Krooninen sairaus

tiivistelmä

haimatiehyen adenokarsinooman sisältävät osajoukon yksinomaan kasvaimia aiheuttavasta syövän kantasolut (CSCS), jotka kykenevät uudelleensijoittamis koko heterogeeninen syöpäsolun populaatiot ja kestävät hyvin tavanomaisen kemoterapian. Tässä osoitamme, että metformiini valikoivasti ablatoitu haiman CSCS osoituksena vähentynyt ilmentyminen pluripotenttisuuden liittyvien geenien ja CSC liittyvä pinta markkereita. Myöhemmin kyky metformiinin käsiteltyä CSCS ja kloonaamalla laajentaa

in vitro

oli peruuttamattomasti kumottiin indusoimalla apoptoosin. Sen sijaan ei-CSCS ensisijaisesti vastasi solusyklin pysähtymiseen, mutta ei poistaa metformiiniin. Mekanistisesti metformiini lisääntynyt reaktiivisen hapen tuotantoa CSC ja vähentänyt niiden mitokondrion kalvon läpäisevä potentiaalia. Myöhempi induktio tappava energiakriisin CSCS oli riippumaton AMPK /mTOR. Lopuksi ensisijainen syöpäkudoksessa ksenograftimalleja metformiinin vähentää tehokkaasti kasvaintaakkaa ja esti taudin etenemistä; jos yhdistettynä peruskudoksettoman kohdistaminen smoothened estäjä parantaa kudospenetraatio, vaikka gemsitabiinin todella ilmestyi tarpeettomiksi.

Citation: Lonardo E, Cioffi M, Sancho P, Sanchez-Ripoll Y, Trabulo SM, Dorado J, et al . (2013) Metformiini tavoitteet metabolisen Akilleen kantapää of Human Haimasyöpä Kantasolut. PLoS ONE 8 (10): e76518. doi: 10,1371 /journal.pone.0076518

Editor: Anita B. Hjelmeland, Cleveland Clinic, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 toukokuu 2013; Hyväksytty: 1. syyskuuta 2013. Julkaistu: 18 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Lonardo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus tukivat ERC Advanced tutkija Grant (Pa-CSC 233460), Euroopan yhteisön seitsemännen puiteohjelman (FP7 /2007-2013) avustussopimuksen nro 256974, The Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria ( PS09 /02129), ja Programa Nacional de Internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; molemmat Ministerio de Ciencia e Innovación, Espanja). E.L. tukee Roche Postdoctoral jäsenohjelmaan. M.C. tukee La Caixa Predoctoral jäsenohjelmaan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) edelleen yksi tuhoisin syövät, ja on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat teollisuusmaissa, joissa on 5 vuoden pysyvyys on alle 5% [1]. Monet riskitekijät kuten tupakointi, alkoholin, ja krooninen haimatulehdus on tunnustettu mahdollisiksi riskitekijöitä kehittämiseen PDAC [2]. Epidemiologiset tutkimukset viittaavat myös siihen, että diabetes, etenkin tyypin 2, liittyy parannettu riski PDAC [3], [4]. Siksi tutkijat ovat aloittaneet löytää oletetun yhteyden käytön diabeteslääke huumeita ja vähentää riskiä saada ja /tai etenemistä PDAC. Silmiinpistävän, Retrospektiivinen analyysi, suun kautta metformiinin potilailla, joilla on diabetes tyypin II todettiin yhteydessä alentuneeseen riski kehittää PDAC [5] sekä parempaan lopputulokseen potilailla, joilla on PDAC [6].

ensisijainen systeemistä vaikutusta metformiinin (Met) edustaa pienentää veren glukoosipitoisuutta kautta pienentää maksan glukoneogeneesin ja lisääntynyt glukoosin sisäänottoa perifeerisissä kudoksissa [7]. Mekanistisesti, metformiini epäsuorasti aktivoi AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) signalointia [8], ja sen jälkeen inhiboi mTOR aktiivisuutta, joka on usein lisääntynyt syöpäsoluissa [9], kuten haimasyövän kantasolut (CSCS), kuten erittäin tuumorigeenistä alapopulaatio [10]. Tämä estävä vaikutus metformiinin AMPK /mTOR signalointi aiheuttaa alentuneen proteiinisynteesiä ja soluproliferaatiota [11], [12]. Lisäksi perustettiin PDAC solulinjoissa metformiinia kykenee myös estämään PDAC [13]. Kiehtovan, toinen tuore tutkimus ehdotti, että CSCS voitaisiin kohdistaa metformiinin kautta uudelleen ilmentäminen miRNA osallisena erilaistumiseen, vaikka nämä tiedot perustuvat validoimattomia syöpäsolulinja johdettu CSCS [14].

Toisin kuin suurin erilaistuneiden solujen kasvain, CSCS on osoitettu olevan erittäin vastustuskykyinen kemoterapiaa [15]. Siksi lääkkeiden valikoivasti tavoite CSCS voi edustaa tehokkaampi lähestymistapa voittaa vastustus ja /tai hoitoon uusiutumisen PDAC. Täällä me nyt tarjota vakuuttavia todisteita siitä, että CSCS johdettu monipuolinen kokoelma ensisijainen ihmisen PDACs ovat erittäin alttiita metaboliseen uudelleenohjelmointi metformiinin johtaa pitkäaikaiseen eloonjäämiseen prekliinisissä hiirimalleissa.

Tulokset

Olemme aiemmin osoittaneet, että ensisijainen haiman CSCS voidaan rikastaa

in vitro

kuin kiinnittymisestä riippumaton kolmiulotteinen palloja, jotka rikastetaan soluja kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia [15]. Yhteensä yhdeksästä ihmisen PDAC -ksenografteja käyttää A6L, 163, 185, 215, 247, 253, ja 286 on kuvattu aiemmin [16], [17] sekä 354 ja JH029, jotka saatiin käyttämällä samaa menetelmää. Tärkeintä,

in vitro

kokeissa kaikki solut vasta eristetty varhaisesta kulkua ksenograftit ja viljellään alhainen kohtia kuin tarttuvat solut tai kiinnittymisestä riippumaton aloilla. Kuulat ovat rikastuneet CD133

+ soluissa (kuvio. S1A) ja useita muita markkereita, jotka on liitetty CSC fenotyyppi verrattuna kiinnittyneitä soluja [18].

Metformiini vähentää ilmentymistä CSCS markkereita

Ensimmäinen, loimme ilmaus orgaanisen kationikuljetusjärjestelmän 1, 2, ja 3 (OCT1-3) meidän ensisijainen PDAC solut (Fig. 1A), jotka ovat ratkaisevan tärkeitä soluunottoa metformiinia. Metformiini käytettiin pitoisuuksina, jotka eivät ole suoraan myrkyllinen ensisijainen PDAC solujen ja ei-transformoitujen haiman soluja (PSC, haiman tähtisolut, HDPE, ihmisen tiehyen haiman epiteelisolujen) (Fig. 1 B), jotka ovat huomattavasti alemmat verrattuna käytetyt konsentraatiot aiemmissa tutkimuksissa PDAC solulinjojen (10-30 mm) [14]. Seuraavaksi löysimme merkittäviä muutoksia mRNA tasoilla CSCS geenien (CD133, ALK4, solmukohtien, Aktiviinilla ja Smad2) ja pluripotenttisuus liittyvien geenien (Nanog, Oct4 ja Sox2) minkä metformiinin (Fig. 1 C; käytettiin alukkeita luetellaan taulukossa S1), joka vahvistettiin myös proteiinitasolla (Fig. 1 D). Silmiinpistävän, metformiini näytti valikoivasti poistaa CSCS kuin CSC-merkki positiivisten solujen CD133, CD44, CXCR4 ja SSEA-1 väheni, kun taas epiteelin erilaistumista Maker EpCAM kasvoi (Kuva. 1 E).

(A) Ensisijainen PDAC soluja , mutta ei ole normaalia haiman solut ilmentävät orgaaninen kationi transporter 1, 2 ja 3 (n = 3). (B) määritelmä terapeuttisen vaihteluvälin metformiinin ensisijaisen PDAC soluissa. Solujen lukumäärä kasvanut läsnä on ilmoitettua pitoisuudet metformiinin 24 h (n = 6). (C) qPCR analyysi CSCS liittyvien geenien aloilla käsiteltiin 3 mM metformiini 7 päivää. Aineisto on normalisoitu housekeeping-geeni ja ne on esitetty kertainen muutos geenien ilmentyminen suhteessa kontrolliin soluja (n = 6). (D) edustaja Western blot, joka havainnollistaa vähentää Oct4-proteiinin ilmentymistä vasteena metformiiniin (n = 3). (E) edustaja virtaussytometria analyysi CSCS merkkiaineiden aloilla käsitelty 7 päivän 3 mM metformiinin verrattuna hoitamattomiin palloja (ylempi paneeli). Yhteenveto tietojen PDAC-185, A6L, 215, 253, ja 354 on esitetty (alempi paneeli; n = 6).

Metformiini valikoivasti vähenee in vitro ja in vivo kasvainten muodostumiseen

Me seuraavaksi tutkinut funktionaalisia vaikutuksia metformiinin on kyky uusiutua ja CSCS. Pallo muodostuminen määrityksessä osoitti voimakasta laskua koko on muodostettu palloiksi metformiinin (Fig. 2A S1B) eston kautta laajentamista jälkeläiset CSCS, jotka muodostavat suurimman osan soluista muodostunut aloilla. Vielä tärkeämpää on, huomasimme, että metformiini vähensi määrää todellisuudessa muodostettu pallojen kanssa samaa tehokkuutta 3 ja 10 mM (Fig. 2B). Jotta voidaan tutkia pitkän aikavälin vaikutuksia metformiinin kohtelu kyky uusiutua solujen eivät osoittaneet merkitsevää eroa aikana ensimmäiseen kanavaan pallo muodostumista (Panc-185 ja Panc-215), toisen ja kolmannen asteen palloja aloitettiin ilman metformiinia hoitoon. Formation pallojen toisessa ja kolmannessa kohtia rajusti haitannut viittaa siihen, että metformiini hoito oli peruuttamattomasti poistettu suurin osa CSCS estämällä tai kumota niiden kyky uusiutua (Fig. 2C). Johdonmukaisesti, esikäsittely metformiinin muodostumiseen vähemmän ja pienempiä pesäkkeitä kontrolliin verrattuna (kuvio. 2D). Kultakanta CSC toimintaan osallistuu

in vivo

kasvainten muodostumiseen. Taajuus kasvaimia aiheuttavasta peräisin olevien solujen PDAC-354, 215, ja A6L pallojen oli säännöllisesti erittäin korkeat, joiden arvot alle 1:500 ja tuli selvästi rarified metformiinin käsittely (Kuva. 2E). Lopulta huomasimme, että metformiini esikäsittely haiman CSCS myöhemmin vähentäneet muuttavien (Fig. S2A) ja invasiivisia kapasiteetti (Fig. 2F).

(A) Metformiini vähentää koko aloilla. Edustavat kuvat pallojen jälkeen saatu metformiinin ja 7 päivää. Kvantifiointi pallo koko (n≥6). (B) Sphere muodostumista kapasiteettia läsnä tai poissa ollessa metformiini 7 päivää (n≥6). (C) kyky uusiutua syövän kantasoluja eristettiin kasvaimia vastaamasta huonosti kannalta ensimmäisen kanavan pallo muodostavat kapasiteettia. Soluja jatkuvasti passage kuin toisen ja kolmannen asteen aloilla käsitelty yhdessä metformiinin tai ajoneuvon vasta ensimmäisen sukupolven pallo muodostumista (n = 6). (D) Colony muodostumista PDAC-185, A6L, 215, 253, ja 354 osoittaa 0,05% kristalliviolettia jälkeen 21 päivää (n = 3). (E) harvenemista on

in vivo

tuumorigeenisia syövän kantasoluja aloilla käsitelty metformiinia verrattuna ajoneuvoon. (F) Invasion of pallo peräisin olevien solujen 24 tunnin kuluttua hoidon metformiinin tai kontrolli (n = 3).

metformiinin nimenomaan poistaa haiman CSCS

Väestö kaksinkertaistaminen tarttuvien solujen oli merkittävästi vähentää metformiinin vahvojen intertumoral vaihtelua (Kuva. 3A). Johdonmukaisesti, Ki67 ilmentyminen väheni viittaa soluproliferaation inhibointi (Fig. 3B), joka vahvistettiin alennettu ilmentyminen cyclinD1 mRNA (Fig. 3C) ja proteiinin taso (Fig. S2B). Seuraavaksi analysoimme solusyklin profiili kiinnittyneitä soluja versus CSCS virtaussytometrialla. Kiinnostavaa kyllä, tiedot osoittivat, että toiminnallisia vaikutuksia metformiinin solusyklin etenemiseen oli paljon marginaalinen pallo peräisin olevia soluja viittaa selvä mekanismi vastuussa kadonneista aikana jatkokäsittely (Fig. 3d). Todellakin, kun taas metformiini ei merkittävästi muuttanut nopeutta apoptoottisten tarttuvien solujen osoituksena anneksiiniV /Dapi värjäytymistä (1,23 ± 0,37 kertainen muutos), se johti voimakas apoptoosin induktioon alalla peräisin olevia soluja (2,95 ± 1,10 kertainen muutos; P 100 ng /ml), ja suunta aktivoituminen AMPK (A769662; 10 uM) on pallo muodostumiseen ja (n = 6). (D) pesäkkeiden muodostumista PDAC-215, 253, ja 354-solut (n = 3). (E) kokonaismäärä ja mitokondrioiden (Mito) ROS tuotanto 8 tunnin jälkeen valvonta- tai metformiiniin. (F) Mitokondrioiden transmembraaninen potentiaali 8 tunnin valvonta- tai metformiiniin.

Seuraavaksi arveltu, että erityinen herkkyys CSCS metformiinin saattaa johtua antioksidantti ominaisuuksia metformiinin [19]. Todellakin, metformiini hoito lisäsi merkittävästi mitokondrioiden reaktiivisten happiradikaalien (ROS) in CSCS johdettu kaikista käytetyt kasvaimia, mutta nämä muutokset olivat selvempiä nopean vasteen (PDAC-253 ja 354) verrattuna myöhässä vasteen PDAC-215 ja 286 (jos metformiini vaikutukset eivät ole havaittavissa ensimmäisen sukupolven alalla muodostuminen) (Fig. 4E). Mielenkiintoista, yhdenmukaiset tulokset saatiin mitokondrion transmembraanisen potentiaalin, joka näkyvimmin vähennetty nopean vasteen (Fig. 4F). Käyttäen mitokondrioiden koetin TMRE, osoitamme, että näissä kasvaimissa metformiinin laski niiden mitokondrion kalvon läpäisevä potentiaali (käytetään yleisenä merkki mitokondriotoksisuuden ja apoptoosin induktion), kun taas se pysyi muuttumattomana tai vain hieman vähennetty hidas vaste. Tämä suora vaikutus mitokondrioissa voivat myös selittää ero herkkyydessä ei-CSCS ja CSCS kuin viimeksi mainitut näyttävät olevan riippuvaisia ​​mitokondriot energian tuottamiseen, kun taas ei-CSCS pääasiassa luottaa mitokondrioiden-riippumattomista lähteistä, kuten aerobinen Glykolyysivaiheen (Warburg vaikutus) [20]. Lisäksi olemme myös vahvistaneet, että metformiinin vaikutusten mitokondrioissa oli riippumaton AMPK /mTOR koska kumpikaan suora AMP aktivaattori A769662 eikä mTOR-estäjä rapamysiini kykenivät jäljittelee vaikutuksia metformiinin (Fig. S4A /B).

metformiinin pysähtyy PDAC eteneminen in vivo

ensin tutkittiin vaikutuksia metformiinin

in vivo

käyttäen lyhyt 7 päivän metformiinin hoitoon PDAC-185. Aikana myöhemmin seurannan 40 päivän havaitsimme merkittävä väheneminen kasvaimen kasvua ja täydellistä hoitovastetta 3 out 8 kasvaimista metformiini käsitellyn-hiirten eikä tapahdu anteeksiantamista kontrolliryhmässä (Fig. S5). Johdonmukaisia ​​tietoja saatiin muista PDACs kanssa Metformiinimonoterapiasta on erittäin tehokas asiakkuutta tauti regressio (Kuva. 5A-F). Useita tärkeitä havaintoja tehtiin Tutkimusten aikana. Ensinnäkin, ei brutto toksisuutta ei havaittu pitkittynyt metformiini kohtelun kuin kehon paino pysyi ennallaan (kuvio. 5A, oikea paneeli). Toiseksi, kasvaimet hitaasti, mutta säännöllisesti uusiutunut peruuttamisen jälkeen metformiinin päivänä 100 (Fig. 5A, vasen paneeli). Kolmanneksi, kun taas lisäys gemsitabiinin

in vitro

todettiin additiivinen vaikutus CSC väestöstä (Fig. 5C), mitään lisäainetta vaikutusta voitiin todeta

in vivo

varten metformiini plus gemsitabiinia (Fig. 5D).

(A)

Vasen paneeli

: PDAC-215 kudos istutettiin ja hoito jaettiin jälkeen alkuperäisen kasvaimen take todennettiin. Hiiriä käsiteltiin joko gemsitabiinin (Gem) tai metformiini (Met). Metformiinin lopetettiin D100 potentiaalin testaamiseksi jäljellä vaurioiden aloittaa taudin uusiutumisen. Sen jälkeen dokumentoitu taudin uusiutumisen, metformiinin hoito aloittaa uudelleen.

Oikea paneeli

: Paino hoidon aikana. (B)

Vasen paneeli

: Histologinen analyysi: hematoksyliinillä Eosiini (H n = 6).

Nämä tiedot sai meidät oletuksen, että gemsitabiinia ei ole asianmukaisesti toimitettu PDAC kudoksen [21] ja /tai strooman suojasi CSCS alkaen vahingollisia vaikutuksia metformiinin edistämällä stemness ja myöhemmin kestävyys [22]. Siksi lisäsimme tasoitetaan estäjä Sibi-C1 kuin strooman /tähtisolut kohdistamisen aineen yhdistelmä gemsitabiinin ja metformiinin. Koska olemme aiemmin osoittaneet, että yhdistelmä gemsitabiinin plus tasoittaa estäjä ei estä uusiutumisen [10] ja gemsitabiinin edustaa tällä hetkellä vakiohoito PDAC, me vain testannut tämän yhdistelmän. Tehostamisen lisäksi kudokseen toimitus gemsitabiinin, [21] kolmoissidoksen johti myös kaksinkertaistumiseen kudoksen metformiinin pitoisuuden (23,1 ± 0,82 vs. 10,8 ± 1,9 mg /g). Myöhemmin toistettavissa tauti regressio havaittiin (Fig. 6A-C) ja, mikä vielä tärkeämpää, tämä yhdistelmä oli tehokas myös kasvaimissa aiemmin osoitettu olevan vastustuskykyisiä mTOR esto (Fig. 6D) [23].

( A) PDAC-185 kudos istutetaan hiiriin ja käsiteltävä ilmoitetulla lukien tasoitetaan estäjä Sibi-C1. (B) Sisältöä EpCAM + ja CD133 + soluja, vastaavasti, (

yläpaneeli

) ja pallo muodostuminen kapasiteetti (

alempi paneeli

). (C) Histologinen analyysi: hematoksyliinillä 75 pm iso ~ 97% CD133high. Sarja- Viemisen, 7 päivän ikäiset palloja kerättiin käyttämällä 40 pm solun- Dissosioidut yhden soluihin trypsiinillä, ja sitten uudelleen kasvatetaan 7 d.