Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kolme SLIT ligandit ja niiden neljä Robo reseptorit on perustavanlaatuinen rooli nisäkkäiden kehitystä edistämällä apoptoosin ja repulsing poikkeava solujen vaeltamiseen.

rakoja

ja

ROBOs

ovat nousseet ehdokas tuumorisuppressorigeeneille, jonka ekspressio inhiboituu eri epiteelikasvaimissa. Olemme osoittaneet, että niiden ilmaisua voitaisiin säätelee negatiivisesti kortisolin normaaleissa munasarjan luteal soluissa. Me arveltu, että ovulaation jälkeen paikallisesti tuotetun kortisolin estäisivät

SLIT /Robo

ilmentymisen munasarjojen pinnan epiteeli (OSE) helpottaa korjaamiseen ja että tämä sääntely polku oli vielä läsnä, ja voitaisiin manipuloida, munasarjaepiteelisolujen syöpäsoluja. Tässä tarkastelimme ilmaisun ja sääntely SLIT /Robo väylän OSE, munasarjasyövän epiteelisolujen ja munasarjojen kasvainsolulinjoissa. Basal

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

ja

ROBO4

ilmentyminen oli alempi primääriviljelmien munasarjasyöpä epiteelin solut verrattuna normaaliin OSE (

P

0,05) ja huonosti eriytetty SKOV-3-soluissa verrattuna eriytetympien PEO-14-solut (

P

0,05). Kortisoli vähensi ilmentymistä tiettyjen

rakoja

ja

ROBOs

normaalissa OSE ja PEO-14-solut (

P

0,05). Lisäksi esto SLIT /Robo aktiivisuus pienentää apoptoosia sekä PEO-14 ja Skov-3 kasvainsoluja (

P

0,05). Mielenkiintoista

SLIT /ROBO

ilmentymistä voidaan kasvattaa pienentämällä ilmentyminen glukokortikoidireseptorin käyttäen siRNA (

P

0,05). Kaiken kaikkiaan meidän havainnot osoittavat, että post ovulaatiota vaiheessa yksi rooli kortisolin voi olla tilapäisesti estää SLIT /Robo ilmaisun helpottamiseksi uudistumista OSE. Siksi tämä reitti voi olla tavoite kehittää strategioita manipuloida SLIT /Robo järjestelmä munasarjasyöpä.

Citation: Dickinson RE, Fegan KS, Ren X, Hillier SG, Duncan WC (2011) Glukokortikoidi sääntely SLIT /Robo Kasvaimen synnyssä on munasarjojen pintaepiteelissä ja munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 6 (11): e27792. doi: 10,1371 /journal.pone.0027792

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 04 huhtikuu 2011; Hyväksytty: 25 lokakuu 2011; Julkaistu: 23 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Dickinson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: WCD on tukee Scottish Senior Clinical Fellowship Skotlannin rahoitus neuvosto ja tätä työtä rahoittivat CSO (SCD /02). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

erittyy viiltämällä glykoproteiini ja sen Robo reseptorin alunperin määritelty tärkeiksi aksoniohjauksen molekyylejä kehitysmaissa

Drosophila

hermostoon [1], [2]. Niiden tehtävänä on kehittyvä säilynyt kuin selkärankaisilla SLIT (SLIT1, SLIT2, SLIT3) ja Robo (ROBO1, ROBO2, ROBO3, ROBO4) estävät myös poikkeava hermosolu muuttoliike [3]. Kuitenkin useimmat jäsenet selkärankaisten SLIT ja Robo perheet ilmaistaan ​​myös ulkopuolella hermoston ja ovat sidoksissa kehittämistä erilaisten elinten kuten maitorauhasen ja munasarjan [4], [5]. Organogeneesin aikana Rako /Robo vuorovaikutus sen ajatellaan säätelevän useissa prosesseissa myös solujen jakautumista, apoptoosia, tarttuvuus ja migraatio ei-hermosolujen [6], [7].

Molekyylit, jotka ovat tärkeitä rooleja kehitys ovat usein väärin säädellystä syövässä [8]. Itse

rakoja

ja

ROBOs

ovat ehdokas tuumorisuppressorigeeneille, jonka ekspressio vähenee useissa epiteeli- kasvainsolutyypit, pääasiassa poistetaan, heterotsygoottisuuden menetys ja promoottorialueen hypermetylaation [9]. Tämä sisältää syövät johdettu lisääntymiskudosten lukien kohdunkaulan, eturauhas- ja munasarjasyöpä ituradan kasvaimet [10] – [13]. Viimeaikaiset toiminnalliset tutkimukset ovat myös tukenut teoriaa, että rakojen ja ROBOs on kasvaimia estävä toiminta. Rako /ROBO reitin edistää ohjelmoidun solukuoleman ja /tai vähentää leviämisen fibrosarkooman, ruokatorven, hepatosellulaarinen, peräsuolen, eturauhasen ja rintasyöpäsoluihin [14] – [17]. SLIT2 esti myös hyökkäyksen lukuisia erilaisia ​​kasvainsoluja mukaan lukien eturauhasen, rinnan, kohdun limakalvon ja munasarjojen [13], [18], [19].

SLIT /ROBO reitin on nyt ollut osoitettu olevan fysiologisia rooleja normaaleissa lisääntymiskudosten [6]. SLIT /ROBO signalointi näyttää säädellä istukan angiogeneesiä ja trophoblast toiminto autokriinisellä ja /tai parakriinisellä tavalla [20]. Lisäksi, suurin osa rakoja ja ROBOs myös ajallisesti säädellään normaalin kuukautiskierron kohdun limakalvo ja ilmaistaan ​​munanjohdin [21]. Lisäksi on lisääntynyt ilmentyminen

rakoja

ja

ROBOs

aikuisten keltarauhasen aikana myöhäisen luteaalivaiheen munasarjojen sykli. Tällä hetkellä SLIT /Robo vuorovaikutus voi toimia edistääkseen sen hajoamisen stimuloimalla apoptoosin ja estämällä migraatio keltarauhasen solujen [22]. Vuonna keltarauhasen ja kohdun limakalvon ilmaus rakoja ja ROBOs ovat hormonaalisesti säädellään. Siellä alennettiin

SLIT /Robo

ilmaisun decidualised endometrium alkuraskauden [21]. Lisäksi luteotrooppisesti molekyylit, istukkagonadotropiinia [23] ja kortisolin [24], jotka ovat lisääntynyt raskauden alkuvaiheessa, vähentää ilmentymistä

rakoja

ja

ROBOs

luteal soluissa [22] .

Noin 90% munasarjojen maligniteetteja luokitellaan kasvaimia, joiden ajatellaan johtuvan munasarjojen pintaepiteelissä (OSE) [25]. Riski munasarjasyövän korreloi positiivisesti määrä ovulaatioita [26]. Siis toistuvat vammoja ja myöhemmin korjaukseen OSE aikana ovulaation voivat altistaa kudosta neoplasia [27]. Ovulaatio on tulehduksellinen tapahtuma häiritsevät OSE, mutta vaativat tarkkuutta. Tämä korjaus helpottaa lisääntynyt paikallinen tuotanto tulehdusta steroidi kortisolin välityksellä säätely ylöspäin 11ß-hydroksisteroididehydrogenaasi tyypin 1 [28].

arveltu, että OSE ilmaista raot ja ROBOs ja että kortisolin voi tilapäisesti vähentää ilmentymistä näiden tuumorisuppressorigeeneille helpottaa selviytymistä, proliferaatiota ja näiden solujen vaeltamiseen korjausprosessin aikana. Jos näin oli tämän reitin saattaa olla merkitystä munasarjasyövän etenemiseen ja jos se pysyy aktiivisena pahanlaatuisissa OSE soluissa se voi tarjota terapeuttisia strategioita manipuloida geenejä. Siksi tutkittiin ilmaisun, lokalisointi ja sääntely SLIT /Robo väylän OSE. Me tarkasteltiin myös raot ja ROBOs olivat poikkeavasti ilmaistiin ja hormonaalisesti säännelty munasarjasyöpäsoluja. Lisäksi olemme analysoineet toiminnallista merkitystä häirityn SLIT /ROBO väylän munasarjasyöpäsoluja.

Tulokset

raon /ROBO reitti ilmentyy differentiaalisesti ihmisen OSE, munasarjasyöpä solut ja munasarjan kasvainsolun linjat

SLIT2 ja ROBO1 voitaisiin immunolocalised normaalin ihmisen munasarjan pintaepiteelin (Fig. 1A-C). RT-PCR-analyysi vahvisti ilmaus

SLIT2

ja

ROBO1

primaariviljelmissä OSE ja osoittivat, että siellä oli joitakin ilmaus

SLIT3

,

ROBO2

ja

ROBO4

näissä soluissa (Kuva. 1 D). Sitten tutkittiin näiden geenien ilmentymistä primaariviljelmissä pahanlaatuisia soluja, jotka ovat peräisin vesivatsanestesupernatan- naisten munasarjojen epiteelin syövän.

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

ja

ROBO4

ilmaistiin myös näissä soluissa mutta kvantitatiivisia analyysi osoitti, että ne vähenivät 25-82% verrattuna primääriviljelmien normaalin OSE (Fig. 2A) (

P

0,05).

A) Light-kentän mikroskopia munasarjojen näyttää tietyn värjäytyminen SLIT2 (ruskea) kun OSE. B) Samoin positiivinen ROBO1 (ruskea) värjäytyminen havaittiin myös OSE. C) N: o värjäytymistä ei havaittu negatiivisessa kontrollissa. Mittaviivat edustaa 100 um. D) RT-PCR

rakoja

ja

ROBOs

viljellyissä letku. Lukuun ottamatta

SLIT1

ja

ROBO3

jäsenet

SLIT

ja

Robo

perheiden ilmaistiin letku. FB = sikiön aivojen positiivinen kontrolli; -RT = RT negatiivinen negatiivinen kontrolli.

A) Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR oli lisääntynyt

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

ja

ROBO4

primaariviljelmissä letkun verrattuna pahanlaatuisten epiteelisolujen viljellyn askites munasarjasyöpä potilaille. B) RT-PCR osoittaa, että sekä SKOV-3 ja PEO-14 solulinjat ilmensivät

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

ja

ROBO2

. C) Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR osoittaa

SLIT2

,

SLIT3

ja

ROBO2

transkriptit runsaampaa hyvin eriytettyä PEO-14 soluja verrattuna huonosti eriytetty SKOV- 3-soluissa. FB = sikiön aivojen positiivinen kontrolli; -RT = RT negatiivinen negatiivinen kontrolli; – = DNA negatiivinen negatiivinen kontrolli; * =

P

0,05; ** =

P

0,01; *** =

P

0,005.

Sen varmistamiseksi, että pahanlaatuisia OSE solut oli alennettu ilmaus

rakoja

ja

ROBOs

me tutkimme niiden ilmentymistä kahdessa eri munasarjatuumorissa solulinjoissa. PEO-14 solulinja on johdettu hyvin erilaistunut munasarjan adenokarsinooma ja on yhtymäkohtia enemmän hyvänlaatuinen munasarjaepiteelisoluilla ja varhaisessa vaiheessa munasarjasyöpä. Sen sijaan SKOV-3-solulinja on johdettu huonosti eriytetty munasarjojen adenokarsinooma ja on ominaista pitkälle kasvaimen [29]. Molemmat solulinjat ilmensivät

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

ja

ROBO2

(Fig. 2B). Kuitenkin rinnalle tuloksemme ensisijainen soluviljelmässä,

SLIT2

,

SLIT3

ja

ROBO2

ilmentyminen väheni välillä 58% ja 97% vuonna huonosti eriytetty SKOV- 3-soluissa verrattuna hyvin erilaistunut PEO-14-solut (Fig. 2C) (

P

0,05). Vaikka PEO-14 ja Skov-3-solut voivat erota muissa näkökohtia sekä niiden erilaistumista asemasta nämä tiedot viittaavat siihen, että ilmaus

SLIT /Robo

tuumorisuppressorigeeniä polku voidaan vähentää aikana kasvaimen kehittymisen tai etenemisen.

raon sulkevan /ROBO vuorovaikutus pienenee apoptoosin munasarjojen kasvainsoluissa

vaikutus SLIT /ROBO reitin solun eloonjäämistä tutkittiin käyttäen yhdistelmä-DNA-ROBO1 /Fc-kimeeran, joka toimii ligandina ansa estävän SLIT /Robo vuorovaikutus, ja suora esto

SLIT2

avulla siRNA. Hoito PEO-14 ja SKOV-3-soluja kanssa ROBO1 /Fc-kimeeran ei vaikuttanut solujen lisääntymistä (

P

0,05, tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin sekä PEO-14 ja Skov-3-soluissa esto SLIT toiminnan kanssa ROBO1 /Fc-kimeeran vähennetään apoptoosin 20-21% mitattuna aktivoitu kaspaasi 3/7 määritys (

P

0,05 ) (Fig. 3A). Ohimenevä transfektio on

SLIT2

siRNA pienentää vain

SLIT2

ilmentymistä sekä PEO-14 ja SKOV-3-soluissa. PEO-14 ja Skov-3-solujen alentunut

SLIT2

ilme oli merkittävä 17-26% lasku lohkaistaan ​​kaspaasi-3 ja -7 toimintaa (

P

0,05, pariksi t- testi) (Fig. 3B). Tämä viittaa siihen, että vähentäminen SLIT /ROBO geenin reitin liittyy lisääntynyt solun eloonjäämistä.

A) Hoito ROBO1 /Fc-kimeeran vähentää kaspaasi-3/7 aktiivisuutta, verrattuna hoitoon PBS /0,1% (w /v) BSA: ta (kontrolli) sekä PEO-14 ja SKOV-3-soluja. B) Transfektio

SLIT2

siRNA vähentää kaspaasi-3/7 aktiivisuutta, verrattuna hoidon salattu siRNA ohjaus. * =

P

0,05.

Kortisoli säätelee negatiivisesti ilmaus

rakoja

ja

ROBOs

vuonna OSE ja hyvin erilaistunut munasarjasyövän solulinja

olivatko ilmentymisen SLIT /ROBO väylän munasarjaepiteelisoluilla säädeltiin. Ihmisen munasarjan luteal solua raon /Robo reitin voitaisiin fysiologisesti estävät kortisolin [22]. Kuten kortisolin tuotetaan paikallisesti OSE, ja on tulehdusta rooli ovulaation jälkeen [30], tutkimme onko kortisolin voi säädellä SLIT /Robo ilmaisun OSE.

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

ja

ROBO4

ilmentyminen väheni 25-30% kortisolin ( 1000 nM) käsiteltiin primääriviljelmien normaalin OSE (

P

0,05) (Fig. 4A). Kuitenkin ensisijainen kulttuureissa pahanlaatuisten epiteelisolujen kortisolin ei aiheuttanut enempää vähenemiseen näiden geenien ilmentymistä (

P

0,05) (Fig. 4B).

A) Real -Aika kvantitatiivinen PCR osoittaa, että kortisolin (1000 nM), verrattuna Etanoli operaattorin hallintaa, vähentää

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

ja

ROBO4

ilmentymisen primääriviljelmien letku. B) Kortisoli ei muuttanut ilmaus

rakoja

ja

ROBOs

primaariviljelmissä munasarjasyövän epiteelin syöpäsolujen. C)

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

ja

ROBO2

ilmentyminen oli merkitsevästi pienempi kortisolin eriytetymmällä PEO-14 soluihin. D) kuitenkin ilmaisuaan

rakoja

ja

ROBOs

ei säännelty Kortisoli on huonosti eriytetty SKOV-3-soluissa. E) Kortisoli pienensi erittää tasot SLIT2 proteiinin PEO-14-solut (kontrolli eritys on 0,5 ng /ml). F) Kortisoli ei vaikuttanut erittää tasoa SLIT2 proteiinin SKOV-3-soluja (kontrolli eritys on 0,5 ng /ml). * =

P

0,05; ** =

P

0,01.

PEO-14 ja Skov-3 munasarjojen kasvainsolulinjoja myös potentiaalia vastata kortisolin järjestelmää kuin ilmaista glukokortikoidireseptorin (GR). Lisäksi ne ilmaisevat mineraalikortikoidireseptoriin (MR), mutta eivät ilmennä progesteronireseptorin (PR) (Fig. 5A). Vuonna eriytetymmällä PEO-14-solut, kortisolin vähensi ilmaus

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

ja

ROBO2

mukaan 13-31% (

P

0,05) (Fig. 4C). Lisäksi kortisoli pienensi erittyvän SLIT2 proteiinipitoisuus 53% (

P

0,05) (kuvio. 4E). Kuten ensisijainen soluviljelmissä, sääntely näiden

rakoja

ja

ROBOs

, sekä erittyvä SLIT2 proteiini, katosi malignimpiin, ja vähemmän eriytetty, SKOV-3-solut (

P

0,05) (Fig. 4D, F). Tämä viittaa siihen, että kortisoli voi olla fysiologinen rooli vähentää raon /Robo vuorovaikutuksen aikana korjaukseen OSE ja että tämä reitti voi silti olla aktiivisia joissain alkuvaiheen munasarjojen syöpiä.

A) RT-PCR osoittaa, että PEO -14 ja Skov-3 solut ilmensivät

GR

ja

MR

mutta ei

PR

. Rintojen kasvaimen solulinja HTB-19 käytettiin positiivisena kontrollina ja -RT käytettiin negatiivisena kontrollina. B) Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR osoittaa, että transfektio

GR

siRNA vähentää

GR

ilmentyminen molemmissa solulinjoissa verrattuna salattu (sc) siRNA-ohjaus. C) Vahvistus, että

GR

siRNA ei vaikuttanut

MR

ilmentymistä PEO-14 ja SKOV-3-soluissa. D) Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR osoittaa kasvua

SLIT2

,

ROBO1

ja

ROBO2

ilmaisun jälkeen

GR

kaataa mukaan

GR

siRNA PEO-14 soluihin. E) osoittaminen, että

GR

siRNA transfektoiduissa SKOV-3-soluissa oli myös lisääntynyt

SLIT2

ja

ROBO1

ilme. * =

P

0,05.

manipulointi

rakoja

ja

ROBOs

munasarjasyöpää kasvainsoluissa kohdistamalla glukokortikoidireseptorin

Näin ollen, vaikka glukokortikoideja teoreettinen haitallinen vaikutus varhaisen munasarjasyövän soluja, se tarkoittaa, että manipulointi GR, joiden tarkoituksena on lisätä

SLIT /ROBO

geeniekspressiota, on potentiaalinen terapeuttinen kohde. Siksi ”tippuu alas”

GR

käyttämällä

GR

siRNA kortisolin reagoivaa PEO-14 soluihin. Transfektio

GR

siRNA 48 tuntia aiheutti merkittävän 63%: n vähennys

GR

lauseke (

P

0,001) (kuvio. 5B) vaikuttamatta

MR

lauseke (Fig. 5C). Tämä lisääntynyt ilmentyminen

SLIT2

,

ROBO1

ja

ROBO2

tuumorisuppressorigeeneille (

P

0,05) (Fig. 5D). Lisäksi transfektio

GR

siRNA johti samankaltaiseen vähentäminen

GR

ilmentymistä kortisolin-komentoihin SKOV-3-soluja (

P

0,01) ( kuva 5B). Tärkeää on ilmaus

SLIT2

ja

ROBO1

tuumorisuppressorigeeneille tehostui myös

GR

siRNA transfektiolla (

P

0,05) (kuvio . 5E).

PEO-14 ja SKOV-3-soluja käsiteltiin myös mifepristonin (RU486), joka toimii GR-antagonisti. RU486 hoito yksinään ei vaikuttanut ilmaus

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

tai

ROBO2

joko solulinjassa (

P

0,05, tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin RU486 hoito ei poistamaan kortisolin välittämää negatiivisen säätelyn

SLIT /ROBO

ilmentymisen PEO-14-soluja (tietoja ei esitetty). Tämä viittaa siihen, että voi olla ligandi riippumattomia vaikutuksia GR on SLIT /ROBO ilmaisun ja vahvistaa, että jopa huonosti eriytetty syöpäsoluissa manipulointi GR voi säädellä ilmentymistä tuumorisuppressorigeeneille.

Keskustelu

tässä tutkimuksessa osoitetaan, että normaalin ihmisen aikuisen OSE ilmaisee, RNA-tasolla,

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

ja

ROBO4

. Käyttämällä immunohistokemia myös osoitti, että SLIT2 ja ROBO1 ilmaistaan ​​myös proteiinitasolla. Koska jokainen rakojen pystyy vuorovaikutuksessa kunkin ROBOs, mahdollisesti lukuun ottamatta ROBO4, on todennäköistä, että raon /ROBO vuorovaikutus esiintyy OSE. Tämä ei ole yllättävää, koska nämä molekyylit ilmentyvät muita munasarjojen soluissa, mukaan lukien granulosa luteiinia, kotelo- luteiinia ja luteal fibroblastisoluja aikuisen keltarauhasen [22] ja ennalta granuloosasoluissa ja varhaismunasolujen ensiarvoisen munarakkuloiden sisällä kehittää sikiön munasarja [5 ]. Normaali munasarja on siis päällä fysiologisen autokriinisen tai parakriinisen toimia SLIT /ROBO järjestelmän.

Huomasimme, että normaalissa OSE loven /ROBO järjestelmä voidaan säädellä kortisoli. Kortisoli vähensi ilmaus

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

ja

ROBO4

primaariviljelmissä OSE solujen . Olemme aiemmin osoittaneet, että sama pitoisuus kortisolin voi estää ilmentymisen

SLIT2

ja

SLIT3

primaarisissa viljelmissä luteinised granuloosasoluissa ja luteal fibroblastin kaltaisia ​​soluja [22]. Ovulaation jälkeen on lisätä paikallisen tuotannon kortisolin OSE jotka voivat toimia kannustaa kudosten korjaamiseen ja uudistamiseen [28]. Annosalueella fysiologisesti asiaankuuluvien pitoisuuksien OSE soluissa kortisolin on osoitettu olevan anti-inflammatorinen vaikutus ja se voi estää interleukiini-1 stimuloitujen MMP-9 ilmaisun [30], [31]. Lisäksi olemme aiemmin osoittaneet, että kortisolin, negatiivisesti ekspressiota sääteleviä rakoja ja ROBOs, inhiboi apoptoosia ja helpottaa solumigraatio [22]. Tämä merkitsee sitä, että ovulaation jälkeen yksi vaikutuksia paikallisesti tuotetun kortisolin voi olla väliaikaisesti alentaa ekspressiota SLIT /ROBO tuumorisuppressorigeeneille korjaamisen helpottamiseksi vaurioituneen OSE.

Monissa epiteelisyöpien on siihen liittyvä menetys ilmentymisen jäsenten SLIT /ROBO perhe [9]. Esimerkiksi vähentynyt ilmentyminen

SLIT

ja

Robo

selostukset on havaittu ruokatorven okasolusyöpä, hepatosellulaarinen, keuhko-, eturauhas- ja rintasyöpä [10], [15], [16], [ ,,,0],32], [33]. Tämä vähennys ilmaus ei kuitenkaan ole yleinen ja joidenkin syöpien, kuten glioomat [34] ja toistuvia kohdun limakalvon syöpä [35] ylläpitää tai lisätä SLIT /ROBO reitin. Kuitenkin muutoksia ilmentymisessä tämän reitin pahanlaatuisia epiteelisolujen munasarjasyöpä ei ole aiemmin tutkittu.

viljeltiin pahanlaatuiset epiteelisolut vesivatsanestesupernatan- potilailla, joilla on pitkälle munasarjan epiteelin syövän ja verrattiin SLIT /ROBO ilmaisun että normaalissa OSE. Löysimme alentunut ilmentyminen

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

ja

ROBO4

pahanlaatuisissa soluissa. Vaikka uskomme nämä kulttuurit ovat puhtaat viljelmät pahanlaatuisten munasarjojen soluista [36], on mahdollista, että voi olla ei-pahanlaatuisia epäpuhtaat solujen joissakin kulttuureissa. Siksi verrattiin myös hyvin erilaistunut PEO-14-solujen kanssa huonosti eriytetty SKOV-3-soluissa. Molemmissa tapauksissa enemmän pahanlaatuisia soluja oli pienempi ilmentyminen rakojen ja joitakin ROBOs. Sen vuoksi on todennäköistä, että munasarjasyöpä voidaan lisätä luetteloon kasvainten vähensi SLIT /Robo ilme.

Menimme tutkimaan, mitä vaikutuksia vähemmän aktiivista SLIT /Robo reitti voi olla solujen toimintaa. Viimeaikaiset tutkimukset ovat antaneet ymmärtää, että SLIT2 voi estää hyökkäyksen kohdun limakalvon ja munasarjasyövän kasvainsolulinjoissa [19]. Olemme myös osoittaneet, että esto SLIT /Robo signalointi primaariviljelmissä luteal fibroblastien edistää solujen vaeltamiseen [22]. Lisäksi esto SLIT toimia luteal soluja normaalista munasarjasta esti apoptoosin ja vähennetään kaspaasi-3/7-aktiivisuus [22]. Oli väheneminen kaspaasi-3/7 välittämää apoptoosia PEO-14 ja Skov-3 soluja SLIT /Robo signalointi estyy SLIT jossa käytetään ROBO1 /Fc-kimeeran ja SLIT2 synteesin avulla siRNA tekniikkaa. Voimistunutta apoptoosia, joihin liittyy alentunut ilmentyminen Bcl-2 ja Bcl-xl anti-apoptoottiset, nähtiin SLIT2 transfektoiduissa fibrosarkoomat ja ruokatorven okasolusyöpää [16]. SLIT2 voi myös indusoida apoptoosia liittyy kaspaasi 3 rinta- ja keuhkosyövän solulinjat [37]. Kaiken väheneminen SLIT /Robo aktiivisuus liittyy lisääntynyt solujen eloonjäämistä ja muuttoliike ja tämä on todennäköisesti merkitystä munasarjasyövän ja sen etenemistä.

Jos glukokortikoidi estoa raon /Robo-reitti on edelleen ilmenee pahanlaatuisia epiteelisolujen munasarjasyövän sitten kortisolin voi seurata vaikutuksia solujen eloonjäämistä ja muuttoliike, jotka olisivat haitallisia potilaalle. Meidän ensisijainen kulttuureissa kehittyneen munasarjasyövän, sekä huonosti eriytetty SKOV-3 munasarjasyövän solulinja, sääntelyä rakoja ja ROBOs mukaan kortisolin menetettiin. Kuitenkin se säilyi eriytetymmällä PEO-14 tuumorisolulinjassa. Tämä merkitsee, että reitti voi silti olla aktiivisia alkuvaiheessa munasarjasyövän tai vähemmän pahanlaatuinen fenotyypit. Mielenkiintoista glukokortikoidit voivat estää apoptoosin aikana fibrosarcoma kehitys [38] ja munasarjojen kasvainsolulinjoissa ja soluja vesivatsanestesupernatan- munasarjasyöpä potilaiden [39]. Deksametasoni voi myös rajoittaa indusoiman apoptoosin kemoterapiaa erilaisia ​​kasvaimen muodoissaan, mukaan lukien rinta-, eturauhas-, kohdunkaulan ja munasarjakarsinoomasolut [40] – [42]. Siksi glukokortikoidi estäminen rakoja ja ROBOs saattaa silti olla mahdollista joissakin pahanlaatuisten solujen.

Koska säätely ylöspäin rakojen on osoitettu olevan estäviä vaikutuksia kasvaimen kasvuun ja invaasio on mahdollista, että manipulointi glukokortikoidien reitin on terapeuttista käyttöä. RU486, GR ja PR-antagonisti, voi aiheuttaa apoptoosin eturauhas- ja munasarjasyöpä soluja [43], [44]. Blockade kortisolin aktiivisuuden PEO-14 ja Skov-3-solut, joista puuttuu PR käyttäen RU486 ei vaikuttanut ilmaus

rakoja

ja

ROBOs

kummassakaan solulinjassa. Kuitenkin RU486 teki lakkauttaa negatiiviseen säätelyyn

SLIT /Robo

ilmentymisen PEO-14-soluissa.

Mikä tärkeintä, kun esti endogeenisen

GR

ilmaisua käyttäen siRNA oli kasvuun ilmaisun tiettyjen

rakoja

ja

ROBOs

sekä PEO-14 ja SKOV-3-soluissa. Tämä merkitsee, että

rakoja

ja

ROBOs

voitaisiin säädellä, on transkription tasolla, GR ja merkittävä rooli GR valvonnassa

SLIT /Robo

ilme voi olla ligandi riippumattomia. Meidän bioinformatiikan analyysi paljasti useita GR-reagoiva ja siihen liittyvät elementit (GRE) in promoottorialueiden

SLIT2

,

SLIT3

,

ROBO1

,

ROBO2

ja

ROBO4

. Kiehtovan, neuroblastoomakasvaimissa soluissa, aktivoitujen GR suoraan vuorovaikutuksessa p53 ja estää p53 riippuvainen solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin [45]. Kuitenkin GR voi toimia tuumorisuppressori muun tyyppisiä kasvaimia, mukaan lukien ihosyöpä [46]. Siksi tarkka toiminta GR syövän voisi olla riippuvainen kasvaimen tyypistä.

Yhteenvetona, tämä tutkimus on lisätodisteita että rako /Robo polku on rooli normaalin munasarjan fysiologiaan ja säätelevät hormonit kuten glukokortikoidien. Olemme myös osoittaneet, että raot ja ROBOs näyttävät poikkeavasti ilmaistaan ​​munasarjasyöpä. Lisäksi vähentäminen tämän reitin voisi lisätä tuumorigeneesiä ja etenemisen kautta häiriöstä soluprosesseja kuten apoptoosin ja torjunnassa solumigraation. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot tukevat käsitystä, että vähentäminen SLIT /Robo reitti on tärkeä pahanlaatuinen kehittymistä ja etenemistä. Tämä tutkimus osoittaa myös, että kohdistaminen niiden fysiologiset sääntelyä steroidit voivat olla käyttöä munasarjasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Solujen ja kudosten kerääminen

Kaikki solut ja kudokset saatiin tietoisen kirjallisen suostumuksen jälkeen hyväksyntää Lothian Medical Research eettisen komitean. Ihmisen OSE solut saatiin munasarjat naisilla ennen vaihdevuosia (n = 5) tehdään elektiivinen leikkaus ei-pahanlaatuisia gynekologisten olosuhteissa kuten aiemmin on kuvattu [29]. Pahanlaatuiset epiteelisolut saatiin vesivatsanesteestä naisten (n = 8), jossa on leikkaus pitkälle munasarjan epiteelin syövän kuten aiemmin on kuvattu [36]. Normaalit ihmisen munasarjakudoksen oli kerätty ilmaisen tutkimuksen [47]. SKOV-3 ja PEO-14 solulinjat ystävällisesti P. Pujol, INSERM, Montpellier, Ranska ja S. Langdon, University of Edinburgh, Edinburgh, UK.

Soluviljely ja hoitoja

ensisijainen OSE parit ja munasarjasyöpä soluja ylläpidettiin rutiinisti elatusaineet koostuu Medium 199 (Invitrogen, Paisley, UK) ja MCDB105 (Sigma-Aldrich Corp., Gillingham, UK) (pH 7,3, 01:01 vv

-1), jota oli täydennetty 15% (v /v) sikiövasikan seerumia, 50 IU /ml penisilliiniä, 50 ug /ml streptomysiiniä ja 2 mM L-glutamiinia. PEO-14 ja SKOV-3-soluja viljeltiin samassa media mutta sitä on täydennetty 10% (v /v) FBS: ää. Sillä kortisolin hoitoon tutkimukset Solut siirrostettiin kuusi-kuoppaisille levyille tiheydellä 2 x 10

5 solua /kuoppa. 24 tunnin jälkeen tuoreella väliaineella, joka sisälsi joko 1000 nM Kortisoli [22], [30], [31] etanolissa tai vastaavan määrän etanolia (0,001% v /v) lisättiin soluihin. Muissa kokeissa 50pM RU486 [24] (Sigma) kanssa ja ilman kortisolin käytettiin. Kukin käsittely suoritettiin teknisissä kolmena kappaleena. 24 tunnin kuluttua 1 ml: ssa väliaine poistettiin jokaisesta kuopasta ja varastoitiin -20 ° C: ssa entsyymi-immunosorbenttimääritys (ELISA), koe ja RNA uutettiin soluista, kuten on kuvattu alla.

ROBO1 /Fc hoito tutkimuksia solut ympättiin 2 x 10

4 solua /kuoppa 96-kuoppaisille levyille. 24 tunnin jälkeen tuoreella väliaineella, joka sisälsi joko yhdistelmä-DNA-rotta ROBO1 /Fc-kimeeri (R & D Systems, Inc., Abingdon, Iso-Britannia, 1 ug /ml) tai vastaavan tilavuuden PBS: ää /0,1% (w /v) BSA: ta lisättiin solut. Käsittelyt tehtiin teknisiä neljänä kappaleena. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia myöhemmin solut analysoitiin apoptoosin käyttämällä kaspaasi-Glo 3/7 määrityksessä kuvatulla tavalla.

Short häiritsevä RNA teknologia

Kaksikymmentäneljä tuntia ennen transfektiota PEO-14 tai SKOV-3-soluja siirrostettiin antibiootti vapaan median niin, että solut olivat 50% konfluentti transfektion. Lyhyt häiritsevä RNA-oligonukleotideja vastaan ​​GR ja SLIT2 sekä negatiiviset kontrollit, joilla ei ole merkittävää sekvenssin samankaltaisuutta ihmisen geenin sekvenssien, saatiin Applied Biosystems (Warrington, Iso-Britannia). Ne transfektoitiin transientisti soluihin käyttäen Oligofectamine transfektioreagenssia mukaan valmistajan ohjeiden (Invitrogen). Lyhyesti, siRNA oligonukleotidit laimennettiin lopulliseen konsentraatioon 200 nM Opti-MEM I Reduced Serum Media (Invitrogen) ja yhdistettiin laimennettiin Oligofectamine jotta siRNA:Oligofectamine kompleksien muodostamiseksi huoneenlämpötilassa. SiRNA:Oligofectamine kompleksi lisättiin sitten tipoittain kuhunkin kuoppaan, ja soluja inkuboitiin sitten 37 ° C: ssa, 5% CO

2: ssa 48-72 tunnin ajan. Ekspression analyysi kokeissa soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä ja jokainen transfektio suoritettiin kolmena kappaleena. Jotta kaspaasi-3/7 aktiivisuuden määrityksessä kokeissa soluja kasvatettiin 96-kuoppalevyillä, ja jokainen transfektio suoritettiin neljänä rinnakkaisena.

Expression analyysin

RNA uutettiin kustakin kuopasta ja solut käyttäen RNeasy Mini kit (QIAGEN Ltd., Crawley, UK) ja käsiteltiin deoksiribonukleaasia I (QIAGEN). RNA: ta käytettiin templaattina cDNA-synteesi käyttäen Taqman käänteistranskriptaasia reagenssit (Applied Biosystems). Spesifisten alukkeiden

rakoja

ja

ROBOs

on aiemmin kuvattu yksityiskohtaisesti [22]. PCR suoritettiin Eppendorf Mastercycler kaltevuus lupa lämpösyklilaitteessa (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA) käyttäen GoTaq Flexi DNA-polymeraasia (Promega Ltd., Southampton, UK). PCR thermocycle koostui alkudenaturaation 5 minuuttia 95 ° C: ssa seurasi 35 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, pariutuminen lämpötilassa 30 sekuntia, 72 ° C 30 sekuntia, ja lopullinen laajennus 10 minuutin ajan 72 ° C. PCR-tuotteet tehtiin näkyviksi 2% (w /v) agaroosigeelillä, johon on lisätty etidiumbromidia.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR

RNA uutettiin ja käänteistranskriboitiin, kuten edellä on kuvattu. Standardikäyrä muodostettiin sarjalaimennoksilla cDNA syntetisoitiin ihmisen sikiön aivojen kokonais-RNA: ta (Stratagene Europe, Amsterdam, Alankomaat). Reaaliaikainen PCR-monistus suoritettiin sitten kahtena 10 ui reaktiot käyttämällä

Virta

SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) seuraten valmistajan ohjeita ja käyttäen ABI 7500HT nopea reaaliaikainen PCR-järjestelmä väline (Applied Biosystems) . Käytetyt alukkeet olivat samat kuin ilmaisun analyysin ja on kuvattu aiemmin [22].