Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viime työ on korostettu gluta- (GLS) on keskeinen toimija syövän solujen aineenvaihduntaa, tarjoamalla glutamiinia johdettu hiilen ja typen polkuja, jotka tukevat lisääntymistä. On merkittävää kiinnostusta kohdistaminen GLS syövän hoitoon, vaikka geeni ei tiedetä mutatoitunut tai monistettu kasvaimia. Tämän seurauksena tunnistaminen taipuisa markkereita, jotka ennustavat GLS riippuvuus tarvitaan kääntämistä GLS estäjien klinikalle. Tässä me validoida pienmolekyylisalpaaja- GLS ja osoittavat, että ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut vallitsee heikko E-kadheriinin ja korkea vimentiinista ilmaisun, tunnusmerkit mesenkymaalisten fenotyypin, ovat erityisen herkkiä estää entsyymin. Lisäksi keuhkosyöpä solut indusoidaan läpikäymään epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT) hankkivat herkkyyttä GLS estäjä. Metabolinen tutkimukset viittaavat siihen, että mesenkymaaliset solut on heikentynyt kyky oksidatiivisen fosforylaation ja lisääntynyt alttius oksidatiivisen stressin, tekevät niistä pysty selviytymään häiriöiden aiheuttama GLS esto. Nämä havainnot valaista valikoiva metabolinen riippuvuudet mesenkymaalisten keuhkosyöpään solujen ja ehdottaa uusia reittejä mahdollisina kohteina tässä aggressiivinen syöpätyypin.

Citation: Ulanet DB, Couto K, Jha A, Choe S, Wang A, Woo HK, et ai. (2014) mesenkyymikasvaimia Fenotyyppikuvaus altistaa Lung Cancer Cells heikentyneestä leviämisen ja redox stressin aiheuttaman gluta- esto. PLoS ONE 9 (12): e115144. doi: 10,1371 /journal.pone.0115144

Editor: Pier Giorgio Petronini, University of Parma, Italia

vastaanotettu: 16 heinäkuu 2014; Hyväksytty: 19 marraskuu 2014; Julkaistu: 12 joulukuu 2014

Copyright: © 2014 Ulanet et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki oleelliset tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Kaikki työ rahoittivat Agios Pharmaceuticals. Rahoittajat kautta työntekijät, jotka ovat laatineet tämän käsikirjoituksen, oli rooli tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista, ja valmistelu käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat kaikki työntekijät Agios Pharmaceuticals. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkoja koskevat tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

On arvostettu 60 vuotta että glutamiini (Gin) on ehdollisesti välttämätön aminohappo varten syöpäsolujen kasvun solujen viljelmässä [1]. Glutamiini on runsain kiertävä aminohappo ihmisillä pitoisuutena ~500 uM seerumissa, ja monet tutkimukset osoittavat, että Gin on merkittävä lähde hiilen ja typen kasvainsolujen [2], [3]. Eräs entsyymi erityisesti, gluta-, paikantuu mitokondriot ja näyttää olevan kriittinen pääsyn glutamiinin Hiilen trikarboksyylihappo (TCA) kierto monissa syöpäsoluissa [4], [5]. Glutamiini muunnetaan glutamaatin ja ammoniakkia gluta-, ja glutamaatin hiili myöhemmin edestakaisin osaksi TCA sykli muuntamalla a-ketoglutaraatiksi (α-KG) useiden eri entsyymeillä kuten glutamaattidehydrogenaasin ja eri aminotransferaasit. Nisäkkäät kuljettaa kaksi geeniä, jotka koodaavat mitokondrion gluta-,

GLS1

(tai KGA) ja

GLS2

(tai LGA), joka alun perin tunnistettiin normaalissa munuaisten ja maksan, vastaavasti [6].

GLS1

geeni tuottaa kaksi hallitseva silmukoitumisvariantit koodaavat kanoninen GLS1 (tunnetaan myös KGA) ja GAC, mutta ero toimintoja näiden kahden vaihtoehdon ei ymmärretä [7].

Useat tyylikäs tutkimukset ovat osoittaneet osuus hiilen peräisin Gln osaksi TCA sykli kautta glutaminolysis [8], [9].

GLS1

ilme on myös todettu tavoitteeksi myc onkogeenin [10] ja se on liitetty efektorina Rho transformaatio rintasyövän solulinjoissa [11]. Puuttuminen GLS aktiivisuuden kautta joko geneettisiä tai farmakologisen manipulaatio on osoitettu useita ryhmiä vaikuttaa negatiivisesti kasvun valitse syöpäsolulinjojen [11] – [13]. Perustuen kokonaisuudessaan Julkaistujen tietojen tärkeydestä Gln ja gluta- syövässä, GLS on korostettu mahdollisena huumeiden tavoite onkologian merkkejä [14]. Tietääksemme

GLS1

ei mutatoitunut tai monistettu ihmisen syövissä. Helpottamiseksi käytön GLS1 estäjien klinikalla ymmärtää paremmin geneettisen ja fenotyyppisen yhteyksissä, jotka ohjaavat riippuvuus GLS1 on tarpeen.

Tässä tutkimuksessa validoida on-kohdesoluun perustuva aktiivisuus julkaistu GLS1 estäjä, BPTES (bis-2- (5-fenyyliasetamido-1,2,4-tiadiatsol-2-yyli) etyyli sulfidia) [15], mikä osoittaa, että se toimii erityisesti kautta GLS1-riippuvaisen mekanismin indusoimaan anti-proliferatiivinen ja aineenvaihdunnan häiriöt soluissa. Käytämme BPTES kuin validoitu työkalu yhdisteen seulomiseksi paneelin keuhkosyöpää linjat ja identifioidaan alaryhmä riviä, joilla on GLS riippuvuutta ja ilmentävät merkkiaineita ominaisia ​​mesenkymaalisten fenotyypin. TGF-β välittämä induktio EMT herkistynyt solujen GLS esto ja siihen liittyi heikentynyt mitokondrio hengitys kapasiteettia ja lisääntynyt herkkyys oksidatiivista stressiä. Nämä havainnot viittaavat selektiivinen rooli GLS vuonna mesenkymaalisten NSCLC soluissa, jotka hyödyntävät GLS tarjota hiilen lähde oksidatiivisen fosforylaation ja säilyttää redox tasapaino tarvitaan solujen lisääntymistä.

Tulokset

Solun viiva paneeli näytön ja validointi BPTES välineenä yhdiste

perehtyä geneettiseen /fenotyyppiset tekijöitä GLS riippuvuus, me seulotaan paneelia solulinjojen julkaistun GLS1 estäjä BPTES [15]. Keskityimme erityisesti yhdessä kasvaimen tyyppi, keuhkosyöpä, koska suuri määrä vakiintuneesta solulinjasta malleja saatavilla. Niistä 62 keuhkojen linjat valitaan analysoitavaksi BPTES, 44 on luokiteltu NSCLC (S1 Taulukko S2 File). Suhteellinen kasvu (mu_

BPTES /mu_

DMSO) laskettiin seuraavan lääkehoito parhaan verrata suhteellista herkkyyttä BPTES välillä solulinjoja, jotka vaihtelivat kahdentumisaikoina. Noin 30% näistä 62 linjojen osoittivat merkittävää herkkyyden BPTES määrittelemien 40% vähennys kasvu (Fig. 1A, S1 Taulukko S2 File). Aste herkkyys BPTES oli erittäin vaihteleva, solukuolemaan havaittavissa joissakin solulinjoissa (μ

BPTES /μ

DMSO 0; esim A427) ja lähes täydellinen puuttuminen vasteen toisissa (esim NCI- H1563). Koska CellTiter-Glo (CTG), joka mittaa ATP-tasot, käytettiin nopeaa, korvike menetelmä seulomiseksi solujen määrä seuraavat BPTES hoidon, me validoitu, että vaikutukset gluta- estoa solun ATP-tasot oli edustava lukeman solujen määrä. Arviointi solujen määrä DNA sisältöä (Syto60) osoittivat vertailukelpoinen vaikutus BPTES hoidon soluproliferaatioon kuten osoitetaan CTG klo 72 tunnin päätepisteen (S1 Kuva S1 File).

(A) Herkkyys paneelin NSCLC linjat kasvun hidastuminen 10pM BPTES on 72 tunnin runsaudenmäärityksessä. Kasvu (mu) piirrettiin suhteessa DMSO käyttölukituksen solulinjaa (MU /max). (B, C) A427 kantasoluja tai soluja, jotka ekspressoivat stabiilisti tyhjän vektorin kontrolli (Con), villityypin GAC (GAC), tai BPTES kestävä GAC entsyymi (GAC-BR) käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla BPTES (A ) tai ei-aktiivinen BPTES analoginen, AGX-4769 (C), joka 72 tunnin runsaudenmäärityksessä. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen, jossa keskiarvo ja keskihajonta ilmoitettu. (D, E) mittaus isotopomer merkitty

13C (5) Glu (D) tai

13C (4) Asp (E) soluista käsiteltiin 4 tunnin ajan kanssa BPTES tai inaktiivinen analogi AGX-4769. Tulokset ovat keskiarvo kolme toistoa kanssa keskihajonta ilmoitettu. Laskettu p-arvot opiskelija t-testiä,

* (3 x 10

-8),

** (10

-9),

# (10

-7 ),

## (2 x 10

-6).

sen varmistamiseksi, että vaikutukset BPTES soluihin ovat kohde-me valmistimme A427-solut yli-ilmentämään cDNA joka koodaa aikaisemmin kuvatun BPTES kestävä mutatoitu GAC, nimeltään GAC-BR (F318A ja F322A) ja arvioidaan vaikutus BPTES solujen näiden solujen kasvua verrattuna soluihin, jotka yli-ilmentävät villityypin GAC (GAC-WT) tai tyhjän vektorin. GAC-BR ei pysty sitomaan BPTES mutta säilyttää katalyyttinen aktiivisuus [16]. Yli-ilmentymisen GAC-BR sulatettu A427 solut vastustuskykyisiä kasvua estäviä vaikutuksia BPTES (Fig. 1 B), kun taas solut, jotka ilmentävät tyhjän vektorin tai GAC-WT säilytetään merkittävä herkkyys BPTES. Osahintaan tylppä vaikutus BPTES kasvuun GAC-WT verrattuna vanhempien tai tyhjä ilmentävä linjat todennäköisesti johtuu ~2x kasvuun GAC ilmaisun tässä mallissa. Olemme myös käyttää tämän järjestelmän käsitellä paikan tavoite vaikutuksista BPTES moduloinnissa de novo synteesiä glutamaatin ja aspartaatin päässä glutamiini. S2 Kuva (S1 File) korostetaan virtaus hiilen glutamiinia glutamaatin ja loppupään TCA välituotteiden kuten on kuvattu [8], [9]. Yli-ilmentymisen GAC-BR, mutta ei GAC-WT, parantaisivat BPTES aiheuttama lohkon glutamiinia virtaavat glutamaatti ja aspartaatti (Fig. 1 D, E). Epätäydellisen palauttaminen

13C (5) -aspartaattia tasot voivat heijastaa erityinen herkkyys tämän metaboliitti GLS esto, ehkä johtuu panos sekä hiilen ja typen glutamiinia aspartaattiin biosynteesin ja /tai johtuen vaikutuksista esto endogeeninen GLS1 toimintaa. Biokemiallisesti aktiivinen BPTES analoginen, AGX-4769, jossa on konservatiivinen muutos (S3 kuva S1 File), käytettiin hoitoon samoja solulinjoja ja ettei sillä ole vaikutusta proliferaatioon tai myötävirtaan aineenvaihduntatuotteiden (kuviot. 1C-E). Nämä tulokset osoittavat, että vaikutukset BPTES proliferaatioon ja modulaatioon loppupään aineenvaihduntatuotteiden johtuu esto GLS1 ja eivät johdu off-kohde vaikutuksia.

Vielä toinen keino validointi hyödyllisyyden BPTES välineenä yhdiste seuloa GLS riippuvuutta, suoritimme siRNA välittämä knockdovvn GLS1 (joko kokonaan tai GAC nimenomaan) osajoukossa 6 NSCLC linjat paneelista. Kaikki 3 riviä, jotka olivat herkkiä BPTES olivat myös herkkiä GLS KD, kun taas 3, jotka eivät olleet herkkiä BPTES olivat vähemmän /ei herkkä (S4 Kuva S1 File). Vaikka KD GAC yksin johti merkittävä kasvu inhibition BPTES herkkä linjat, KD koko GLS1 tuottaa vielä syvempi vajaatoiminta mikä osoittaa, että molemmat isoformit GLS1 (KGA ja GAC) edistävät kasvua /elinkelpoisuuden näihin soluihin.

GLS1 riippuvuus NSCLC kanssa mesenkymaalisten (EMT) fenotyyppi

Perustuu välillä BPTES herkkyys havaita yli 62 solulinjoissa (Fig. 1), etsittiin transkription merkkiaineiden liittyvä herkkyys tai vastus jotka käyttävät yleisesti saatavilla aineisto päässä Broad Institute (https://array.nci.nih.gov/caarray/project/golub-00327). Huomattavaa on, että kumpikaan GLS1 eikä GLS2 mRNA ekspressiotasoja korreloi herkkyys. Top 200 antureista osoittaa Merkittävin korrelaatio herkkyys sitten toimitettiin GeneGO koulutusjakson analyysi (https://portal.genego.com/cgi/data_manager.cgi). Totesimme, että mitään aineenvaihduntaan liittyviä reittejä olivat yhteydessä BPTES reagointikykyä, mikä osoittaa, että kaikki olennaiset erot aineenvaihdunnan välillä herkkien ja resistenttien solut eivät yleisesti heijastuu transkription tasolla (taulukko S2 File_S2). Mielenkiintoista, 4 top 25 polkuja liittyivät EMT (riveissä 1, 15, 23, 25, Fig. 2A). Immuunivaste reittejä olivat myös hyvin edustettuina tässä analyysissä. Vaikka päätimme keskittää tutkimuksia välisestä EMT ja GLS1 riippuvuus on huomattava, että yhteys NF-KB: n ja gluta- aktiivisuus on osoitettu muiden [11], [17].

(A ) GeneGo analyysi osoittaa neljän kärkikastiin mesenkymaalisten allekirjoituksia korreloi BPTES herkkyys. P-arvot lasketaan sisällä GeneGo ohjelmiston avulla Hypergeometrinen jakeluun. (B) Anti-korrelaatio korkean E-kadheriinin alhainen vimentiinista RNA ekspressiotasot ja herkkyys BPTES. (C) Mu /mumax arvot kuvataan seuraavien 72 tunnin hoito NSCLC linjojen 10pM BPTES. Equal proteiinin määrät kasvainsolulinjan uutteet elektroforeettisesti, jossa ryhmä herkempi riviä vasemmalla ja vähiten herkkä oikealla, ja immunoblotattiin varten ilmoitettu proteiineja. Histoni H3 käytettiin latauskontrollina. (D) kvantitointi keskimääräinen GAC-proteiinin tasojen suhteen PC-proteiinin ilmentymisen (+/- SEM) on BPTES herkkiä (n = 7), välituotetta (n = 7), ja epäherkkä (n = 7) linjat.

P

= 0,03 vertaamalla GAC ​​/PC-proteiinin tasot herkillä verrattuna tunteeton linjat;

P

= 0,06 vertaamalla herkkiä välitason ryhmissä (pariton 2-tail t-testi).

Jotta voitaisiin tunnistaa spesifisiä markkereita ennustava BPTES herkkyys, me tutkittiin luettelo merkittävästi korreloi koettimia edellä analyysin yksittäisten EMT liittyviä geenejä. E-kadheriinin ja vimentiinin positiivisesti ja negatiivisesti korreloi kasvun läsnä BPTES (eli herkkyyden puute GLS inhibitio), vastaavasti (Fig. 2B). Low E-kadheriinin /korkea vimentiinista ovat hyvin määriteltyjä markkereita soluja, jotka on mesenkymaaliset fenotyyppi [18]. Merkittävä korrelaatio havaittiin myös useita muita geenejä tyypillisesti moduloitu aikana EMT, kuten claudin4 /7 ja ZEB1 (taulukko S3 File_S2). Alun BPTES näyttö, osajoukko 21 NSCLC linjat tutkittiin uudestaan ​​varten BPTES herkkyyden ja analysoitiin proteiinin ekspressiotasot valittujen markkereiden tunnistaa transkriptionaalinen profilointi analyysi (Fig. 2C, D, taulukko S4 File_S2). Vuonna 6/7 alkuun herkkä NSCLC linjat, matala E-kadheriinin ja korkea vimentiinista proteiinia tasot olivat toistuvasti havaittu (Fig. 2C). Ryhmä herkkien linjojen leimasi myös keskimäärin suurempi suhde GAC /pyruvaattikarboksylaasi (PC) proteiinipitoisuuden (Fig. 2C, D;

P

= 0,03). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin vertaamalla yhteensä GLS1 /PC tasolle. Päätimme keskittyä GAC tasoilla kuin tämä isoformi vallitseva useimmissa syöpäsoluissa. PC-proteiinia tasot yksin olivat merkittävästi koholla tunteeton verrattuna herkkien linjojen (

P

= 0,02) ja mRNA-tasot korreloivat negatiivisesti BPTES herkkyys suurempi paneelissa 60+ keuhkosyövän linjat seulotaan (Pearson korrelaatio tekijä: 0,29 ; Pearson

P

arvo: 0,03). Koska pyruvaattikarboksylaasi voi korvata gluta- tarjoamisessa hiilen TCA syklin [19], yhdistys muuttunut GAC /PC-suhteet herkkyys GLS esto viittaa siihen mahdollisuuteen, että vaihtoehtoisten hiilen tuloa TCA voi vaikuttaa GLS riippuvuus.

Mielenkiintoista, kolme NSCLC linjat, jotka olivat kaikkein herkimpiä BPTES (A427, LXF289, SW1573) kaikilla on aktivoivia mutaatioita β-kateniinin (T41A in A427 ja LXF289, S33F vuonna SW1573, taulukossa S4 File_S2). Wnt /β-kateniinin signalointi on yksi monista polkuja, jotka on liitetty ajo EMT [20]. Tämän seurauksena, käytimme siRNA-välitteisen knockdovvn β-kateniinin A427-soluissa sen määrittämiseksi, onko menetys johtaisi muutos herkkyys BPTES. Silmiinpistävän, β-kateniinin knockdovvn johti alentunut herkkyys BPTES hoitoon (Fig. 3A). Mielenkiintoista, väheneminen β-kateniinin proteiinin tasot seurasi lisääntyminen E-kadheriinin tasot (Fig. 3B), kuten on aiemmin kuvattu virtsarakon syövän soluissa [21]. Puuttuessa BPTES hoidon, β-kateniinin KD johti vaatimaton (23%: n lasku;

P

= 0,02) vajaatoimintaa solujen kasvua (Fig. 3A).

(A) A427 solut transfektoitiin ei-kohdistuksen (NT) tai β-kateniinin kohdistaminen siRNA: t ja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla BPTES (vasen paneeli). Kasvuluvut normalisoitiin DMSO käsitellyt solut transfektoitu NT siRNA. Oikea paneeli esittää vaikutukset β-kateniinin siRNA kasvuun DMSO käsiteltyjen solujen. (B) Immunoblotti A427 proteiiniextraktien kerättiin soluista 72 tuntia transfektion jälkeen. (C) NCI-H358-soluja käsiteltiin 25 ng /ml TGF-ß 4 viikkoa. Induktio EMT vahvistettiin menetys E-kadheriinin ja voitto vimentiinista. EMT seurasi kasvu GAC suhteessa tietokoneeseen proteiinin tasot (tuloksia edustaja 2 itsenäistä koetta). Aktiini tasot tarkoitettu proteiinin normalisointia. (D) NCI-H358 vanhempien ja 6wk TGF-ß käsitellyt solut käsiteltiin kolmena rinnakkaisena BPTES 72 tuntia ja solujen kasvua arvioitiin CTG. Tulokset edustavat 3 itsenäistä koetta ja piirretään keskimääräinen kasvuvauhti (+/- SD) verrattuna DMSO käsiteltyihin soluihin.

TGFli-indusoitu EMT NCI-H358 NSCLC-solujen johtaa GLS1 riippuvuus

jotta voidaan paremmin ymmärtää osuus mesenkymaalisten vs. epiteelisolujen fenotyyppi GLS riippuvuutta, käsittelimme NCI-H358-soluissa, jotka ovat fenotyypiltään epiteelin (korkea E-kadheriinin /matala vimentiinista) ja näytteille kohtalainen herkkyys BPTES (Fig. 2C), jossa TGFli aiheuttavan EMT. Kuten on raportoitu [22], TGFli siirtynyt NCI-H358 linja on mesenkymaaliset fenotyypin osoituksena väheni E-kadheriinin ja kohonnut vimentiinista (Fig. 3C). Erityisesti GAC proteiinitasot vaikutti myös tänä siirtymävaiheessa, jossa on 2-kertainen proteiinin tasot mesenkymaaliset variantti (Fig. 3C). Sen sijaan, PC tasot hieman vähennetty (1.4x vähennys) päälle EMT, mikä puolestaan ​​lisää GAC /PC-suhde (Fig. 3C). Mielenkiintoista, samanaikainen kasvu GAC ilmaisun tasoilla vähemmän näkyvästi ilmaisi KGA isoformin laski (-40%), kun EMT. Asetus ja potentiaali ero toiminta eri GLS1 isoformeja jää epäselväksi. Yhdenmukainen malli, joka mesenkymaaliset merkki ennustaa GLS1 riippuvuus, TGFp käsiteltyä NCI-H358 mesenkyymisolujen osoitti merkittävästi suurempi herkkyys BPTES suhteessa käsittelemättömiin soluihin (kuvio. 3D). TGFp saaneista oli linjan 1,5-2-kertaisesti kasvu verrattuna vanhempien linja, vaikka suurimmissa paneelista linjat seulottu, ei ollut korrelaatiota kasvu ja herkkyys BPTES. Tämä data yhdessä ilmaisun analyysit solulinjan paneelista, vahvasti väittää, että mesenkymaaliset keuhkosyöpään solut ovat alttiita riippuvuutta GLS1.

Koska gluta- toimii avaimena säätelijänä glutamiini hiiltä tuloa TCA, me kysytään esto GLS1 differentiaalisesti vaikuttaa oksidatiivisen fosforylaation (OXPHOS) on epiteelin verrattuna mesenkymaaliset (NCI-H358_M) linja. Mitokondrioiden hapenkulutus mitattiin tosiaikaisesti seuraavissa BPTES hoidon. Lähtötilanteessa O

2 kcal (OCR) ei ollut merkitsevästi erilainen näiden linjojen välillä (S5a Kuva S1 File). Sen jälkeen 2 tuntia hoidon BPTES, OCR oli verrattain vähennetty epiteeli- ja mesenkymaalisten linjojen verrattuna DMSO: käsitellyt solut (Fig. 4A; S5B Kuva S1 File). Erityisesti yhä aika jälkeinen BPTES hoitoa, OCR on emolinjan hitaasti takaisin, kun OCR edelleen vähenee ajan NCI-H358_M soluja (Fig. 4A, S5B kuva S1 File). Väheneminen OCR ei heijasta vähentynyt solujen määrä tässä varhaisessa (20 h) ajanhetkellä (S5c Kuva S1 File). Sen vahvistamiseksi, että tämä vaikutus GLS esto ei ollut ainutlaatuinen NCI-H358-soluissa suoritimme saman kokeen ylimääräinen pari herkkien (NCI-H1703) ja tunteeton (NCI-H1563) soluissa. Esto O

2 kulutus oli hyvin selektiivinen GLS1 riippuvaisten NCI-H1703 linjan (Fig. 4B) viittaa siihen, että heikentynyt oksidatiivisen fosforylaation on yksi komponentti antiproliferatiivisia vaikutuksia aiheuttamien GLS esto.

(A) NCI-H358 epiteeli- ja mesenkymaalisten linjojen tai (B) NCI-H1703 (BPTES herkkä) ja NCI-H1563 (BPTES herkkä) soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai 8 uM BPTES ja hapenkulutuksen (OCR) seurattiin yli 20 hr hoito. Data normalisoida OCR aikana nolla (100%) ja esitetään keskiarvoina +/- SEM.

P

= 0,024 kehitystä vertailevia hapenkulutuksen kanssa BPTES on epiteelin vs mesenkymaaliset linja;

P

= 0,00017 vertaamalla NCI-H1703 ja NCI-H1563-soluissa. (C) OCR käsittelyn jälkeen ilmoitetuilla huumeiden hämmentää mitokondrioiden hengitystä. Data normalisoida OCR mittaus ennen oligomysiini hoitoa. (D) lisääminen pyruvaatin median palauttaa heikentynyt FCCP vasteen mesenkymaaliset linjaa. Keskiarvot +/- SEM osoitettu. Tulokset edustavat 2-3 itsenäisen kokeen.

ero vaikutus BPTES mitokondrion hengitystä mesenkymaaliset versus epiteelin linja johti meidät kyseenalaistaa nämä rivit saattavat laajemmin eroavat kykyä adaptiivisesti vastata metabolinen /mitokondrioiden stressiä. Tutkitaan tällainen mahdollisuus, suoritimme peräkkäinen solujen käsittely oligomysiini (ATP estäjä), FCCP (erotetaan toisistaan ​​ammatillisiin hengitys ATP synteesi, ja näin arvioida maksimaalisesta hengityksen), ja rotenone (estää pääsyn elektronien Complex I) [23]. On silmiinpistävää, NCI-H358_M solut olivat viallisia lisäämisessä O

2 kulutus vastauksena FCCP, joka ilmaisee alempien hengitysteiden kapasiteetti näiden solujen (Fig. 4C; S5d Kuva S1 File). Äskettäin on osoitettu, että pyruvaatti tarvitaan stimulaatio maksimaalisen OCR rintasyöpäsoluissa [24]. Mielenkiintoista on, että ylimääräisiä täydentämistä RPMI-elatusaineeseen (joka sisältää 11 mM glukoosia ja 2 mM glutamiinia), jossa 2 mM pyruvaattia, kun läsnä on mitokondrioiden -inhibiittorit palauttivat kykyä NCI-H358_M solujen vastata FCCP lisääntynyt OCR (Fig. 4D) , mikä osoittaa, että nämä solut eivät ehkä pysty hyödyntämään tehokkaasti endogeenisen tarvikkeet pyruvaatin /muiden vaihtoehtoisten hiilen lähteitä riittävästi polttoaineen niiden varanto hengitysteiden kapasiteetti. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että siirtyminen mesenkymaalisten tilaan voi johtaa heikentyneeseen kykyyn adaptiivisesti vastata GLS esto ja mahdollisesti muihin mitokondrioiden rasituksia.

Seuraavaksi testasimme ovatko korvaavat hiilen lähteitä voisi pelastaa heikentynyt kasvu NCI-H358_M soluissa BPTES hoitoon. Lisäämällä joko natriumpyruvaattia tai solun läpäisevä analogi α-KG, dimetyyli-2-oksoglutaraatti (m-αKG), kasvualustaan ​​johti pelastamiseen proliferaation ~85-90%, joka havaittiin vehikkelillä käsiteltyihin soluihin verrattuna ja ~45% ja dimetyylisukkinaatti (Fig. 5). Toisin αKG ja pyruvaatti, sukkinaatti tietojemme ei ole raportoitu olevan antioksidantti ominaisuuksia. Koska glutamaatti johdettu glutamiini voidaan ottaa huomioon glutationin (GSH) biosynteesireitistä ja auttaa säilyttämään redox tasapaino [25] (sekä ruokkii TCA kautta muuntaminen a-KG) tutkimme myös vaikutus solun läpäisevä johdos GSH , glutationi vähensi etyyliesteri (GSH-TEM), ja antioksidantti N-asetyylikysteiini (NAC) on BPTES aiheuttama kasvun esto. Sekä GSH-TEM ja NAC yksin palautettu kasvu ~75-85%, että ajoneuvon käsiteltyjä soluja, kun taas yhdistelmä pyruvaatin ja NAC palauttaa lisääntymistä lähes 95%, kun kontrollisoluja (Fig. 5). Nämä havainnot viittaavat siihen, että häiriöt sekä redox stressiä ja TCA-sykli anaplerosis edistää antiproliferatiivisia vaikutuksia GLS inhibition näissä soluissa.

NCI-H358_M soluja käsiteltiin DMSO: ssa tai 8 uM BPTES kolmena kappaleena läsnäollessa tai puuttuminen dimetyyli-2-oksoglutaraattia (m-α-KG), natriumpyruvaattia, dimetyylisukkinaatti, glutationi vähentää etyyliesteri (GSH-TEM), tai N-asetyylikysteiini (NAC) 96 tunnin ajan, ja solujen kasvu mitattiin CTG. Tulokset edustavat 2 toisistaan ​​riippumatonta koetta. Arvot kuvaavat keskimääräinen kasvuvauhti +/- SD suhteessa soluihin käsitelty pelkästään DMSO: lla.

P

vertailu- DMSO vs BPTES hoidon eri pelastus edellytykset:

P

= 0,0001 (ei pelastus),

P

= 0.04 (m-α-KG),

P

= 0,001 (2 mM pyruvaattia),

P

= 0,0003 (m-sukkinaatti),

P

= 0,01 (GSH-TEM),

P

= 0,003 (NAC),

P

= 0,06 (pyruvaatti + NAC).

jotta edelleen selvittämiseksi mekanismi taustalla ero herkkyyttä epiteelin ja mesenkymaaliset NCI- H358 solujen GLS esto, suoritimme metabolisen analyysi näiden solujen, tutkimalla kuvioita glutamiinia ja glukoosia (Glc) käyttöaste (Glc merkinnät kaavamainen kuvattu S6 kuviossa (S1 File) ja vaikutukset GLS eston. ensin vahvisti, että BPTES oli verrattain estämällä GLS molemmilla linjojen valvomalla

13C (5) -Gln ja

13C (5) Glu tasoilla LCMS soluissa syötetään tasaisesti leimattu

13C-Gln (U

13C-Gin). käyttäen

13C (5) Glu /

13C (5) -Gln tasoa kuin lukijalaitteen GLS aktiivisuuden, osoitimme tehokas (97%) esto GLS aktiivisuutta sekä epiteelin ja mesenkymaaliset linjat (Fig. 6A; S7 Kuva S1 File). Tämä data osoittaa, että valtaosa muuntaminen Gln Glu näissä solulinjoissa katalysoi GLS1 ja ei GLS2 tai muita Gln käyttämällä entsyymejä. Yksi mahdollinen hypoteesi selittää ero herkkyyttä kaksi riviä oli, että mesenkymaaliset solut voisivat ensisijaisesti käyttää glutamiinia polttoaineen TCA. Yllättäen 4 tunnin syötteen solujen U

13C-Gln osoitti merkittävän panoksen glutamiinia sitraattitoksiuudesta altaat sekä epiteelin (63%) ja mesenkymaaliset (49%) linja (Fig. 6B). Yhdenmukainen näkyvä osuus glutamiinia sitraattiin allasta, 20 hr BPTES hoito vähensi yhteensä tasoja TCA aineenvaihduntatuotteiden, kuten α-KG ja sitraatti (Fig.6C; S7 Kuva S1 File). Vähän tai ei lainkaan vaikutusta lääkkeen solujen lukumäärän havaittiin tämän ajan kuluessa on BPTES hoidon näissä (S5c Kuva S1 File) ja muut testatut solulinjat (S1 Kuva S1 File). Huolimatta siitä, että glutamiini osaltaan selvemmin sitraattiin altaat epiteelin verrattuna mesenkymaaliset linja (Fig. 6B), sitraatti tasot laskivat enemmän dramaattisesti alentaa (61%) yhteensä tasoilla BPTES käsitelty NCI-H358_M soluissa. Yhdessä kanssa lisääntynyt lasku O

2 kulutusta BPTES vuonna mesenkymaaliset verrattuna epiteelin linja, nämä tiedot viittaavat siihen mahdollisesti heikentynyt kyky mesenkymaalisten linjan sopeutua lohkon Gln virtaa TCA, ehkäpä johtuen on ero kyky käyttää vaihtoehtoisia hiililähteitä tämä asetus.

NCI-H358 epiteelin (E) ja mesenkymaaliset (M) riviä käsiteltiin DMSO: ssa tai 8 uM BPTES 20 tuntia. Soluja joko leimaamaton tai U-

13C-Glc tai U-

13C-Gln etiketit olivat mukana viimeisten 4 tunnin lääkehoidon ja tasot Keski hiili aineenvaihduntatuotteiden mitattiin LCMS. (A) esto GLS aktiivisuutta BPTES. (B) Prosenttia sitraatti allas, joka on joko leimaamaton tai sisältävät hiiltä peräisin U-

13C-Gln (DMSO käsiteltyihin soluihin). (C) TCA aineenvaihduntatuote ja glutationi-altaan kokoisia +/- BPTES. Tiedot kerättiin kolminkertaisena tai nelinkertaisena 3 erilliselle kokeelle (for α-KG ja sitraatti) ja kuvataan keskiarvona tasoilla +/- SD suhteessa NCI-H358 DMSO käsitellyt solut; arvot normalisoitiin solujen määrä,

P

= * 1 x 10

-5; ** 4 × 10

-6; *** 9 x 10

-8 (D) Sitraatti isotopomer prosenttiosuudet

13C (6) -Glc leimattuja soluja käsitellään +/- BPTES. *

P

= 0,001, **

P

= 0,002 verrattaessa% sitraattia m + 2 DMSO: ssa tai BPTES käsitelty E vs M-soluissa, vastaavasti. (E) Muutokset suhteellisesti vähiten DHAP ja 3PG tasot EvsM soluissa +/- BPTES.

P

arvoja vertailua metaboliittitasoihin +/- BPTES: * 0,1 ** 0,57,

# 0.04,

## 0,07. Tulokset edustavat 2 toisistaan ​​riippumatonta koetta.

Mielenkiintoista, verensokerin virtaa TCA käyttäen U-

13C-Glc feed (S7 Kuva S1 File), paljasti glukoosin osuus 28% ja 37% koko sitraatin altaan epiteelin ja mesenkymaaliset solut, vastaavasti; upon BPTES hoito, tämä suhteellinen osuus aleni 15% epiteelin ja 3% mesenkymaaliset linjan (Fig. 6D; S7 Kuva S1 File), joka ilmaisee selektiivisen lohkon glukoosi virtaa TCA kanssa BPTES kohtelu mesenkymaaliset linja. Yhdenmukainen käsitystä, tutkiminen glykolyyttisissä väli- altaan kokoisia paljasti lisääntynyt DHAP ja vähentää 3-PG tasoa (Kuva. 6E; S7 Kuva S1: File) kanssa BPTES hoitoa mesenkymaaliset linja, joka osoittaa lohko virtaus tässä vaiheessa glykolyysissä.

erojen lisäksi metaboliittien mukana bioenergetic /biosynteesireittejä, NCI-H358_M solut olivat alemmat pelkistettyä glutationia (GSH) tasoja sekä perus- että BPTES käsiteltiin asetus, verrattuna epiteelin variantin (Fig. 6C; S7 Kuva S1 File). 6 ylimääräistä NSCLC linjat tutkittiin, oli samanlainen suuntaus välillä asteen pudotus GSH allasta BPTES herkkyys (S8A Kuva S1 File), joka johtaa meidät tutkimaan vaikutuksia BPTES hoidon ROS tasoilla.

Modulation oksidatiivisen stressin GLS eston mesenkymaalisten NSCLC soluissa korreloi herkkyys

Voit testata, onko herkkyys GLS esto korreloi lisääntynyt hapettava rasitus BPTES hoito, mittasimme tasot reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) käyttäen CM-H2DCFDA in NCI-H358 epiteelin ja mesenkymaaliset pari sekä toinen pari BPTES herkkien (NCI-H1703) /tunteeton (NCI-H838) linjat. NCI-H838 line valittiin tutkittavaksi, koska samanlainen NCI-H358 line, se on huono herkkyys BPTES huolimatta huomattava osuus Gin on TCA hiilivarastojen (julkaisematon data). Vaikka GLS esto lisännyt ROS tasoa kaikissa neljässä riviä testattu, herkkä linjat osoittivat suurempaa suuruus kasvusta ROS mukaan BPTES (7,4 vs. 4,4-kertaisesti NCI-H358_M verrattuna vanhempien, 15,9-kertainen vs. 4,6-kertaiseksi NCI -H1703 verrattuna NCI-H838-soluissa, Fig. 7A). Mielenkiintoista on, että on osoitettu, että oksidatiivinen stressi voi heikentää hiilihydraatti vuon kautta glykolyysin kautta inaktivaation entsyymien, mukaan lukien GAPDH [26]. Yhdessä nämä tiedot viittaavat malliin, jossa lisääntynyt ROS sukupolvi seuraavat GLS eston mesenkymaaliset solut herkistää GLS esto osittain estämällä glukoosin virtaa TCA, mikä vähentää sitraatti tasoilla ja OXPHOS (Fig. 7C).

(A) Soluja käsiteltiin BPTES 20 tuntia ja ROS tasot mitattiin CM-H2DCFDA väriainetta. Tulokset edustavat 3 itsenäistä koetta; data graafisesti ROS tasoilla suhteessa DMSO hoitoon kunkin solulinjan (keskiarvo +/- SD);

P

= 0.01 vertaamalla induktion ROS jonka BPTES on 2 paria herkkä /tunteeton linjat. (B) NCI-H358 epiteelin ja mesenkymaaliset linjat hoidettiin BSO tai H

20

2 on 72 tunnin CTG määrityksessä. Tulokset edustavat 2-3 riippumatonta koetta ja piirretään keskiarvona +/- SD. (C) Malli herkkyys mesenkymaalisten NSCLC solujen GLS esto. Esto Gin → Glu muuntamisen BPTES heikentää virtausta hiiltä Gln osaksi TCA molemmissa linjoissa.