) sitoutuvat forboliesterit ja ovat Ca

2+ riippuvainen. The ’romaani ”PKCS (δ, ε, η ja θ) eivät riipu Ca

2 +, mutta älä sido forboliesterien. Kolmannen alaperhe käsittää ”epätyypilliset” PKCS (ξ, ι, λ ja μ), jotka eivät sitoudu joko Ca

2+ tai forboliesterin [14], [15]. Konstitutiivisesti aktivoitua solun pinnan reseptorit, kuten EGF-reseptori tai PDGF-reseptorin [16], tai Ras [17], aiheuttaa hyperactivation PKC sekä mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK) cascade. Yliekspressio PKCδ indusoi enemmän pahanlaatuinen haimasyöpä solufenotyypin

in vivo

avulla muuntelemalla solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen [18]. Toinen tutkimus osoitti, että aktivoitu PKC indusoi lamellipodioihin muodostumisen ja siitä aiheutuva lisääntynyt muuttavien aktiivisuus sidekalvon fibroblastien [19]. Näin ollen on ehdotettu, että PKCS indusoida solujen lisääntymistä /eloonjäämistä, invaasio ja metastaasi.

Tässä tutkimuksessa, ANX7 tunnistettiin uutena sitomispartnerin Bart ja Bart havaittiin liittyvän ANX7-PKC kompleksin muodostumista PDAC soluissa. Lisäksi nykyinen tulokset osoittivat, että kaatamalla Bart indusoi soluinvaasiota lisäämällä PKC-a-aktiivisuuden kautta menetys ANX7-PKC-a-kompleksin muodostumisen. Siten vähentynyt aktiivinen PKC-a

kautta

sekä Bart ja ANX7 myötävaikuttaa eston PDAC invasiivisuus.

Tulokset

Bart sitoutuu ANX7 vuonna PDAC soluissa

Bart knockdown kasvaa retroperitoneaalinen invaasion ja PDAC solun etäpesäke maksan käytettäessä potilaalle tehdä ksenograftimallia kuvatun aiemman raportin [4]. Tutkia mekanismi, jolla Bart estää invasiivisuus ja etäpesäkkeiden, immunosaostuksella (IP) kokeet suoritettiin ihmisen PDAC solulinja S2-013 käyttämällä spesifistä vasta-ainetta Bart, havaitsemiseksi komplekseja Bart muiden proteiinien kanssa. S2-013 on kloonattu alalinja on PDAC solulinjan (SUIT-2) johdettu maksan etäpesäke [20], ja saatiin tri T. Iwamura (Miyazaki Medical College, Miyazaki, Japani). Hopeavärjätyssä immu- jakeet erotettiin SDS-PAGE-geeleillä paljasti 50-kDa joka ei nähty isotyyppikontrollia immunopresipitaatit (nuoli kuvassa. 1A). Bändi leikattiin irti ja analysoitiin Q-TOF-MS jälkeen geelissä trypsiinin ruoansulatusta, ja tunnistettiin ANX7. Peptidisekvenssi kattavuus oli 15% (Fig. 1 B). Tämä spesifinen sitoutuminen ANX7 Bart osoitettiin yhdessä IP päässä S2-013 solut (Fig. 1 C) ja subsellulaarisia rinnakkaispaikantumisen analysoitiin immuno- S2-013 soluja (Fig. 1 D). Bart ja ANX7 coimmunoprecipitated ja oli colocalized sytoplasmassa. Huomattavaa on, että Bart ja ANX7 kertynyt lamellipodial ulkonemia, jotka ovat välttämättömiä solujen vaeltamiseen (nuolet kuvassa. 1E).

. Immunopresipitaattien S2-013 soluista käyttäen normaalia kaniinin IgG (ohjaus) ja anti-BART-vasta tutkittiin hopeavärianalyysi. Q-TOF-MS-analyysia tutkitaan näkyvä bändi BART immunosaostumissa (nuoli). B. peittävyysprosentin ANX7 edustaa tunnistettujen peptidien koko proteiinisekvenssin (hakunumero NM_004034). C. immunosaostettiin endogeeninen BART tai ANX7 peräisin S2-013 tutkittiin Western-blottauksella käyttäen anti-BART ja anti-ANX7 vasta-aineita. Normaali kanin tai hiiren IgG: tä käytettiin isotyyppikontrollia Bart ja ANX7, vastaavasti. D. immunosytokemiallinen värjäys S2-013 soluihin käyttämällä anti-Bart (vihreä) ja anti-ANX7 (punainen) vasta-aineita. Sininen, DAPI värjäystä. Bar, 10 pm. E. Nuolet osoittavat, että Bart (vihreä) ja ANX7 (punainen) colocalize on lamellipodial ulkonemia on S2-013 soluja. Sininen, DAPI värjäystä. Bar, 10 pm.

ANX7 estää PDAC soluinvaasiota

Aiemmin solun klooneja, joissa BART stabiilisti tukahdutti vektoripohjaisia ​​erityinen lyhyt hiusneula Sirna (siRNA) in S2-013 soluissa, jotka aiemmin ilmaisseet korkeita Bart [4]. Määrittää toiminnon BART-ANX7 komplekseja, haavan paranemista immunovärjäyksellä määritystä käytettiin tarkkailla lokalisointi Bart ja ANX7 on polarisoitunut vaeltavien solujen (Fig. 2A). Sekä Bart ja ANX7 rekrytoitiin etureunat aikana haavan paranemista ohjaus S2-013 solujen (nuolet kuvassa. 2A). Ehtyminen BART esti ANX7 kerääntyminen etureunat (alempi paneelit kuvassa. 2A). Yhdessä seurauksena kuvion. 1E, nämä tulokset osoittavat, että Bart ja ANX7 keskinäisessä riippuvuussuhteessa lokalisoida klo etureunojen ja lamellipodial ulkonemia liittyy solujen vaeltamiseen.

. Negatiivinen salattu ohjaus (Scr-1) ja Bart RNAi (siBART-1) S2-013 solujen konfluentteja viljelmiä haavoittui. 4 tunnin kuluttua solut immunovärjättiin käyttämällä anti-Bart (vihreä) ja anti-ANX7 (punainen) vasta-aineita. Sininen, DAPI värjäystä. Nuolet, colocalized Bart ja ANX7 kärjessä valvonnan soluja. Bars, 10 pm. B. siRNA oligonukleotidit kohdistuvat ANX7 (siANX7) ja negatiivisen salattu ohjaus transfektoitiin transientisti S2-013 ja PANC-1-soluissa. Western blotting validoitu ANX7 Knockdown molemmissa solulinjoissa. C. Transwell motiliteetti määritystä soluja käsiteltiin kuten (B). Siirtynyt solujen neljällä ryhmää kohti laskettiin. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baareja

, SD. *

p

0,005 verrattuna kontrolli soluihin. D. kvantifiointi kahden kammion invaasiomääritys käsiteltyjen solujen kuin (B). Hyökkäsi solut neljällä ryhmää kohti laskettiin. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baareja

, SD. *

p

0,001 verrattuna kontrolli soluihin.

In vitro

määrityksiä käytettiin vaikutusten tutkimiseksi ANX7 solun liikkuvuuteen ja invaasiota. Kuten on osoitettu Western blot-analyysi, ANX7 ilmentyminen vähenee merkittävästi S2-013 ja PDAC solulinja, PANC-1, 72 h transfektion jälkeen kanssa ANX7 kohdistaminen siRNA oligonukleotidit, toisin kuin solut, jotka on transfektoitu salatun siRNA-oligonukleotidit (kuvio . 2B). Tukahduttaminen ANX7 parannettu motiliteetin transwell motiliteetin analyyseissä S2-013 ja PANC-1 verrattuna kontrollisoluihin (Fig. 2C). Vuonna kaksikamarinen invaasio määrityksissä, ANX7 RNAi-solut olivat merkittävästi enemmän invasiivisia kuin ohjaus S2-013 ja PANC-1-solut (Fig. 2D). Nämä tulokset viittaavat tärkeä merkitys sitomisesta BART ja ANX7 estoon solumigraation.

sidonta ANX7 ja fosforyloidun PKC liittyy estämällä invaasiokyvyssä PDAC solujen

Co-IP on ANX7 ja PKC kompleksi suoritettiin käyttäen anti-ANX7 tai anti-PKC-aineella (10800) saatetaan kanssa PKC-a, β1, β2, δ, ε ja η isomuotojen S2-013 soluissa. Immunoblottauksen immunopresipitaatit paljasti, että ANX7 yhteistyössä immunosaostettiin PKC (Fig. 3A). PKC ilme ei ollut erityisen hyvä, mutta oli huomattavia summia ANX7-immu- kompleksit ilman PKC eritystä. Vaikutukset kaatamalla ANX7 sääntelystä PKC: n aktiivisuutta tutkittiin käyttäen Western blottaus käyttämällä anti-fosfo-PKC vasta-ainetta (9379), joka havaitsee klassisen PKCS (α, β1, β2 ja γ) ja uudet PKCS (δ, ε, η ja θ), kun fosforyloitiin jäännös homologinen Thr514 on PKCγ (Fig. 3B). ANX7 pudotus indusoimaa fosforylaatiota PKC S2-013 soluissa, mikä osoittaa, että ANX7 on rooli laskeva fosforyloidun PKC. Tutkitaan subsellulaariseen rinnakkaispaikantumisen on ANX7 ja fosforyloidun PKC, S2-013 solut immunovärjättiin. ANX7 ja fosforyloitu PKC oli colocalized in lamellipodial ulkonemia (nuolet kuvassa. 3C). Mielenkiintoista on, ANX7 ja fosforyloitu PKC rekrytoitiin ja colocalized että etureunat haavan paranemisen aikana ja S2-013 solujen (nuolet kuviossa. 3D), mikä osoittaa, että fosforyloitu PKC liittyy anti-invasiivisen toiminnan ANX7. Koska ANX7 voisi toimia laskeva PKC: n aktiivisuutta (Fig. 3B), ANX7-riippuvaisen inhibition soluinvaasion todennäköisesti liittyy vähentynyt aktiivisuus spesifisen klassisen tai uusien PKC-isoformit. Siten lisäkokeita analysointiin BART-ANX7 liittyvä esto soluinvaasiota keskittyivät klassinen ja uusia PKC-isoformit, johon anti-fosfo-PKC-aineella (9379) reagoivat.

. Immunosaostus endogeenisen ANX7 tai PKC päässä S2-013 soluja. Immunosaosteita tutkittiin Western-blottauksella käyttäen anti-ANX7 ja anti-PKC vasta-aineita. Normaalin hiiren tai kanin IgG: tä käytettiin isotyyppikontrollia ANX7 tai PKC, vastaavasti. B. Western blot anti-PKC ja anti-fosfo-PKC vasta osoittaa S2-013 soluja transfektoitiin ohimenevästi siRNA varten ANX7 verrattuna soluihin transfektoitu sekoitetun ohjaus. C. immunosytokemiallinen värjäytyminen S2-013 soluissa, määritettynä anti-ANX7 (vihreä) ja anti-fosfo-PKC (punainen) vasta-aineita. Sininen, DAPI värjäystä. Nuolet, colocalized ANX7 ja fosforyloitua PKC at lamellipodial ulkonemia. Bar, 10 pm. D. Confluent S2-013 solut haavoittui. 4 tunnin kuluttua solut immunovärjättiin käyttämällä anti-ANX7 (vihreä) ja anti-fosfo-PKC (punainen) vasta-aineita. Sininen, DAPI värjäystä. Nuolet, colocalized ANX7 ja fosforyloitua PKC eturintamassa. Bar, 10 pm.

Fosfory- PKC indusoi solujen invaasion PDAC solujen

PKC stimulaattori, forboli 12-myristaatti 13-asetaattia (PMA) on voimakas kasvaimen promoottori [21] joka indusoi migraatio sidekalvon fibroblastien [19] ja glioblastoomasolut [9]. PMA vuorovaikutuksessa ja aktivoi sekä klassista ja uusia PKC-isoformit [21]. Siksi vaikutus PMA solujen hyökkäys S2-013 ja PANC-1 tutkittiin. Immunoblottauksella käyttäen anti-fosfo-PKC-aineella (9379) osoitti, että käsittely PMA lisääntynyt aktiivinen PKCS (Fig. 4A). PMA merkittävästi stimuloi solujen hyökkäys S2-013 ja PANC-1

in vitro

invaasiota määritykset (Fig. 4B), mikä osoittaa, että PMA-herkkien PKC-isoformien edistää invasiivisuuden PDAC soluja. Sen vahvistamiseksi, että PMA-indusoidun hyökkäys oli riippuvainen aktiivinen PKCS, solut ensin käsiteltiin PKC-inhibiittorin (kalfostiini C, estäjä sekä klassisia ja uusia PKcs), ja sitten käsiteltiin PMA: lla. Hoidon alussa PKC-inhibiittorin esti PMA-indusoidun lisääntymistä PKC: n aktiivisuutta (Fig. 4A) ja esti PMA-välitteisen solun hyökkäystä S2-013 ja PANC-1 (Fig. 4B). Nämä tulokset osoittavat, että tiettyjä isoformit klassisen ja uusia PKCS voivat aiheuttaa PDAC soluinvaasiota.

. S2-013 ja PANC-1-solut esikäsiteltiin tai ilman kalfostiini C: ssa, käsiteltiin PMA: lla, ja PKC: n aktiivisuutta arvioitiin Western-blottauksella anti-fosfo-PKC-vasta-ainetta. B. S2-013 ja PANC-1-soluja käsiteltiin kuten (A) maljattiin Matrigel hyökkäystä kammioihin. Hyökkäsi solut neljällä ryhmää kohti laskettiin. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baareja

, SD. *

p

0,001; **

p

0,003 verrattuna käsittelemättömien ohjaus soluja. C. S2-013 soluja käsiteltiin kanssa tai ilman PMA, ja immunosytokemiallista värjäys suoritettiin käyttäen anti-E-kadheriinin ja anti-β-kateniinin vasta-aineita (vihreä). Sininen, DAPI värjäys; baareja, 10 pm.

Cell-soluadheesiota voi myös vaikuttaa liikkuvuuteen [22]. Muodostuessa solu-solu kontakteja, solut vähentävät niiden maahanmuuttoluku ja solun pinnan uloke aktiivisuutta, ja vähentää niiden mikrotubulusten ja aktiini-hehkulamppuja dynamiikka [23]. Vaikutuksen määrittämiseksi klassisen ja uusien PKCS on solu-solu-kontakti, S2-013 soluja inkuboitiin PMA: lla ja immunofluoresenssilla suoritettiin käyttäen anti-E-kadheriinin ja anti-β-kateniinin vasta-aineita (Fig. 4C). PMA vähensi merkitsevästi risteyksessä proteiineista alueita solu-solu kosketukseen, mikä osoittaa vähentynyt perifeerinen lokalisointia risteyksestä proteiineja, jolloin kiinnittyminen liittymissä on alentunut vakautta. Nämä tulokset viittaavat siihen, että PMA-herkkien PKCS rooli alenevassa vakauden solu-solu kontakteja ja puolestaan ​​asiakkuutta soluinvaasiota.

Bart tukee sitoutumisen ANX7 aktiiviseen PKC ja toiminnot alenevassa aktiivinen PKC

määrittämiseksi vaikutuksen BART-ANX7 komplekseja sääntelystä aktiivisuus PKC vaikutukset BART knockdown on ANX7 affiniteetti konstitutiivisesti aktivoitua PKCS käsittelemällä PMA tutkittiin (Kuva. 5A). PMA stimulointi aiheutti merkittäviä lisäyksiä määrän ANX7-PKC komplekseja valvonta soluissa, kun taas ei ollut eroja BART RNAi S2-013 soluja. Lisäksi riippumatta siitä, onko sitoutuminen voidaan inhiboida PKC: n estäjät ennen stimulaatiota ohjaus solujen PMA arvioitiin. Kalfostiini C ja kelerytriinistä kloridi (estäjä PKC-a, β, γ ja δ) merkittävästi vähentynyt ANX7-PKC vuorovaikutuksen PMA-stimuloiduissa kontrollisoluja (Fig. 5A). Lisäksi, Bart immunosaostettiin lisääntyneisiin ANX7 kun S2-013 soluja käsiteltiin PMA, ja esi-inkubaatio kalfostiini C esti sitoutumisen lisääntymisen (kuvio. 5B). Immunosytokemiallisessa analyysi suoritettiin tutkimaan solunsisäinen lokalisaatio PMA-indusoidun ANX7-PKC komplekseja ohjaus ja Bart RNAi S2-013 solut (Fig. 5C). ANX7 colocalized PMA-stimuloitujen PKCS kontrollisoluissa (nuolet kuvassa. 5C); kuitenkin, Bart knockdown esti sitoutumisen ANX7 ja PMA-stimuloitujen PKCS (arrowheads kuvassa. 5C). Lisäksi IP kokeissa käyttäen anti-fosforyloitua PKC-aineella (9379) vahvisti, että kaatamalla Bart inhiboivat ANX7 ja fosforyloidun PKC (Fig. 5D, E).

. Immunosaostus PKC kontrollista ja Bart RNAi S2-013 solujen kannustanut PMA tai ilman esikäsittelyä kalfostiini C tai kelerytriinistä kloridi tutkittiin Western blottauksella käyttäen anti-ANX7 ja anti-PKC vasta-aineita. *, Co-immunosaostettiin ANX7 PKC Bart RNAi S2-013 soluja. B. immunosaostus BART S2-013 solut käsiteltiin kuten (A) tutkittiin Western-blottauksella käyttäen anti-ANX7 ja anti-Bart vasta-aineita. C. immunosytokemiallinen värjäys ohjaus (ylempi paneeli) ja Bart RNAi (alempi paneeli) S2-013 soluja stimuloitiin PMA käyttäen anti-PKC (vihreä) ja anti-ANX7 (punainen) vasta-aineita. Sininen, DAPI värjäystä. Nuolet, ANX7 colocalized PMA-herkkien PKCS hallinnassa soluissa; arrowheads, PMA-herkkä PKCS ei colocalized kanssa ANX7 Bart RNAi soluissa. Bars, 10 pm. D. immunosaostus fosforyloidun PKC kontrollista ja Bart RNAi S2-013 solut tutkittiin Western blottauksella käyttäen anti-ANX7 ja anti-fosfo-PKC vasta-aineita. E. densitometrinen tulosten analysointi kuvion 5D. Taso ANX7 että saostumat arvioitiin normalisoinnin jälkeen ANX7 signaaleja fosfo-PKC signaaleja solulysaateista. F. Western blot anti-BART ja anti-fosfo-PKC vasta näyttää kaksi S2-013 kloonit transfektoidaan siRNA Bart (siBART-1 ja 2) verrattuna mock (Neo-1) ja salattu (Scr-1) ohjaus klooneja.

Bart RNAi S2-013 solut olivat koholla aktiivisen PKC tasoilla ja muuttumaton vakaan tilan tasoja PKCS (Fig. 5F). Tämä tulos osoittaa, että Bart voi liittyä alentuneet aktiivisen PKC. Oletamme, että Bart säätelee vuorovaikutukset ANX7 ja aktiivisia muotoja kohde PKCS kuin tukimolekyylia ja /tai lastin proteiinia ANX7 mahdollistaa ANX7 laskevan kohde PKC: n aktiivisuutta, ja vuorostaan ​​estää solujen invaasiota.

PKC aktiivisuutta ei ole suoraan säädellä ANX7

roolin tutkimiseksi PKC säätelyssä fosforylaation ANX7, kuten aiemmin on raportoitu kromafiinisoluissa [8], S2-013 ja PANC-1-solut leimattiin metabolisesti [

32P] -orthophosphoric happo, ja sitten stimuloitiin PMA. Radioaktiivisesti leimatun ANX7 immunosaostettiin anti-ANX7 monoklonaalinen vasta-aine, ja analysoitiin fosfori kuvantaminen (Fig. 6A). Jos ANX7 on substraatti erityisiä PKCS taso ANX7 fosforylaation pitäisi johtaa huomattavasti muutoksia vasteena PMA. Kuitenkin PMA stimulaatio ei korottaa ANX7 fosforylaation kummassakaan solulinjassa. Seuraavaksi

in vitro

fosforylaatiota määrityksiä käytetään määrittämään, onko PKC-aktiivisuus säädetään suoraan ANX7 (Fig. 6B). Puhdistettu rotan aivojen, ja sen puhtaus on 95% ja joka sisältää klassista ja uusia PKC-isoformit, inkuboitiin yhdistelmä-ANX7 proteiinin kanssa tai ilman rekombinantin Bart proteiinia. ANX7 ei muuttanut aktiivisuutta PKCS ja lisäämällä Bart proteiinia ei liittynyt säännellä PKC: n aktiivisuutta. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ANX7 ei ole substraatti PKC, ja että ANX7 ei muutu fosforylaation tasoja kohteena PKCS suoraan.

. S2-013 ja PANC-1-soluja esimerkittyyn kanssa [

32P] -orthophosphoric happoa ja stimuloidaan tai PMA. ANX7 immunosaostettiin, erotettiin SDS-PAGE: lla ja analysoitiin autoradiografialla. Immunoblot suoritettiin solulysaatin latauskontrollina. B.

In vitro

fosforylaatiomääritykset vaikutuksen tutkimiseksi Bart ja ANX7 PKC-fosforylaatioon. Puhdistettu rotan aivoissa inkuboitiin rekombinantti ANX7 tai ilman yhdistelmä-Bart. Reaktion tuotteet analysoitiin ELISA-määrityksellä. ABS

Y

-akselin tarkoittaa absorbanssi 492 nm viitteeksi mitattuna mikrolevylukijalla.

PKC-a liittyy BART-ANX7 kompleksit

määritellä erityiset isoformit PKC jotka sitoutuvat ANX7 tässä järjestelmässä, tarkka ilmaisu profiilia klassisen ja uusien PKCS tuotettiin Western-blottauksella käyttämällä yksittäisiä anti-fosfo-PKC-vasta-aineiden Bart RNAi-soluissa, jotka ovat peräisin S2-013 (Fig. 7A). Koska fosforylaation tasoja kohteena PKCS nostettiin Bart RNAi-soluissa (kuvio. 5F), upregulated fosfo-PKcs Bart RNAi solut valittiin lisäanalyysiä varten. Näistä PKC-a merkittävästi aktivoitiin BART knockdown in S2-013. Lisäksi PKC-a oli runsaasti fosforyloitiin ANX7 RNAi soluissa S2-013 ja PANC-1 (Fig. 7B). Seuraavaksi sitoutuminen ANX7 fosforyloituine PKC-a osoitettiin immunosaostuksella ja Western blotting analyysi S2-013 soluissa (Kuva. 8A). Fosfo-PKCη ei immunosaostettiin ANX7. Tutkitaan subsellulaariseen rinnakkaispaikantumisen fosforyloidun PKC-a, S2-013 solut immunovärjättiin. Fosforyloituu PKC-a sijaitsi lamellipodial ulkonemia (nuolet kuvassa. 8B). Lisäksi ANX7 ja fosforyloitu PKC-a rekrytoitiin etureunat aikana haavan paranemista ohjaus S2-013 soluja (ylempi paneeli kuviossa. 8C). Ehtyminen Bart eivät aiheuttaneet kertymistä ANX7 klo etureunat ja myöhemmät rinnakkaispaikantumisen fosforyloituine PKC-a (alempi paneelit kuvassa. 8C). Nämä tulokset osoittavat, että PKC-a on keskinäisessä riippuvuussuhteessa liittyy Bart ja ANX7 modulointiin PDAC solujen vaeltamiseen.

. Western blot, jossa vastaan ​​klassisen ja uusien PKC-isoformit osoittavat kaksi S2-013 kloonit transfektoidaan siRNA Bart verrattuna mock ja salattu ohjaus klooneja. B. siRNA oligonukleotidit kohdistuvat ANX7 ja negatiivisen sekoitetun ohjaus transfektoitiin transientisti S2-013 ja PANC-1-soluissa. Western blot, jossa vastaan ​​klassisen ja uusi PKC-isoformit suoritettiin.

. Immunosaostus ANX7 (vasemmanpuoleiset paneelit) tai fosfo-PKC-a (oikea paneeli) alkaen S2-013 soluista tutkittiin Western-blottauksella käyttämällä vasta-aineita ANX7, fosfori-PKC-a ja fosfo-PKCη. B. Immunosykokemialliset värjäytyminen S2-013 soluissa, määritettynä anti-fosfo-PKC-ainetta (vihreä). Sininen, DAPI värjäystä. Nuolet, fosforyloitu PKC at lamellipodial ulkonemia. Bar, 10 pm. C. Konfluentit viljelmiä ohjaus ja Bart RNAi S2-013 soluja haavoittui. 4 tunnin kuluttua solut immunovärjättiin käyttämällä anti-ANX7 (vihreä) ja anti-fosfo-PKC-a (punainen) vasta-aineita. Sininen, DAPI värjäystä. Bars, 10 pm.

Erityisiä estäjiä PKC-a inhiboivat lisääntynyt solujen maahanmuuttoa knockdovvn Bart ja ANX7

tutkia PKC-a-signalointi on osallisena lisääntynyt maahanmuutto BART tai ANX7 knockdown vuonna S2-013, joka on PKC-a /β1 estäjä Ro-32-0432 ja tiettyä PKC-a-estäjän safmgoli sovellettiin

in vitro

hyökkäystä määrityksiä. Kuten on esitetty kuviossa. 9A ja 9B, fosforyloitu PKC-a-oli nimenomaan pieneni Ro-32-0432 ja safingoli hoitoa, mutta ilmauksia fosfo-PKCη ei ole muutettu. Suurin migraatio S2-013 solujen jälkeistä kaatamalla Bart tai ANX7; kuitenkin lisääntynyt liikkuvuus estyi preinkuboimalla Ro-32-0432 (Fig. 9C) ja safmgoli (Fig. 9D). Lisääntynyt invasiivisuutta Bart tai ANX7 pudotus ei ole estetty esi-inkubointi, jossa Myristoylated pseudosubstrate PKCη estäjä (Fig. 9E) ja PKCδ estäjä (rottlerin; tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset viittaavat siihen, että aktivointi PKC-a vaaditaan PDAC migraatiota aiheuttama Bart tai ANX7 knockdown.

. Bart RNAi S2-013 solut ja S2-013 solut transfektoitiin väliaikaisesti ANX7-siRNA esikäsiteltiin tai ilman Ro-32-0432. Aktiivisuus PKC-a ja η arvioitiin Western-blottauksella. B. Solut esitetty (A) esikäsiteltiin tai ilman safmgoli. Aktiivisuus PKC-a ja PKCη arvioitiin Western-blottauksella. C. vaikutus Ro-32-0432 solujen invaasio tutkittiin käyttäen transwell invaasiomääritys. Siirtynyt solujen neljällä ryhmää kohti laskettiin. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baareja

, SD. *

p

0,001 verrattuna ei-käsiteltyihin soluihin. D. vaikutus safmgoli solujen invaasio tutkittiin käyttäen siirtokuoppaan invaasiomääritys. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baareja

, SD. *

p

0,001; **

p

0,003 verrattuna ei-käsiteltyihin soluihin. E. vaikutus rottlerin ja pseudosubstrate PKCη inhibiittorin soluinvaasion tutkittiin käyttäen transwell invaasiomääritys. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen.

Sarakkeet

, keskiarvo;

baareja

, SD.

Keskustelu

PDAC on yksi tappavimmista syövistä johtuu sen kyvystä laajasti hyökätä ympäröivien kudosten ja etäispesäkkeitä varhaisessa vaiheessa [24 ]. Laaja paikallinen tunkeutuminen ja etäpesäke ovat tärkeimmät kuolinsyitä PDAC [25]. Kun otetaan huomioon rooli BART estossa PDAC soluinvaasiota, tämä tutkimus suunniteltiin tunnistamaan Bart sitovia proteiineja liittyy PDAC solun invasiivisuus. Keskeisiä piirteitä tässä raportissa ovat seuraavat:

Bart ja ANX7 voivat toimia yhdessä monimutkaisissa estävän solujen vaeltamiseen.

Bart ja ANX7 voivat estävät solujen invaasiota vähentämällä aktiivisen PKC klo etureunat.

Fosfory- PKC-a vastaa lisääntyneestä invasiivisuuden PDAC solujen nähty Bart tai ANX7 knockdown. PKC-a on keskinäisessä riippuvuussuhteessa liittyy Bart ja ANX7 moduloinnissa invaasiokyvyssä PDAC soluja.

Usein menetys ANX7 ilmentymistä havaittiin eturauhassyöpä, erityisesti etäpesäkkeitä ja paikallisen uusiutumisen hormoneille resistentin sairauden [7]. Kun taas null

ANX7

– /- hiiret kuolevat alkionkehityksen ANX7 heterotsygoottinen hiiriä (

ANX7

+/-) kehittää, kypsä, ja ikä normaalisti, ja enemmän mielenkiintoisesti, on syöpä-altis fenotyyppi [10]. Laaja valikoima spontaaneja kasvaimia on havaittu

ANX7

+/- hiiret, kuten maksassa, eturauhasessa, kohdun limakalvo, sylkirauhasten, ja kateenkorva [11]. Hiiren, haploinsufficiency on ANX7 ekspressio näyttää ajaa etenemistä syövän takia genomin epästabiilisuuden läpi diskreetti signalointireitin, joihin kuuluu muita tuumorisuppressorigeeneille, DNA-korjauksen geenejä, ja apoptoosiin liittyvien geenien. Tuloksemme viittaavat siihen, että Bart ja ANX7 osansa vähentää fosforylaation taso PKC-a-in PDAC soluissa.

In vitro

kokeita pystynyt osoittamaan, että ANX7 suoraan vähentynyt aktiivisuus PKC (Fig. 6B); kuitenkin kuvio. 6A osoittaa lopullisesti, että ANX7 ollut substraatti PKC PDAC soluissa. Vaikka mekanismia, jolla ANX7 säätelee PKC: n aktiivisuutta ei tunneta, on huomattava, että Bart ja ANX7 voisi toimia yhdessä vähentävän aktiivisuutta PKC-a-isoformia ja puolestaan ​​tukahduttaa invaasiokyvyssä PDAC soluja. Tutkimus mahdollisti arvio solun signalointireitin säätelee

ANX7

tuumorisuppressorigeeni in PDAC. Lisätutkimuksia tarvitaan sen määrittämiseksi, mitkä molekyylit suoraan tukahduttaa PKC-a, ja tunnistaa tarkka alustoille PKC-a, jotta ymmärtää liittyviä mekanismeja BART-ANX7 estoa soluinvaasiota.

rooli PKC-a-in PDAC solumigraation ei tutkittu laajasti. Useat erilliset näytöt viittaavat siihen, että PKC-a pelaa kriittinen rooli solujen lisääntymistä /muuttoliike /invaasio, mukaan lukien ihmisen huonosti eriytetty maksan syöpä [26], kohdun limakalvon syöpä [27] ja mahasyövän [28]. Cell signalointipolkujen joihin PKC perheen aloittanut ligandin, kuten kasvutekijä, sitä vastaavaan solun pinnan reseptoriin, joka laukaisee jakautuminen fosfolipideistä phospholipases C ja D ja tuotannon diasyyliglyserolia (DAG). DAG sitoutuu ja aktivoi useimmat PKC-isoformit, jotka sitten siirtävät erityisiä subsellulaaristen, että vaihtelevat PKC-isoformin ja solutyypistä. Lopulta MAPK, mukaan lukien ekstrasellulaarisen signaalin säädelty proteiinikinaasi (ERK), c-jun N-terminaalista kinaasin (JNK), ja p38MAPK, on ​​ratkaiseva rooli solujen muuttoliikkeen välittyy PMA-aktivoitujen PKCS [19], [29 ]. Bart ja ANX7 kumoaa fosforylaation ERK on PDAC solujen on osoitettu (tietoja ei esitetä), viittaa siihen, että PKC-a voi liittyä moduloimaan ERK aktiivisuus liittyy mahdollisesti Bart-ANX7 liittyvät inhibition invasiivisuus. Lisäksi on mahdollista, että PKC-a-indusoidun eksosytoosilla moduloi solujen vaeltamiseen. Niinpä tulevissa tutkimuksissa PKC-a perusteltua edelleen luonnehtia sen exocitic toiminta ja selventämään sen mahdollisesta vaikutuksesta solujen vaeltamiseen.

Yhteenvetona esitetyt havainnot tässä tutkimuksessa ovat kannustavia n keskeisiä rooleja Bart koordinoituun asetuksessa PKC-a-aktiivisuuden

kautta

sitova ANX7. Toiminnallinen merkitys yhdistyksen BART, ANX7 ja PKC-a-moduloinnissa invaasiokyvyssä PDAC solujen perustettiin. On mahdollista, että Bart ja ANX7 voivat selvästi säädellä alavirran signalointia PKC-a, joka on mahdollisesti merkitystä soluinvaasiota toimimalla anti-invasiivisia molekyylejä.