Krooninen sairaus

tiivistelmä

Molecular diagnostiikka ihmisen syövissä voi lisätä tarkkuutta ennuste, helpottaa valintaa optimaalisen hoito-ohjelman , parantaa potilaiden hoitotuloksiin, vähentää kustannuksia hoidon ja hyväksi kehittäminen yksilöllisiä lähestymistapoja potilaiden hoitoa. Lisäksi herkkyys ja tarkkuus ovat keskeisiä ominaisuuksia tahansa diagnostisen menetelmän. Olemme kehittäneet erittäin herkkä mikrosirun havaitsemiseksi yhteisen KRAS ja BRAF onkogeenisten mutaatioiden. Kolorektaalisyövässä, KRAS ja BRAF mutaatioita on osoitettu tunnistamaan klusterin potilailla, jotka eivät reagoi anti-EGFR-hoitojen; tunnistaminen Näiden mutaatioiden vuoksi on kliinisesti erittäin tärkeää. Voit tarkistaa tekniset ominaisuudet mikrosirun järjestelmän oikeaa tunnistamista KRAS mutaatiostatuksesta riippumatta kahdessa hotspot kodonit 12 ja 13 ja BRAF

V600E mutaatio peräsuolen kasvain, valitsimme 75 näytettä aiemmin ominaista tavanomaisilla ja CO- vahvistus alemmilla denaturaatiolämpötilassa-PCR (COLD-PCR) ja sen jälkeen High Resolution sulamisanalyysi ja suoralla sekvensoinnilla. Näistä näytteistä 60 kerättiin leikkauksen aikana ja heti täynnä RNAlater kun 15 jakojäännösten olivat formaliinilla kiinnitetyt ja parafinoidut (FFPE) kudoksiin. Detektioraja ehdotetun menetelmän oli erilainen 7 KRAS mutaatiot testattiin sekä V600E BRAF mutaatio. Erityisesti mikrosiru on pystynyt havaitsemaan vähintään noin 0,01% mutatoitujen alleelien taustalla villityypin DNA: ta. Sokea validointi näytetään täysin yhteneväinen tuloksia. Erinomainen sopimus tulokset osoittivat, että uusi mikrosiru alusta on erittäin spesifinen myöntämismenettelyissä oikeassa genotyyppi ilman väkevöintiä strategiaa.

Citation: Galbiati S, Damin F, Pinzani P, Mancini I Vinci S, Chiari M , et ai. (2013) Uusi Microarray Alustan Ultra-Sensitive genotyypin KRAS ja BRAF Gene variantit peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (3): e59939. doi: 10,1371 /journal.pone.0059939

Editor: Ajay Goel, Baylor University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 06 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 21 helmikuu 2013; Julkaistu 25 maaliskuuta 2013

Copyright: © 2013 Galbiati et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

määrittely molekyylimerkkiaineet ihmisen syövistä voitaisiin keskeinen kehittämistä henkilökohtainen lähestymistapa potilaan hoitoon. Itse tunnistaminen asianmukaisten biomarkkereiden saattaisi lisätä tarkkuutta ennuste, helpottaa valintaa optimaalisen hoito-ohjelman, parantaa potilaiden hoitotuloksiin, ja alentaa kustannuksia hoidon [1]. Siten kerrostumista single potilaiden perustuu molekyylien ja geneettisiä ominaisuuksia on odotettu kehitys modernin kliinisen onkologian.

Äskettäin terapeuttisten aineiden kohdentamista tiettyihin geneettisiä variantteja ja hyvin tunnettu molekyyli reittejä on kehitetty. Tässä tapauksessa onkogeenin KRAS, joka on osa signalointireitin useita eri molekyylejä. Gain-of-function missensemutaatioita usein somaattisesti hankitaan peräsuolen syövän, vallitsevasti kolme hot spot edustaa kodoneja 12, 13, ja 61. Valitettavasti näillä tasoilla määrä vaihdot on korkea, joten niiden havaitseminen monimutkaisempi alleelispesifistä tekniikat. Konstitutiivisesti, aktivoivat mutaatiot näillä hot spot sivustot voivat määrittää vastustuskyky EGFR kohdistetut hoitomuodot, jotka pitäisi muuten parantaa merkittävästi eloonjäämisaste ja elämänlaatua potilaiden [2], [3], [4], [5]. Mahdollisuuksia KRAS kodonioptimoida 12/13 mutaatioita tehokkaina molekyylimarkkereita huumeiden valinta on saanut paljon huomiota johtaa niiden käyttöä rutiini kärsivien potilaiden hoidon ja peräsuolen syöpä [6]. Eurooppalainen terveysviranomaisen (https://www.emea.europa.eu/pdfs/human/press/pr/27923508en.pdf.) Sekä American Society for Clinical Oncology [7] ja National Kattava Cancer Network (NCCN , https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/PDF/colon.pdf.) vaativat KRAS mutaatioanalyysiin siitä peräsuolen syövän ennen anti-EGFR terapia.

Toinen lupaava biomarkkereiden anti-EGFR vastus edustaa BRAF

V600E mutaatio, joka esiintyy noin 10% paksusuolen ja peräsuolen syöpiä. BRAF on välitön alavirtavaikuttajainhibiittorit KRAS Ras /Raf /MAPK signalointireitin ja BRAF

V600E aktivoiva mutaatio on toisensa poissulkevia KRAS mutaatioita [6]. Huolimatta tällä hetkellä rajoitettu data, ja puute täydellistä yksimielisyyttä, on todennäköistä, että BRAF mutaatiot on rooli määritettäessä vastauksena EGFR mAb hoitoa ja se liittyy huonompi ennuste, riippumatta hoidon [8], [9]. Lisäksi potilailla, joilla on kasvaimia kuljettavat mutantti BRAF saattavat myös hyötyä selektiivisiä BRAF estäjät, kuten PLX-4032 [10].

Tässä skenaariossa seulonta strategioita, nykyinen analyysimenetelmät (tavanomaisen sekvensoinnin, pyrosekvensointi jne .) ovat aikaa vieviä, kalliita ja niiltä puuttuu kestävyys. Toinen esiin nouseva kysymys on yhdistetty todellisen näiden menetelmien herkkyys jotka näyttävät havaita vähemmistö mutatoituja alleeleja vasta kun läsnä suurempina pitoisuuksina 10-20%. Aiemmissa työt [11], [12], me korosti herkkyyden havaitsemiseen vähemmistön mutatoitujen alleelien biologisissa näytteissä ja vahvisti hyödyllisyydestä COLD-PCR niiden rikastamiseen, erityisesti näytteitä alhainen prosenttiosuuksia syöpäsoluja. Keskimäärin 15% potilaista aluksi luokiteltu negatiivinen KRAS tai BRAF

V600E variantteja löydettiin positiivinen jälkeen COLD-PCR [11], [12].

mikrosirut ovat edullinen ja tarkka työkalu rinnakkaisten genotyypitys useita markkereita, jotka soveltuvat rutiinianalyyseihin lääketieteellisessä diagnostiikassa [13]. Täällä raportoimme kehittämisestä erittäin herkkä mikrosirun havaitsemiseksi KRAS ja BRAF mutaatioita. Microarray on kehitetty käyttämällä kiteisen piin dia päällystetty termisesti kasvatettu piidioksidia (SiO

2) kerroksen ja funktionalisoitu adsorboimalla kopolymeeriä dimetyyliakryyliamidia (DMA), N-acryloyloxysucinimide (NAS) ja meta-acryloy -propyylitrimetoksisilaani (MAPS), kopoly (DMA-NAS-MAPS), alun perin kehitetty lasi DNA mikrosiruja [14]. Selkäranka polymeeri koostuu DMA-monomeeri, joka adsorboituu pinnalle vetysidosten; NAS on kemiallisesti reaktiivinen monomeeri, joka reagoi kovalenttisesti bio-antureista, kun taas MAPS edistää elokuva vakautta kondensoimalla pinta silanoleja. Pinnoite on yksinkertainen ja toistettavissa verrattuna orgaaniset silanointi, prosessi, joka vaatii hyvin valvotuissa olosuhteissa ja kärsivät huonosta toistettavuus. Tämä polymeeri on laajalti sovellettu bioanturin alalla bio-funktionalisaation polystyreeniä nanohelmien [15], pii microcantilevers [16], polydimetyylisiloksaania [17], ja nitroselluloosa [18] alustoille.

Valinta piisubstraatin päällystetty kerroksella SiO

2 100 nm paksuus johtaa voimakkaaseen tiivistämistä fluoresenssi pinnalla johtuvat optisesta rakentava väliset häiriöt ja heijastuneen valot fluoresoivan säteilyn. Kunto rakenteellinen interferenssi, on alustan pinta täyttyy useita erilaisia ​​lasilevyjen päällystetty kerroksia dielektristä ainetta tai metallikalvoja [19]. Kuitenkin strategia mukana tällaisten monimutkaisten monikerrosrakenteita usein kärsii alhainen toistettavuus ja vaikea prosessi valvontaa. Yksinkertaisin kokoonpano saavuttaa fluoresoiva lisälaite lähellä toimittamat monikerroksinen dioja koostuu piin Planar heijastin päällystetty ohuella kalvolla SiO

2 [20], [21] ehdottamia tätä työtä.

arvioimiseksi tekninen suorituskyky äskettäin kehitetty alusta ja tarkistaa sen kyky korjata genotyypin KRAS ja BRAF

V600E mutaatioiden peräsuolen kasvain näytteissä, valitsimme 60 kudosnäytteitä jo luokiteltu näitä geneettisiä variantteja täydellisellä protokollat ​​perinteisen ja COLD -PCR, High Resolution sulamisanalyysi ja suoralla sekvensoinnilla. Erinomainen tulos tuloksista keskustellaan, jotta voidaan osoittaa edut ja haitat molempia tekniikoita.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics

kudosnäytteitä kerättiin Azienda Ospedaliera Universitaria Careggi Firenze (Italia) 75 leikkauspotilaiden CRC kaudella 1/6 /2009-2 /5/2011. Kaikki henkilöt tähän tutkimukseen rekisteröidyt kunhan kirjallinen lupa. Tutkimuksen hyväksyi kistusneuvostolta yliopiston Florence. Lisäksi olemme käyttäneet kahta solulinjaa, jonka ATCC-LGC Standards-yhteistyö: CCRF-CEM-solulinja viitteenä KRAS mutaatio p.G12D (heterotsygoottinen) ja ihmisen melanooma A375: n lähteenä homotsygoottinen BRAF

V600E DNA . Ihmisen kolorektaalikarsinoomasolulinjaa SW620 (käytetään viitteenä KRAS mutaation pG12V, homozygousand ihmisen rintasyövän MCF-7 (villin tyypin sekä KRAS ja BRAF geenit) toimitti Banca Biologica e Cell Factory (IRCCS Azienda Ospedaliera Universitaria San Martino – IST Instituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro).

näytteen valmistus

Sixty kudosnäytteitä kerättiin leikkauksen aikana ja heti täynnä RNAlater (Qiagen Gmbh, Hilden, Saksa) 4 ° C 24 tuntia ja sen jälkeen säilytettiin -80 ° C: ssa analyysiin asti. kudokset hajotettiin Tissue lyser ruostumatonta terästä helmiä 5 mm (Qiagen) mukaan valmistajan ohjeiden. DNA: n puhdistus suoritettiin QIAcube ™ ja QIAamp DNA mini Kit (Qiagen ).

DNA-pitoisuus määritettiin Nanodrop ND-1000 Spektrofotometri (Thermo Scientific, DE, USA).

lisäksi 15 FFPE kudokset analysoitiin myös, DNA FFPE kudoksista uutettiin käyttäen FFPE Tissue kit (Qiagen) seuraavasti valmistajan ohjeita.

DNA-näytteet ensin tutkittu tavanomaisilla PCR ja COLD-PCR-monistukseen, jota seuraa HRM ja suoralla sekvensoinnilla. Myöhemmin he sokeasti toimitettiin analyysi äskettäin kehitetty mikrosiru laite aasit sen kyky KRAS ja BRAF mutaatioita genotyypitys.

Positiivinen kontrolli näytteet edustaa DNA solulinjojen mutaatioita kohde geenejä (katso edellinen jakso Ethics). Erityisesti villityypin ja mutantti-näytteet analysoitiin erikseen yksittäisten näytteiden ja seokset, saadakseen tunnettu prosenttiosuus mutatoidun alleelin (6%: sta 0,01%), jota käytetään määritettäessä määrityksen herkkyyden KRAS p.G12D ja BRAF V600E variantteja.

Lisäksi plasmidi-DNA, joka sisältää villityypin sekvenssit ja vaihtoehtoisesti kaikki pitää varianttien saamiseksi käytettiin liuotetaan näytteet osoittaa määrityksen herkkyys ja spesifisyys kaikkien muiden KRAS mutaatioita.

mutageneesi

mutantti-, joissa plasmidit muodostettiin kloonaamalla erityisten mutatoidun PCR-tuotteiden kätkeminen seitsemän mutaatiot testattiin määrityksessä ja vastaavan villityypin fragmentti. Mutagenisoidut fragmentit valmistettiin käyttäen muunnelmaa menetelmästä, on aiemmin kuvattu [22]. Lyhyesti, mutageneesi saavutettiin jakamalla jokainen amplikoni kahdeksi palasia. 5′-fragmentti monistettiin sitten alkuperäiseen eteenpäin aluketta ja mutagenoidulla käänteisaluke käyttöön konservatiivinen transversioon. Rinnan, 3 ’fragmentti monistettiin alkuperäisen käänteisaluketta ja mutagenoidun eteenpäin alukkeen käyttöön saman nukleotidin muutos, kuten edellä (katso taulukko S1). Tämä johti tuotantoon kaksi osittain päällekkäistä fragmentit, jotka olivat kukin geeliä eluoitiin lopullisessa tilavuudessa 50-100 ui tislattua vettä poistamiseksi kuin sisällytetty alukkeita. Olemme sekoitettu 2 ui kutakin eluoituun liuokseen yhdessä; Kunkin jälkeen seosta pitkänomainen 15 sykliä läsnä ollessa PCR-reaktioseosta, joka sisälsi kaikki reagenssit, mutta alukkeita. Tuotteen venymä reaktion, mikä johtaa täyspitkän keskitetysti mutagenisoiduilla fragmentti, oli edelleen PCR-monistettiin 20-30 sykliä lisäämällä koko PCR-seos ja kloonattiin plasmidivektorin (TOPO TA Cloning, Invitrogen, Life Technologies, Milano, Italia ) valmistajan protokollan. Suora sekvensointi vahvisti, että halutut nukleotidin muutos otettiin mutagenisoidulla ohjaus.

PCR-olosuhteet

eksoni 2 KRAS-geenin monistettiin seuraavaa alukesarjaa: 5′-GCC TGC TGA AAA TGA CTG AA -3 ’(eteenpäin) ja 5′- AGA ATG GTC CTG CAC CAG TAA-3′ (5-amino-modifioitu, käänteinen) tuottaa 167 ep: n fragmentti. Käytetyt alukkeet monistusta BRAF eksonin 15 (amplikonin koko 173 bp) oli 5’- TGC TTG CTC TGA TAG GAA AAT G-3 ’(eteenpäin) ja 5′-CCA CAA AAT GGA TCC AGA CA-3’ (5-amino modifioituja, käänteinen).

PCR molemmat geenit suoritettiin 25 ui reaktiossa, joka sisälsi 15 ng DNA: ta, 200 uM kutakin deoksinukleotidi, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 m m KCI, 1,5 mM MgCl

2, 1,5 U DNA-polymeraasia (AmpliTaq Gold, Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ja 10 pmol kutakin aluketta. Sykliolosuhteita merkitsi alkudenaturaatio 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 35 sykliä 95 ° C: ssa 30 s, 58 ° C: ssa 30 s ja 72 ° C: ssa 30 s, ja lopullinen pidennys 72 ° C ° C: ssa 10 minuutin ajan .

PCR puhdistus

Kun vahvistus prosessi, kukin amplikoni puhdistettiin ja niistä poistettiin suola käyttämällä 96-kuoppaiselle levylle (Multiscreen-PCR levyt MANU 030) yhdessä Multiscreen Separation System (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA). PCR-tuotteet eluoitiin 35 ui 1 x tulostus puskuria (150 mM natriumfosfaattia, pH 8,5).

Reporter ja stabilointiaine suunnittelu

Toimittajat suunniteltiin dot-blot muodossa pohjan vaihtelu joka vastaa kohteiden sijaitsevat sisäisesti (taulukko 1). Universaali merkinnät formaatti käytettiin (kuvio 1), joka perustuu toimittajat sisältää sekvenssin erityisiä hännän joka hybridisoituu universaali Cy3 tai Cy5 leimatut koettimet (villin tyypin koetin: CTC AAT GTT CGG ACT CAG-Cy3; mutantti koetin: TGT CAA GCG ATA TAC TGC-Cy5) [23].

Hybridisaatio vaiheet: 1) stabilointiaine oligonukleotidi avaa sekundaarirakenteen PCR-fragmentin; 2) ”universaali reportteri mix”. Yhdistelmä sisältää villin tyypin ja mutantti toimittajille. Jokainen toimittaja pidennetään hännän täydentävä leimatun universaali oligonukleotidi. Syaniini 3- (Cy3) ja syaniini 5- (Cy5) leimattu universaali oligonukleotidi kiinnittyvät villityyppi- ja mutantti toimittajille, vastaavasti.

Stabilizer (oligonukleotidi tarpeen avata sekundäärirakenteiden läsnä amplikonin) ja toimittaja muotoilu suoritettiin avulla web-vapaat ohjelmat (DNAmfold server: https://www.bioinfo.rpi.edu/Ezukerm/rna ja OligoAnalyzer 3,0 Integrated DNA Technologies: http: //www.idtdna .com) [24]. Kaikki toimittajat suunniteltiin käyttäen antisense-juosteen kuin kohde amplikonin. Kaikki 7 KRAS mutaatiot analysoitiin samalla stabilointiaine oligonukleotidin esitetty taulukossa 1. kodoni 600 BRAF mutaatio edellytti kaksi stabilointiaineita (Stab 1: sijaitsee 5 ’mutaatioon; Stab 2: sijaitsee 3’ mutaatio , esitetty taulukossa 1).

Silicon kalvolta ja mikrosirujen valmistelu

Hoitamaton pii liukuu 1000A Thermal Oxide (14 x 14 mm

2) toimitti SVM, Silicon Valley Microelectronics Inc . (Santa Clara, CA USA). Silicon objektilasit esikäsitelty 0,1 M natriumhydroksidia 30 minuutin ajan ja pestiin vedellä ja kuivattiin. Esikäsittelyn jälkeen, pii diat upotettiin 30 min kopoly (DMA-NAS-MAPS) (1% paino /tilavuus 0,9 M (NH 4)

2SO

4 vesiliuosta). Kopoly (DMA-NAS-MAPS) syntetisoitiin ja karakterisoitiin, kuten on kuvattu [14].

Objektilasit huuhdeltiin lopuksi vedellä ja kuivattiin vakuumissa 80 ° C: ssa.

PCR-tuotteet kullekin geeni, monistettiin alukkeilla, joissa on 5 ’primaarinen aminoryhmä, on tarpeen sitoa amplikonit kovalenttisesti substraattiin välinen reaktio aminoryhmien ja aktiiviset esterit polymeeripinnoitteen, nähtiin microarray alustoille. Kolme ui amino-modifioitu amplikoneja painettiin 6 rinnakkaisten pietsosähköistä spotter, SciFLEXARRAYER S5 (Scienion Saksa), päällystetyn piin dioja. Aminoa modifioitu oligonukleotidi leimattu Cy3 huomattiin kuin paikkasidonnainen viittaus neljään sarakkeeseen joka array. Tiputtelua olosuhteet tehtiin kuten on kuvattu [25]. Amplikoneista kytkettiin paneelit inkuboimalla avoimessa säilytyslaatikko, vahvistetut suljetussa kammiossa, kyllästetään natriumkloridilla (40 g /100 ml H

2O) ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa yön yli.

inkubaation jälkeen, kaikki jäljellä reaktiivisia ryhmiä pinnoitteen polymeerin blokattiin kastamalla luistin esilämmitetään blokkausliuoksessa kuten on raportoitu [25].

hybridisaatio

Juuri ennen hybridisaatiota, painettu levyt kastettiin 0,1 M NaOH: ssa 5 min denaturoimiseksi kaksijuosteisen immobilisoitu amplikoneja, sitten huuhdeltiin vedellä ja kuivattiin. Sekvenssit toimittajat ja stabilointiaineiden kanssa hybridisaatio lämpötilat esitetään taulukossa 1. Ensimmäisessä vaiheessa, 0,5 ui stabilointiaineen oligonukleotidiä sekoitettiin 49,5 ui hybridisaatio- puskuria (2 x SSC, 0,1% SDS, 0,2 mg /ml BSA: ta) jopa 1 uM lopullinen pitoisuus ja levitetään täplikäs alue dian. Levyjä inkuboitiin 20 ° C: ssa 30 min Thermomixer Comfort (Eppendorf) hybridisaatio kammio, ja sitten pestään huoneenlämpötilassa 4 × SSC puskurilla poista kansi lipsahdus. Tämä ensimmäinen pesuvaihe seurasi lyhyt pesu (30 t) vähäsuolainen puskuria (0,2 x SSC). Sitten havaitsemiseksi G12S, G12D, G12C, G12R, G13D KRAS mutaatioita ja BRAF

V600E mutaatioita, toimittaja, että villityypin ja mutatoidun sekvenssit ja niitä vastaavat yleistä oligonukleotidit leimattiin Cy3 ja Cy5 vastaavasti, sekoitettiin yhteen ekvimolaariset määrät (lopullinen konsentraatio 1 uM) ja lisättiin hybridisaatiopuskuriin (2 x SSC, 0,1% SDS, 0,2 mg /ml BSA: ta) (katso kuvio 1 määritystä järjestelmä). Kun kyseessä on G12A ja G12V KRAS mutaatiot oli tarpeen inkuboitua amplikonien kahdessa peräkkäisessä vaiheessa. Ensimmäisessä vaiheessa amplikoneista hybridisoitiin toimittaja komplementaarinen mutatoidun sekvenssin yhdessä vastaavan universaali oligonukleotidi leimataan Cy5; Sitten, kun lyhyen pesu 4 x SSC poistaa kannen liukua, että toinen amplikoneista hybridisoitiin toimittaja komplementaarinen villityyppi- ja sen vastaava universaali oligonukleotidi leimattu Cy3. Molemmat inkubaatiot kesti 1 tunnin.

Lopuksi pii Levyt poistettiin hybridisaatio kammiosta ja liotetaan lyhyesti 4 x SSC-puskuria irrottaa kannen slip, pestiin kahdesti 5 min 2 x SSC /0,1% SDS , esilämmitetty on spesifinen hybridisaatio lämpötilassa, sitten upotetaan, peräkkäin, liuoksessa 0,2 x SSC: ssä ja 0,1 x SSC: ssa 1 min ajan huoneenlämpötilassa, kuivataan sentrifugoimalla 780 rpm: ssa 3 minuutin ajan ja se skannataan.

Kuva skannaus ja tietojen analysointi

ProScanArray (Perkin Elmer, MA, USA) käytettiin skannata hybridisoituneen dioja. Erityisesti vihreä laser (λ

ex 543 nm /λ

em 570 nm) Cy3 väriainetta ja punainen laser (λ

ex 633 nm /λ

em 670 nm) Cy5 väriaine sovellettiin. Valomonistinput- (PMT) putki vahvistus ja hitsaustehot muuttaa välillä fluorokromien ja eri kokeessa. 16-bittinen TIFF-kuvat analysoitiin 5 um resoluutio. Tiedot intensiteettiä uutettiin skannerin ohjelmiston ja datan analyysi suoritettiin kunkin kokeen aikaisemmin kuvatulla [25].

Perinteiset ja COLD-PCR-monistamisen seurasi High Resolution Sulaminen (HRM) ja suoralla sekvensoinnilla

Perinteiset PCR, COLD-PCR, HRM ja sekvensointi protokollat ​​on jo kuvattu [11], [26].

tulokset

1) Perinteiset ja COLD-PCR-monistus HRM ja sekvensointi tulokset

Aluksi kaikki 75 näytettä seulottiin tutkimukseen KRAS mutaatioiden ja BRAF

V600E HRM ja sekvensoinnilla. Toisessa vaiheessa, kaikki näytteet (mutatoitunut ja villin tyypin) olivat uudelleen täydelliseen seulonta käyttäen COLD-PCR-monistukseen, jota seuraa HRM ja sekvensointi kuten jo raportoitu [11].

Maailmanlaajuisesti 59 ulos 75 näytteiden sisälsivät vaihtoehtoisesti yksi mutaatio joko KRAS kuormittajat tai BRAF

V600E variantti, kun taas 16 luokiteltiin villityypin näytteitä ja negatiivisina verrokkeina mukaan. On tärkeää huomata, että 9/59 mutatoitu näytteiden tunnistaminen emässubstituutiot oli mahdollista vain käyttämällä nopeasti tai koko COLD-PCR, mikä todennäköisesti johtuu alemman prosenttiosuudet mutatoitujen alleelien lähtö- näytteistä. Nämä näytteet osuvasti käyttöön Validointitutkimuksessa herkkyyden testaamiseksi ehdotetun alustan. Yksityiskohtainen kuvaus jakelun KRAS ja BRAF variantit meidän näytteitä katso taulukko 2.

2) optimointi Piin slide analyysin

Villityypin vertailunäytteet sekä saatettua heterotsygoottinen ohjaus näytteet (tuottamat asianmukaisesti sekoittamalla plasmidi-DNA, joka sisältää villityypin ja mutatoiduista sekvensseistä kaikki 7 KRAS mutaatioita ja BRAF

V600E varianttia), käytettiin testaamaan spesifisyyttä. Sen jälkeen optimointi lämpötilan ja hybridisaatio aikaan oikea tunnistaminen kaikkien genotyyppien saavutettiin. Eräs esimerkki on esitetty kuvioissa 2 ja 3, joissa hybridisaatio kokeilun G12R KRAS ja BRAF

V600E mutaatio on esitetty, vastaavasti. Optimoidussa järjestelmässä kaikki analysoitiin mutaatiot voisimme näyttöä siitä, että: i) fluoresoivat signaalit olivat korkeat, ii) ei ristiinhybridisoitumisen saatiin edes variantteja, jotka vaikuttavat samassa tai viereisessä nukleotidikohdissa (kuvio 2D) ja iii) hyvä toistettavuus paikasta toiseen (esitetty virhepalkeilla) havaittiin.

(A) mikrosiru skannausta Cy3 fluoresenssin signaali, joka vastaa villityypin alleelin. Kohteet sarakkeessa 1,2,3,4 edustavat aminomodifioituja oligonukleotidi leimattu Cy3 käytettävä viitteenä paikkoja. (B) skannausta Cy5 fluoresenssin signaali, joka vastaa mutatoituneen alleelin. (C) mikrosirujen tiputtelua järjestelmään. wt: villityyppinen kontrollinäytteitä; Het1, Het2 ja Het3: heterotsygoottinen ohjaus näytteitä G12A, G12C, G12R, G12S, G12V, G13D; G12D KRAS mutaatiot; vaaleanharmaa neliöt edustavat aminomodifioituja oligonukleotidi leimattu Cy3 käytettävä viitteenä paikkoja. (D) normalisoitu suhteellinen fluoresenssin voimakkuus, kun hybridisaatio tunnettuja näytteitä kanssa Toimittajat täydentävät G12R vaihtelua. Palkit ovat keskiarvo intensiteetin 6 toistojen kunkin näytteen. Virhepalkit ovat keskihajonnat fluoresenssin voimakkuus kunkin näytteen.

(A) Cy3 fluoresenssin signaalin, joka vastaa villityypin alleelin. Kohteet sarakkeessa 1,2,3,4 edustavat aminomodifioituja oligonukleotidi leimattu Cy3 käytettävä viitteenä paikkoja. (B) Cy5 fluoresenssin signaalin, joka vastaa mutatoituneen alleelin. (C) mikrosirujen tiputtelua järjestelmään. wt: villityyppinen kontrollinäytteitä; Het1, Het2 ja Het3: heterotsygoottinen kontrollinäytteitä; mut: homotsygoottista mutantti kontrollinäytteestä; vaaleanharmaa neliöt edustavat aminomodifioituja oligonukleotidi leimattu Cy3 käytettävä viitteenä paikkoja. (D) normalisoitu suhteellinen fluoresenssin voimakkuus, kun hybridisaatio tunnettuja näytteitä kanssa Toimittajat täydentävä V600E BRAF vaihtelua. Palkit ovat keskiarvo intensiteetin 6 toistojen kunkin näytteen. Virhepalkit ovat keskihajonnat fluoresenssin voimakkuus kunkin näytteen.

3) herkkyys määrityksessä

herkkyys määrityksessä erotteleva eri suhteissa mutatoitujen alleelien arvioitiin sarjalaimennoksia (6%, 3%, 1,6%, 0,8%, 0,4%, 0,2%, 0,1%, 0,05%, 0,02%, 0,01% mutatoitu /villityypin) mutatoidun DNA sopivasti sekoittaa villin tyypin DNA. Erityisesti käytimme CCRF-CEM-solulinja viitteenä KRAS mutaatio p.G12D (heterotsygoottinen), ihmisen kolorektaalikarsinoomasolulinjaa SW620 (käytetään viitteenä KRAS mutaation pG12V, homotsygoottinen), ja ihmisen melanoomasolulinjat A375 (käytetään lähde homotsygoottisen BRAF

V600E DNA). Ihmisen rintasyövän MCF-7 käytettiin villin tyypin sekä KRAS ja BRAF geenejä. Kaikkien muiden KRAS mutaatiot käytimme mutantti-laakeri plasmidien tuottamat.

toteamisraja ehdotetun menetelmän oli erilainen 7 KRAS mutaatiot testattiin sekä V600E BRAF mutaatio. Erityisesti mikrosiru on pystynyt havaitsemaan vähintään noin 0,01% mutatoitujen alleelien taustalla villityypin DNA: ta G13D mutaation, noin 0,025% mutatoidun alleelin G12R mutaation, 0,05% varten G12C mutaation , 0,1% varten G12D mutaation, 0,2% varten V600E BRAF-mutaatio, 0,4% varten G12A ja G12S mutaatiot ja 0,8% varten G12V vastaavasti. Kuviossa 4 kaksi esimerkkiä tuloksista, jotka on saatu G13D KRAS mutaatio ja BRAF

V600E mutaatio on esitetty.

Detection raja G13D mutaatio (A) ja V600E BRAF-mutaatio (B) . wt: villityyppinen kontrollinäytteitä; Het1, Het2 ja Het3: heterotsygoottinen kontrollinäytteitä; numerot 1-10: sarjalaimennoksia, 1 = 6%, 2 = 3%, 3 = 1,6%, 4 = 0,8%, 5 = 0,4%, 6 = 0,2%, 7 = 0,1%, 8 = 0,05%, 9 = 0,02%, 10 = 0,01% vastaavasti. Palkit ovat keskiarvo intensiteetin 6 toistojen kunkin näytteen. Virhe palkit ovat keskihajontojen fluoresenssin voimakkuutta kunkin näytteen.

4) Blind validointi

Määrityksen validointi suoritettiin sokkona analysoimalla 75 näytettä aiheista joko positiivinen tai villin tyypin KRAS ja BRAF mutaatioita, aiemmin tunnettu HRM ja suoralla sekvensoinnilla. Esimerkiksi microarray tulokset G12C KRAS-mutaatio ja BRAF

V600E mutaatio jäädytettyä kudoksia on esitetty kuvioissa 5 ja 6, vastaavasti. Lisäksi kuviossa 7 ja 8 mikrosirun tulokset G12R KRAS-mutaatio ja BRAF

V600E mutaatio FFPE näytteet on esitetty, vastaavasti. Järjestelmä oli erittäin spesifinen osoitetaan oikea genotyyppi kaikkiin näytteisiin. Blind validointi näkyy täysin yhteneväinen tuloksista (taulukko 2) odotetun lukuun ottamatta näytteiden N.31 ja N.40 kantaen p.G13C ja p.V14I KRAS variantteja, jotka nimenomaisesti esiteltiin testata spesifisyyden äskettäin kehitetty koettimia (katso taulukko 2).

(A) Cy5 fluoresenssin signaalin, joka vastaa mutatoituneen alleelin. (B) tiputtelua järjestelmään. wt: villityyppinen kontrollinäytteitä; Het1, Het2 ja Het3: heterotsygoottinen ohjaus näytteitä G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G13D, G12V KRAS mutaatiot; numerot 1-60: kuusikymmentä erilaista kiinteän kasvaimen DNA-näytteitä. Harmaa markkereita edustavat näytteet positiivisia G12C mutaation; vaaleanharmaa neliöt edustavat aminomodifioituja oligonukleotidi leimattu Cy3 käytettävä viitteenä paikkoja. (C) HRM analyysi näytteen numero 30 (numero 2) verrattuna sulaminen profiileja kontrollinäytteitä (villityyppinen viite = numero 1; mutatoitunut viittaus = numero 3) jälkeen monistuksen COLD-PCR: sulaminen käyttäytyminen on suggestiivinen läsnäolo of mutatoitunut DNA näytteessä. (D) suora sekvensointi analyysi näytteen numero 30 toimitettu COLD-PCR-monistus protokolla: Tällä elektroferogrammi vahvistaa läsnäoloa mutatoitunut DNA (G12C) näytteessä.

(A) Cy3 fluoresenssi signaalin, joka vastaa villityypin alleelin. Kohteet sarakkeessa 1,2,3,4 edustavat aminomodifioituja oligonukleotidi leimattu Cy3 käytettävä viitteenä paikkoja. (B) Cy5 fluoresenssin signaalin, joka vastaa mutatoituneen alleelin. (C) tiputtelua järjestelmään. wt: villityyppinen kontrollinäytteitä; BRAF Het1, Het2 ja Het3: heterotsygoottinen kontrollinäytteitä; mut: homotsygoottista mutantti kontrollinäytteestä; numerot 1-60: kuusikymmentä erilaista kiinteä kasvain näytteissä. Harmaa markkereita edustavat näytteet positiivisia BRAF mutaation; vaaleanharmaa neliöt edustavat amino-modifioitu oligonukleotidi leimattu Cy3: lla on käytetty vertailukohtana paikkoja.

(A) Cy3 fluoresenssin signaalin, joka vastaa villityypin alleelin. Kohteet sarakkeessa 1,2,3,4 edustavat aminomodifioituja oligonukleotidi leimattu Cy3 käytettävä viitteenä paikkoja. (B) Cy5 fluoresenssin signaalin, joka vastaa mutatoituneen alleelin. (C) tiputtelua järjestelmään. wt: villityyppinen kontrollinäytteitä; het: heterotsygoottista ohjaus näytteitä G12A, G12C, G12D, G12R, G12S, G12V, G13D, KRAS mutaatiot; numerot 1 ja 15: viisitoista erilaista FFPE kiinteän kasvaimen DNA-näytteitä. Harmaa markkereita edustavat näytteet positiivisia G12R mutaation; vaaleanharmaa neliöt edustavat aminomodifioituja oligonukleotidi leimattu Cy3 käytettävä viitteenä paikkoja. (D) Suhteellinen fluoresenssi-intensiteetti ilmaisemiseksi järjestelmän herkkyyttä arvioitiin G12R mutaation. wt: villityyppinen kontrollinäytteitä; het: heterotsygoottinen kontrollinäytteitä; numerot 1 ja 15: FFPE näytettä. Palkit ovat keskiarvo intensiteetin 6 toistojen kunkin näytteen. Virhepalkit ovat keskihajonnat fluoresenssin voimakkuus kunkin näytteen.

(A) Cy3 fluoresenssin signaalin, joka vastaa villityypin alleelin. Kohteet sarakkeessa 1,2,3,4 edustavat aminomodifioituja oligonukleotidi leimattu Cy3 käytettävä viitteenä paikkoja. (B) Cy5 fluoresenssin signaalin, joka vastaa mutatoituneen alleelin. (C) tiputtelua järjestelmään. wt: villityyppinen kontrollinäytteitä; BRAF het 1, Het2: heterotsygoottista kontrollinäytteitä; BRAF Mut1, Mut2: homotsygoottinen mutantti kontrollinäytteestä; numerot 1 ja 15: viisitoista erilaista FFPE kiinteän kasvaimen DNA-näytteitä. Harmaa markkereita edustavat näytteet positiivisia BRAF mutaation; vaaleanharmaa neliöt edustavat aminomodifioituja oligonukleotidi leimattu Cy3 käytettävä viitteenä paikkoja. (D) Suhteellinen fluoresenssi-intensiteetti ilmaisemiseksi järjestelmän herkkyyttä arvioitiin V600E BRAF mutaatio. wt: villityyppinen kontrollinäytteitä; het: heterotsygoottinen kontrollinäytteitä; numerot 1 ja 15: FFPE näytettä. Palkit ovat keskiarvo intensiteetin 6 toistojen kunkin näytteen. Virhe palkit ovat keskihajontojen fluoresenssin voimakkuutta kunkin näytteen.

Keskustelu

Herkkyys ja spesifisyys ovat keskeisiä ominaisuuksia tahansa diagnostisen menetelmän. Erittäin herkkä määrityksiä, pystyy havaitsemaan pieniä määriä ainetta tutkittavana, voi avata uusia mahdollisuuksia useissa kliinisissä sovelluksissa. Erityisesti tunnistamista vähemmistön mutatoituja alleeleja sisällä ylimäärin villityypin alleelit, joka edustaa yleinen ongelma analyysi syövän DNA: n, on teknisesti erittäin haastavaa ja edellyttää erittäin herkkiä menetelmiä.

Tässä