Krooninen sairaus

tiivistelmä

puute immunogeenisyyden syöpäsolujen on pidetty merkittävä syy niiden epäonnistumiseen induktion kasvainspesifin T-soluvasteen. Tässä asiakirjassa, esitämme näyttöä siitä, että decitabine (DAC), joka on DNA: n metylaatio estäjä, joka on tällä hetkellä käytetään hoidettaessa myelodysplastinen oireyhtymä (MDS), akuutti myelooinen leukemia (AML) ja muut pahanlaatuiset kasvaimet, pystyy saamaan aikaan anti-kasvain sytotoksinen T-lymfosyytti (CTL) vasteen hiiren EL4 kasvain malli. C57BL /6-hiiret, joilla on todettu EL4 kasvaimia käsiteltiin DAC (1,0 mg /kg) kerran päivässä 5 päivää. Olemme havainneet, että DAC-hoito johti tunkeutumisen IFN-γ tuottavien T-lymfosyyttien kasvaimiin ja aiheutti kasvaimen hyljinnän. CD8

+, mutta ei CD4

+ T-solujen uudelleen kasvaimen kasvua. DAC-indusoitua CTL-vaste näytti aikaansaama induktion CD80 ekspression tuumorisoluissa. Epigeneettiset todisteet viittaavat siihen, että DAC: n indusoi CD80 ilmentymisen EL4-soluja kautta demetylaation CpG sivustoja promoottorin CD80-geenin. Lisäksi olemme myös osoittaneet, että ohimenevää, pienen annoksen DAC käsittely voi indusoida CD80-geenin ilmentymistä erilaisissa ihmisen syöpäsoluja. Tämä tutkimus on ensimmäinen näyttö siitä, että epigeneettisten modulaatio voi indusoida merkittävän T-solun kostimulatorinen molekyyli on syöpäsoluja, joka voi voittaa immuunitoleranssin, ja indusoivat tehokkaan kasvaimen vastaisen CTL-vasteen. Tulokset ovat merkittäviä vaikutuksia suunnittelussa DAC-pohjainen syövän immunoterapiassa.

Citation: Wang L-X, Mei Z-Y, Zhou J-H, Yao Y-S, Li Y-H, Xu Y-H, et al. (2013) Alhaisen annoksen desitabiinista hoito sai aikaan CD80 Expression syöpäsoluissa ja stimuloi kasvaimen spesifisten sytotoksisten T-lymfosyyttien vasteet. PLoS ONE 8 (5): e62924. doi: 10,1371 /journal.pone.0062924

Editor: Fabrizio Mattei, Instituto Superiore di Sanità, Italia

vastaanotettu: 05 joulukuu 2012; Hyväksytty: 26 maaliskuu 2013; Julkaistu: 09 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta National Basic Research Program of China (2005CB522400), National Natural Science Foundation of China (90919044, 30971297, 81000221 ja 81170518), High ja New Technology Program of PLA (2010gxjs091), Capital Medical Development Scientific Research Fund (nro 2007-2040). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

suuri haaste syövän immunoterapiassa on immuuni kiertämistä syöpäsoluja [1]. Aikana kasvaimen kehittymisen ja etenemisen, kasvaimet kootakseen immunosuppressoivilla verkkoon, mukaan lukien kasvaimeen liittyvät myeloidisoluissa ja eri säätelijä-T-solujen [2], [3]. Syöpäsolut itse ovat geneettisesti epävakaita; ne voivat alas-säädellä major histocompatibility complex (MHC) luokan I molekyylit [4], [5] ja menettävät ilmentymisen kasvainantigeenien [6], [7], [8]. Lisäksi syöpäsolut eivät yleensä ilmaista avain kostimuloivia molekyylejä, kuten CD80: n, vaan ilmaista joitakin co-estävä molekyylejä, jotka tekevät kasvaimen antigeenispesifisen T-solun toleranssin [9]. Kaikki nämä tekijät estävät induktion tehokas T-solujen vaste kasvaimia. Siten voittaa immuuni kiertäminen on suuri merkitys syövän immunoterapiassa.

Epigeneettiset todisteet viittaavat siihen, että syöpäsolut, joitakin keskeisiä immuunijärjestelmän stimuloivien molekyylien säätelevät DNA: n metylaation niiden promoottorialueen. Joitakin tunnettuja kasvain antigeenejä, kuten syövän kivesantigeenien (CTA: t) ovat lähes yksinomaan säätelee DNA: n metylaatio [10], [11], [12], [13], [14], [15]. MHC luokan I ja sen antigeenin esittelyä koneet on myös osoitettu säätelevän DNA: n metylaatio [16], [17], [18], [19]. Lisäksi Toimintakehotukset ja MHC-molekyyleihin, on myös näyttöä, että adheesiomolekyylien [16], [20], kuten ICAM-1 ja LFA-3, ja kostimulatorisil- molekyylit [19], [20], kuten CD40 ja CD86 voidaan säätää DNA: n metylaation syöpäsoluissa. Siten demetyloimalla aineita, jotka voivat ylössäätää ilmentyminen kasvaimen antigeenejä, MHC luokan I ja tarttuvuus /kostimuloivia molekyylejä syöpäsoluissa olisi hyödyllistä parannettaessa kasvain immunogeenisuutta sekä alttius immuuni tuhoa. Itse asiassa on olemassa todisteita, jotka viittaavat siihen demetylaatio hoito voi lisätä huomattavasti syöpäsolun alttiutta tuhoutumiseen T-solujen [11], [15], [17], [21]. Kuitenkin, ei ole suoraa

in vivo

todisteita siitä, että demetylaation syövän hoitoon johtaa tietyn kasvaimen vastaisen T-soluvasteen.

desitabiinista (DAC), joka on DNA demetyloivan ainetta [22], on viime aikoina tullut voimakas terapeuttinen hoitoon pre-leukemiasolujen hematologiseen taudin MDS [23], [24], joka on perustettu leukemia [25], [26], [27] ja kehittynyt keuhkosyöpä [28]. Matala annos DAC voi aiheuttaa jatkuvaa antituumorivaikutuksia jopa hoidon keskeyttämisen jälkeen [24], [29], [30], mikä viittaa siihen, että aktiivinen immuunivaste voidaan indusoituu saaneilla potilailla. Voit selvittää DAC hoito voi aiheuttaa anti-kasvain immuunivasteen

in vivo

, tutkimme vaikutusta pieniannoksisen DAC hoito hiirillä vakiintuneiden T-solu lymfooma EL4 kasvaimia. Huomasimme, että ohimenevä ja pieni annos DAC hoito johti induktioon tuumorinvastaisen sytotoksinen T-lymfosyytti (CTL) vasteen, joka välittämä kasvaimen regressio. DAC aiheuttama CTL-vaste näyttää aikaansaama induktion CD80 ilmaisun EL4-soluja. Lisäksi olemme myös havainneet, että ohimenevä, pienen annoksen DAC käsittely voi indusoida CD80-geenin ilmentymistä erilaisissa ihmisen syöpäsoluja. Tämä tutkimus on ensimmäinen näyttö siitä, että epigeneettisten modulaatio voi indusoida merkittävän T-solun kostimulatorinen molekyyli on syöpäsoluja, joka voi voittaa immuunitoleranssin, ja indusoivat tehokkaan kasvaimen vastaisen CTL-vasteen.

Methods

hiiret

C57BL /6 ja CBF1 hiiriä ostettiin Beijing Vital-joen Lab Animal Technology Co Ltd C57BL /6 kongeeniset kannan hiiriä B6.SJL-Ptprc

PepC

b /Boy-M (CD45.1

+) saatiin tohtori Chunfeng Qu (valtion Key Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Institute /sairaala, Kiina Academy of Medical Sciences, Beijing, Kiina). Kaikki hiiret pidettiin Kiinan PLA General Hospital (CPGH) erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa. Kaikki eläinkokeet suoritettiin kansallisen ja institutionaalisten ohjeita eläinten hoitoon ja oli hyväksynyt eläinten käyttöä ja hoitoa komitea, CPGH.

Soluviljely ja EL4 Subklooni perustaminen

Kaikki solulinjat olivat alun perin saatu American Type Culture Collection (ATCC). EL4-soluja (hiiren T-solulymfooma /leukemian solulinja) viljeltiin ja ylläpidettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), jota oli täydennetty 10% lämmön avulla inaktivoitua hevosen seerumia (Hyclone), 100 ug /ml penisilliiniä /streptomysiiniä ja L-glutamiinia. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 5% CO

2. EL4 jatkokloonit perustettiin käyttäen rajoittavalla laimennoksella 96-kuoppaisille pyöreäpohjainen kudosviljelylevyille perustuu CD80 ilme. Kaksi EL4 subklooneja, eli EL4 C45, joilla on korkea ilmentymisen CD80, ja EL4 C3, joilla ei ole CD80: n, käytettiin tässä tutkimuksessa. Ihmisen solulinjoja K562 (solulinja on peräisin potilaasta, joilla on krooninen myelooinen leukemia at blastikriisin), U937 (akuutti myelooinen leukemia, M5), THP-1 (akuutti myelooinen leukemia, M5), NB4 (akuutti myelooinen leukemia, M3) , Kasumi-1 (akuutti myelooinen leukemia, M2), Molt-4 (T-solu akuutti lymfaattinen leukemia), HUT-78 (T-solu lymfooma) ja Raji (Burkittin lymfooma) kasvatettiin ja ylläpidettiin RPMI-1640: llä (Hyclone) keskipitkän jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia.

in vitro ja in vivo hoito desitabiinista

desitabiinista (DAC, Xian-Janssen Pharmaceuticals Ltd, Kiina) liuotettiin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS) (pH 7,4), jolloin saatiin 100 uM varastojen ja säilytettiin -20 ° C: ssa. Sillä

in vitro

tutkimuksissa, DAC lisättiin soluviljelyalustaan ​​lopulliseen konsentraatioon 0,25 uM 72 tuntia. Saman pitoisuuden sytidiini (Sigma) PBS: ssä tai PBS: ää vain lisättiin solujen valvontaa hoidon. 24 tuntia käsittelyn jälkeen solut kerättiin jatkotutkimuksiin. Sillä

in vivo

tutkimuksissa käyttäen DAC, hiiriä, joilla on todettu EL4 kasvaimia ruiskutettiin DAC (1,0 mg /painokilo 200 ul PBS) tai PBS i.p. kerran päivässä 5 peräkkäisenä päivänä. Hiiret tapettiin 7-10 päivää päättymisen jälkeen lääkehoitoa ja tuumorit leikattiin käsiteltiin kasvainta infiltroivia lymfosyyttejä (TIL) analyysi.

Käänteinen transkriptio-PCR (RT-PCR) B

Kokonais-RNA uutettiin DAC-käsitelty tai ajoneuvon käsiteltyjen EL4-soluja ja muita ihmisen leukemia ja lymfooma-soluja käyttäen TRIzol-reagenssia (Invitrogen) valmistajan ohjeita. RT suoritettiin käyttäen Reverse Transcription System (Promega) 1 ug kokonais-RNA: ta, ja PCR-monistukset suoritettiin sitten käyttäen alukkeita esitetään taulukossa 1.Simultaneous monistuminen glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH) gene käyttämällä alukkeita hiiren (eteenpäin 5 ’-GATGCCCCCATGTTTGT-3′; käänteinen 5′-CCGTTCAGCTCTGGGATGA -3) ja ihmisillä (eteenpäin 5’- GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 ’; käänteinen 5′-TTGATTTTGGAGGGATCTCG-3’) käytettiin sisäisenä kontrollina määrän ja eheyden RNA analysoitiin. Kaikki PCR-tuotteet erotettiin agaroosigeeleillä ja visualisoitiin käyttäen etidiumbromidia värjäystä.

Real Time PCR

Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen ABI 7900-HT-sekvenssin järjestelmä (PEApplied Biosystems , Carlsbad, CA, USA) käyttäen aiemmin määritetty olosuhteissa [31]. SYBR Esiseos Ex Taq PCR -kittiä (Takara Bio Inc.), ja samoja alukkeita, joita käytetään RT-PCR käytettiin monistamiseen hiiren P1A, Melan, Magea4, CD80, CD79b, CD74, CD48, CD300a, CD3eap, CD274, CD247, CD180 ja GAPDH geenit. Kukin näyte analysoitiin kolmena rinnakkaisena, ja kokeet toistettiin kaksi kertaa. Suhteellinen määrä mRNA laskettiin piirtämällä Ct (jakson numero), ja keskimääräinen suhteellinen ilmaus kullekin ryhmälle määritettiin käyttäen vertailevaa menetelmää (2

– △△ Ct).

tuumorigeneesiä

C57BL6 hiiriin injektoitiin eri annoksilla (useimmiten käyttäen 1 x 10

4 solua /hiiri, sc) DAC-käsitellyt tai ohjata EL4-soluja. Tuumoritilavuudet mitattiin ab

2/2 (a = pituus; b = leveys) joka toinen tai kolmas päivä. Indusoimaan hiiren leukemia, hiiriin injektoitiin 2 x 10

4 EL4 solua /hiiri iv

In vivo CD8 + ja CD4 + T-solujen väheneminen

C57BL /6-hiiriin injektoitiin 400 ug: anti-CD4 (klooni GK 1.5 BioXcell, NH, USA), tai anti-CD8 (klooni 53-6,72; BioXcell, NH, USA) monoklonaalisia vasta-aineita ip joka 4. päivä heti hoidon jälkeen DAC. Ohjaus hiiriä käsiteltiin puhdistetulla rotan IgG2b tai IgG2a, vastaavasti (BioXcell, NH, USA). Ehtyminen vaikutuksia arvioitiin päätepisteen kokeen värjäämällä perna ja kasvainsolut CD4 ja CD8 käyttämällä anti-CD4 (RM4.4) ja anti-CD8 (5H10-1) mAb: itä (eBioscience), mitä seurasi virtaussytometria-analyysi .

vasta-aineet ja virtaussytometrinen analyysi

Kaikki käytetyt vasta-aineet hankittiin BD Biosciences (San Diego, CA) tai eBioscience (San Diego, CA). Värjäykseen solunpintamarkkereiden, solut (syöpäsolut, pernasolua yksisolususpensioita kasvaimia) värjättiin vasta-aineilla (FITC-, PE-, Apc- tai Percp- leimattu CD80, CD4, CD8a, CD3, NK1.1, IFN -γ, ja isotyypin kontrollivasta-aineita) värjäyspuskuriin (PBS, 1% FCS), jäillä 30 minuutin ajan. Solut kiinnitettiin 1% paraformaldehydillä PBS: ssä. Havaitsemiseksi solunsisäisten sytokiinien, soluja stimuloitiin

in vitro

PMA (100 ng /ml) ja ionomysiinillä (1000 ng /ml) 5 h. Golgin

Stop (BD Pharmingen, USA) lisättiin (1/1500) viime 2 h inkuboinnin. Solut värjätään ensin solun pinnan markkereita, kuten CD4 tai CD8, jota seurasi standardi solunsisäisen sytokiinin värjäystä menettely IFN-γ. Solut kerättiin käyttämällä FACSCalibur® virtaussytometriä ja tiedot analysoitiin käyttäen FlowJo ohjelmistoa (Tree Star, Inc., OR).

Gene Expression Microarray Analysis

Kokonais-RNA uutettiin DAC- käsitelty ja vehikkelillä käsiteltyjen EL4-soluja käyttäen TRIzol-reagenssia (Invitrogen) valmistajan ohjeita. cDNA, joka on leimattu fluoresoivalla värillä (Cy5 ja Cy3-dCTP) synnytettiin käyttäen CapitalBio cRNA Amplification ja Labeling Kit (CapitalBio, Peking, Kiina). SmartArray (CapitalBio, Peking, Kiina) siruja, jotka sisältävät noin 25000 hiiren geeneistä hybridisoitiin leimatun cDNA-koettimien on GeneChip- järjestelmään. Arrays skannattiin konfokaalisella LuxScan ™ skanneri ja saatujen kuvien analysoitiin käyttämällä LuxScan ™ 3.0 -ohjelmiston (molemmat CapitalBio, Peking, Kiina). Merkitys analyysi mikrosirut (SAM) suoritettiin sen määrittämiseksi differentiaalisesti ilmentyvien geenien.

bisulfiittimodifiointi Sequencing

metylaatiostatus CpG-dinukleotidissä kaksi aluetta (oligo 1: nukleotidin -792–335, oligo2: nukleotidi -151-258), suhteessa 5 ’päähän CD80-geenin, analysoitiin. Genominen DNA valmistettiin EL4 alakloonien EL4 C3 (CD80

-) ja EL4 C45 (CD80

+), ajoneuvo tai DAC-käsiteltyjen EL4-soluissa käyttäen Wizard Genominen DNA Purification Kit (Promega Inc, USA). Subkloonaamista ja sekvensointi yksittäisten alleelien, bisulfiitti-käsitelty genomista DNA: ta monistettiin käyttäen Epitect bisulfit (Qiagen, Saksa) käyttämällä seuraavia alukepareja: fragmentti 1 (eteenpäin 5′-GGGTATTTTTTTAAAAGAAGAGA-3 ’; taaksepäin 5’-AATCCTACAAAAACATCAATCAAC-3 ’), fragmentti 2 (eteenpäin 5’GGTTGGGTGGGAATTATTTTATT-3′; taaksepäin 5’-ACTTAAACACCTCCTAAACTCACA-3 ’).

PCR-tuotteet puhdistettiin geelillä ja kloonattiin pGEM-T-vektoriin (Promega Inc, USA ). Insertoitu PCR-fragmentit yksittäistä kloonia sekvensoitiin käyttäen ABI PRISMDNA sekvensseri (Applied Biosystems, USA).

sekalymfosyyttireaktiomää- ja CD80 Blockade

T-solut kerättiin pernan ja imusolmukkeet ja EL4- immunisoitujen BALB /c-hiiriä käytettiin vastesoluja. DAC tai vehikkelillä käsitellyssä EL4-soluja säteilytettiin X-ray (14 Gy), käytettiin stimulaattorisoluina. Vastesoluja ja stimulaattorin soluja inkuboitiin 96-kuoppaisilla levyillä suhteessa 08:01, 04:01, 02:01 ja 01:01, ja viljeltiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 6 päivää. T-soluproliferaatiota arvioitiin kanssa Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumomoto, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, sen jälkeen, kun oli inkuboitu 6 päivää 37 ° C: ssa, 10 ui vesiliukoista tetratsoliumsuolaa (WST) -8 lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja soluja inkuboitiin vielä 4-6 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Absorbanssi näytteestä 450 nm: ssä mitattiin. For CD80 salpaus, anti-CD80 (16-10A1, eBioscience, San Diego, CA) tai kontrolli isotyyppiä IgG, (eBioscience, San Diego, CA) lisättiin yhdessä viljelemisen kuoppiin lopulliseen pitoisuuteen 5 ug /ml .

IL-2 ja IFN-γ ELISA

supernatantit sekoitettu viljelmät kerättiin 72 tunnin kuluttua yhdessä viljelemisen ja analysoitiin IL-2 ja IFN-γ käyttäen ELISA-kittejä (eBiosciences, San Diego, CA).

tilastot

Tilastolliset analyysit tehtiin käyttäen GraphPad Prism Software (GraphPad Software, Inc., USA). Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan kasvaimen tilavuuden eroja kahden ryhmän välillä. Vertailun hiiren selviytymisen, Kaplan-Meier selviytymisen analyysin ja log-rank testi käytettiin.

P

arvo alle 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

DAC Treatment Estää EL4 Cell kasvaimen kehittymisen ja Johtaa regressio olevien kasvainten C57BL /6 Hiiret

Sen testaamiseksi, DAC hoito vaikuttaa tuumorigeenisyyden syöpäsolujen hiirillä, EL4-soluja käsiteltiin joko DAC (0,25 uM) tai sytidiini (0,25 uM) tai vehikkeliä (PBS) 72 tunnin ajan. Olemme mukana sytidiini kontrollina aineena koska DAC on sytidiinin. Lisäksi, edellinen tutkimus on osoittanut, että nukleotidi (Tymidiini) käsittely on myrkyllistä EL4-soluja [32]. Elinkelpoisten EL4-soluja edellä mainituissa hoidoissa sitten injektoitiin C57BL /6-hiirten ihon alle (s.c.), jonka määrä 1 x 10

4 solua /hiiri. Tässä numero, sytidiini ja ajoneuvojen käsiteltyjen EL4-soluja muodostunut kasvaimia kaikissa ruiskutettiin hiiriin ja kasvoi asteittain; ei sen sijaan ole kasvaimet muodostettiin hiirillä, jotka saivat DAC-käsiteltyjen EL4-soluja (kuvio 1A). EL4 kasvaimia perustettiin C57BL /6-hiirten vasta, kun hyvin suuri määrä DAC-käsiteltyjen EL4-soluja käytettiin (8-16 kertaisesti suuremmilla annoksilla) (kuvio 1 B). Laskimonsisäinen injektio ajoneuvon käsiteltyjen EL4-soluja (1 x 10

4 solua /hiiri) johti kehittämiseen EL4-leukemia in CBF1 hiirillä ja aiheutti kuoleman useimpien hiirillä; sen sijaan ei hiiret, jotka saivat tämän määrän DAC-käsiteltyjen EL4-soluja kuoli leukemiaan (kuvio 1 C). Sen testaamiseksi,

vivo

injektion DAC voi estää olevien kasvainten kasvua, EL4-soluja injektoidaan C57BL /6-hiirten s.c. Kun kasvaimet kasvoivat kooltaan noin 5 x 6 mm, nämä hiiret käsiteltiin DAC tai PBS: llä i.p. vuorokaudessa 5 peräkkäisenä päivänä. Toisin kuin progressiivisen kasvaimen kasvua ajoneuvon käsitellyissä hiirissä, DAC hoito aiheutti jatkuvaa kasvaimen regressiota, vaikka DAC hoito lopetettiin (kuvio 1 D). Niinpä DAC-käsiteltyjen EL4-soluja osoittavat heikentynyt kyky kasvainten synnyssä, ja ohimenevä DAC hiirten käsittely perustettu kasvaimia johtaa jatkuvaan kasvaimen regressio.

(A) EL4-soluja käsiteltiin DAC (0,25 uM viljelyalustaan) tai sytidiini tai PBS: ää 72 tuntia. Sitten solut injektoitiin kuhunkin hiiren s.c. annoksena 1 x 10

4 solua /hiiri. Tuumorin koko mitattiin kahteen suuntaan joka toinen tai kolmas päivä. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa: tilavuus = (L x W

2) /2 jossa L = pituus; W = leveys. *

P

0,05, kun DAC-hoitoa verrattuna PBS tai sytidiini hoitoon. Viidestä kuuteen hiirtä käytettiin kussakin ryhmässä, ja tietoja, jotka on yhdistetty kahdesta kokeesta. (B) EL4-soluja käsiteltiin DAC injisoitiin C57BL /6-hiirten s.c. annoksena 1 x 10

4 solua /hiiri (G1), 8 x 10

4 solua /hiiri (G2) tai 16 x 10

4 solua /hiiri (G3). PBS-käsiteltyjen EL4-soluja (1 x 10

4 solua /hiiri) toimi kontrollina. Hiiren selviytyminen tiedot näytetään. Viisi hiiriä kuhunkin ryhmään kuuluvan ja esitetyt tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. (C) DAC-käsitelty tai PBS-käsiteltyjen EL4-soluja injektoitiin kuhunkin hiiren i.v. annoksena 1 x 10

4 solua /hiiri. Hiiren eloonjääminen seurattiin jopa 100 päivää sen jälkeen tuumorisoluinjektion. Kymmenen hiirtä ryhmää kohti käytettiin, ja esitetyt tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. (D) Hiiret vakiintuneiden EL4 kasvaimia hoidettiin DAC tai PBS i.p. 5 peräkkäisenä päivänä päivästä alkaen 10. Tiedot esitetään edustavat kolmea koetta. Tähdet osoittavat tilastollinen merkitys

P

0,05.

DAC hoito indusoi anti-kasvain CTL Responses

Se, että ohimenevää DAC hoito johti pysyviä kasvain regressio viittaa siihen, että DAC: n hoitoon olisi voinut indusoi anti-kasvain immuunivasteita. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi, C57BL /6-hiiret, joilla on todettu EL4 kasvaimia käsiteltiin DAC, kuten on kuvattu edellä (kuvio 1 D). Seitsemästä kymmeneen päivää myöhemmin hiiret tapettiin, ja mononukleaariset solut kasvaimia värjättiin CD4, CD8 ja NK1.1 /CD3, seuraa analyysi käyttäen virtaussytometriaa. Kuten kuviossa 2A on esitetty, kasvainten DAC-käsitellyistä hiiristä oli kasvanut merkittävästi määrä CD8

+ ja CD4

+ T-soluja verrattuna kasvaimia ajoneuvojen-käsitellyistä hiiristä; NK1.1

+ CD3

– NK-solut olivat tuskin havaittavissa kasvaimia DAC-käsiteltyjen ja PBS-käsiteltyihin hiiriin (kuvio 2A, B). Kasvainten DAC-käsitellyistä hiiristä sisälsivät suurempia määriä IFN-γ tuottavien CD8 + T-soluja verrattuna kasvaimia ajoneuvojen-käsitellyistä hiiristä (kuvio 2C, D). Sen määrittämiseksi, onko kasvanut T-solu-vasteet olivat vastuussa DAC aiheuttama kasvaimen taantumiseen, C57BL /6-hiiret, joilla on todettu EL4 kasvaimia käsiteltiin DAC käsiteltiin myös anti-CD8 ja anti-CD4-vasta-aineita tai niiden suhteellinen kontrollivasta-aineita i.p. Anti-CD8 tai anti-CD4 hoito johti täydelliseen CD8

+ tai CD4

+ solujen pernat ja kasvaimia (kuvio 3A, C). CD8

+ T-soluja (kuvio 3B), mutta ei CD4

+ T-soluja (kuvio 3D), johti aggressiivisempia kasvaimen kasvua muuten suojasi hiiriä. Näin ollen, DAC hiirten, joilla on todettu kasvaimia indusoitiin CD8

+ T-soluvälitteinen kasvaimen vastaisen immuniteetin.

(A-B) C57BL /6-hiiret, joilla on todettu EL4 kasvaimia käsiteltiin DAC (1 mg /kg) tai PBS: ää kerran päivässä 5 peräkkäisen päivän ajan. 7-10 päivää käsittelyn jälkeen, hiiret tapettiin, kasvaimet kerättiin, ja erottaa toisistaan ​​kasvaimen solut värjättiin ilmentyminen eri solun pinnan markkereita, jota seurasi virtaussytometria määrän CD8

+, CD4

+ ja NK1. 1

+ CD3

– soluja. (C) virtaussytometrianalyysin ja kvantifiointiin solunsisäisen IFN-γ tuotantoa kasvain soluttautumalla CD8

+ T-soluja. Pylväät edustavat keskiarvoa + SD; n = 3-7 hiirtä ryhmää kohti. (D) virtaussytometrinen analyysi solunsisäisen IFN-γ tuotantoa kasvaimeen infiltroituvien CD4

+ T-soluja. Pylväät edustavat keskiarvoa + SD; n = 3-7 hiirtä ryhmää kohti. Studentin t-testiä käytettiin tilastolliseen analyysiin. Numerot virtaussytometristen luvut osoittavat% positiivisia soluja, jotka vastaavat kutakin portille.

neljä annos anti-CD8 tai anti-CD4-vasta-ainetta (400 ug /per hiiri, ip) injektoitiin 4 päivän välein alkava 1. päivänä, kun DAC hoidon. Kolme hiirtä ryhmää kohti käytettiin esitetyssä kokeessa. (A) CD8

+ T-solut pernassa ja kasvaimet analysoitiin virtaussytometrillä sen jälkeen, kun anti-CD8-vasta-aine tai isotyypin kontrollivasta-ainetta hoito. (B) Kasvaimen kasvu hiirissä, joita hoidettiin anti-CD8 tai isotyyppi-sovitettua kontrolli-mAb seuraavat DAC annon. Data edustaa kaksi erillistä koetta samoin tuloksin. Tähdet osoittavat tilastollinen merkitys

P

0,05. (C) CD4

+ T-solut pernassa ja kasvaimet analysoitiin virtaussytometrillä sen jälkeen, kun anti-CD4-vasta-aine tai isotyypin kontrollivasta-ainetta hoito. (D) Kasvaimen kasvua hiirissä, joita hoidettiin anti-CD4 tai isotyyppi-sovitettua kontrolli-mAb seuraavat DAC annon. Data edustaa kaksi erillistä koetta samoin tuloksin. Numerot virtaussytometristen luvut osoittavat% positiivisia soluja, jotka vastaavat kutakin portille.

DAC hoito sai aikaan CD80 ilmentäminen tuumorisoluissa

Koska DAC indusoi CTL-vasteita in EL4 kasvaimissa, me arveltu, että DAC hoito voi säätää ylös immuuni stimuloiva molekyylien läsnä EL4-solut, jotka voivat stimuloida CTL-vasteet immunokompetenteilla hiirillä. Aikaisemmat tutkimukset ovat raportoineet ylössäätöä MHC-luokan molekyylien ja kasvaimen antigeenejä demetyloimalla aineet [11], [17]. Kuitenkin emme onnistuneet havaitsemaan säätelyä MHC-luokan I ja luokan II molekyylien DAC-käsiteltyjen EL4-soluja (tietoja ei esitetty). Tutkimaan edelleen mekanismeja DAC aiheuttama kasvain immuniteetin, vertasimme ero geenien ilmentymistä DAC-käsiteltyjen EL4-soluja ja käyttäviin cDNA microarray analyyseja (GEO liittymistä # GSE38473) ja totesi, että DAC hoito muuttivat merkittävästi geeniekspressioprofilointi in EL4 soluja verrattuna ajoneuvon käsittelyä (kuva S1A). Kaikkiaan 847 voimistunut geenien havaittiin DAC-käsiteltyjen EL4-soluja käyttämällä SAM analyysi (kuvio S1B). Niistä yliaktiivista geenien DAC-käsiteltyjen EL4-soluja, 3 syövän kivesantigeenien ja 9 klusterin erilaistumisen (CD) molekyylejä, mukaan lukien CD80 (B7-1), joka on välttämätön T-solujen kostimuloiva molekyyli, havaittiin (kuvio 4A). RT-PCR ja qRT-PCR myös todentaa niiden ylössäätöä (kuvio 4B ja 4C).

Hiiri SmartArray sirut hybridisoitiin RNA peräisin DAC tai PBS-käsitellyt EL4-soluja. (A) Heatmap Joidenkin voimistunut geenejä DAC hoitoa. Pylväät edustavat microarray saadut 3 riippumatonta biologisista rinnakkaista. (B) RT-PCR avulla varmistetaan ylös geenien. (C) qRT-PCR: ää käytettiin määrittämään ylös-geenien in DAC ja PBS-käsitellyt EL4-soluja.

Voit selvittää pysyvyys ja vakaus DAC- aiheuttama CD80 ilme, EL4-soluja viljeltiin väliaineessa joka sisältää DAC (0,25 uM) tai PBS: ää 72 tunnin ajan. DAC aiheuttama CD80 ilmentyminen EL4-soluissa varmistettiin sekä mRNA: ta (kuvio 5A) ja proteiinin taso (kuvio 5B). Kineettinen analyysi paljasti, että CD80 ilmaisu korkeimmillaan 3-5 päivän kuluttua DAC hoidon, ja pidettiin merkittäviä määriä noin 3 viikon ajan ja sitten laski perustasolle (kuvio 5C). Testata onko DAC hoito voi aiheuttaa CD80 ilmaisun

in vivo,

EL4-soluja (CD45.2

+) injektoitiin s.c. C57BL /6-hiirten tai i.v. osaksi CD45.1 kongeeniset hiirillä. Kaksi viikkoa myöhemmin hiiret käsiteltiin DAC (1 mg /kg kehon painoa, i.p.) 5 päivän ajan. Seitsemän 10 päivää myöhemmin syöpäsolujen DAC- ja ajoneuvojen-käsitellyistä hiiristä tutkittiin CD80 ilme. DAC hoito merkitsevästi sääteli CD80 ilmentymisen EL4 solujen s.c. kasvaimet (kuvio 5D, vasen paneeli) sekä EL4-soluja luusta marrows (kuvio 5D, oikea paneeli). Sen määrittämiseksi, onko DAC-induced upregulation of CD80 on yleinen ilmiö, 6 ihmisen leukemian solulinjoja ja 2 ihmisen lymfooma solulinjaa käsiteltiin DAC (1 uM 72 tunnin ajan) ja sen jälkeen RT-PCR-analyysillä. Neljä 5 CD80-negatiivinen solulinjoissa (U937, THP-1, NB4 ja Molt-4) osoitti DAC aiheuttama CD80 ilme, kun taas kolmessa solulinjoissa on ennestään CD80-geenin ilmentymisen (K562, Hut-78 ja Raji) induktio vaikutus ei ollut ilmeinen (kuvio 5E).

(A) EL4-soluja käsiteltiin DAC (0,25 uM) tai PBS: ää 72 tuntia. RT-PCR: ää käytettiin havaitsemaan CD80-geenin ilmentymistä DAC ja PBS-käsitellyt EL4-soluja. GAPDH-geeni monistettiin samanaikaisesti latauskontrollina. (B) virtaussytometrinen analyysi CD80 ilmentymisen DAC-käsiteltyjen ja PBS: llä käsiteltyjen EL4-soluja. (C) EL4-soluja käsiteltiin DAC ja PBS: ssa 3 peräkkäisenä päivänä, ja pidettiin viljelmässä. Solut kerättiin kahden päivän välein ja värjättiin anti-CD80 seurasi virtaussytometria-analyysi. (D) EL4-soluja (CD45.2) injektoitiin s.c. C57BL /6-hiirten tai i.v. osaksi CD45.1 kongeeniset C57BL /6-hiiristä. DAC oli ylläpitäjä i.p. 2 viikkoa myöhemmin 5 peräkkäisenä päivänä. EL4 solujen erottaa toisistaan ​​kasvaimista (vasen paneeli) ja luun marrows (BM) (oikea paneeli) analysoitiin CD80 ilmentymistä virtaussytometrialla. (E) induktio CD80 ilmentymisen ihmisen syöpäsolujen linjat. Syövän soluja käsiteltiin DAC (0,25 uM) tai PBS: ää 72 tuntia. RT-PCR: ää käytettiin sen määrittämiseksi, CD80-geenin ilmentymistä. Numerot virtaussytometristen luvut osoittavat% positiivisia soluja, jotka vastaavat kutakin portille.

DAC indusoi demetylointi promoottorialueen CD80 Gene

määrittämiseksi oleva mekanismi, jolla DAC indusoi CD80 ilme EL4-soluja, analysoitiin sekvenssin promoottorialueen hiiren CD80. Ei ollut tyypillistä CpG saarilla promoottorialueen CD80. Kuitenkin, 14 CpG-dinukleotidit havaittiin Exon1 ja sen ylävirran 800 bp alueella (kuvio 6A). Kaksi paria alukkeita suunniteltiin bisulfiitti sekvenssianalyysi kahden fragmentteja, jotka kattavat nukleotidin -792–335 (F1), ja nukleotidisekvenssi -151-258 (F2). Ensin verrataan metylaatiostatuksen CpG-dinukleotidien kahden fragmentit kahdesta EL4 alakloonien kanssa tai ilman luonnollista ilmaisua CD80 (kuvio 6B). F1, 96% CpG dinukleotidejä oli metyloitavaa CD80

– soluja versus 67% vuonna CD80

+ soluja. F2, 92% CpG-dinukleotidien metyloitiin in CD80

– soluja verrattuna 6%: in CD80

+ -soluista (kuvio 6C). DAC hoito EL4-soluja aiheutti merkittävän kasvun demetylaatio sivustoja sekä F1 ja F2 alueet (kuvio 6D). Niistä DAC-käsiteltyjen EL4-CD80

+ solujen esiintyi enemmän demetylaatio sivustoja verrattuna DAC-käsiteltyjen CD80

– soluja (kuvio 6E). Siten CD80-geenin ilmentyminen EL4-soluja läheisesti liittyy demetylaation asema sen promoottorialueen ja DAC käsittely lisää merkittävästi demetylaation CD80 promoottorin.

(A) jakautuminen CpG dinukleotideissä alueella 1 kb ylävirtaan eksonin 1 CD80-geenin. Numerot viittaavat asentoon suhteessa 5’CD80. Kaksi CpG rikastettu alueiden (F1 ja F2) on valittu bisulfiittimodifiointi sekvenssianalyysi. (B) virtaussytometrinen analyysi CD80 ilmaisun kahdella EL4 variantteja (EL4C3 ja EL4C45). Numerot virtaussytometristen luvut osoittavat% positiivisia soluja, jotka vastaavat kutakin portille. (C) bisulfiittimodifiointi sekvensointi CD80 promoottorialueen EL4C45 (yläpaneeli) ja EL4C3 (alempi paneeli). Avoin ja täytetyt ympyrät edustavat demetyloitunut ja metyloitu CpG sivustoja, vastaavasti. Metylointi taajuus CpG sivustoja kunkin solulinjan on osoitettu. (D) bisulfiittimodifiointi Sekvensointianalyysin CD80 promoottorialueen DAC- ja PBS-käsiteltyjen EL4-soluja. (E) EL4-soluja käsiteltiin ensin DAC tai PBS: n, CD80:

+ ja CD80

– EL4-solut lajitellaan sitten virtaussytometrialla perustuva lajittelu. Bisulfiitti sekvensointi analyysi tehtiin DAC-käsitelty, CD80

+ ja CD80

– EL4-soluja.

DAC aiheuttama CD80 ilmentäminen EL4 soluissa Triggers Anti-kasvain CTL Response

Sen määrittämiseksi, onko DAC aiheuttama CD80 ilmentymisen EL4-soluja laukaisee anti-kasvain CTL-vasteita, EL4-soluja viljeltiin yhdessä DAC 72 tuntia. CD80

+ ja CD80

– EL4-solut erotettiin käyttämällä virtaussytometria-pohjainen nopea lajittelu saada erittäin puhdasta CD80

+ ja CD80

– EL4-soluja (kuvio 7A). Nämä solut sen jälkeen injektoitiin C57BL /6-hiiriä (2 x 10

4 solua /hiiri s.c.). Kaikki hiiret, jotka saivat CD80

– EL4 solut kasvoivat kasvaimia, kun taas suurin osa (60-80%) ja hiirillä, jotka saivat DAC hoidetuilla CD80

+ EL4-soluja ei kasvanut kasvain. Joissakin tapauksissa, CD80

+ EL4 kasvaimet kasvoivat ohimenevästi tai kasvoi myöhemmin (kuvio 7B). CD80

+ EL4 kasvaimia sisälsi paljon suurempi määrä CD8

+ ja CD4

+ T-solut (kuvio 7C-E) verrattuna CD80

– EL4 kasvaimia. NK1.1

+ CD3

– NK-soluja vain eräissä tapauksissa havaittu CD80

+ EL4 kasvaimia, mutta ei CD80

– EL4 kasvaimet (kuvio 7C, F). Näin ollen, DAC aiheuttama CD80 ilmentymisen käynnistää kasvaimen vastaisen immuniteetin

in vivo

.

(A) EL4-soluja käsiteltiin DAC. CD80

+ ja CD80

– EL4 solut erotettiin virtaussytometrialla perustuva lajittelu. Virtaussytometrinen analyysi CD80: n ilmentymisen EL4-soluja ennen ja lajittelun jälkeen on esitetty. (B) Kasvaimen kasvu kinetiikka DAC-käsiteltyjen CD80

+ ja CD80

– EL4-soluja. 2 x 10

4 CD80

+ tai CD80

– DAC-käsiteltyjen EL4 solua injektoitiin s.c. kuhunkin hiiri. Kasvaimen kasvu yksittäisissä hiiri näkyy. (C) Virtaussytometrianalyysi T-solujen ja NK-solujen tunkeutuminen CD80

+ ja CD80

– kasvaimia. Yhden solun suspensiot kasvaimia värjättiin CD4, CD8, CD3, NK1.1 seurasi virtaussytometria-analyysi.