Krooninen sairaus

tiivistelmä

Autophagy kuvataan olla mukana homeostaasiin, kehittämiseen ja sairauksien, sekä selviytymisen ja kuoleman prosessi. Sen roolia solukuoleman lähtee väliset suhteet apoptoottisen reitin. Keskityimme selviytymisen autophagy ja tutkitaan sen vuorovaikutusta kuvaavia apoptoottisten koneita. Huomasimme, että vaikka Mcl-1 pysyi tehottomia, Bcl-2 ja Bcl-x L tarvittiin nälkään solujen näyttää täysin toimiva autophagic reitin, kuten on esitetty proteolyysin aktiivisuutta ja havaitseminen autophagic rakkulat. Kuten pro-autophagic toimintojen Bcl-2 ja Bcl-x L ovat riippumattomia Bax. Kuitenkin ne näyttivät toimimaan kautta ei tarpeeton mekanismien Bcl-xL wielded tiukentaa valvontaa kuin Bcl-2-yli asetuksen autophagy: toisin kuin Bcl-2, Bcl-x L ja Atg7 manipulointi tuotti identtisiä fenotyyppejä viittaa ne voivat olla osia samasta signaloinnin koulutusjakson Bcl-x L solunosasijaintia muutettiin päälle nälkään, ja tärkeintä Bcl-x L toimi riippumatta Beclin 1. Still ehjä BH3-sitoutumiskohtaan tarvitaan Bcl-stimuloida täysin toimiva autophagic kautta. Tutkimuksessa korostettiin, että lisäksi vakiintunutta anti-kuolema-toiminto apoptoosin aikana, Bcl-2 ja Bcl-x L on laajempi rooli solujen selviytymistä. Jos Bcl-2 ja Bcl-xL seistä risteyskohdassa välillä pro-selviytymisen ja pro-kuolema autophagy, tämä tutkimus esittelee uuden konseptin, että sääntely autophagy by Bcl-2 ja Bcl-x L oikaistaan ​​sen selviytymisen tai kuolema tulos.

Citation: Priault M, Hue E, Marhuenda F, Pilet P, Oliver L, Vallette FM (2010) Differential Riippuvuus Beclin 1 sääntelevän Pro-Survival Autophagy by Bcl-2 ja Bcl -XL in HCT116 peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 5 (1): e8755. doi: 10,1371 /journal.pone.0008755

Editor: Rafael Linden, Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ), Brasilia

vastaanotettu: 15 syyskuu 2009; Hyväksytty 15 joulukuuta 2009; Julkaistu: 18 tammikuu 2010

Copyright: © 2010 Priault et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Institut National de la Sante et de la Recherche médicale (INSERM), Centre National de la Recherche scientifique (CNRS), Université de Nantes, Université de Bordeaux, Conseil Regional d’Aquitane (ja UMR 5095), ja Agence Nationale pour la Recherche (hanke MABA FV). Sp tukivat tohtorintutkinnon apurahan alkaen INSERM. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Makro-autophagy (jäljempänä autophagy) on catabolic prosessi johtamasta evoluution säilytetty

ATG

geenejä (for autophagy) [1], [2], ja muodostuvat satunnainen sitominen makromolekyylien vastaperustetun kaksi tai useampia kalvoon sitoutunut rakkulat kutsutaan autophagosomes. Kokonsa (tavallisesti 500-1500 nm nisäkässoluissa) [3], [4], autophagosomes voi liittää liukenevaa materiaalia sekä koko organelles. Hajoaminen lasti saavutetaan orastavan autophagic vacuoles ovat fuusioituneet lysosomeihin [5]. Saadut tuotteet ovat sitten käytettävissä kierrätettäväksi biosynteesireittejä; Näin autophagy on yksi tärkeimmistä lysosomaalisen väyliä biologisen materiaalin liikevaihdon.

Autophagy alunperin luonnehdittu selviytymismekanismi, koska se mahdollistaa solujen voittaa ankarissa olosuhteissa mikä pidentää käyttöikää. Kun nälkään, mutaatiot

ATG

geenien johtaa solukuolemaan hiivassa, kloroosia kasveissa, ja laski aikuisten elinaika

daf-2

Caenorhabditis elegans mutantti [1]. Nisäkkäillä, autophagy olemassa perusnopeudella tasolla ja ohjaa homeostaattista toimintoja. Stimulointi autophagy oli pitkään tiedossa vastauksena nälkään tai hormonistimulaatioon [6]; kuitenkin, viimeaikaiset tutkimukset ovat laajentaneet cytoprotective roolia autophagy ylläpitoon solujen elävyyden osoittamalla, että

ATG

geenit ovat välttämättömiä hengissä eri asetuksia nisäkkäillä [7] – [10]. Muuten näissä töissä, autophagy oli elegantisti osoitettu olevan kriittinen bioenergetiikan huolto- ja solujen elinkelpoisuus in vitro, vaan myös olla keskeinen osa in vivo eloonjäämisen koko elimistöön.

Rinnalla tämä fysiologinen rooli kudosten homeostaasiin, autophagy myös paradoksaalisesti liittyy solukuolemaan. Tämä konsepti syntyi havainnosta, että autophagy on yleisesti nähtävissä kuolee soluihin massiivinen poistaminen tarvitaan elimissä [11]. Olemassaolo ”autophagic solukuoleman” eikä ”solukuoleman kanssa autophagy” [12] oli pitkään takia kyseenalaiseksi autophagy ja apoptoosin usein aktivoidaan yhdessä vastauksena korostaa [13] – [15], vaikka näyttämällä erillinen morfologit [16]. Suora näyttöä

ATG

-riippuvan solukuolemaa tuotiin sekä toiminnan menetys tutkimukset osoittavat, että alas-säätely

ATG7

tai

ATG5

hillitsevän solukuoleman apoptoosin vajaiden solujen [17], [18], ja myös yli-ilmentyminen kokeet osoittavat, että ektooppinen ekspressio mutanttien

ATG6

/Beclin 1 voi laukaista autophagy stimulaation, mikä johti

ATG5

-riippuvaisella solukuolemaa [19]. Siten autophagy voidaan harkita vaihtoehtoisena kuolema ohjelma, ainakin soluissa, joilla on heikentynyt apoptoosin koneita. Silti, jos autophagic kuolema on nyt tunnustettu, syy tapahtuman sen puhkeamista ei vielä tunneta, koska (i) mitään lopullisia todisteita autophagy ensisijaisena aloitteentekijänä kuolema on raportoitu, ja (ii) todisteet puuttuu edelleen ärsykkeen, joka olisi vinossa pro-selviytymisen autophagy tehdään tappava ohjelmaan.

äskettäin alalla kiinnostaa autophagic solukuoleman on kasvanut johtuen havaintoon, että autophagy vapauttaminen on sekaantunut syövän, ja koska molekyylien vuorovaikutusta kuvaavia ovat perusteltuja ylikuulumisongelmasta välillä apoptoosin ja autophagy [20]. Siksi kohtalo solujen epäilemättä hallitsee koordinoitua apoptoosin säätelyyn ja autophagy, mutta milloin ja miten vielä ratkaisemattomia kysymyksiä [21], [22]. Yksi ratkaiseva läpimurto siitä Jälkimmäisen asian oli havainto, että avainsäätelijä autophagy Beclin 1 satamat BH3 domain [23], joka sitoutuu BH1-BH2- verkkotunnuksia Antiapoptoottisten Bcl-2 [19] tai Bcl-x [24 ]. Peräkkäin, perusteellinen analyysi sääntelyn autophagy by Bcl-2 ja Bcl-x L tehtiin ja paljasti, että niiden sitoutumista Beclin 1 johti eston autophagy. Tämä sitoutuminen alun perin ehdotti siirtää Beclin 1 alkaen vuorovaikutuksessa ja stimuloiva luokan III fosfatidyyli-3-kinaasi Vps34 toimintaa [19], mutta konsensusta nyt väittää vastaan ​​toisensa poissulkevia vuorovaikutukset Beclin 1 Bcl-2 ja Vps34 [24] – [26], jossa korostetaan, että autophagic toiminta ei ainoastaan ​​ohjaa Beclin 1 yhdessä Bcl-2 /Bcl-xL. Näin ollen, Zeng et ai. ovat raportoineet asetusten jossa Beclin 1 ei sido Bcl-x eikä Bcl-2 [27], joka osoittaa, että nämä yhteisvaikutuksia ei velvoita. Kaikki nämä havainnot viittaavat siihen, että toiminnallinen merkitys Bcl-2 /Beclin 1 tai Bcl-x L /Beclin 1 vuorovaikutusta ei ole täysin ymmärretty vielä. Vielä, näkymä Bcl-2 anti-autophagic proteiini [28] – [30] haastoi havainto, että yli-ilmentyminen Bcl-2 in apoptoosin-vajaiden solujen voisi sen sijaan voimistaa autophagy [18].

tutkimiseksi edelleen tätä aihetta, päätimme tutkia autophagic toiminnot Bcl-2-perheen jäsentä olosuhteissa, joissa autophagy stimulaation toimii selviytymisen prosessi: samanlainen kuin mitä havaittiin kuoleman edistävää autophagy, huomasimme, että selviytyminen autophagy on nimenomaan sotkeutunut anti-apoptoottisen toiminnot Bcl-2 ja Bcl-x L; kuitenkin kiinnostavaa, ne molemmat todettu stimuloivan autophagy ja näytteillä eri riippuvuus Beclin 1 toistaa tällaista pro-PELASTAUTUMINEN.

Tulokset

Nälänhätä aiheuttama Autophagy on Survival prosessin HCT116 Cells

kiistanalaista pro-selviytymisen [7], [10] tai pro-kuolema [17] – [19] tulosten manipulointia autophagy alle ravinteiden reunaehdot ovat vauhdittaneet yhteenotto useiden tutkimusten . Siksi lähdettiin alun perin puuttua kohtalo nälkään solujen meidän asetuksista: peräsuolen HCT116-solut valittiin, koska ne näyttivät, joukossa kaikki solulinjat olemme testanneet, näytteille vahvin autophagic vastaus kohdatessaan ravinteiden rajoitus (meidän julkaisematon data ). Solut siirrettiin nälkiinnityskasvatusaine ja seuraa video mikroskoopilla yli 48 tuntia. Morfometrisiin analyysit (Fig. 1A) paljasti, että HCT116 vanhempien solut enimmäkseen näkyvissä apoptoottisia piirteitä (noin 55%) kuin vahvistanut kaspaasi 3 aktivaation (Fig. 1 B), kun taas -30% koki oletuksena aiheuttaman kuoleman nopeasta osmoottinen kuolema (20 kohteeseen 30 minuutin kuluttua irtoamista levystä), ja alle 5% pysyi hengissä. HCT116-BaxKO koklooni analysoitiin myös määrittämään tuloksesta nälkään apoptoosin vajaiden solujen: odotetusti morfometrisiin analyysi (Fig. 1A) ja western blot (kuvio. 1 B) ei havainnut mitään apoptoottisia ominaisuus, ja havaitsimme, että osa soluista joille osmoottisen kuoleman pysyi ennallaan (-30%). Mielenkiintoista, toinen fenotyyppi vallitsi sillä yli 50% HCT116-BaxKO solut irrotettiin levystä mutta säilyttää elinkelpoisuus, koska ne talteen normaali kiinnittyminen ja lisääntymistä, kun ne siirretään takaisin täydellistä kasvualustaa (Fig. 1 C). Huomattavaa on, että nämä irrotettuja soluja ei voinut selittää mitoosi soluissa 48 tunnin kuluttua nälkään, koska ravinnerajoitteisuuden tiedetään aiheuttavan nopean solukierron pysähtymisen [10], [31]. Sen varmistamiseksi, että tämä palautuva ”pysähtymiseen tila” oli merkitystä on autophagic metabolisesti lepotilassa fenotyyppiin Lum et al. ovat kuvanneet [10], me seuraavaksi määritettiin vaatimuksen toiminnallisen autophagic koneita. Autophagy käyttää kahta ubikitiinistä kuten konjugaatio järjestelmiä autophagosomes loppuun, jotka molemmat sisältävät Atg7, proteiini muistuttaa E1 ubikitiinistä aktivoivia entsyymejä [32] välttämätöntä autophagy [33]. Tämän seurauksena, Atg5 on konjugoitu Atg12 kun autophagy on aktivoitu; western blot paljasti, että nälkään massiivisesti aiheuttama autophagy in HCT116 BaxKO jatkokloonin verrattuna vanhempien soluihin (Fig. 1 B). Genetic heikentyvän autophagy suoritettiin myös käyttäen shRNA kohdentamista Atg7, ja nälässä HCT116-BaxKO shAtg7 solujen havaittiin läpi massiivisen osmoottisen solukuolemaa (-80%), mikä johtuu viallisen tuloa autophagic pysähtymiseen tila ( 5%) (kuvio . 1A), mikä vahvistetaan dramaattinen väheneminen Atg5-Atg12 konjugaatin näissä soluissa (Kuva. 1 B). Pysähtymisen tilassa oli siis riippuvainen autophagy ja osoittautui keino pitää kuoleman loitolla. Olemme päätellä, että vaikka ohimenevä koska solut lopulta kuolevat, jos nälkään on pitkittynyt, autophagy annetaan säilyä meidän asetuksista.

(A) morfometrinen analysoi solujen ilman ravintoa 48 tuntia. Solut maljattiin täyteen kasvatusliuokseen ja Aikakierrosvideo mikroskopia aloitettiin heti siirtämistä HBSS. Elävät solut määritellään kiinnittyneet solut, apoptoottiset solut on määritelty soluiksi, joilla on monia membraania blebs, kuolema menetys osmoottisen eheys on määritelty, jotka ilmentävät turvotus yhden rakkulan, ja pysähtymiseen solut on määritelty soluiksi, jotka ovat irronneet substraattiin mutta säilyttää solukalvon eheyden. Vähintään 700 solua analysoitiin yli kolmena kappaleena kokeiluja. Mitta-asteikko: 50 um. (B) Western-blotit osoittavat kaspaasi 3 aktivointi ja Atg5-Atg12 konjugaatin kokosoluissa otteita soluista ravintoa osoitetut ajat. (C) ei-tarttuva HCT116-BaxKO soluja 24 tuntia nälkään viljelmät otettiin talteen ja siirrettiin täydellistä alustaa. Solujen annettiin tarttua 6 tunnin, sitten Aikakierrosvideo mikroskopia aloitettiin 48 tuntia. Mitta-asteikko: 100 um.

Euroopan Autophagic kapasiteetit peräsuolen HCT116 solujen Riippumaton Bax

Edellisessä kokeessa ehdotti, että kun solut voivat suorittaa sekä apoptoosin ja autophagy, apoptoottiset fenotyypit ovat ensisijaisia autophagic ominaisuuksia. Olimme siis koskee sitä mahdollisuutta, että autophagic vastaus voitaisiin todellakin heikentää toteuttamista apoptoosin. Käsitellä tätä kysymystä, olemme verranneet autophagic kapasiteetti HCT116 ja HCT116-BaxKO soluja olosuhteissa, joissa macroautophagy on vallitseva muoto proteiinien hajoamista, eli sen jälkeen kun 6-9 tuntia nälkään [34]. Kuva. 2A esittää hajoamista L – [

14C] valiini-leimattu pitkäikäinen proteiineja. Pohjapinta proteolyysiä mitattu kontrolloiduissa olosuhteissa oli samanlainen molemmissa solulinjoissa ja vastaavasti asettaa sisäinen viite (valkoiset pylväät). Nälänhätä samalla johti kaksinkertaiseksi kasvanut proteolyysiä molemmissa solulinjoissa (mustat palkit). Tämä proteolyysi oli (i) olennaisesti lysosomaalisen koska bafilomysiini A1 (Baf A1, estäjä lysosomaalisen ATPase protonipumpun) kokonaan estää sen vahvistukseksi (tumman harmaat tolpat), ja (ii) liittyy autophagy koska sen stimulaatio merkittävästi päinvastaiseksi 3-MA (vaaleanharmaa palkit). Kontrollina apoptoottinen induktio etoposidin samana ajaksi ei stimuloinut mitään proteolyysiä (viivoitetut pylväät). Olemme myös määritettiin konversio sytosolin Atg8 /LC3-I osaksi autophagosome sidottu fosfatidyylietanoliamiini konjugaatin LC3-II, joka on yksi tunnusmerkkejä autophagy. Western blotit (Fig. 2B) vahvisti, että HCT116 ja HCT116-BaxKO molemmat tuotettu vastaavia määriä LC3-II upon nälkään. Hajanainen sytosolinen of pistekeratopatiaa lokalisaation mCherry-LC3 seurattiin myös hiiren alkion fibroblasteissa (MEF) vaihtoehtona solulinja, ja osoittivat, että nälkään laukaisi samaa autophagosomal relocalisation of LC3 villityypin MEF ja Bax tippuu-out MEF (kuvio . S1). Yhdessä meidän kokeet osoittavat, että apoptoosin toteutus ei heikennä autophagic vastaus, ja voimme päätellä, että autophagic kapasiteetti on riippumaton Bax.

(A) HCT116 ja HCT116-BaxKO soluja inkuboitiin L – [

14C] valiini, ja jahtasi 9 tuntia täydellisessä alustassa (valkoiset pylväät), HBSS (mustat palkit) tai HBSS lisätty joko 0,1 uM Baf A1 (tumman harmaat tolpat) tai 10 mM 3-MA (vaaleanharmaa baareissa), tai täydellisessä väliaineessa +20 uM etoposidia (viivoitetut pylväät). Tulokset ilmoittavat stimulaatio proteolyysin suhteessa vastaavaan pohjapinta tasoilla mitattuna ei-nälkää olosuhteissa (valkoiset pylväät). Arvot ovat keinoja vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen ± S.D. (B) Western blot ja kvantifiointiin muuntaminen LC3-I osaksi fosfatidyylietanoliamiini-konjugoitua LC3-II. Soluja kasvatettiin täydellisessä elatusaineessa tai nälkään 9 tuntia, kun läsnä on E-64d (20 ug /ml) ja leupeptiiniä (20 pg /ml), hajoamisen estämiseksi sisäisen autophagosomal LC3-II. 150 ug kokosolulysaatissa ladattiin 15% SDS-PAGE. * Student testi p 0,02.

Kohdunulkoinen Expression of Bcl-2 ja Bcl-x L, mutta ei Mcl-1, stimuloi Autophagy

Jälkimmäinen tulos annetaan maadoitus meidän päätöslauselman käyttää apoptoosin puutosta jatkokloonin HCT116-BaxKO käsitellä sääntelyä pro-eloonjäämisen autophagy anti-apoptoottiset proteiinit, kun taas erottaa panos Bcl-2-perheen jäseniä apoptoosin. HCT116-BaxKO-solut transfektoitiin plasmideilla, jotka koodaavat joko Bcl-2, Bcl-x L ja Mcl-1, mikä johtaa vastaavasti 9, 2 ja 3-kertaiseksi proteiinin lisäys (Fig. 3A). Nälänhätä ei muuttanut ekspressioprofiileja (Fig. S2). Video mikroskopia nälkään soluista osoitti, että yli-ilmentyminen Bcl-2 ja Bcl-x L lisäsi merkittävästi solujen lukumäärä tulevien autophagic pysähtymiseen tila (Fig. 3B, vastaavasti 88% ja 82%), kun taas Mcl-1 yli-ilmentymisen täydennetty sen sijaan lukumäärä elinkelpoisia kiinnittyneitä soluja (Fig. 3B, valkoinen palkki = 48%). Siten Bcl-2 ja Bcl-x L oli selvästi erilainen vaikutus kuin Mcl-1 autophagy. Tämä vahvistettiin autophagic proteolyysin (Fig. 3C) ja lähetyksen nimikroskooppikuvia (TEM), jossa hajottavien vesikkelit olivat runsaasti soluissa, jotka ilmentävät Bcl-2 ja Bcl-x L, kun taas ekspressoivat Mcl-1 pysyi transfektoimattomat solut (Fig. 3d, ja kuva S3 suurennus); huomata, joskus laaja Vakuolisaatiota ilmestyi solujen sytoplasmassa yli-ilmentävät Bcl-xL (Fig. 3d, vasen paneeli). Kun käytimme BaxKO MEF ja seurataan mCherry-LC3 fluoresenssin kuvio, olemme huomanneet, että relocalisation proteiinin kohti pistemäinen rakenteet oli merkittävästi stimuloida Bcl-2: n tai Bcl-xL: n transfektoiduissa soluissa (kuvio. 3E), mikä osoittaa, että ilmiö on konservoitunut vaihtoehtoisessa solulinjassa. Kaikki kultakantaan käytetyt tekniikat toistaiseksi yksimielisesti osoitti, että vain autophagic rakkulat (AVS) vaikuttaa Bcl-2 tai Bcl-x yli-ilmentyminen, kun taas muut lipidien, kuten multi-vesicular elimet eivät ole; Siksi käytimme monodansylpentane (MDH) [35] (lipofiilinen väriaine, joka jo osoittautunut tahra AVS [36]) ajaa tietokoneavusteisen analyyseja AVS, mittaavat niiden koosta, ja määrittää niiden esiintymistiheys (kuvio. S4): köyhdytetty HCT116-BaxKO transfektoitujen solujen Bcl-2 tai Bcl-x paljasti lisäämisen määrän AVS, korreloi useammin ulkonäön suurempien AVS, jotkut on kaksi kertaa niin suuri kuin klassisen autophagosomes vahvistama satunnainen TEM. Vastakkaisella, Mcl-1 transfektoiduissa soluissa ei ollut tilastollisesti erilainen transfektoimattomista soluista. Siksi voimme päätellä, että vaikka Mcl-1 ei keskeisessä asemassa selviytymisen autophagy, Bcl-2 ja Bcl-xL nimenomaan stimuloida autophagic kapasiteettia ja lisätä AVS määrää ja kokoa.

(A) Western-blotit solujen, jotka on transfektoitu tyhjällä vektorilla, tai vektoreita, jotka koodaavat Bcl-2: n tai Bcl-xL tai Mcl-1. 50 ug proteiinia uutteet analysoitiin 12% SDS-PAGE. Mcl-1 detektoitiin kypsä proteiini (m), joka on saumattu variantti (t) ja kaspaasi-katkaistuun tuote (c). (B) morfometrinen analyysit HCT116-BaxKO johdettuja stabiileja solulinjoja: solut levytettiin täyteen kasvatusliuokseen ja Aikakierrosvideo mikroskopia alkoi, kun solut siirrettiin HBSS (nälkään) vai ei (täydellinen). Vähintään 700 solua analysoitiin ainakin kolmena kappaleena kokeita. (C) Suhteellinen stimulaatio nälkään aiheuttaman 3-MA-herkkä hajoamisen pitkäikäisten proteiinien HCT116-BaxKO solulinjat transfektoidaan tai Bcl-2: n tai Bcl-xL tai Mcl-1. Solut ajettiin 6 tuntia HBSS tai HBSS + 3-MA. 3-MA herkkä aktiivisuus mitattiin HCT116-BaxKO solut asetettiin 1 ja tulokset edustavat 3-MA herkkä toiminnasta kunkin solulinjan suhteessa että löytyy transfektoimattomissa soluissa. Tiedot ovat keskiarvo (± S.D.), Joka on vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Student-testiä käytettiin tilastoja merkitys tuloksia verrataan transfektoimattomiin soluihin: (*) p = 0,010 (**) p = 0,001 ja (***) p = 0479. (D) TEM HCT116-BaxKO solujen yli-ilmentävät Bcl-2: n tai Bcl-xL tai Mcl-1 6 tunnin kuluttua nälkään HBSS: ssä. Nuolet klo hajottavien autophagosomes. Mitta-asteikko: 2 um. (E) 24 h transfektion jälkeen joko mCherryLC3 yksin tai mCherryLC3 ja Flag-Bcl-x L tai Flag-Bcl-2, BaxKO MEF-soluja kasvatettiin täydellisessä elatusaineessa tai nälkään 6 tuntia vahvistettu. Immonocytochemistry paljastaa Flag-merkittyjen rakenteiden (vihreä). Kuvia edustavat vähintään 4 itsenäisestä kokeesta. Mitta-asteikko: 10 um.

Down-asetus Bcl-XL on enemmän voimakas inhibiittori Autophagy kuin Bcl-2

vieressä tutkitaan vaikutus Bcl-2 ja Bcl-x L alassäätöä verrattuna kuin Atg7 vuonna nälkään soluissa. Infektiokertoimella (MOI) 4 aiheutti vähintään 90%: hiljentäminen kohdegeenien (Fig. 4A) ilman syötön vaikutusta toisiinsa (ei esitetty). Yli ajassa kokeen, elinkelpoisuutta transdusoitujen solujen pysyi ohjaus arvoihin ( 90%, tuloksia ei ole esitetty) sekä täydellisessä alustassa tai sen jälkeen 6h nälkään. TEM osoittivat, että kahden kalvoon sitoutunut vesikkelit olivat tuskin havaittavissa nälkään soluissa, jossa Bcl-2, Bcl-x L tai Atg7 oli alassäädetty verrattuna SCR transdusoidut solut (Fig. 4B). Plasmidia käytettiin transduktion shRNAs koodaa vihreää fluoresoivaa proteiinia (GFP) ja voisimme siten korreloi infektion tehokkuudesta kanssa autophagic vaste paljasti mCherryLC3 lokalisointi (Fig. 4C). Kun nälkään, jotka ilmentävät korkea transduktion shAtg7 (erittäin GFP-positiiviset solut) osoitti diffuusin sytosolin jakauma mCherryLC3 osoittaa, että autophagy oli tehokkaasti heikentynyt, kun taas transduktoimattomia soluilla punctate mCherryLC3 organisaatio. Vuonna pitäminen, nälässä solut jossa shBcl-2 tai shBcl-xL oli tehokkaasti transdusoitu näytteillä hajanainen mCherryLC3 värjäys, vaikka shBcl-xL toistettavasti laukaisi vahvempi estävä fenotyyppi kuin shBcl-2. Siten Bcl-2: n tai Bcl-xL: n säätely alaspäin oli estävä vaikutus autophagy, mutta tämä koe voisi osoittaa, että Bcl-2 ja Bcl-x L ei voi olla täysin tarpeeton molekyylejä valvontaa selviytymisen autophagy. Yrittäessään määrällisesti tällainen ero, vihdoin määritettiin nälkään aiheuttamaa proteolyysiä shRNAs transdusoidut solut: varten MOI 4, Bcl-2 tippuu alas solujen säilytti 75% 3-MA herkkä proteolyysiä verrattuna ryntäily shRNA (SCR). Tämä tasanne saavutettiin jo kanssa MOI 2 ja pysyi ennallaan jopa korkeamman MÕIS (ei kuvassa). Sen sijaan, Bcl-xL: n ja Atg7 hiljentäminen laski hajoamisnopeutta vastaavasti 15 ja 17% (Fig. 4D). Siten Bcl-2 ja Bcl-x L knock-down molemmilla oli vakuuttava estävä vaikutus autophagic proteolyysiä. Kuitenkin vain Bcl-xL: down-regulation jäljitellä että Atg7 ja osoittautui keskeinen molekyyli valvonta autophagy.

(A) Western blot -analyysit HCT116-BaxKO infektoitujen solujen määrän kasvaessa viruspartikkelien transdusoimaan shRNA vastaan ​​Bcl- 2, Bcl-x L tai Atg7, tai salattu shRNA (SCR). Kokonaisproteiinia uutteet tehtiin, ja 50 ug proteiinit analysoitiin SDS-PAGE. (B) HCT116-BaxKO infektoitujen solujen viruspartikkelien kuljettavat shRNA vastaan ​​Bcl-2, Bcl-x L tai Atg7 kanssa MOI = 4 analysoitiin autophagic hajoamista pitkäikäisten proteiinien heti infektion jälkeen. Solut ajettiin 6 tuntia HBSS tai HBSS + 10 mM 3-MA. 3-MA herkkä aktiivisuus mitattiin SCR-infektoiduissa soluissa oli asetettu 100%, ja tulokset edustavat 3-MA herkkä toimintaa kunkin tartunnan solulinjan suhteen, jotka löytyvät SCR-infektoiduissa soluissa. Tiedot ovat keskiarvo (± S.D.), Joka on vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Kun virhe ei ole ilmoitettu, baari oli liian pieni nähtäväksi. (C) HCT116-BaxKO pysyvästi transfektoitujen solujen mCherryLC3 infektoitiin viruspartikkelien kuljettavat shRNA vastaan ​​Bcl-2, Bcl-x L tai Atg7 kanssa MOI = 4. Solut analysoitiin niiden GFP-fluoresenssin (infektoituja soluja) ja LC3 relocalisation jälkeen 6 tuntia nälkään. Mitta-asteikko: 15 um. (D) TEM 6 tuntia sen jälkeen nälkään HCT116-BaxKO soluihin, joissa Bcl-2: n tai Bcl-xL: n tai Atg7 ilmentyminen oli vaimennettu. Mitta-asteikko: 2 um.

Bcl-xL Säätelee Survival Autophagy riippumatta Beclin 1

Studies raportointi anti-autophagic toiminnot Bcl-2 ja Bcl-x L kuvaavat olosuhteita, joissa stimuloidaan autophagy solukuolemaan, ja osoittivat, että niiden sitoutuminen Beclin 1 estetty puhkeamista autophagy. Vastakkaisella, Zeng et ai. raportoitu että ei-nälkään U-251 glioblastoomasolut, ei Bcl-2 eikä Bcl-x olivat normaalit endogeeniset sitovia kokonaisuuksia Beclin 1 [27], mikä viittaa siihen, että asetuksista riippuen, nämä proteiinit eivät velvoita kumppaneita.

meidän paradigma cytoprotective autophagy, endogeeninen Beclin 1 immunosaostettiin ohjaus tai nälkään solulysaateista (kuvio. 5A). Bcl-2 oli tehokkaasti vedetty alas, mutta ei Bcl-x; huomata, Bcl-2 /Beclin 1 yhdistys ei vaihdella nälkään versus kontrolli soluja. Päinvastaista immunosaostus endogeenisen Bcl-2 vahvisti nämä havainnot, kun taas Bcl-taaskaan alasvetovastukset havaittavia Beclin 1. Nämä kokeet tukevat ero sääntely pro-eloonjäämisen autophagy by Bcl-2 ja Bcl-x L, mutta lisäkokeita tarvittiin sen varmistamiseksi, että Bcl-x toimivat riippumatta Beclin 1. Subsellulaariset osoitti, että lukuun ottamatta mitokondrioiden osan Bcl-2, huomattavia määriä Bcl-2 ja Beclin 1 päällekkäisyyttä kevyiden jakeiden ja edelleen sopusoinnussa IP tuloksia, ei mitään näiden proteiinien muuttui lokalisointi hallinnassa tai nälkään soluja. Sen sijaan, Bcl-x L havaittiin koko gradientin kontrollisoluissa ja sen relocalised erittäin kevyiden jakeiden nälässä pidetyillä soluissa; koska määrä vastaa näissä Bcl-x on läsnä, on kohtuullista olettaa, että se voi vuorovaikutuksessa monien kumppaneiden, ja tämä voi selittää sen, että Beclin 1 ei löydy sen tärkein vuorovaikutuksessa kumppanin kautta IP kokeiluja. Konfokaaliset analyysit osoittivat, että Bcl-co-paikallistaa mitokondrion sisäkalvon proteiinia Atp1 hallinnassa ja nälkään solujen (Kuva. 5C); joten kevyiden jakeiden hosting Bcl-in nälkään solut ovat välittömässä läheisyydessä mitokondrioiden.

(A) Co-immunosaostus endogeenisen Beclin 1 endogeenisen Bcl-2 ja Bcl-x L in HCT116-Bax KO soluissa kasvatettiin täydellisessä väliaineessa tai nälkään 6 tuntia. (B) Solunosafraktiointi ja HCT116-Bax KO-soluja kasvatettiin täydellisessä elatusaineessa tai nälkään 6 tuntia. Solut rikottiin Dounce homogenisaattorilla, post-ydinvoiman supernatantit ladattiin päälle jatkuvan 10-55% sakkaroosia kaltevuus varten ultrasentrifugointi yössä. Fraktiot, 500 ui kerättiin, ja kokonaisproteiinin saostetaan. Sama määrä kustakin fraktiosta eroteltiin 14% tris-trisiini SDS-PAGE. Western-blotit olivat, kuten on kuvattu menetelmät jaksossa. (C) Immunosytokemia endogeenisen Bcl-xL: n ja ATP1 in HCT116-BaxKO soluja kasvatettiin täydellisessä elatusaineessa tai nälkään 6 tuntia.

Koska IP-kokeet osoittivat vuorovaikutusta Bcl-2 ja Beclin 1, mutta olivat tuloksettomia for Bcl-x L ja Beclin 1, päätimme perustaa viimeinen joukko kokeita tutkimaan edelleen toiminnallisia eroja Bcl-2 ja Bcl-x L ja riippuvuus Beclin 1. Analysoimme autophagy soluissa yli-ilmentävät Beclin 1 tai BH3 mutantit Beclin 1

F123A ja Beclin 1

125A, jotka vastaavasti irti tai säilyttävät sitoutumisen Bcl-2 ja Bcl-x L [19], [37] (proteiinin ekspressiotasot on esitetty kuviossa. S5 ). Kuvio 6A esittää, että, kuten odotettua, Beclin 1 ektooppinen ilmentyminen stimuloi nälkään aiheuttama autophagic proteolyysiä. Tällainen piirre oli tiukasti riippuvainen funktionaalinen BH3 domain (eli pystyvät vuorovaikutukseen BH1-BH2- sisältävä kumppanit) lähtien Beclin 1

125A jäljitteli villityyppistä proteiinia, kun taas Beclin 1

F123A oli täysin kykenemätön laukaisemaan autophagy. BH1 mutantit Bcl-2 ja Bcl-x L (eli Bcl-2

G145A tai Bcl-x

G138A), jotka molemmat löysä niiden vuorovaikutusta BH3-domeenin Beclin 1 [19], [24] oli vastavuoroisesti analysoitu. Tasot yli-ilmentymisen HCT116-BaxKO solut olivat samanlaisia ​​kuin ektooppisen Bcl-2 ja Bcl-x L (Fig. S2). Estää Bcl-2 Beclin 1 kumosi kokonaan stimulaatio autophagic proteolyysiä havaittiin natiivin Bcl-2. TEM vahvisti, että määrä ja koko autophagic rakkulat Bcl-2

G145A ilmentävät solut olivat hyvin erilaiset Bcl-2 ilmentäviä soluja, ja ne olivat jopa verrattavissa ei-transfektoitujen solujen (vertaa Fig. 3d ja Fig. 6B oikea). Näin ollen, Bcl-2 pro-autophagic toiminnot täysin luottaa siihen, että sitoutumisen BH3, joka sisältää kumppanin (luultavasti Beclin 1 mukainen IP-kokeita ja proteolyysille saadut tiedot Beclin 1

F123A). Sen sijaan, Bcl-x

G138A silti säilyttänyt hieman kyky stimuloida autophagic hajoamista, vaikka se oli paljon vähemmän tehokas kuin sen natiivi vastine (Kuva. 6A). TEM osoitti, että Bcl-x

G138A stimuloi AVS synteesin yhtä tehokkaasti kuin Bcl-x (vertaa Fig. 6B vasemman Fig. 3d). Relocalisation of mCherry-LC3 in BaxKO-MEF transfektoitu Bcl-x

G138A vahvistanut tämän havainnon (vertaa Fig. 6C kuvioon. 3E). Colocalisation ja LC3 ja Lamp1A nälässä pidetyillä HCT116 BaxKO soluja, jotka ilmentävät Bcl-x L- ja Bcl-xL:

G138A osoitti, että autophagic vesikkelit sisälsi sekä markkereita, ja näin ollen ovat hajottavien autophagosomes. Siksi mutaatio Bcl-x L BH3 sitoutumiskohdan johti rakenteellisesti ehjä mutta vajaatyökykyisiin autophagic kautta. Tämä joukko tiedot osoittavat, että hajottavia AVS muodostuu Bcl-x

G138A mutta lisäkokeita tarvitaan selittämään, miksi nämä AVS ovat vähemmän toiminnallisia kuin Bcl-x ilmentävien solujen. Vertailu määrä Atg5-Atg12 konjugaatin ei transfektoidut solut tai solut, jotka ilmentävät Bcl-x L- ja Bcl-xL:

G138A ei ole määritellyt mitään eroa, mikä osoittaa, että konjugointi vaihe ei ole rajoittava, ja ei voida enää stimuloida Bcl- xL ilmentymistä (Fig. S6). Tulevaisuuden kokeissa pyritään verrataan kinetiikka AVS kypsymisen Bcl-xL: n ja Bcl-x L

G138A ilmentävien solujen. Johtopäätöksenä Bcl-2 ja Bcl-x L omaavat ero riippuvuus Beclin 1 do näyttö niiden pro-autophagic toimintoja. Kun taas Bcl-2 täysin luottaa sen sitoutumista Beclin 1, Bcl-x L ei ohjata muodostumista autophagosomes kautta Beclin 1, ja ehdotamme, että proteiini, joka käyttää BH3-sitovan domeenin auttaa Bcl-xL stimuloimaan toiminnallisen autophagic kautta.

(A) suhteellinen stimulaatio nälkään aiheuttaman 3-MA-herkkä hajoaminen pitkäikäisten proteiinien HCT116-BaxKO jotka transfek- tai Bcl-2, Bcl-2

G145A, Bcl- xL, Bcl-x L

G138A, Beclin 1, Beclin 1

F123A tai Beclin 1

I125A. Solut ajettiin 6 tuntia HBSS tai HBSS + 3-MA. Tulokset edustavat 3-MA herkkä toiminnasta kunkin solulinjan suhteessa että löytyy transfektoimattomissa soluissa. Tiedot ovat keskiarvo (± S.D.), Joka on vähintään 3 toisistaan ​​riippumattoman kokeen. Student testiä käytettiin tilastojen merkityksen tuloksia verrataan transfektoimattomiin soluihin; p-arvot ei ole merkitty kuvaajassa ovat p 0,01. (B) TEM HCT116-BaxKO transfektoitujen solujen Bcl-x L

G138A (vasen) tai Bcl-2

G145A (oikealla) 6 tunnin kuluttua nälkään. Mitta-asteikko: 2 um. (C) 24 h kuluttua transfektoimalla mCherryLC3 kanssa Flag-Bcl-x

G138A, BaxKO MEF kasvatettiin täydellisessä väliaineessa tai ruokittu 6 tuntia vahvistettu. Immonocytochemistry paljastaa Flag-merkittyjen rakenteiden (vihreä). Kuvia edustavat vähintään 4 itsenäisestä kokeesta. Mitta-asteikko: 10 um. (D) HCT116BaxKO solut yli-ilmentävät Bcl-x L- ja Bcl-xL:

G138A transfektoitiin mCherryLC3 ja mEGFP-Lamp1A. 6 tunnin kuluttua nälkään, solut kiinnitettiin ja havaitaan vahvan 100x tavoitteen (asteikko bar: 5 pm).

Keskustelu

molekyyliperusta ennustaa cytoprotective tai pro-