Krooninen sairaus

tiivistelmä

taustaa ja tarkoitus

Kalsium on ehdotettu välittäjänä on kemopreventatiivisesti paksusuolen syöpä (CRC), mutta kattava mekanismi taustalla ehkäisevä vaikutus ei ole vielä selvää. Siksi teimme tämän tutkimuksen arvioimaan mahdollisia rooleja ja mekanismeja kalsium-välitteisen ehkäisy CRC aiheuttamien 1,2-dimetyylihydratsiinin (DMH) hiirillä.

Methods

geeniekspressioanalyysissä , 6 ei-kasvain peräsuolen kudosten hiiristä peräisin DMH + Kalsium ryhmä ja 3 näytettä kussakin päässä DMH ja kontrolliryhmien hybridisoitiin on 4 × 44 K Agilent koko genomin oligo microarray, ja valitut geenit todensi reaaliaikaisen polymeraasiketjureaktion (PCR). Toiminnallinen analyysi microarray tietojen suoritettiin käyttäen Kegg ja Gene ontologia (GO) analyysit. Hub geenit tunnistettiin käyttäen Pathway Studio ohjelmistoja.

Tulokset

Kasvain ilmaantuvuus on DMH ja DMH + Kalsium ryhmät olivat 90% ja 40%, vastaavasti. Microarray geenien ilmentymisen analyysi osoitti, että

S100A9

,

Defa20

,

Mmp10

,

MMP7

,

Ptgs2

, ja

Ang2

olivat kaikkein vaimentua geenit, kun taas

Per3

,

Tef

,

Rnf152

, ja

Prdx6

merkittävästi voimistunut vuonna DMH + Kalsium ryhmässä verrattuna DMH ryhmään. Toiminnallinen analyysi osoitti, että Wnt, solusyklin ja arakidonihapon väyliä merkittävästi vaimentua siinä DMH + Kalsium ryhmä, ja että GO termejä solujen erilaistumiseen liittyvien, solusyklin, lisääntymistä, solukuoleman, tarttuvuus, ja solumigraatio vaikuttavat olennaisesti .

Forkhead laatikko M1

(

FOXM1

) ja

tumatekijä kappa-B

(

NF-KB

) katsottiin voimakas napa geenejä.

Johtopäätös

DMH aiheuttaman CRC hiirimallissa, kokonaisvaltaiset olivat mukana monimutkaisia ​​geeniekspression muutoksia kattaa monia muuttunut polkuja ja GO termejä. Kuitenkin, miten kalsium säätelee näitä tapahtumia jää tutkittavaksi.

Citation: Wang J-L, Lin Y-W, Chen H-M, Kong X, Xiong H, Shen N, et al. (2011) Kalsium Estää tuumorigeneesiä hiirimallissa peräsuolen syövän. PLoS ONE 6 (8): e22566. doi: 10,1371 /journal.pone.0022566

Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Yhdysvallat

vastaanotettu 13 marraskuuta 2010 Hyväksytty: 29 Kesäkuu 2011; Julkaistu: 17 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Ministry of Public Health, Kiina (nro 200802094), avustusta National Science Todettu of China (30830055) Jing-Yuan Fang; ja avustusta National Natural Science Foundation of China (nro: 30900757) Hua Xiong. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

nykyinen peräsuolisyövän ilmaantuvuus (CRC) on korkea, ja sen ennuste on edelleen huono [1]; näin ollen, on tärkeää kehittää strategioita kehittymisen estämiseksi CRC. Monet aineet käytetään estämään CRC [2]; kuitenkaan ole johdonmukaisuuden varmistaminen koko tekijöille [3], [4], [5], ja jotkin aineet voivat aiheuttaa vakavia sivuvaikutuksia [6], [7]. Siten vaihtoehtoinen lähestymistapa on tarpeen ehkäisyyn CRC.

Tuore systeeminen tarkastelu paljasti, että kalsium saattavat kiinnostaa ehkäisyssä CRC verrattuna aspiriinin ja seulonnan [8]. Kuitenkin tehokkuus kalsium on vielä epävarmaa. Yhdistettiin havainnot 10 kohorttitutkimuksissa paljasti käänteinen suhde kalsiumin saannin ja CRC riski [9], mutta tämä suhde ei ole vahvistettu satunnaistetussa kontrolloidussa kliinisessä tutkimuksessa [10]. Kuitenkin, johtuen rajoituksista satunnaistetussa ohjaus tutkimuksessa (RCT), esim pienen annoksen kalsiumia, lyhyt pituus seurannan, ja vaikutus estrogeenin saanti [11], johtopäätös RCT ei ollut vakuuttava. Kuitenkin, tehokkuus kalsiumin ehkäisemiseksi CRC edelleen kiistanalainen [12].

Samalla tavoin mekanismi kalsium-välitteisen ehkäisy CRC ei ole vielä selvä. Aiemmissa tutkimuksissa, kalsium oli ajatellut vähentää riskiä CRC sitoutumalla myrkyllisiä toissijainen sappihapot ja muodostavat liukenemattomia saippuat ontelossa paksusuolen [13], tai vähentämällä proliferaation, erilaistumisen stimuloinnissa ja apoptoosin indusoimiseksi paksusuolen limakalvon [ ,,,0],14], [15]. Tuoreessa tutkimuksessa todettiin, että kalsium voi kumota liikakasvu distaalisessa paksusuolessa estämällä kalsiumkanavan reseptori eli ohimenevä reseptorin potentiaali kanava, subfamily V, jäsen 6 (TRPV6) [16]. Nämä havainnot osoittavat, että kalsium voi vähentää riskiä CRC kautta erilaisia ​​mekanismeja, mutta erityinen ja kattava mekanismi on vielä epäselvä. Siksi teimme tämän tutkimuksen arvioimaan mahdollisia rooleja ja mekanismeja kalsium-välitteisen ehkäisy CRC aiheuttamien 1,2-dimetyylihydratsiinin (DMH) hiirillä. Uskomme, että havainnot edistetään tutkimuksen kliininen käyttö kalsiumia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimuksemme hyväksyi Animal Care ja käyttö komitean Shanghai Jiao Tong University School of Medicine Renji sairaala, Shanghai, Kiina. Kaikki eläin menettelyt suoritettiin ohjeiden mukaisesti kehittämien Kiinan neuvoston Animal Care ja protokolla hyväksymä Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Renji sairaala, Shanghai, Kiina.

Kemikaalit

DMH saatiin Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Normaali ja korkea kalsiumpitoisuus rehun hiiret saatiin Shanghai SLAC Laboratory Animal Company (Shanghai, Kiina). Pääkomponentit normaalin ja korkean kalsiumpitoisuuden rehun olivat samat: proteiini, 22,1%; rasvaa, 5,28%; tuhkaa, 5,2%; kuitu, 4,12%; typpi-uutos, 52%; fosforia, 0,92%; ja D3-vitamiini 6818,4 IU /kg. Kalsium- (muodossa kalsiumkarbonaattia) normaalissa ja korkea kalsiumpitoisuus syöttö oli 1,24% ja 3,0%, tässä järjestyksessä. Korkea kalsiumin syöttö säädettiin lisäämällä kalsiumkarbonaattia, jotta saadaan lopullinen kalsiumpitoisuus 3%. Koska olemme sitä mieltä, että kiistanalainen tehokkuus korkean kalsiumpitoisuuden ruokavalion ehkäisystä CRC voidaan osittain johtuen pieni annos kalsiumia aiemmissa tutkimuksissa, joten päätimme käyttää suurempia kalsiumpitoisuuden testata tarkkaa ennaltaehkäisevän vaikutuksen CRC ja hiirten toleranssi .

Koe-eläimet

yhteensä 80 naaras SLAC: ICR [paino, 18-20 g; asteen erityisiä taudinaiheuttajista vapaat (SPF)] ostettiin Kiinan Academy of Sciences (Shanghai, Kiina). Ne pidettiin huoneenlämmössä (22 ° C), jonka suhteellinen kosteus on 60% ja 12 tunnin valo /pimeä sykliä; ne toimitettiin standardin laboratorion ruokavalion ja juomaveden. Hiiret jaettiin satunnaisesti 4 ryhmään (20 hiirtä kussakin ryhmässä): kontrolliryhmä, DMH ryhmä, DMH + Kalsium ryhmä, ja kalsium ryhmä. Hiiret kontrolliryhmän toimitettiin normaalin rehun ja sai ihonalaisen injektion fysiologista suolaliuosta; ne on DMH ryhmän toimitettiin tavanomaista ruokintaa ja saivat ihonalaisen DMH annoksella 20 mg /kg kerran viikossa 20 viikon ajan; ne on DMH + Kalsium ryhmä toimitti korkean kalsium rehu- ja saivat ihonalaisen DMH annoksella 20 mg /kg kerran viikossa 20 viikon ajan; Niille Calcium ryhmän toimitettiin korkean kalsium- rehun ja sai ihonalaisen injektion fysiologista suolaliuosta. Hiiret tapettiin lopussa 24 viikkoa, ja ilmaantuvuus CRC kussakin ryhmässä tutkittiin. Tämä menetelmä on kuvattu yksityiskohtaisesti edellisessä tutkimuksessa [17]. Lyhyesti, pitkittäinen viiltoa tehtiin peräsuolen kudosten tarkkailla määrän brutto kasvaimia. Sen jälkeen kun, brutto tuumorit poistettiin erikseen ja täyden paksuuden peräsuolen kudoksia leikattu kahtia pituusakselin. Osa juuri saatu kasvain näytteitä yhdessä niiden puolen vastaavat ei-kasvain peräsuolen kudokset pakastettiin välittömästi nestemäisessä typessä. Loput näytteet kiinnitettiin formaliiniliuokseen ja parafiiniin lohkoissa patologisen analyysin ja immunohistokemia.

Histologinen analyysi

histologista analyysiä, 4-pm paksu osat formaliinilla kiinnitetyt, paraffiini- upotettu koolontuumoreissa valmistettiin. Sen jälkeen hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäys, osien kunkin kasvaimen tutkittiin valomikroskoopilla (Olympus, Japani). Tulokset vahvistivat, että patologi Chen XY.

RNA, merkintöjä, hybridisaatio, ja analyysi

Yhteensä RNA: iden 12 ei ollut kasvainta peräsuolen kudosten [3 Ohjaus ryhmän 3 alkaen DMH ryhmä, 6 alkaen DMH + Kalsium ryhmä (keskuudessa luku 6 DMH + Kalsium ryhmä, 3 olivat hiiristä kanssa kasvaimia ja 3 olivat hiiristä ilman kasvaimia)] kerättiin käyttämällä TRIzol (Invitrogen) valmistajan ohjeita. RNA-pitoisuus mitattiin käyttäen Nanodrop ND-1000 spektrofotometrillä, ja denaturoiva geelielektroforeesi suoritettiin. Seuraavaksi näytteet monistettiin, merkitty käyttäen Agilent pika Amp -leimauskitillä, ja hybridisoitiin käyttäen Agilent koko genomin oligo mikrosiru (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) käyttäen Agilent SureHyb hybridisaatiota kammioita. Hybridisaation jälkeen ja pesun jälkeen käsitellyt kalvot skannattiin Agilent DNA-siru skannerin asetuksia suosittelemia Agilent Technologies.

Tuloksena tekstitiedostot poimittu Agilent Feature Extraction Software (versio 10.5.1.1) tuotiin Agilent GeneSpring GX -ohjelma (versio 11.0) lisäanalyysiä. Taustaa intensiteetti on katkaistu ennen normalisointia. Microarray aineistoja normalisoitiin vuonna GeneSpring GX käyttäen Agilent FE yksivärinen skenaarion (lähinnä mediaani normalisointi). Differentiaalisesti ilmentyvien geenien tunnistettiin määrittämällä kertamuutoksen (FC) ja p-arvot

t

-testi. Geenit, joiden FC of ≥1.5 ja p-arvo ≤0.05 välillä 2 ryhmää havaittiin differentiaalisesti ilmentyvien geenien. Funktionaalinen analyysi differentiaalisesti ilmentyvien geenien suoritettiin käyttäen Gene ontologia (GO) (https://www.geneontology.gov/) [18] ja Kegg PATHWAY Database (https://www.genome.jp/kegg/pathway. html). Hub geenit tunnistettiin käyttämällä Pathway Studio (Ariadne Genomics) [19].

Reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio

Käänteinen transkriptio suoritettiin käyttäen oligo (dT) alukkeita ja yläindeksi II käänteistranskriptaasia (Takara ). Kvantifiointi geenin ilmentyminen suoritettiin käyttäen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR) (Takara). Ilmaisu taso 18 s rRNA käytettiin sisäisenä kontrollina. Ilmaisua seuraavista geeneistä analysoitiin:

S100A9

,

Defa20

,

Mmp10

,

Ptgs2

,

Per3

,

Tef

,

Rnf152

, ja

Prdx6

. Alukkeet luetellaan taulukossa 1.

immunohistokemia

neljä mikrometriä paksu osa formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut ei ollut kasvainta, paksusuolen kudokset poistettiin parafiini ja rehydratoitiin. Mikroaalto korjaus menetelmää käytettiin antigeenin haku. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estettiin inkuboimalla osien 0,3% vetyperoksidia 10 minuutin ajan. Ei-spesifinen antigeeni estettiin inkuboimalla osien lampaan seerumi 30 min. Leikkeitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa kostutetussa kammiossa, jossa kanin monoklonaalista anti-β-kateniinin (Cell Signaling Technology, # 9562) laimennoksena 1:200. Anti-kani-IgG käytettiin sekundaarisena vasta-aineena (30 min inkubointi). Diaminobentsidiiniä käytettiin kromogeenista tai leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä. Näytteet inkuboitiin PBS: llä eikä ensisijainen vasta-ainetta, käytettiin negatiivisina kontrolleina.

Tilastollinen analyysi

tulokset eläinkokeissa ja reaaliaikaisella PCR: llä analysoitiin käyttäen SAS-9,2-ohjelmiston (SAS Institute Inc. USA). Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD. Opiskelijan

t

-testi käytettiin vertaamaan arvojen 2 riippumattomien.

Tulokset

Eläinkokeet

tärkeimmät tulokset eläinkokeita näkyvät kuviossa 1. Me onnistuneesti aiheuttama CRC hiirillä käyttäen DMH (kuvio 1A). Useimmat syövät tunnistettiin adenokarsinooman mukaan histologinen analyysi (kuvio 1 B, 1 C). Kun DMH ja DMH + Kalsium ryhmissä, kasvaimen esiintymistiheys oli 90% ja 40% (kuvio 1 D), keskimääräinen lukumäärä kasvainten hiirtä kohti oli 5,39 ± 1,97 ja 3,0 ± 1,31 (kuvio 1 E), ja keskimääräinen maksimihalkaisija kasvainten oli 6,44 ± 1,72 ja 2,63 ± 1,19 (kuva 1 F), tässä järjestyksessä. Ei kasvain havaittiin Ohjaus ja Kalsium ryhmiä. Kasvu ja kehitys hiiristä Kalsium ryhmässä ei vaikuta merkittävästi, ja patologinen tutkimus niiden munuaiset, sydämet, keuhkot, maksa, ja pernat paljastaneet mitään ilmeistä poikkeavuuksia (tuloksia ei ole esitetty).

A.

havainnointi kasvaimia paksusuolen hiirten lopettamisen jälkeen 24 viikkoa.

B

(x 200) ja

C

(x 400). Useimmat kasvaimet vahvistettiin adenokarsinoomat mukaan patologinen tutkimus.

D

. Kasvaininsidenssiä joukossa 4 ryhmää.

E

. Kasvain numero /hiirien joukossa 4 ryhmää.

F

. Suurin kasvain halkaisija joukossa 4 ryhmää (Ohjaus: kontrolliryhmä, sai tavanomaista ruokintaa ja injektio normaaliin natriumin 20 viikon ajan; DMH: DMH ryhmä, sai tavanomaista ruokintaa ja injektio DMH 20 viikon ajan; DMH + Kalsium ryhmä: sai high-kalsium rehun ja injektio DMH 20 viikon ajan; kalsium ryhmä: sai korkea-kalsium rehu- ja injektio normaaliin natriumin 20 viikkoa). *

P

arvo 0,05 välillä DMH + Kalsium ryhmä ja DMH ryhmä.

geeniekspressioprofiili tekijänä mikrosiruanalyysillä

Kaikki 12 paksunsuolen kudokset tyhjentänyt laadunvalvonta askel ja analysoitiin, kuten on kuvattu menetelmät-osassa. Microarray-analyysi tehtiin välillä kontrolliryhmän (3 näytettä), DMH ryhmä (3 näytettä), ja DMH + Kalsium ryhmä (6 näytettä). Vertasimme myös geeni-ilmentymisen tasojen näytteiden kanssa tai ilman kasvaimia joukossa DMH + Kalsium ryhmä.

Hierarkkinen ryhmittely analyysi 12 array ilmaisu tiedot osoittivat homogeeninen ilmentymisen profiili joukossa näytteitä kustakin ryhmästä (kuvio S1 ). Asettamalla suodatin FC ± 1,5 ja p arvoon ≤0.05, huomasimme, että ilmentyminen 12395 geenien muuttunut merkittävästi vuonna DMH ryhmässä verrattuna kontrolliryhmässä (katso taulukko S1), ja että 1508 geenien merkittävästi muuttunut vuonna DMH + Kalsium ryhmä verrattuna vuonna DMH ryhmässä (katso taulukko S2). Verrattuna Taulukko S1 ja taulukossa S2, huomasimme, että ilmaus 549 geenejä, joiden muutokset johtuvat DMH hoitoa voitaisiin kumota ravinnon kalsiumin (katso taulukko S3). Taulukossa 2, 30 kaikkein differentiaalisesti ilmentyvien geenien on esitetty, joista useimmat liittyvät läheisesti kasvaimien syntyyn, kuten

S100A9

(S100 kalsiumia sitova proteiini A9 [calgranulin B]),

Defa20

(defensiinisekvenssin alfa 20),

Mmp10

(matriksimetalloproteinaasi 10),

Ang2

(angiogeniini, ribonukleaasi A family, osa 2),

Per3

(kauden homologi 3)

Tef

(thyrotroph alkion tekijä), ja

Ptgs2

(prostaglandiini-endoperoksidisyntaasi 2). Sillä 8 valitun geenin, eli

S100A9

,

Defa20

,

Mmp10

,

Ptgs2

,

Per3

,

Tef

,

Rnf152

, ja

Prdx6

, saadut tulokset microarray-analyysi varmistettiin reaaliaikainen PCR (kuvio 2). Valitsimme nämä geenit PCR vahvistusta, koska ne liittyvät läheisesti kasvaimien syntyyn ja kannattaa lisätutkimuksia.

Käytimme 18 s rRNA sisäisenä kontrollina. Suhteellinen mRNA: n ekspressio laskettiin 2

-ΔΔT menetelmällä. Tiedot ovat keskiarvo 10 näytettä ± SD. Ohjaus, geeni-ilmentymisen tasoa normaalissa paksusuolen kudoksessa hiirten kontrolliryhmässä; DMH, geeni-ilmentymisen taso ei ollut kasvainta paksusuolen kudoksen hiiristä DMH ryhmä; DMH + Kalsium, geeniekspression taso ei ollut kasvainta paksusuolen kudoksen hiiristä DMH + Kalsium ryhmä; Kalsium, geenin ilmentyminen ei ollut kasvainta paksusuolen kudoksen hiiristä kalsiumin ryhmässä. *

P

arvo 0,05 välillä DMH + Kalsium ryhmä ja DMH ryhmä; §

P

arvo 0,05 välillä Kalsium ryhmä ja kontrolliryhmä.

onko erityinen biologinen reittejä tai funktionaalinen geeni ryhmiä vaikuttaa eri tavoin korkea kalsium ruokavalio, me Analysoimme microarray aineisto (perusteella tulokset esitetään taulukossa S3) käyttämällä GO ja Kegg ohjelmistoja. Yksityiskohtaiset tulokset esitetään taulukossa S4 ja Taulukko S5. Asettamalla p-arvo on ≤0.05, löydettiin merkittäviä downregulation 39 signalointireittien, kuten jotkut kasvaimeen liittyviä reittejä, kuten solusyklin reitin, Wnt-signalointireitin aktivaatio, verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF) signalointireitin ja transformoiva kasvutekijä ( TGF-β) signalointireitin. Kaikkein rikastettu reitit on esitetty taulukossa 3. Meillä oli tapana immunohistokemia havaitsemaan proteiinin ilmentymisen ja jakelu β-kateniinin, ydin molekyylin Wnt-reitin, ja todettiin, että sen ekspressio oli merkittävästi suurempi kuin kasvaimen paksusuolen limakalvon päässä DMH ryhmässä kuin että kontrolliryhmästä, mutta sen ilmentyminen DMH + Kalsium ryhmä heikkeni merkittävästi verrattuna DMH ryhmään (kuva 3). Kaikkiaan 703 GO termejä, kuten kasvaimeen liittyvät GO termejä kuten solujen erilaistuminen, soluproliferaatiota, apoptoosin, angiogeneesi, soluadheesion, solusyklin ja solunjakautumisen, olivat muuttuneet merkittävästi.

Ohjaus, kontrolliryhmä; DMH, DMH ryhmä; DMH + Kalsium, DMH + Kalsium ryhmä; Kalsium, Kalsium ryhmä.

Käytimme myös Pathway Studio ohjelmisto suodattaa napaan geenejä, jotka saattavat avainrooleja kalsium-välitteisen ehkäisy CRC (taulukko 4). Näiden, 2 geenit valittiin rakentamiseksi geenin verkkoihin (kuvio 4). Pohjalta verkkojen, voisimme määrittää selvästi ydin roolit navan geenejä.

differentiaalisesti ilmentyvien geenien säätelee 2 navan geenejä (A,

FOXM1

, B,

NF-KB

) näytetään muodossa verkko kaavio. Vihreä tai punainen väritys, sekvenssit, jotka ovat vaimentua tai voimistussäädellään DMH + Kalsium ryhmässä verrattuna DMH ryhmä, vastaavasti. Intensiteetti väri on verrannollinen muutoksen suuruutta.

Lisäksi olemme edelleen verrattuna geenin ilmentymisen tasot hiiret päässä DMH + Kalsium ryhmä /ilman kasvaimia ja todettu että geenien ilmentymisen tasot useimpien edellä valittujen geenien hiirillä päässä DMH + Kalsium ryhmä kasvaimia oli näiden päässä DMH + Kalsium ryhmä ilman kasvaimia ja niillä, DMH ryhmästä (katso taulukko S6 ja kuva S1). Huomasimme myös, että ilmaus joidenkin kalsiumin kuljettajat oli erilainen eri hiiriä päässä DMH + Kalsium ryhmä /ilman kasvaimia. Esimerkiksi ilmaus Trpv6 ja Trpv3 oli merkittävästi voimistunut hiirissä päässä DMH + Kalsium ryhmä kasvaimia verrattuna ilman kasvaimia; kuitenkin, ilmaus plasmalemmal Ca

2 + -ATPaasi (PMCA) oli merkittävästi vaimentua.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa käytimme DMH aiheuttaman CRC hiirimallissa, joka osoittaa fenotyypin ja genotyyppiset ominaisuuksia samanlaisia ​​kuin ihmisen satunnaista CRC, ja näin ollen voidaan tutkia ehkäisyyn CRC [20]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että esiintyvyys CRC väheni merkittävästi hiirillä ruokittu korkea kalsium ruokavalio, mikä osoittaa selkeä rooli kalsiumin ehkäisyssä CRC. Tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​monien muiden tutkimusten. Senttiä [21] ovat havainneet, että rotilla on korkea kalsium ruokavaliossa on vähentynyt CRC ilmaantuvuus verrattuna alhainen kalsium ruokavaliossa (86% vs. 53%), Salas [22] Lisäksi havaittiin merkittävä väheneminen kasvainten määrä ja laskua CRC esiintyvyys ryhmässä ruokittu korkea kalsium ruokavaliota (97% vs. 64%). Kuitenkin jotkut tutkimukset ovat havainneet eri tuloksia. Sitrin [23] todettiin, että kumpikaan kalsiumtäydennyksen yksin eikä kalsium- yhdessä D-vitamiinin puutos muuttanut esiintyvyys CRC aiheuttama DMH, Mølck [24] jopa löytänyt ilmaantuvuus lisääntyi rotilla ruokitaan runsaasti kalsiumia ruokavalio. Mielestämme erot eläimen kanta, eläinten ikä, kasvatus ympäristö, perusteella ruokavalio, DMH annokset ja kesto injektio, kalsiumpitoisuuden, kalsium interventio aika voidaan lukea erot tuloksista eri tutkimusten avulla korkean kalsiumpitoisuuden. Vahvistetut ennaltaehkäisevän tehokkuuden CRC korkea kalsium ruokavaliosta ei vielä voida torjua näistä tutkimuksista. Mielestämme se voi johtua pienestä kalsium- näissä tutkimuksissa. Niinpä käytimme korkeampi kalsiumpitoisuus (3%) rehussa testata ennaltaehkäisevän vaikutuksen CRC ja hiirten ”toleranssi. Itse asiassa tämä korkea kalsium syöte oli hyvä ennaltaehkäisevän vaikutuksen CRC meidän kokeessa ja mitään ilmeistä haittavaikutuksia havaittiin hiirillä. Lisäksi, ei ole kasvainta havaittiin Kalsium ryhmissä. Kasvu ja kehitys hiiristä Kalsium ryhmässä ei vaikuta merkittävästi, ja patologinen tutkimus niiden munuaiset, sydämet, keuhkot, maksa, ja pernat paljastanut mitään selvää poikkeavuuksia, ilmaus useimpien valittujen geenien vahvistettiin reaaliaikaista PCR että Kalsium ryhmässä oli sama kuin kontrolliryhmässä. Nämä havainnot osoittavat, että tämä korkea kalsium ruokavalio on turvallinen hiirillä.

Seuraavaksi käytimme microarray geeniekspressioprofiili analyysi määrittää mekanismi kalsium-välitteisen ehkäisy CRC. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus käyttää sirutekniikalla tutkittaessa roolia korkean kalsiumpitoisuuden ruokavalion ehkäisyssä CRC.

Kun FC asetettiin ≥1.5, muutokset 549 geenien jotka olivat seurausta DMH hoitoa voitaisiin kääntää ruokavalion kalsiumia.

S100A9

on kaikkein vaimentua geeni; sen tuote on sytoplasminen Ca

2 +: ta sitovaa proteiinia. Vaikka solunulkoisen S100A9 voisi indusoida apoptoosia sitoutumalla vielä tuntemattomia reseptorin ja aiheuttavat dimerointi Bax ja Bak ja niiden translokaation mitokondriot johtavat mitokondriovaurioita [25], sen ilmentyminen epiteelisoluissa voidaan todellakin indusoida solujen lisääntymistä aktivoimalla fosfoinositidin 3- kinaasi (PI3K) -Akt-NF-KB: n selviytymisen reitti, joka liittyy kasvaimen kehittymisen [26]. Lisäksi, S100A9 on tärkeä proinflammatorinen sytokiini osallistuu synnynnäisen immuniteetin, ja sen ilmentyminen havaittiin olevan koholla lukuisia patologisia tiloja, jotka liittyvät tulehdukseen [27]. Monet muut tulehdussytokiinejä, kuten Defa, olivat myös merkittävästi vaimentua [jäsenet defensiinisekvenssin perheensä vaimentua eri tasoilla:

Defa-rs2

(FC = -9,88),

Defa20

(FC = -8,16)]. Tuumorinekroositekijä (

TNF

) ja sen reseptoreihin myös vaimentua eri tasoilla:

TNF

(FC = -1,87),

Tnfrsf11b

(FC = -5,98),

Tnfrsf19

(FC = -2,27). Useat muut tutkimukset suoritettiin käyttäen DMH tai azoxymethane (AOM) aiheuttama CRC mallia myös havaittu korkeita ilmentymisen tasoja S100A9 ja Defa kasvainkudoksissa [28], [29]. Tulehdussytokiinejä tärkeitä rooleja luontaisen ja adaptiivisen immuniteetin; kuitenkin, nämä kohonnut sytokiinien ovat mukana myös kasvaimen aloittamista edistäminen, ja hyökkäys [30], [31], [32], [33], ja näin, on tärkeä rooli tulehdukseen liittyvä syövän synnyn [34].

MMP ovat perheen matriisin metalloproteinaasien, jotka voivat tärkeä rooli kasvaimen mikroympäristössä [35]. Monet jäsenet MMP perheen merkittävästi vaimentua siinä DMH + Kalsium ryhmä [

MMP10

(FC = -9,47),

MMP-13

(FC = -9,1),

MMP7

(FC = -7,07) ja

MMP11

(FC = -1,56)]. Muut metalloproteinaasientsyymien myös vaimentua, kuten

Adam8

ja

ADAM10

, jotka vaimentua mukaan 2,08 ja 1,6 kertaa, vastaavasti. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että monet jäsenet MMP ja ADAM perhe voisi olla eri rooleja kasvainten synnyssä. Esimerkiksi

MMP7

voisi pilkkoa Fas-ligandin, mikä alentaa vaikutus kemoterapian kasvaimen kumoamalla apoptoosin [36].

ADAM10

voi laukaista vapauttamaan liukoisen kasvutekijän (EGF), välittävät vuodattamalla E-kadheriinin, translokaatiota β-kateniinin tumaan, ja siten, ajo soluproliferaatiota [37]. Kuitenkin tärkein rooli jäsenten MMP ja ADAM perhe edistää kasvainten invaasio ja etäpesäkkeiden hajottamalla soluväliaineen [38], [39]. Nämä havainnot osoittavat, että korkea kalsium ruokavalio voi olla tärkeä rooli estämään hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden CRC. Koska

in vitro

tutkimukset osoittivat, että CRC-soluissa, E-kadheriinin ilmentyminen voidaan indusoida lisäämällä solunulkoinen Ca

2+ konsentraatio [40], kalsium voidaan pitää tukahduttaa epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) estää CRC etäpesäkkeitä.

Per3

oli kaikkein ilmen- tymisen lisääntymisen geenin tutkimuksessamme kuuluva kauden geenejä. Ne geenit ovat keskeisiä elementtejä transkription /translaation palaute silmukoita, jotka tuottavat endogeenistä vuorokausirytmin, ja

Per3

osallistuu kellonaikastandardi aivolisäkkeen ja keuhkojen [41]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat viitanneet siihen, että vuorokausirytmin geenit osallistuvat kasvun ja kehityksen eri syöpiä, ja aika-geenit on nyt yhdistetty DNA-vaurioita vastaus polkuja, estämällä syöpäsolujen kasvua, ja kasvu apoptoottisten nopeudella [42]. Oshima tutkimus on osoittanut, että ilmentyminen

Per3

CRC kudoksissa oli merkittävästi pienempi kuin viereisen normaalin limakalvon, mikä viittaa siihen, että

Per3

voi toimia kasvainsuppressorigeenin [43].

Tef

oli toiseksi ilmen- tymisen lisääntymisen geeni tutkimuksessamme. Se kuuluu PAR-domain perus leusiinivetoketjun (PAR bZip) transkriptiotekijät ja on mukana vieroitus ja lääkeainemetaboliaan [44] ja ylläpidossa solun muodon fibroblasteissa [45]. Se toimii myös pro-apoptoottisen geenin edistämällä ilmentymistä bcl-gs tai firm [46], [47]. Monia muita geenejä myös voimistunut, esim

Rnf152

ja

Prdx6

.

Rnf152

on uusi RING finger-proteiinin ja sen on todettu olevan pro-apoptoottista aktiivisuutta [48].

Prdx6

on jäsen PRDX perheen, liittyy toimintoja, kuten solujen lisääntymistä, erilaistumista ja apoptoosia, jolloin suorittamalla syövän vastaista aktiivisuutta [49].

Käyttämällä koulutusjakson analyysi, me totesi, että Wnt polku vaikutti merkittävästi. Vaikka ilmaus Wnt estävä tekijä

wif1

merkittävästi vaimentua, että monet geenit liittyvät Wnt-signalointireitin aktivaatio ja niiden kohdegeenien säädeltiin vähentävästi [eli

Tcf7

,

Myc

,

sykliini d1

(

CCND1

), ja

MMP7

FC of -1,53, -1,61, -1,62, ja -7,07, vastaavasti]. Proteiini ilmentyminen β-kateniinin väheni merkittävästi vuonna DMH + Kalsium ryhmä, mikä viittaa siihen, että Wnt koulutusjakso on vaimentua tässä ryhmässä. Tämä on yhdenmukaista aiempien havaintojen [28], [50]. Mielenkiintoista, solusyklin polku oli myös merkitsevästi estyy DMH + Kalsium ryhmä, monet geenit tämän reitin on johdonmukaisesti vaimentua, eli sykliinit

CCNB1

ja

CCND1

oli vaimentua mukaan 1,79 ja 1,62 kertaa, vastaavasti, ja ilmaisu sykliini-riippuvaisen kinaasin

CDK1

väheni 1,66 kertaa.

joukossa metaboliareitit, arakidonihapon reitit olivat merkittävästi estyy DMH + kalsium ryhmä. Monet entsyymit tämän reitin oli vähentynyt ilmentyminen, esimerkiksi Ptgs2, joka tunnetaan myös syklo-oksigenaasi-2 (COX-2), väheni 3 kertaa. Arakidonihapon reitti aktivoituu tulehduksen aikana, mikä johtaa prostaglandiinisynteesin ja tromboksaani, joilla on tärkeä rooli inflammatorisen vasteen [51]. Lisäksi keskeinen entsyymi tämän reitin, Ptgs2 (COX-2), on tärkeä rooli aloittamisen CRC. COX-2 yli-ilmentymisen osoitettiin korreloivan syövän syntymistä yli 80% CRC [52]. Eläinmalleissa, COX-2: n ilmentymisen havaittiin olevan riittävä aiheuttamaan kasvaimien syntyyn [53]. Mekanismi voi liittyä aktivointi indusoituvan typpioksidisyntaasin (iNOS) ja VEGF: n signaloinnin muodostumisen edistämiseksi uusien verisuonten [54]. Perusteella siihen toteamukseen, että ilmaus tulehduksellisten sytokiinien S100A9, Defa, TNF, ja TNF-reseptorien merkittävästi myös vaimentua siinä DMH + Kalsium ryhmä, me arveltu, että kalsium voi olla tärkeä rooli vähentää tulehdusta liittyvien kasvaimien syntyyn.

joukossa Pathway Studio johdettuja napa geenejä, jotka voivat avainrooleja kalsium-välitteisen ehkäisy CRC,

FOXM1

,

NF-KB

jne, oli mukana. FOXM1 kuuluu perheeseen evoluutiossa säilyneitä transkription säätimiä, jotka olivat ominaista läsnäolo DNA-sitova domeeni tunnetaan forkhead ruutuun verkkotunnus. Korkeampi ilmentymä FOXM1 todettiin monenlaisissa ihmisen syövistä [55]. FOXM1 voi tärkeitä rooleja solujen lisääntymisen ja apoptoosin [56]. Molekyylimekanismin taustalla FOXM1 signalointia välittämää induktio kasvaimen kasvu ei ole täysin selvitetty. Kuitenkin useita kasvaimia synnyttävän reittejä kuten PI3K /Akt, NF-KB, ekstrasellulaarisen signaali säädelty kinaasi (ERK), mitogeeniaktivoidut proteiinikinaasi (MAPK), VEGF, reaktiivisia happiradikaaleja (ROS), c-myc, ja hypoksia-indusoituva tekijä (HIF) -1 on raportoitu olevan vuorovaikutuksessa FOXM1 signalointia; tämä viittaa siihen, että vuorovaikutus FOXM1 signalointi ja muut signaalinvälitysreittien voi olla tärkeä rooli kasvainten synnyssä [57]. On huomattava, että ilmaisu monien geenien säätelee NF-KB: n osoittivat muuttunut ilmentyminen DMH + Kalsium-ryhmä, esim,

TNF

,

PTGS2

,

MYC

CCND1

,

ETS liittyvä geeni 1

(

ERG1

),

S100A9

, ja

imukudoksen tehostajana kerroin 1

(

LEF1

), viittaa siihen, että NF-KB voi toimia myös keskitin geenin kalsium-välitteisen ehkäisy CRC. Vaikka ilmaus NF-KB ei muuttunut merkittävästi transkriptiotasolla, se on saattanut muuttua translaatiotutkimukseen tai posttranslationaalinen tasolla. Ekspressiokuviota NF-KB on DMH + Kalsium ryhmä ja sen erityinen mekanismi on vielä selvittämättä.

Olemme myös havainneet, että geenin ilmentymisen tasot useimpien edellä valittujen geenien hiirillä päässä DMH + kalsium ryhmä kasvaimia oli näiden samasta ryhmästä ilman kasvaimia ja niillä, DMH ryhmästä, mikä vahvisti, että on tärkeää näiden geenien kalsiumin n ehkäisyyn CRC.