Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Yleisesti arvioidaan suunnattu entsyymin aihiolääketerapia (GDEPT) on kaksivaiheinen hoito-protokollaa kiinteitä kasvaimia, jolla siirretään koodaavan geenin aihiolääkkeen aktivoivaan entsyymiin, minkä jälkeen annetaan inaktiivisen aihiolääkkeen, joka myöhemmin aktivoidaan entsyymi sen kasvaimen myrkyllisiä muodossa. Kuitenkin perustaminen tällaisia ​​uusia hoito-torjumiseksi haimasyövän edellyttää määritelty ja vankka eläinmallijärjestelmiä.

Methods

Täällä kokonaisvaltaisesti verrattuna kuusi ihmisen haimasyövän solulinjoissa (PaCa-44, PANC-1, MIA PaCa-2, Hs-766T, Capan-2, ja BxPc-3) in ihonalaisen ja orthotopical hiiri malleja sekä niiden herkkyys eri GDEPTs.

tulokset

Kasvaimen otto oli 83%: sta 100%: in ihonalaisen mallia ja 60%: sta 100% on orthotopical hiirimallissa, lukuun ottamatta Hs-766T-solujen, jotka eivät kasva ortotooppisesti. Pathohistological analyysit orthotopical mallien paljasti infiltroiva kasvua lähes kaikki kasvainten haimaan; kuitenkin, eri solulinjojen aiheutti kasvainten, joilla on erilaiset morfologiset ominaisuudet. Kaikki tuloksena kasvainten olivat positiivisia MUC-1 värjäystä osoittaa niiden alkuperää rauhas tai ductal epiteelin, mutta paljasti hajallaan yleiseurooppalainen sytokeratiini värjäystä. Siirto sytokromi P450 ja sytosiinideaminaasi itsemurhageeni, vastaavasti, osaksi haimasyövän solulinjoissa käyttämällä retrovirusvektoria tekniikka paljasti korkean infectibility näistä solulinjoista, ja sen ansiosta analyysin herkkyys näiden solujen kemoterapeuttisten ifosfamidi ja 5-fluorosytosiini vastaavasti.

Johtopäätös

Nämä tiedot ovat oikeutettuja solulinjoista osana arvokasta

in vitro

ja

in vivo

malleja käytettäväksi määriteltyjen prekliinisissä tutkimukset haima kasvainten hoidossa.

Citation: HLAVATÝ J, Petznek H, Holzmüller H, osoitteelle, Jandl G, Berger A, et al. (2012) Evaluation of Gene-Directed Enzyme-Product Therapy (GDEPT) in Human haimasyöpäkasvainsoluissa ja niiden käyttöä in vivo -malleissa varten Haimasyöpä. PLoS ONE 7 (7): e40611. doi: 10,1371 /journal.pone.0040611

Editor: Hiroyasu Nakano, Juntendo University School of Medicine, Japani

vastaanotettu: 07 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 11 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 16 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 HLAVATÝ et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoitettiin osittain Itävallan Industrial Research edistämisrahasto ohjelma sekä Christian Doppler Laboratory for Gene terapeuttinen Vector Development. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksessa suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Muut tekijät BS ja WHG julistaa kuuluminen yhtiön Austrianova Singapore PTE LTD. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja. Mikään muu asiaan liittyvät ilmoitukset työhön, konsultointi, patentit, tuotteiden kehittämiseen tai kaupan tuotteet jne olemassa. Tekijät JH, HP, HH, AU, GJ, AB, MR ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Huolimatta laaja tieteellinen ponnisteluista ja kertynyt tietoa haimasyöpä biologian, kuolleisuus tämä useimmiten kuolemaan johtava sairaus ei ole merkittävästi alennettu aikana viimeisten 30 vuoden aikana. Lisäksi maailmanlaajuinen esiintyvyys tämän taudin on kasvussa [1], [2]. Kun mahdollista, nykyinen standardi hoitoa liittyy poistettu kirurgisella kanssa tai ilman postoperatiivinen kemoterapiaa tai kemo- /sädehoidon (katsausta varten katso [3]). Viime aikoihin asti yleisin kemoterapeuttinen aine, jota käytetään hoitoon haimasyöpä on 5-fluorourasiili (5-FU), antaa joko yksinään tai yhdessä muiden kemoterapeuttisten lääkkeiden ja /tai sädehoidon [4], [5], [6]. Kuitenkin toinen nukleotidianalogina gemsitabiini (Gemzar), tuodaan markkinoille 1997 lähinnä sen lievittävän vaikutusten sijaan parantaa selviytymistä, on nopeasti tullut kemoterapeuttisen hoidon valinnan haimasyövän koska sen terapeuttista potentiaalia yksin tai yhdessä [7] [8], [9].

kuitenkin, uusia hoitovaihtoehtoja tarvitaan pikaisesti, ja viime vuosikymmeninä, useat tutkijat ovat alkaneet arvioida uusia ja epätavanomaisia ​​strategioita hoitoon haimasyöpä. Tämä sisältää uusia immunologisia strategioita käytetään monoklonaalisia vasta-aineita ja terapeuttisia rokotteita, sekä geenin, lähestymistavat, kuten antisense-nukleiinihappoja, ekspressio dominanttinegatiivivaikutus onkogeenin mutanttien ilmentyminen tuumorisuppressorigeeneille tai geenin ohjaama entsyymin aihiolääketerapia (GDEPT; tarkistettavaksi katso [10], [11]). Vuonna GDEPT, joka tunnetaan myös nimellä itsemurhan geeniterapian tietyn, heterologinen geeni tuodaan tuumorisoluihin [12]. Kun ilmaistaan, kunkin geenin tuote on voitava paikallisesti muuntaa systeemisesti myrkyttömiä aihiolääkkeen sen aktiivisen solun myrkyllinen muoto, kohdistamaan terapeuttisen vaikutuksen kasvainsoluissa sekä ympäröivien solujen johtuen ns sivustakatsojavaikutus välittämä diffuusion myrkyllisten metaboliittien.

Herpes simplex -viruksen tymidiinikinaasin (HSVtk), sytosiinideaminaasi (CD) ja sytokromi P450 (CYP) itsemurhan geenejä, jotka on aikaisemmin osoitettu olevan tehokkaita erilaisissa tuumorimalleissa mukaan ( tarkistetaan [13]). Virusvektoreita perustuu retrovirukset, kuten hiiren leukemiaviruksen (MLV), ovat saavuttaneet merkittävän suosion tehokkaan ja stabiilin geeni-ilmentymisen näiden itsemurhan geenien tuumorisoluissa siten useissa tutkimuksissa käytetään retrovirusvektoreita toimittamiseen terapeuttisten geenien haiman kasvainsoluihin (katsausta varten katso [14]).

ensimmäinen askel arvioida uusia ideoita ja konsepteja hoidon, kokeista, joissa käytettävissä ihmisen haimasyöpäkasvainsolulinjo- linjojen suoritetaan usein. Tärkeydestä huolimatta

in vitro

kokeissa tulosten tulkinta ja johtopäätökset on arvioitava kriittisesti, koska käytetyt mallit ovat usein keinotekoista järjestelmää, joka ei saa heijasta

in vivo

tilanne. Puuttuminen hiirimalleissa pääpiirteittäin kriittisiä tekijöitä taudin on haitannut ei-kliinisiä tutkimuksia [15], mukaan lukien GDEPT lähestymistapoja. Sen vuoksi, muuhun ei-kliininen arviointi uusien hoitomuotojen vaatii sopivan eläinmallin ihmisen haimasyövän. Aiemmin kehittäminen in vivo haiman kasvain malleja on kuvattu Mohammad ja kollegat, jotka tuottivat ksenografti hiirimallissa (istuttamalla ensisijaisen ihmisen kasvaimen materiaali) ja eläinmalleissa käyttämällä ensisijaista potilaan soluja sekä solulinjat [16], [ ,,,0],17], [18]. Viime aikoina useat haimasyöpä perustuvat mallit muuntogeeniset eläimet on perustettu (katso katsaus [19]).

Tässä tutkimuksessa, pyrimme analysoimaan ja vertailemaan kuusi erilaista ihmisen haimasyöpäkasvainsolulinjo- rivit ihonalainen ja potilaalle tehdä hiiren kasvain malleja sekä arvioida soveltuvuutta näiden mallien ei-kliinisiä tutkimuksia GDEPT. Ihonalainen kasvaimet muodostettiin SCID /beige-hiiriä käyttämällä kutakin solulinjoissa. Kun potilaalle tehdä mallin, viisi kuudesta solulinjojen aiheutti kasvainten ja useimmat näistä suodattunut haima kanssa lukuun ottamatta Capan-2-solulinjassa. Lisäksi olemme pystyneet osoittamaan, että retrovirusvälitteiseen ilmentymistä itsemurhan geenejä, jotka koodaavat sytosiinideaminaasi- tai P450 2B1 antaa herkkyyttä transdusoitujen solujen vastaaviin aihiolääke (5-fluorisytosiinia, ifosfamidi) kliinisesti merkittävinä pitoisuuksina. Tässä esitetyt tiedot saattavat olla merkittäviä toisten tutkijoiden suhteen valinnan sopivan eläinmallin ihmisen haimasyövän.

Tulokset ja keskustelu

Tässä tutkimuksessa vertasimme paneeli ihmisen haiman sinoomasolulinjoja PANC-1, PaCa-44, Capan-2, BxPC-3, MIA PaCa-2, ja Hs-766T kannalta soveltuvuus varten

in vivo

hiirimallissa haimasyöpä. BxPC-3, Panc-1, PaCa-44 ja Capan-2 solulinjat peräisin ductal adenokarsinoomat haima, kun taas MIA PaCa-2-solut ovat peräisin karsinoomat haiman ruumiin [20], [21], [22], [23], [24]. HS-766T-solulinja oli peräisin imusolmuke etäpesäke haiman karsinooman [25]. Kaikki solulinjat olivat

in vitro

kasvanut adherentteina yksikerrosviljelyissä epiteelin (PANC-1, MIA PaCa-2, Hs-766T, BxPC-3) tai kierroksen monikulmainen (Capan-2, PaCa-44) morfologia. Koska geneettinen integrities kasvaimen merkkiaineiden p53, K-ras, p16 ja Smad4 (tunnetaan myös nimellä DPC), jotka liittyvät määrin kasvainten [26], vertasimme käytetyt solulinjat suhteessa niiden genotyyppi näitä markkereita (taulukko 1). Mitään selvää johdonmukaisuus geneettisiä muutoksia tutkituista geeneistä kunkin solulinjoissa on ilmeinen ja tulokset ovat usein riippuvaisia ​​analyysin tyypistä soveltaa (katso katsaus [27], [28]). Lähes kaikki solulinjat oli mutaatioita solusyklin säätelevä tuumorisuppressorien p53 ja p16. Mutaatioita haimakarsinooma liittyy tuumorisuppressorin Smad4, joka on mukana transformoiva kasvutekijä beta (TGF) signalointia, havaittiin alentunut vain solulinjoissa Hs-766T ja BxPC-3 [27]. Kaikista käytetyt solulinjat tässä tutkimuksessa vain BxPc-3 kuvataan olevan ehjä K-ras-onkogeenin [27].

ihonalainen ja Orthotopic kasvainten muodostumiselle

Upon ihonalainen injektio eri haimasyövän solulinjoissa, kaikki eläimet osoittivat kasvaimen muodostumisen (paitsi yksi hiiri PANC-1 ryhmä). PaCa-44-johdettu kasvaimia osoitti nopeinta mutta ei homogeeninen kasvua. Seitsemän vuorokauden kuluttua solujen injektion nämä kasvaimet olivat mitattavissa, joiden paksuus ja ensimmäinen eläin oli teurastettava 18 päivän kuluttua kasvaimen kokoa tuli suurempi kuin 1900 mm

3, mikä on osoittanut kasvuvauhti on yli 1600 mm

3 neljän päivän kuluessa (Fig. 1). Toinen voimakkainta kasvaimen kasvu havaittiin alkaen PANC-1 kasvaimia, jota seurasi Capan-2, BxPC-3 ja Hs-766T-soluissa, mikä näkyy maltillisempaa kasvaimen kasvua. Samanlainen PaCa-44, MIA PaCa-2 kasvaimet olivat mitattavissa seitsemän vuorokauden kuluessa injektion, mutta sen sijaan ne säilyttivät koko 28 päivää ennen jatkamista kasvaa (Fig. 1).

5 x 10

6 solua kutakin haiman solulinjaa injektoitiin ihonalaisesti vasempaan kylkeen CB-17 /IcrHsd-

Prkcd

scid Lyst

bg

hiirillä päivänä 0. Näkyvä kasvaimet mitattiin kahdesti viikossa joiden paksuus ja koko laskettiin kaavalla ”pituus x leveys x leveys /2”.

määrittämiseksi orthotopical käyttäytymisen syntyy haiman kasvaimet, palaset ihon alle muodostunut kasvaimia transplantoitiin tiiviissä läheisyys haiman CB-17 /IcrHsd-

Prkcd

scid Lyst

bg

hiirillä. PaCa-44, PANC-1, BxPC-3 ja Capan-2 solut kasvoivat vatsaonteloon (ip) kaikilla eläimillä. MIA PaCa-2 kasvaimen kasvua havaittiin i.p. kolme viidestä eläimestä (taulukko 2). Vaikka Hs-766T kasvaimen kappaleita implantoitiin toistuvasti ip, ei kasvaimen muodostusta ei havaittu (taulukko 2), vaikka uusi analyysi istutetaan kappaletta vahvisti kasvainsolujen elinkelpoisuuden (tietoja ei esitetty).

Yli kaksi kolmasosaa of PaCa-44, PANC-1, MIA PaCa-2 ja BxPC-3 kasvaimia soluttautunut haiman. Kuitenkin jäljellä kasvaimia oli yhteys vatsan sijasta haiman (taulukko 2). Vuodesta Capan-2 kasvaimia, vain yksi soluttautuneet haima, kun taas toiset olivat kiinni perna tai vatsan näyttämättä tunkeutuminen (taulukko 2). Toisin kuin muut solun tyyppi, Hs-766T johdettu kasvaimia ei ole liitetty mihinkään elimeen ollenkaan ja havaittiin sijaitsee löyhästi vatsan.

Tumor Pathology

kasvaimet kaikista ortotooppisesti kasvavat solulinjat samoin kuin ihon alle kasvava solulinja Hs-766T analysoitiin histologisesti. Analyysi lähes kaikki ortotooppisten kasvainmuodossa paljasti polttoväli hyökkäyksen autochtonic haima kiinteällä anaplastinen karsinooma paitsi BxPC-3 kasvain malli, joka osoitti, levitetään putkimaisen erilaistumista ja Capan-2-soluihin, jotka kasvoivat kuin adenokarsinooma. PANC-1, BxPC-3 ja Capan-2 kasvaimia osoitti vähän solu- ja ydin- pleomorfisimia ja koostuivat suurten solujen runsas kalpea solulimassa ja suuret ytimet (PANC-1, Capan-2) tai pieni, pyöreä soluja tiheä ytimet ( BxPC-3). PaCa-44 ja MIA PaCa-2 kasvaimia, päinvastoin, oli näkyvä solu ja ydinvoiman pleomorphisms. MIA PaCa-2 kasvainten koostui pääosin pieniä, pyöreitä karan muotoisia soluja tiheä ytimien lisäksi suuria soluja paljastaen hyper-eosinofiilinen sytoplasman alueilla tyypillistä asinussolut, kun taas PaCa-44 kasvaimia osoitti suuria, sytoplasma-rikas solujen suuria ytimiä. Lisäksi Capan-2 ja BxPC-3 kasvainsoluja oli ainoastaan ​​maltillista mitoosia, solujen kaikkien muiden kasvaimia osoitti erittäin lisääntynyt mitoosi toiminta osoittaa korkea pahanlaatuisuuden näistä kasvaimista. Lisäksi PANC-1, MIA PaCa-2, ja BxPC3 kasvaimia suuria alueita, joille nekroosia voidaan havaita – edelleen ominaista erittäin pahanlaatuisten kasvainten. Yhdessä lähes kaikki kasvaimet paljasti korkealuokkaisesta erilaistamattomuuden, vain Capan-2 kasvaimet sekä joillakin alueilla BxPC-3 kasvaimia jäljellä ominaisten rauhas alkuperä kasvaimet ovat havaittavissa.

Only pieni lymfosyyttisen ja neutrofiiliseen tunkeutuminen kasvain-vieruskudos, kuten rasva- ja sidekudoksen ja autochtonic haima, havaittiin PANC-1, PaCa-44, BxPC-3, MIA PaCa-2, ja Capan-2 mallit, joissa lisäksi lymfosyyttinen infiltraatio PaCa-44 kasvain itse kudoksesta (Fig. 2A). Lisäksi hajanainen kohtalainen neutrofiilinen hyökkäystä koko MIA PaCa-2 peräisin kasvaimista painopistealueista colliquation havaittiin (Fig. 2A). Koska orthotopical istuttaminen Hs-766T kasvain paloja ei johtanut kasvaimen kasvua, analogisen ihonalaisen mallia histologisesti analysoitiin paljastaen kiinteä anaplastinen karsinooma merkittävässä solu- ja ydinvoiman pleomorphisms, jotka koostuvat pääasiassa pieniä, pyöreitä karan muotoinen solujen tiheä ytimet, korkea mitoosi toimintaa, ja suuri osa nekroottisen kasvainkudoksen (Fig. 2A). Laaja oksat sidekudoksen oli havaittavissa kehän kasvaimia, mutta myös levittää vieressä kasvainsolujen ryhmien BxPC-3, Capan-2 ja PaCa-44 kasvaimet; PACA-44 kasvainten fibroosia mukana oli epäkypsä leukocytic infiltraatit.

(2A) jaksot haimatuumorien johdettujen osoitettujen haiman solulinjat värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. HS-766T näyte leikattiin ihonalaisen kasvaimen; kaikki muut näytteet otettiin ortotooppisesti kasvanut kasvaimia. (2B) Eri osioita BxPC-3-johdettu kasvaimen tehtiin immunohistologinen analyysi vasta-aineilla Mucin-1 (MUC-1), pan-sytokeratiini (Pan-CK), ja α-sileän lihaksen aktiini (SMA). Musta palkki edustaa pituutta 53 pm, lukuun ottamatta anti-MUC-1 värjäytymistä (27 pm).

PAS värjäys suoritettiin tunnistaa kasvaimen rakenteita peräisin kanavat ja /tai acini. In Capan-2 ja BxPC-3 kasvaimia 40% ja 25% kasvainsoluista oli positiivisia PAS, vastaavasti. Kaikki muut kasvaimet, lukuun ottamatta MIA PaCa-2 ja PANC-1, joka jäi täysin negatiivinen, paljasti vain marginaalinen määrä PAS-värjäytyneiden solujen – johtuu todennäköisesti niiden enemmän dedifferentoituneiden tila (tuloksia ei ole esitetty).

immunohistokemiallinen (IHC) värjäys MUC-1-proteiinia, joka on ilmaistu useimmat rauhas ja ductal epiteelisolujen johti erillisiä merkintöjä lähes koko kasvain massa PACA-44, PANC-1, BxPC-3 (kuvio . 2B) ja Capan-2 potilaalle tehdä kasvain malleja ja noin 75% MIA PaCa-2 kasvain. Verrattuna immunologinen signaaleja havaittu normaalin ihmisen haima, jossa ruskehtava merkintöjä löytyi sytoplasmassa acini ja ductal epiteelisolujen ilmaus profiilit näiden kasvaimia ovat osoitus niiden acinar ja duktaalisia alkuperää. Vaikka histomorphology vain harvoin muistuttaa autochtonic haiman kudoksen, mukaan värjäytyminen profiilit edellä on mainittu, nämä kasvaimet ovat tunnistettavissa adenokarsinooma ductal alkuperää, jonka osuus on 85% ja 90% kaikista haiman kasvaimia [29], [30]. Kuitenkin mukaan WHO: n luokituksen, joka tunnistaa useita vaihtoehtoja lisäksi klassinen tubuloglandular adenokarsinooma [30], lähes kaikki ortotooppisten kasvainten vastaavat anaplastinen karsinooma variantti. Mielenkiintoista, IHC havaitseminen sytokeratiineja (CK) 1-8, 10, 14-16 und 19 käyttämällä Pan-CK-vasta johti immunovärjäysmenetelmällä koko kasvain perustettu PaCa-44, BxPC-3 ja Capan-2-soluissa, mutta vain 60% ja 40% värjätään solut MIA PaCa-2 ja PANC-1 kasvaimia, vastaavasti. Pan-CK pääasiassa värjättyä putkimainen /ductal rakenteet normaalin ihmisen haima, vähentynyt immunoleimaus in MIA PaCa-2 ja PANC-1 verrattuna muihin kasvaimiin viittaavien entistä acinar alkuperä näistä kasvaimista, tai lähinnä tapauksessa MIA PaCa-2, joka on myös ilmaistu MUC-1 vain 75% kasvainsoluista, ilmaisu kuvio voi olla osoitus korkeamman maligniteetin, joka tukee histologinen ulkonäkö tämän kasvaimen laajoilla alueilla kuolion, neutrofiilinen colliquation ja korkea mitoosinopeudella. Signaalit saadaan analysoimalla kyky yleiseurooppalaisen CK ja MUC-1-vasta-aineiden sitoutuvan solulinjoja epähomogeeninen ja epäjohdonmukaisia, mikä vaikeuttaa tulkintaa tämän tiedon.

Yhteenvetona mukaan niiden histologinen ulkonäkö, PAS-värjäys kuvio, ja ilmaisu profiilit MUC-1 ja Pan-CK, MIA PaCa-2 ja PANC-1 solulinjojen johti kaikkein dedifferentoituneet kasvaimia tämän tutkimuksen; kuitenkin yksiselitteinen muistuttaa terveen ihmisen haiman annettiin ole kasvainten, kuten, lukuun ottamatta pientä putkimainen alue Capan-2, jopa ei-anaplastinen kasvaimia oli kiinteä, ei-glandulaarinen kasvu.

Käyttämällä anti-SMA, lukuisia syvästi ruskehtava värillinen solulimaan rikas stroomasolut vieressä kasvainsoluja löydettiin koko kasvaimia kaikkien solulinjojen; normaali haima pysyivät negatiivisina (Fig. 2). Selvät fibroosia mukana PSCs, selvimmin BxPC-3, Capan-2 ja PaCa-44 kasvaimia. GFAP-värjäys paljasti positiivinen immuunivärjäystä vain MIA PaCa-2 kasvaimia, jotka edustavat merkitty stellate solun prosesseja ympäröivä haiman acini. Näin ollen, kuten aktivoitu PSCs tiedetään olevan periaatteen efektorisolujen fibroosia, mikä on johdonmukaista patologinen piirre ihmisen haimasyövän [31], [32], [33], ja häiritsevät desmoplastic kasvaimen strooman parantaa toimituksen ja tehoa anti -tumor lääkkeet [33]. BxPC-3, Capan-2, ja PaCa-4-solut ovat lupaavimmat kasvainmuodoista tutkimuksiin, jotka liittyvät esto fibrogenesis ihmisen haimasyövän.

tulokset osoittavat, että käyttämällä erilaisia ​​haiman solulinjoja käytettäessä potilaalle tehdä asetus, laaja kirjo heterologisten haiman kasvain tyypit voitaisiin perustaa toimivan mallin eri terapeuttisten sovellusten haimassa kasvaimen hoidossa. Aiemmat tutkimukset SCID-hiirissä osoitti, että s.c. istutettu kasvaimia vain harvoin osoittavat etäpesäkkeitä [16]. Tutkimuksessamme hiiriä pidettiin jopa 18 viikon ajan Capan-2 ja BxPC-3 kasvain puhkeamista, 13 ja 10 viikkoa sen jälkeen MIA PaCa-2 ja PANC-1 kasvain puhkeamista, vastaavasti, ja 4 viikon kuluttua PaCa-44 kasvain puhkeaminen ja brutto analyysit hiiren elinten osoittavat, että yksikään kasvainsolujen johtanut paikallisten distaalipinnoille etäpesäkkeitä joko jälkeen sc tai potilaalle tehdä elinsiirtoja. Sen sijaan, Tseng ja työtovereiden viime aikoina metastaaseja in B6 /129 hiirissä 6-8 viikkoa implantoinnin jälkeen solulinjat maksametastaaseista saatu K-ras (G12D /+), LSL-Trp53 (R172H /+) ja Pdx-1 -Cre hiirissä [34]. Kuten ihmisillä suurin osa, ellei kaikki haimakarsinoomat näyttää paikallisen ja distaalinen etäpesäke ajan puute metastaattisen taipumus on otettava huomioon määritettäessä lääkkeen tehoa tutkimuksessa näitä kasvainsolulinjoissa.

Lisäksi in vivo malleissa kuljettaa ihmisen solun ksenografteja, äskettäin, geneettisesti hiiri malleja haimasyövän on perustettu (katso katsaus [19], [35]). Koska nämä mallijärjestelmiin perustuvat kerta geneettisiä muutoksia, ne ovat arvokkaita välineitä tutkia vaikutuksen tällaisten geneettisiä muutoksia tai yhden signalointireittien kasvaimen kehitys [19]. Ne ovat kuitenkin vähemmän sopivia arvioida uusia terapeuttisia käsitteitä haimasyövän hoitoon. Sen sijaan malli järjestelmiä kuten ortotooppisesti kasvaa ihmisen kasvaimista ksenografteja ovat paljon paremmin kuin ne muistuttavat johtuen alkuperä ihmisen haiman kasvaimia, nykytilaa ja epäyhtenäisyyttä ihmisten sairauksien.

sytosiinideaminaasi- välittämää herkkyys ihmisen haiman Cell Lines Kohti 5-fluorosytosiini

suhteellisen tutkia tappotehoon sytosiinideaminaasi /5-FC järjestelmä meidän haimasyövän malleja, jokaisesta kuudesta kasvainsolulinjojen stabiilisti tartunnan

in vitro

kanssa retrovirusvektorin PCCDWmCMVpuro, kätkeminen hiivan sytosiinideaminaasi (CD) geenin transkriptionaalisen säätelyn kaikkialla läsnä hiiren sytomegaloviruksen (CMV) promoottori [36]. Hiiva CD mahdollistaa konversio myrkytön aihiolääkkeen 5-fluorosytosiinin (5-FC) on erittäin myrkyllinen kemoterapeuttisen aineen 5-fluorourasiilin (5-FU) ja näin ollen sen jälkeen, kun integroitumista haimasyövän soluja, sen ilmentyminen pitäisi antaa etuoikeutettu kasvaimen soluvajeeseen upon 5-FC annon.

vahvista CD transkription jälkeen retrovirus transduktio, RT-PCR suoritettiin lysaateista transdusoidut solut samoin kuin transdusoimattomien soluissa. ~480 Bp CD-geenin fragmentti havaittiin selvästi soluissa, jotka on transdusoitu vektorilla PCCDWmCMVpuro (Fig. 3), mutta se oli poissa ei-infektoiduissa soluissa. Nämä tiedot osoittavat, asianmukaisen vektorin yhdentymisen ja verrattavissa ilmentyminen CD siirtogeenin kaikissa solulinjoissa (Fig. 3).

Solun kokonais-RNA eristettiin osoitettu solulinjoissa ja mRNA käänteiskopioitiin käyttäen oligo (dT) alukkeita. CD sekä Gaph-geenistä fragmenttia monistettiin käyttämällä spesifisiä alukkeita ja erotettiin agaroosigeelissä, joka esittää odotetun kokoisia ~480 bp CD ja ~350 bp GAPDH. CDNA määrä käyttää PCR-monistus säätää tuottamaan vastaavia määriä GAPDH-geenin fragmentti.

Tämän arvioimiseksi GDEPT strategian hoitoon haimasyövän soluja

in vitro

, päätimme LD

50 annon jälkeen aihiolääke 5-FC ihmisen haiman tuumorisolulinjoja aiemmin transdusoitu PCCDWmCMVpuro. Verrattuna trandusoidun solut, jotka eivät olleet herkkiä 5-FC ( 1000 ug /ml), LD

50 aleni 16-kertaisesti keskimäärin kaikissa solulinjoissa (taulukko 3). Tämä huomattava lisäys 5-FC herkkyys osoittavat, että ilmentyminen CD onnistunut konversio aihiolääkkeen 5-FC on myrkyllinen 5-FU kaikissa transdusoiduissa haimassa tuumorisolulinjoissa. Mielenkiintoista on, että CD-ilmentävä solulinja BxPc-3 oli jopa 30 kertaa herkempi 5-FC verrattuna transdusoidut Hs-766T-soluissa. Sen analysoimiseksi, onko tämä ero herkkyydessä on riippumaton CD ilmaisun, sekä käsittelemätöntä ja transduktion haiman solulinjat suoraan inkuboitiin myrkyllisiä 5-FU. Kuten odotettua, herkkyys kaikissa solulinjoissa, 5-FU oli riippumaton transduktion vektorin PCCDWmCMVpuro. Kuitenkin, mukaisesti 5-FC hoidon tulokset, BxPC-3-solut olivat noin 30-kertaisesti enemmän herkkiä 5-FU kuin Hs-766T-soluissa (taulukko 3), mikä viittaa siihen, että testattu haiman solulinjoja on ero alttiutta myrkyllisen huumeiden

sinänsä

. Kliinisten tutkimusten työllistää 5-FC, plasmassa potilailla ovat saavuttamassa tason 50-125 ug /ml 5-FC suun kautta 150 mg 5-FC painokiloa kohden [37], [38], [39] . Kuitenkin pitoisuudet plasmassa ovat yli 100 mikrog /ml pidetään usein myrkyllisiksi potilaalle [39]. Tässä suhteessa, hoito vektori PCCDWmCMVpuro annettiin neljä kuudesta testatuista solulinjoista reagoida 5-FC-pitoisuus alle 100 pg /ml, mikä viittaa siihen, että GDEPT voi sallia tehokkaan kasvaimen hoitoa aihiolääkkeen annoksia pienemmät kuin ei-spesifistä toksisuutta.

sytokromi P450-välitteinen tappaminen ihmisen haiman tuumorisolulinioissa

käyttö kemoterapeuttisen aineen ifosfamidi hoitoon haimasyövän on kuvattu useissa tutkimuksissa [40], [ ,,,0],41], [42], [43], [44]. Aihiolääke ifosfamidi muunnetaan fosforamidiliitoksia sinappi P450. Fosforamidiliitoksia sinappi tekee DNA jakautuvien solujen huonosti alkyloimalla, joka on perusta sen selektiivisyys jakautuvia soluja kuten sisältyvän nopeasti kasvava kasvaimia. Valitettavasti, kuten sytokromi P450 on pääasiassa maksassa, toksisuus ifosfamidi metaboliitti on melko systeemistä eikä kasvainspesifisiä. Parantaa kasvaimen kohdistuvaa toksisuutta suhteellista haiman kasvain malli, käytimme retrovirusvektorin PCCWmCMV kätkeminen rotan sytokromi P450 2B1 (CYP2B1) geenin vakaan transduktion haiman solulinjoissa.

seurata ilmentymisen CYP2B1 jälkeen transduktio, Western blot analyysit on suoritettu proteiinin lysaatit transdusoitujen ja ei-transdusoituja soluja. CYP2B1 ilmentyminen havaittiin vain solujen aiemmin transdusoitu retrovirusvektorilla (Fig. 4). Solulinja BxPC-3 havaittiin vain vähäisiä ekspressiotasot CYP2B1. Arvioida herkkyyden CYP2B1-ilmentäviä haima- kasvainsolulinjoja BxPC-3, MIA PaCa-2, Hs-766T, PaCa-44 ja PANC-1 kohti ifosfamidi, LD

50 määritettiin verrattuna trandusoidun soluihin. Epäspesifinen myrkyllisyys aihiolääkkeen ifosfamidi in transdusoimattomien solulinjoissa vaihtelivat merkittävästi ja oli vaihtelevat 0,18 mM (Hs-766T-solut) enintään 2 mM (PANC-1-solut) LD

50-arvot (taulukko 4). Ilmentäminen CYP2B1 transgeenin johti jopa 13-kertaisesti lisääntynyt alttius ifosfamidi neljässä viidestä testatuissa solulinjoissa (taulukko. 4). Vain Hs-766T-soluissa, jotka olivat kaikkein herkimpiä ifosfamidi

sinänsä

, ei osoittanut parannettu alttius ifosfamidi huolimatta CYP2B1 geenin ilmentymisen.

Yhteensä solulysaateista 8 x 10

5-solut erotettiin 10% polyakryyliamidigeelillä denaturoivissa olosuhteissa. Sen jälkeen blotting, CYP2B1-proteiini havaittiin kanssa CYP-spesifistä vasta-ainetta.

Tutkimukset toteutettavuudesta in vivo GDEPT haimasyöpä on jo tehty aiemmin [44], [45], [46], [47], [48]. Olemme osoittaneet, että kapseloidut solut geneettisesti muunnettu ilmentämään sytokromi P450 itsemurhageeniä jotka on implantoitu hiiriin läheisyydessä kasvaimia, jotka ovat peräisin PaCa 44 solut kykenevät aiheuttamaan tuumorin väheneminen, kun sopiva aihiolääke, joka aktivoituu sytokromi P450 annetaan [45] , [46]. Lisäksi olemme käyttäneet näitä kapseloidut solut kliinisessä tutkimuksessa potilailla, joilla haimasyöpä ja pystyivät osoittamaan, että mediaanielossaolosta tässä potilasryhmässä kaksinkertaistettiin [44], [47].

Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että tällaiset GDEPT lähestyy hoitoon haimasyövän ovat lupaavia. Kuitenkin tällaisia ​​uusia hoitoja on testattava useampaan kuin yhteen asiaan eläinmallijärjestelmä muistuttava ominaisuus vastaavien kasvainten niin pitkälle kuin mahdollista. Tämä osoittaa selvästi pikaisesti edelleen karakterisointia eläinmalleissa valinta, kuten olemme osoittaneet tässä tutkimuksessa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki eläimet käsiteltiin tiukasti mukaisesti eläinten hyvä käytäntö. Eläinten työ hyväksyttiin neuvoa eläinkokeiden liittovaltion opetus-, tiede- ja kulttuuriministeriön mukaan Itävallan lain eläinkokeet (BGBl nro 501/1988, BGBl I nro 169/1999, ja BGBl I Ei . 136/2001) ja lisenssin eläinkokeiden annettiin nimenomaan tätä tutkimusta varten (GZ 68,205 /177-BRGT /2003). Kaikki pyrittiin minimoimaan eläinten kärsimyksiä. Leikkauksia tehtiin yleisanestesiassa. Eläimet tapettiin ennen kasvaimen saavuttanut palpoitavissa koko 1500 mm

3.

Plasmidit

koodaava sekvenssi sytosiinideaminaasi geenin (CD, GenBank no. U55193, pos. 183-659) alkaen

Saccharomyces cerevisiae

monistettiin PCR hiivan genomisesta DNA: sta (Sigma) ja tämän jälkeen syötetään pCR-XL-TOPO-kloonausvektoriin (Invitrogen) tuloksena plasmidi pYCD. Sitten sytosiinideaminaasi cDNA irrotettiin plasmidista pYCD kautta

EcoRI

I restriktiohajotuksen ja ligatoitiin 7,7 kb

EcoRI

I-fragmentti plasmidin pPCEWmCMVpuro koodaa MLV-pohjainen retrovirusvektori [ ,,,0],36]. Saatu plasmidi nimettiin pPCCDWmCMVpuro. Koodaava sekvenssi rotan sytokromi P450 2B1 (CYP2B1) geeni monistettiin PCR: llä plasmidista PC3 /2B1 [47] käyttämällä alukkeita Age-CYP (5′-GCGTACCGGTCCACCATGGAGCCCAGTATCTTGC-3 ’) ja CYP-Not (5′-AAGCGGCCGCTATCACCGAGCTGAGAAGCAG-3’ ) kätkeminen

ikä

I ja

Ei

I spesifisiä restriktiokohtia, vastaavasti, ja kloonattiin suuri

ikä

I-

Ei

I katkelma retrovirusvektori plasmidi pPCEmCMV [36]. Saatu plasmidi nimettiin pPCCmCMV. Tuottaa plasmidin pPCCWmCMV, metsämurmeli hepatiittivirus posttranskriptionaalisella säätelyelementti (WPRE) vapautettiin plasmidista pPCEWmCMV restriktiopilkonnalla kanssa

Ei

I ja insertoitiin

Ei

I-linearisoitua vektori pPCCmCMV [36 ].

solulinjat

amfotrooppisille retroviruspakkauksen soluja perustuu ihmisalkion munuais- solulinja HEK293 [49], ihmisen haimasyöpäkasvainsolulinjo- linjat PANC-1 (ATCC CRL-1469), PaCa- 44 [22], MIA PaCa-2 (ATCC CRL-1420), ja Hs-766T (ATCC HTB-134) kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM /Glutamax, Life Technologies), jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (FCS , Life Technologies). Ihmisen haiman kasvainsolulinjoja BxPC-3 (ATCC CRL-1687) ja Capan-2 (ATCC HTB-80) viljeltiin RPMI-alustassa (Life Technologies), jota oli täydennetty 10% FCS: ää ja glutamiinia ja McCoys väliaineessa (Life Technologies), jota oli täydennetty 10 % FCS: ää, vastaavasti. NIH3T3-solut (ATCC CRL-1658) ylläpidettiin DMEM /Glutamax täydennetty 5% FCS: ää.

Virus tuotanto ja Pysyvästi Infected Cells

kalsiumfosfaatti kerasaostus menetelmää käytettiin luomaan stabiilisti virusta tuottavia soluja [50]. Lyhyesti, 7 x 10

5 HEK293 perustuu retroviruspakkauksen soluihin [49] transfektoitiin 6-kuoppalevyllä 3,0 ug plasmidia pPCCDWmCMVpuro ja pPCCWmCMV, vastaavasti. 24 tuntia myöhemmin solut käsiteltiin trypsiinillä ja valittu DMEM, joka sisälsi joko 0,6 ug /ml puromysiinille (Sigma) pPCCDWmCMVpuro transfektoidut solut tai 400 ug /ml genetisiiniä (Gibco) ja pPCCWmCMV transfektoituja soluja, kunnes yhden solun pesäkkeet muodostuivat.