Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Osteosarkooman on yleisin primaarikasvaimen luun. Kiinteät kasvaimet ovat valmistettu heterogeeninen solupopulaatioiden, joka näyttää eri tavoitteet ja roolit kasvaimen taloudessa. Melko pieni solualaryhmäksi mahtuu tai hankkia varsi potentiaaleja, saamassa aggressiivisuus ja yhä odotettavissa toistumisen. CD133 antigeeni on pentaspan kalvon glykoproteiinia, joka on ehdotettu syövän kantasoluja markkeri, koska se on aikaisemmin osoitettu olevan kykenee tunnistamaan syövän aloittamista alaryhmän aivot, paksusuoli, melanooma ja muut kiinteät tuumorit. Siksi tavoitteenamme oli tarkkailla mahdollisen esiintymisen ilmentävät solut CD133 antigeeni sisällä kiinteiden kasvainten solulinjat osteosarkooman ja sitten ymmärtää niiden biologiset ominaisuudet ja suorituskyky.

Menetelmät ja tärkeimmät havainnot

tässä tutkimuksessa käytetään SAOS2, MG63 ja U2OS, kolme ihmisen sarkooma solulinjoja eristettiin nuorista valkoihoisilla vapaaehtoisilla, pystyimme tunnistaa ja kuvata, niiden joukossa, CD133

+ solut osoittavat seuraavat ominaisuudet: korkea proliferaationopeus, solusyklin havaitseminen G2 \\ M vaihe, positiivisuutta Ki-67, ja ilmaus ABCG2 kuljettajat. Lisäksi on FACS, pystyimme tarkkailemaan CD133

+ solun osa osoittaa puolella väestöstä profiilin ja muodostavat pallo-klustereita seerumittomassa väliaineessa suurella klonogeeniset hyötysuhde.

Johtopäätökset

Yhteenvetona havaintomme johtaa ajatukseen, että voimme olettaa, että olemme tunnistaneet, ensimmäistä kertaa, CD133

+ solujen luusarkoomasolulinjoissa, osoittavat monia piirteitä syövän kantasoluja. Tämä voi olla melko kiinnostusta pystyäkseen suunnittelemaan uusia hoitoja vastaan ​​luusyöpä.

Citation: Tirino V, Desiderio V, d’Aquino R, De Francesco F, Pirozzi G, Galderisi U, et al. (2008) havaitseminen ja karakterisointi CD133

+ Syöpä Kantasolut Human Solid Kasvaimet. PLoS ONE 3 (10): e3469. doi: 10,1371 /journal.pone.0003469

Editor: Thomas Zwaka, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 12, 2008; Hyväksytty: 29 syyskuu 2008; Julkaistu: 21 lokakuu 2008

Copyright: © 2008 Tirino et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: MURST ( Italia), 2. Napolin yliopisto. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Osteosarkooman on yleisin primaarikasvaimen luun. Sitä esiintyy luun ja ylimääräisiä luinen sivustoja, ja näyttää bimodaalinen ikäjakauma, jossa on ensimmäinen huippu toisella vuosikymmenellä elämän, jotka liittyvät nuoren kasvupyrähdys (400 uuden lapsia tapausta vuodessa Yhdysvalloille) ja toinen huippu iäkkäiden [1]. Ilmaantuvuus on hieman suurempi Afrikkalainen-amerikkalaiset kuin kaukasialaisissa ja kuolema on yleensä seurausta asteittainen keuhkojen etäpesäkkeiden kanssa hengityksen vajaatoiminta johtuu laajalle levinnyt tauti [2]. Sarkooma geneettiset muutokset sisältävät sekä oncosuppressor ja onkogeeni polkuja, joiden tuotteet säätelevät solusyklin etenemisen [3]. Oikeastaan ​​se on hyvin tiedossa, että kiinteitä kasvaimia asuttaman heterogeeninen solupopulaatiolähteitä sisältävät soluja varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia, kuten korkea proliferaationopeus, nopea laajeneminen ja invasiivisen kasvun [4], [5].

kasvain voidaan ajatella kokonaisuutena elin, joka muodostuu erilaisista soluista näyttämällä erilliset tehtävät taloudessa kasvain. On hyvin tunnettua, että funktio kantasolujen on säilyttää ja korjata kudoksiin. Stem potentiaali voidaan myös hankittu syöpäsolu ja tämä tapahtuma on erittäin tärkeää syövän etenemiseen.

Nykyinen mielipide on, että kasvaimet voivat johtua pieni määrä soluja, joiden varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia. Uusien hoitomuotojen kohdistaminen näitä soluja, jotka ovat keskeisiä syövän etenemiseen, voidaan merkittävästi parantaa kliinistä syövän hoitoon. Siksi on ensiarvoisen tärkeää tunnistaa, kasvaimiin, alaryhmien soluja, joilla merkittäviä eroja leviämisen kannalta, varsi merkki ilmaisun ja käyttäytymisen.

CD133 antigeeni on pentaspan membraaniglykoproteiinin, tunnettu kaksi riippumatonta tutkimusta [6], [7] ja alun perin tunnistettu neuroepithelial kantasoluja [8]. Kiinnostuksensa syövän varsi merkki on kasvanut dramaattisesti, koska se näytti, että se pystyi tunnistamaan syövän aloittamista alaryhmän aivoissa [9] ja paksusuolen [10]. Lisäksi CD133

+ soluja on löydetty myös maksasyöpä [11] ja melanooma [12], mutta tähän asti, ei vielä luusarkoomista, jossa läsnä oletettu kantasolujen kaltaisia ​​soluja muodostavien pallojen on raportoitu [13 ].

Siksi pyrimme käyttämään CD133 markkerina mahdollisen esiintymisen havaitsemiseksi syövän kantasolujen SAOS2, MG63 ja U2OS ihmisen sarkooma solulinjoja eristettiin osteosarkoomia nuorten valkoihoinen aiheista. Nämä solulinjat on aiemmin käytetty malleina osteosarkooman [14], [15] ja osteoblastien kaltaisiksi soluiksi [16], [17]. Tässä tutkimuksessa jotta nimenomaan tunnistaa CD133

+ syövän kantasoluja, olemme tutkineet suhdetta varsi ominaisuudet ja kinetiikka CD133 merkki ilmaisua.

Tuloksemme ensinnäkin osoittavat, sillä ensimmäistä kertaa, että CD133 antigeeni on havaittavissa soluissa eri osteosarcoma vakiintui solulinjoissa. Lisäksi olemme osoittaneet, että nämä solut näyttämään korkea proliferaationopeus ja että ne pystyvät muodostamaan klusterin aloilla. Lisäksi olemme havainneet, että nämä solut ovat erittäin klonogeeniset ja kasvaimia synnyttäviä. Yhdessä meidän tiedot johtavat siihen ajatukseen, että syöpä kantasolut (CSCS), jotka ovat kasvain aloittamista soluja löytyy luusarkoomista ja tämä saattaa olla ensiarvoisen tärkeää suunniteltaessa uusia syöpälääkkeiden luun.

tulokset

SAOS2, U2OS ja MG-63 luusarkoomasolulinjoissa testattiin, jotta voidaan havaita, niiden sisällä, kun läsnä on CD133

+ solupopulaation. CD133 on kantasolujen markkeri kuvattiin ensimmäisen kerran neuro-endoteelin esisolujen, ja viime aikoina on tarkoitus olla selektiivinen markkeri syövän kantasolut (CSC) joissakin syövän tyyppejä. Tuloksemme osoittavat selvästi, että kaikissa kolmessa solujen linjat, kaksi alapopulaatioiden a CD133

+ (vaihtelee 3%: sta 5%) ja CD133

-, voidaan tunnistaa (Fig. 1). Käyttämällä FACsorting, saimme CD133

+ rikastettu populaatio (98,8%) ja CD133

– solupopulaation. Ilmaus CD133 antigeenin analysoitiin käyttämällä kahta erilaista vasta-ainetta. Tulokset vahvistivat, että CD133 negatiiviset solut eivät ilmaista antigeenin solun pinnalla ja että CD133 positiiviset solut ilmaistiin sama prosenttiosuus tasolla käyttäen molempia vasta-aineita.

CD133

+ solupopulaation voidaan havaita kaikissa kolmessa solulinjoissa.

lisäksi kaikki kolme solulinjat olivat negatiivisia CD34-antigeenin, mutta ne osoittavat yhtä suuri vahva positiivisuus CD29, CD44 ja CD90, mesenkymaalisten ja syövän kantasoluja markkereita. Sekä jakeet CD133

+ ja CD133

– solut olivat positiivisia CD29, CD44 ja CD90-antigeenejä kaikissa kolmessa solulinjoissa (Fig. 2).

Kaikki kolme solulinjat ovat negatiivisia CD34 antigeeni mutta ne todisteita yhtäläinen vahva positiivisuus CD29, CD44 ja CD90.

kaksi solupopulaatioiden (CD133

+ ja CD133

-) käytettiin sitten suorittaa solusyklin analyysi, kasvua analyysi, pallo klusterin muodostumista määrityksessä, pehmeä agar määritys ja puoli väestöstä havaitsemiseen.

Cell cycle, Proliferaatiomääritykset kasvu- ja analysoi

propidiumjodidia (PI) testi osoitti huomattavaa eroa solusyklin CD133 lajitellut solut. CD133

+ solut olivat enimmäkseen G2 \\ M vaiheessa, kun CD133

– soluja etupäässä G0 \\ G1 (Fig. 3A), mikä osoittaa, että CD133

+ subpopulaatio on aktiivinen lisääntyvän solun osa. Lisäksi kaikki CD133

+ solujen osoittautui olevan Ki-67

+ (Fig. 3B), kun taas suurin osa CD133

– soluja olivat negatiivisia tämä merkki. Ki-67 on proteiini, joka ilmentyy vain jakautuviin soluihin, jolloin myös tulokset vahvistavat, että CD133

+ osa on lähde juuri muodostettujen solujen.

(A) Kuva solusyklin analyysit suoritettiin SAOS2, MG63 ja U2OS solulinjoissa. CD133

+ solupopulaatio on pääasiassa havaittavissa G2 \\ M vaiheessa taas CD133

– soluja etupäässä G0 \\ G1; (B) Kuva esittää Ki-67 reaktiivisuus. CD133

+ solujen osoittautui olevan Ki-67

+, kun taas CD133

– olivat lähinnä negatiivinen tämän merkin; (C) Kuva esittää kasvukäyrät CD133

+ solujen suhteen CD133

– solujen SAOS2, MG63 ja U2OS solulinjoissa. CD133

+ soluilla korkea proliferaatiopotentiaali kaikissa kolmessa solulinjoissa.

Lisäksi jotta voidaan osoittaa, onko CD133

+ solut kykenivät extensivelly lisääntyä verrattuna CD133

– soluja, havaitsimme niiden kasvua. Tuloksemme osoittivat, että kasvain johdetut viljelmät CD133

+ solujen näyttää suurempi proliferaatiopotentiaali suhteen CD133

– soluja kaikissa kolmessa solulinjoissa. Itse (kuvio 3C) CD133

+ solujen omasivat keskimääräisen kaksinkertaistaa aika on noin 40 h, 33 h ja 38 h SAOS2, MG63 ja U2OS solulinjoissa vastaavasti, kun taas CD133

– solut osoittivat keskimäärin kaksinkertaistaa aika 48 h, 44 h ja 42 h SAOS2, MG63 ja U2OS solulinjoissa vastaavasti. Kun solut olivat kiinnittyneet, lajittelun jälkeen, prosenttiosuus CD133 ilmentävien solujen vähentynyt merkittävästi (p 0,001) ajan kulttuurin (tietoja ei esitetty).

Sphere Cluster Formation

kyky kasvaa suspensiossa seerumittomassa väliaineessa, kuvattiin ensimmäisen kerran valitsemaan hermostoputken kantasolujen avulla neuropallo muodostumista, on suurelta osin tutkittu kasvain aloittamista solun valintatapa. Glioblastooma, paksusuolen syöpä, ja melanoomasoluja ennen kaikkea valittu niiden kyky muodostaa alalla klustereita, havaittiin olevan erittäin tuumorigeenisiä ja pystyy etenemään ja muodostaa uudelleen alkuperäisestä kasvaimesta arkkitehtuuria, kun ruiskutetaan salliva isännät. Meidän tuloksia luusarkoomasolulinjoissa osoitti, että pallo klusterit olivat selvästi havaittavissa jo 24 h CD133

+ kulttuureissa (Fig. 4A, C, D), kun taas CD133

– ei muodosta palloja (Fig. 4B). Kun 7 päivän viljelyn pallojen saatu CD133

+ soluja ympättiin vakiona levyjen kanssa 10% FBS. Solut muuttivat pallojen sisällä muutaman tunnin ja kiinnitetty pohjaan pullot, olettaen monikulmion. Nämä solut johtivat pienempiä kooltaan verrattuna CD133

– soluja. Viikon kuluttua teimme ylimääräinen testi CD133 antigeeniä tarttuneet solut. Mielenkiintoista, jälleen CD133

– väestö havaittiin, jotka osoittavat, että CD133

– soluja, tällä kertaa, peräisin CD133

+ solu. Sitten suoritimme uuden lajittelu näiden solujen ja havaittiin, että CD133

+ osa vielä säilytetään kyky muodostaa palloja, kun CD133

– ei.

(A) Sphere klustereita on muodostettu by CD133

+ soluja puolikiinteässä väliaineessa 24 tunnin kuluttua (alkuperäinen suurennos x 100); (B) CD133

– soluja puolikiinteässä väliaineessa 7 päivän jälkeen, eivät muodosta palloja. (Alkuperäinen suurennos x 100); (C) Sphere klustereita muodostetaan CD133

+ soluja 48 tunnin jälkeen (alkuperäinen suurennos x 200); (D) Sphere klustereiden muodostama CD133

+ soluja, kun uusi lajittelun (alkuperäinen suurennos x 400).

Lisäksi testasimme Oct3 /4 ja CD133 ilmaisuja 6

th solu kulku ja 4

th ja 6

th passage, vastaavasti sarcospheres johdettu CD133

+ solujen lajittelun jälkeen. Tulokset osoittivat, että pallot rikastuneet sekä Oct3 /4 ja CD133 ajan kulttuurin (Fig. 5).

Sininen viiva osoittaa isotyyppikontrolleja, punaiset ja vihreät viivat osoittavat ilmaus CD133 klo 4

th ja 6

th solun kulkua vastaavasti. Vuonna histogrammit, Oct3 /4 ilmentyminen on analysoitu 6

th solun kulkua; vihreä viiva osoittaa isotyyppikontrolleja. Sarcospheres niin CD133 ja Oct3 /4 ovat vahvasti positiivisia.

Soft Agar Pitoisuus

Soft agar analyysit suoritettiin, jotta voidaan havainnoida eroja solujen kasvainten muodostumiseen avulla kyky CD133

+ solujen muodostamaan pesäkkeitä suhteen CD133

– soluja. Kuten taulukosta 1, pesäkkeitä muodostettiin tehokkaammin CD133

+ soluja, jotka johtivat 5,5 ± 1,8-kertaisesti suurempi määrä pesäkkeiden kuin ne, jotka havaittiin CD133

– väestö (

p

0,005) in SAOS2; 7,7 ± 1,5 kertaa suurempi pesäkkeiden määrä kuin mitä havaitaan CD133

– väestö (

p

0,001) MG63, ja 6,8 ± 1,7-kertaisesti suurempi määrä pesäkkeiden kuin havaittu CD133

– väestön U2OS (P 0,005).

Side väestö ja ABCG2

sisällä CD133

+ murto hyvin pieni joukko (0,97%) ilmaisi ominaisuus profiilia puoli väestöstä. On tunnettua, että puolella väestöstä fenotyyppi on merkittävin ominaisuus syövän kantasoluja. Tässä tutkimuksessa osoitamme ensimmäistä kertaa, että luusarkoomasolulinjoissa puoli populaatiota voidaan havaita. Lisäksi olemme havainneet, että kaikki kolme solulinjat ilmensivät ABCG2 kuljettimen (Fig. 6), jotka liittyvät yleensä puoli väestö fenotyyppiin ja lääkeresistenssi.

(A) rianalyysit puolella väestöstä. CD133

+ murto kuuluu pieni joukko (0,97%), jotka ilmentävät ominaisuus profiilia sivu- väestön FACS. (B) ABCG2 ilmentyminen SAOS2 solulinjassa, joka esittää ilmeinen positiivisuus; harmaa viiva osoittaa isotyyppikontrollia.

immunohistokemia ja immunofluoresenssilla

Sekä immunohistokemiallinen ja immunofluoresenssilla analyysejä noudatetaan soluihin ja kelluvien pallojen tehtiin tässä tutkimuksessa. Tuloksemme, vastaavasti, FACS-analyysit, vahvisti läsnäolo CD133-antigeeniin solukalvolla CD133

+ lajitellut solut. Lisäksi kelluva pallot osoitti laajalti diffuusia värjäytymistä CD133, jotka vahvistavat, että palloja muodostetaan CD133

+ soluja. Mielenkiintoista on, että CD133

– järjestetty osa värjättiin CD133, joka on sijaittava sisäisen sytoplasmisissa vesikkeleissä, kuten on esitetty confoal mikroskopialla (Fig. 7A, B, C, D, E, F). Jotta syvästi ymmärtää tätä näkökohtaa olemme suoritetaan, on FACS, solun sisäisen värjäys CD133. Olemme havainneet, että kaikki kolme solulinjojen solunsisäisen positiivisuus havaittiin (Fig. 8A), kun taas kontrolli-isotyypit olivat negatiivisia.

(A) immunohistokemiallinen analyysit kiinnittyneitä soluja ja (B) kelluva aloilla osoittaa läsnäolon of CD133 antigeeni (nuolet). (Alkuperäinen suurennos. × 100); (C) Immunofluoresenssianalyysi on SAOS-2 CD133 PE, solun tukirangan värjätään phalloidin-FITC, nucleus DAPI (alkuperäinen suurennos. X 400); (D) Immunoflurescence analyysi SAOS-2-alueille, CD133 PE kuluttua 24 tunnin pito. (Alkuperäinen suurennos x 200); (E) konfokaali analyysejä kiinnittyneitä soluja ja (F) kelluva aloilla vahvistetaan läsnäolo CD133 antigeenin. (Alkuperäinen suurennos. × 400).

(A) Kuva suoritettiin FACS osoittaa solunsisäisen ilmentymisen CD133 antigeenin SAOS-2, MG-63 ja U2OS. (B) Kuva esittää tällä Reaaliaikainen PCR mRNA transkriptin ilmentymistä CD133

+ ja CD133

– soluja. Tasot ovat lähes identtiset havaittuna niin CD133 positiivisia ja negatiivisia soluja.

Real Time-PCR-analyysi

ilmentyminen CD133 mRNA tasojen CD133

+ ja CD133

– tarttuvat solut olivat lähes identtiset havaittuna Real Time PCR (Kuva. 8B). Tämä vahvistaa sekä FACS ja immunofluoresenssilla tuloksia, kuten edellä on esitetty.

Keskustelu

Osteosarkooman on erittäin aggressiivinen kasvain, joka vallitsevasti vaikuttaa nuoriin. Viimeaikaisten tutkimusten [10] – [13], [18] tuetaan, kun läsnä on erittäin tuumorigeenisen solualaryhmään – yleisesti kutsutaan Cancer Stem Cells (CSCS) – tuumorin sisällä irtotavarana, yritimme eristää ja karakterisoida tämän alaryhmän luusarkoomasolulinjoissa . Kasvaimen vauriot kattavat heterogeeninen solupopulaatioiden, joista läsnäolo varren antigeenejä voidaan todentaa avulla fenotyyppiset analyysejä. Kun läsnä on CD133

+ alaryhmän sisällä ihmisen kiinteiden kasvainten on dokumentoitu useissa raporteissa [10] – [13], [18] – [21], ja solut, jotka ekspressoivat tämän merkin näyttää olevan erilainen kuin muut syöpäsolujen . Erityisesti CD133

+ soluilla varsi kaltaisia ​​piirteitä, kuten erilaistumista kyky, korkea proliferaationopeus, pallo klusterin muodostumista ja kykyä levittää kasvain salliva hosts. Syöpähoidon vikoja saattaa johtua tehoton vaikutuksista nykyisen hoidon yhteydessä mahdollisesti lepotilassa CSCS, jotka ovat edelleen elintärkeä ja pitää yllä kykyä uudistua kasvain [22], [23]. Uusien CSC kohdistetun strategiat haittaavat tällä hetkellä ei ole luotettavia markkereita tunnistamiseksi CSCS ja köyhien ymmärtää niiden käyttäytymiseen ja kohtaloon. Solulinjat, jotka ovat peräisin kasvaimiin, säilyttää hierarkkinen kantasolujen kuvioita, osoitettavissa eri klonogeeniset kykyjä, jotka liittyvät solujen ominaisuuksia, kuten kokoa, tarttuvuus, eksluusio ja geeniekspressiomalleja [24].

Tässä tutkimuksessa, käytimme CD133 antigeenin syövän kantasolujen markkeri, jotta voidaan tunnistaa, sisällä vakiintunut luusarkoomasolulinjoissa, solut joilla on eri ominaisuuksia leviämisen kannalta korko, klonogeeniset tehokkuus, pallo-klusterin muodostumista ja värjätä syrjäytymistä. Seulonta kolme luusarkoomasolulinjoissa, CD133

+ osajoukot havaittiin olevan 3%: sta 5% kaikista soluja, mukaan olettaen, että CSCS pitäisi olla vain hyvin pieni solun osajoukko. Ei ole eroja CD29, CD44 ja CD90 ilmaisuja sekä CD133

+ ja CD133

– soluja. Oikeastaan, syövän kantasoluja pidetään lepotilassa

in vivo

ja ne harvoin jakaa epäsymmetrisesti, synnyttää erittäin lisääntyviä jälkeläisiin [5]. Kuitenkin, jos karan hierarkia olemassa solulinjoissa, solujen kantasolujen ominaisuuksia ei voi olla lepotilassa; muuten, ne olisi menetetty joitakin kohtia. Mukaan tämän huomioon, huomasimme, että CD133

+ solut olivat erittäin proliferatiivisen verrattuna CD133

– soluja, mikä vahvistetaan PI analyysi, Ki-67 merkintää ja kasvun analyysejä.

CD133

+ solut osoittivat monia eroja suhteessa niiden kielteisiä kollegansa, joilla on kyky kasvaa palloja on puolikiinteä keskipitkällä ja tehokkaasti muodostamaan pesäkkeitä pehmeässä agarissa. Nämä määritykset ovat yleisesti pidetään vastaavasti kuin indeksit itseuudistumisen, tuumorigeenisyyteen ja kyky muodostaa klooneja. Lisäksi sarcospheres, joka on johdettu CD133

+ soluja, ilmensivät runsaita tasoja Oct3 /4, jotka ovat transkriptiotekijät kriittisesti mukana itseuudistumiseen ja ylläpidossa pluripotenttisuuden erilaistumattomien alkion kantasolujen [25]. Käsissämme CD133

+ solut osoittivat kaikkien kyvyt ja ilmaisi ABCG2, joka on kalvo kuljettaja, liittyy yleensä puoli väestö fenotyyppiin ja huumeiden kestävyys [26]. Näin ollen, tämä voidaan pitää ylimääräinen merkkiaine CSCS. Lisäksi tässä tutkimuksessa tehokkaasti osoitti, ensimmäistä kertaa, että puoli populaatiota voidaan havaita myös luusarkoomasolulinjoissa. Puoli väestö on määritelty Hoechstin syrjäytymisen virtaussytometrialla [27], [28]. Se on vain pieni osa koko solupopulaation ja ilmentää suuria tasoja eri jäsenten ABC transporter perhe, kuten ABCG2 ja MDR1, jotka ovat vastuussa lääkeresistenssin [29], [30]. Kuten odotettua, huomasimme, että puoli väestö tehtiin erittäin pientä osaa (0,97%) koko solujen, ja kiinnostavaa, se oli täysin sisällyttää CD133

+ osajoukko.

Tuloksemme , yhdessä, voivat johtaa tought että CD133

+ solut ovat syövän kantasoluja. Oikeastaan, vaikka tämä olisi tuetaan

in vivo

-tuumoriksenografti, kuten on esitetty muita kiinteitä kasvaimia [10] – [13], [18] – [21], valitettavasti emme pystyneet suorittamaan

in vivo

kokeissa koska luusarkoomasolulinjoissa ei ympätä mitään isäntä. Me tehokkaasti yrittäneet tehdä

in vivo

elinsiirron meidän CD133 kantasolujen, mutta ilman menestystä, kuten kaikki muutkin tutkijat.

Lisäksi voimme myös oletuksen, että CD133

+ alaryhmä käsittää pienemmän CD133

+ \\ ABCG2

+ \\ SP

+ väestöstä, joka voi olla vastustuskykyinen lääkkeille, hallussaan varsi ominaisuuksia ja voi tehokkaasti ajaa syövän etenemistä.

Mielenkiintoista ja odottamatta, meidän käsissämme, jotkut solut, jotka eivät ilmentävät CD133 merkki kalvolle johti tuottaa havaittavan määrän CD133 mRNA-transkriptien, ja ilmaisi CD133 antigeeni sytoplasman rakkulat esitetyllä konfokaalimikroskopiaa. Kuitenkin CD133

+ ja CD133

– lajitellaan populaatiot selvästi näyttää eri käyttäytymistä. Tämä johtaa meidät spekuloida toiminnallista roolia CD133 järjestämisessä kalvo ja valinnassa CSCS, seuraavasti: i) on CD133 erittäin mukana alalla klusterin muodostumista, on välttämätöntä tarttumattomat solujen kasvuun sekä solusta -solujen rajat puhua, joka sallii solujen ja vastaanottaakseen ärsykkeitä, jotka hankitaan tavallisesti adheesiomolekyylien; ii) CD133

+ ja CD133

– populaatiot ovat jatkuvassa ja keskinäisen vaihdon ja ainoa oikea CSCS ilmaista CD133 jatkuvasti kalvolle.

Yhteenvetona havaintomme osoittavat, että CD133 markkeri voi olla hyödyllistä osoittavat eriytetty /erilaistumattoman tilan osteosarkooman kasvaimia ja tämä saattaa johtaa uusiin lähestymistapoihin, jotta suunnitella tarkempia hoito ja parantaa ennustetta.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

SAOS2, MG63 ja U2OS ostettiin ATCC CELL BANK; solut saatettiin α-MEM-viljelyväliaine, jota oli täydennetty 15% FCS: ää, 100 uM 2P-askorbiinihappoa, 2 mM L-glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä (kaikki Invitrogen, San Giuliano Milanese, Milano, Italia) ja laitettiin 75 ml: n pulloihin suodatettua venttiilit. Pulloja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 ja väliaine vaihdetaan kahdesti viikossa. Sen jälkeen, kun yhtymäkohta, solut jaetaan uusien pulloihin loppuun asti kokeessa.

virtaussytometria ja Cell Sorting

Solut irrotettiin käyttäen 0,02% EDTA: a fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS), lasketaan ja pestiin 0,1% BSA PBS: ssä. Vähintään 500000-soluja (100 ul: ssa PBS: ää /0,5% BSA: ta) inkuboitiin fluoresenssileimattua monoklonaalisia vasta-aineita tai vastaavia isotyyppikontrolleja (1/10 laimennettiin 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan pimeässä). Pesun jälkeen vaiheet, leimatut solut analysoitiin virtaussytometrialla käyttäen FACS Vantage solulajittelijaa (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA). Käytetyt vasta-aineet olivat hiiren anti-humaani-CD133 /2 PE konjugoitu (Miltenyi Biotec Srl Calderara di Reno, Bologna, Italia), hiiren anti-ihmis-CD133 PE konjugoitu (eBioscience), hiiren anti-ihmis-CD29 CY konjugoitu (BD Pharmingen, Buccinasco, Milano, Italia), hiiren anti-ihmis-CD34 PE konjugoitu (Miltenyi Biotec), hiiren anti-ihmis-CD44 FITC konjugoitu (Miltenyi Biotec), hiiren anti-ihmis-CD90 FITC konjugoitu (BD Pharmingen), hiiren anti-humaani Oct3 /4 ei konjugoitua (Santa Cruz Biotechnology, Inc. Santa Cruz, Kalifornia, USA), hiiren anti-ihminen Ki67 FITC konjugoitua (Miltenyi Biotec) ja hiiren anti-ihminen ABCG2 ei konjugoitu (Santa Cruz). CD133

+ solut lajitellaan kokeita. CD133

– solut kerättiin kontrollina. Puhtaus lajitellun populaatioiden oli rutiininomaisesti 90%. Isotyyppejä käytettiin verrokkeina.

Seitsemän päivää lajittelun jälkeen, CD133

– solut irrotettiin ja testattiin kahdesti CD133 ilme. Oct3 /4 ilmentyminen analysoitiin 6

nnen solun passage (a ”passage” tarkoittaa, että solut irrotetaan ollessaan yhtymäkohta) taas CD133 ilmentyminen analysoitiin 4

th ja 6

th solun passage sarcopheres johdettu alkaen CD133

+ solujen kolmen solulinjoissa.

solunsisäinen värjäys Ki67, CD133 ja Oct3 /4, soluja käsiteltiin käyttämällä Caltagin Fix Perm Kit (Invitrogen, Milano, Italia) seuraten valmistajan ohjeita. Kaikki tiedot analysoitiin käyttäen CellQuest-ohjelmaa.

Hoechst 33342 poissulkeminen Pitoisuus

SAOS2, MG63 ja U2OS solut suspensoitiin 2,0 × 10

6 solua /ml esilämmitettyä α- MEM-viljelyväliaine, ja se on jaettu kahteen osaan. Osa käsiteltiin 50 uM verapamiilia ja toinen jätettiin käsittelemättä. Molemmat osat inkuboitiin α-MEM-elatusaineessa, jossa 5 ug /ml Hoechst 33342 (Sigma, Milano, Italia) 90 minuuttia 37 ° C: ssa. Inkuboinnin jälkeen solut pestiin PBS: ssä ja pidettiin jäillä 5 minuutin ajan, ja analysoitiin Hoechst 33342 ulosvirtaus FACS Vantage (Becton Dickinson, Milano, Italia) [31]. Hoechst 33342 väriaine viritettiin 350 nm UV ja tuloksena fluoresenssi mitattiin kahdella aallonpituudella käyttäen 424/44 BP ja 675 LP suodattimet havaitsemiseen Hoechstin sininen ja punainen, vastaavasti.

Cell Cycle ja Proliferation Analyysit

Cell cycle analysoitiin virtaussytometrialla. Solut kerättiin PBS: ään, joka sisälsi 2 mM EDTA: ta, pestiin kerran PBS: llä, kiinnitettiin jääkylmää etanolia 70 ° ja inkuboitiin 50 ug /ml PI (Sigma) plus Rnasi 1 mg /ml 60 minuutin ajan 4 ° C: ssa pimeässä. Stained tumat analysoitiin FACS Vantage solulajittelijaa (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA), ja tiedot analysoidaan käyttämällä Mod-Fit 2,0 solusyklin analyysi ohjelma (Becton-Dickinson).

kasvun analyysi

Kun lajittelu CD133, SAOS2, MG-63 ja U2OS solut maljattiin tiheydellä 8,0 x 10

4 solua /kuoppa 6-kuoppaisilla levyillä. Kahdentoista tunnin välein solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään. Alikvootti solususpensiota laimennettiin 0,4% trypan blue (Sigma-Aldrich), pipetoitiin hemosytometrillä ja laskettiin mikroskoopilla 200-kertaisella suurennuksella. Elävät solut ulkopuolelle väriaine, kun taas kuolleet solut myönsi väri ja näin ollen värjätään kovaa trypansininen. Lukumäärä eläviä soluja kunkin koetilalle laskettiin ja edustettuna lineaarisen kuvaajan. Kaksinkertaistumiseen (DT) määritettiin kasvukäyrät tai kaavalla: jossa t ja t

0 olivat ajat, jolloin solut laskettiin, ja N ja N

0 olivat solujen määrä ajoittain t ja t

0, vastaavasti [32].

Soft Agar Pitoisuus

jotta määrittämään eri Tuumorigeenisuustutkimuksissa kahteen soluun jakeet, CD133

+ ja CD133

– solut maljattiin pehmeässä agarissa tiheydellä 100, 500 tai 1000 solua /kuoppa 24-kuoppaisilla levyillä kolmena kappaleena. Colo 38 melanooma solulinjaa käytettiin positiivisena kontrollina.

pohjakerros, 2,4% agaria kantaliuos sulatettiin mikroaaltouunissa, jäähdytettiin 40 C: ssa vesihauteessa, ja sekoitettiin sitten viljelyalustaan, jolloin saatiin liuokseen, jossa oli 0,8% Agar on α-MEM. 0,5 ml /kuoppa tätä liuosta lisättiin 24-kuoppaisille levyille. Pintakerroksen, agar kantaliuos laimennettiin elatusaineeseen, jolloin saatiin liuos, jossa oli 0,3% agaria α-MEM. 0,5 ml /kuoppa liuosta sekoitettiin varovasti ja jaettiin 24-kuoppaisille levyille. CD133

+, CD133

– ja wilde tyyppi SAOS-2, MG63 ja U2OS solut peräkkäin maljattiin ja inkuboitiin 21 päivän ajan 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä 5% CO2 ilmassa ja 50 ui α-MEM . Lopussa itämisaika, pesäkkeet värjättiin 150 ul /kuoppa NBT (nitrobluetetraziolium) konsentraatiossa 1 mg /2 ml PBS: ssä ja laskettiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia (Nikon TS 100, Nikon, Milano, Italia) .

Immunofluoresenssivärjäys

CD133

+ ja CD133

– soluja viljeltiin 24-kuoppalevyillä kiinnitettiin liuoksella, jossa oli 4% paraformaldehydiä /0,2% Triton PBS: ssä 30 min 4 ° C: ssa, pestiin PBS: ssä, käsiteltiin PBS /5% maitoa 60 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sen jälkeen värjättiin primaaristen vasta-aineiden 4 ° C: ssa yön yli. Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat hiiren anti-humaani-CD133 /2 PE konjugoitu (Miltenyi Biotec), hiiren anti-humaani falloidiinia FITC konjugoitu (AlexaFluor-Invitrogen) inkuboitiin 60 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Tumat värjättiin DAPI. Solut pestiin sitten kaksi kertaa edellä kuvatulla tavalla ja niitä tarkkailtiin fluoresenssimikroskoopilla (Nikon TE 2000-S, Milano, Italia). Isotyypit ja ei-koetettiin soluja käytettiin kontrolleina.

Sphere määritykset

Solut maljattiin tiheydellä 60000 solua /kuoppa 6-kuoppaisilla ultra low kiinnityslevyt (Corning Inc., Corning , NY, USA) DMEM /F12-solujen väliaineessa, jota oli täydennetty 1% metyyliselluloosaa, progesteroni (10 nM), putreskiinia (50 uM), natriumseleniittiä (15 nM), transferriini (13 ug /ml), insuliinia (10 ug /ml, Sigma) ja ihmisen EGF (10 ng /ml) ja ihmisen bFGF (10 ng /ml; Sigma) [13]. Tuore alikvootit EGF: n ja bFGF: ää, lisättiin joka toinen päivä. Viljelyn jälkeen 48-72 tuntia, pallot olivat nähtävissä käänteinen faasikontrastimikroskoopissa (Nikon TS 100, Nikon).

Laser-skannaus konfokaalimikroskopia

Solut kasvatetaan 24-kuoppalevyillä vahvistettu 4% paraformaldehydillä 30 min ajan 4 ° C: ssa, pestiin PBS: ssä, käsiteltiin PBS /5% maitoa 60 minuuttia huoneen lämpötilassa ja sitten inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla 4 ° C: ssa yön yli. Ensisijainen vasta-aine oli hiiren anti-ihmis-CD133 /1 Pure (Miltenyi Biotec); toissijainen vasta-aine (vuohen anti-hiiri-FITC tai PE konjugoitu Abcam) inkuboitiin 60 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja DAPI, käytetään värjäämiseksi tumaan, inkuboitiin 7 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sama menettely suoritettiin sarcospheres. Kaikki leimattuja soluja säilytettiin 4 ° C: ssa ennen kuvien hankintaan, käyttäen Zeiss Laser-skannaus -konfokaalimikroskoopilla LSM 510 Meta (Zeiss- Oberkocken-Saksa). Kuvat otettiin resoluutiolla 512 × 512 kuvapistettä. Sopiva argonlaser fluoresenssi visualisoinnin CD133 oli käytetty viritysaallonpituudella 488 nm ja emissio suodatin BP 505-530.

immunohistokemia

Immunoistochemistry varten CD133 SAOS2, MG63 ja U2OS solujen esitettiin. Solut maljattiin tiheydellä 50000 solua /kuoppa 24-kuoppaisille levyille, kiinnitettiin 3,5% paraformaldehydillä 10 min ajan 4 ° C: ssa, ja pestiin PBS: ssä. Primaarista vasta-ainetta käytettiin hiiren anti-ihmis-CD133 /1 Pure (Miltenyi Biotec). Toissijaisen vasta-aineen ja värjäyksen DAKO Cytomation En Vision + System-HRP kit (AEC) on käytetty mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tumat värjättiin hematoksyliinillä ja soluja, havaittiin alle käänteisvalomikroskoopilla. Tämä menettely suoritettiin myös sarcospheres.

RT-reaaliaikaista PCR

Sekvenssit mRNA: nukleotidi- tietopankin (National Center for Biotechnology Information, USA) käytettiin suunnittelemaan alukeparit RT -PCR reaktiot (Primer Express, Applied Biosystems, CA, USA). Primer sekvenssit ovat saatavilla pyynnöstä. Asianmukaiset alueet HPRT (hypoksantiinia-guaniinifosforibosyylitransferaasi-) cDNA käytettiin kontrolleina.