Krooninen sairaus

tiivistelmä

perinteinen kiinalainen lääketiede on saavuttanut suosiota kyky tappaa syöpäsoluja. Äskettäin apoptoottisten ja anti-angiogeeninen vaikutus Trametes robiniophila Murr (Huaier) on tutkittu. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia sen vaikutus solujen liikkuvuuteen ja kasvaimen kasvua munasarjasyöpä. Solujen elinkelpoisuus ja liikkuvuuden mitattiin käyttämällä SRB, naarmu ja muuttoliike määrityksissä. Apoptoosia analysoitiin anneksiini V /PI-värjäyksen. Käyttäen käänteisfaasi-proteiinin array (RPPA) määritys, olemme analysoineet tason 153-proteiinien ja /tai fosforylaatiot in Huaier-käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen. Huaier esti solujen elävyyden ja indusoi sekä varhainen ja myöhäinen apoptoosin SKOV3, SKOV3.ip1 ja Hey solujen aika- ja annosriippuvaisesti. Solujen invasiivisuus ja muuttoliike myös tukahdutettiin merkittävästi. RPPA Tulokset osoittivat merkittäviä eroja (vähintään 30%; P 0,05) tasojen 7 molekyylien SKOV3- soluissa ja 10 SKOV3.ip1 soluissa välillä käsittelemättömien ja käsiteltyjen solujen. Useimmat identifioitujen molekyylien rooleja solujen lisääntymisen, apoptoosia tai solujen adheesiota /hyökkäystä. Western blot-analyysi edelleen vahvistettu, että Huaier hoito johti vähentyneeseen AKT-fosforylaation, parannettu ekspressio yhteensä GSK3p, estämällä fosforylaation GSK3p on S9 vähentäminen sekä sytoplasman β-kateniinin ilmentymistä ja ydin- β-kateniinin translokaatio, ja transkription repression useita Wnt /β-kateniinin kohdegeenien (

DIXDC1, LRP6, WNT5A

, ja sykliini D1). Sen jälkeen kaatamalla GSK3p, β-kateniinin käsitteellä voitu inhiboida Huaier. Lopuksi Huaier esti kasvua munasarjojen tuumoriksenograftien in vivo. Nämä tutkimukset osoittavat, että Huaier estää kasvainsolujen liikkuvuutta munasarjasyövän kautta AKT /GSK3p /β-kateniinin signalointireitin.

Citation: Yan X, lyu T, Jia N, Yu Y, Hua K, Feng W ( 2013) Huaier vesiuute Estää munasarjasyöpä soluliikkuvuus kautta AKT /GSK3p /β-kateniinin Pathway. PLoS ONE 8 (5): e63731. doi: 10,1371 /journal.pone.0063731

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 lokakuu 2012; Hyväksytty: 05 huhtikuu 2013; Julkaistu: 08 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 Yan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukevat National Natural Science Foundation of China, myöntää numero 30973185 (https://www.nsfc.gov.cn). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä on johtava kuolinsyy peräisin gynekologiset syöpään Yhdysvalloissa ja viidenneksi yleisin syy syövän kuolleisuus naisilla [1]. Munasarjojen syövän kasvaa iän myötä. Seitsemänkymmentä prosenttia potilaista on pitkälle edennyt tauti, ja alle neljäkymmentä prosenttia voitaisiin parantaa. Yleinen eloonjääminen kehittyneen munasarjasyövän ei ole osoittautunut lupaava, vaikka leikkauksen jälkeen yhdistettynä uusiin adjuvantin strategioita, kuten suuren annoksen kemoterapiaa kanssa ääreisverenkierron kantasolujen siirto, annoksesta tiheä viikoittain paklitakselin karboplatiinin ja täsmähoitoihin karboplatiinin /paklitakselin. Äskettäin tulokset Satunnaistetussa vaiheen III tutkimuksessa (GOG 0208) osoitti, että käyttö bevasitsumabia (an endoteelikasvutekijäreseptori vasta-aine) aikana ja 10 kuukauden kuluttua karboplatiinin ja paklitakselikemoterapia pidentää mediaani ilman taudin etenemistä noin 4 kuukautta joilla on pitkälle edennyt epiteelin munasarjasyöpä [2]. Kuitenkin yleinen eloonjääminen on samanlainen tavanomainen hoito huolimatta korkealla kustannuksella. Koska mikään näistä strategioista voi täysin suojata munasarjasyöpä potilaita toistuminen ja etäpesäke, uusia lääkkeitä tarvitaan kiireesti.

joukossa täydentäviä hoitoja, perinteinen kiinalainen lääketiede (TCM) on saavuttanut suosiota sen kyky tappaa kasvainsoluja vähemmällä haittaa normaaleille soluille. Lisäksi TCM kasviperäisten hoito on suhteellisen edullista ja on raportoitu lisäävän kemoterapian tehoa, vähentää myrkyllisyyttä, pidentää elinaika, ja parantaa elämänlaatua ja immuunijärjestelmän toimintoihin [3]. Trameta robiniophila Murr (Huaier) on eräänlainen sieni Kiinasta, joka on käytetty TCM noin 1600 vuotta. Kuitenkin sen kasvaimen vastainen vaikutus ja mekanismeja on tutkittu vasta viime vuosina. Tehokas ainesosat uutettiin ja analysoitiin korkean suorituskyvyn nestekromato- chromatophy (HPLC) ja natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS-PAGE) analyysit, jotka tunnistettiin proteoglykaanien tärkeimmät komponentit Huaier uutetta, joka koostui 41,53% polysakkarideja, 12,93 % aminohappoja ja 8,72% vettä [4], [5]. Lääke, joka on hyväksytty Kiinan Food and Drug Administration (FDA), on käytetty hepatosellulaarisia syöpäpotilailla. In vitro kokeet osoittivat, että Huaier voi estää kasvua maksasyöpä soluja (HepG2, MHCC97H), ihmisen keuhkon adenokarsinooma (A549), ja ihmisen rinta- syöpäsolujen (MCF-7, MDA-MB-231) indusoimalla apoptoosin [6] – [8]. Äskettäin, Wang et ai. raportoitu, että Huaier ote voisi toimia voimakas anti-angiogeeninen ja antituumoriaineen [9]. Kuitenkin onko Huaier vaikuttaa biologista käyttäytymistä munasarjojen soluista ei ole tutkittu. Tässä tutkimuksessa, sen lisäksi antiproliferatiivisia ja apoptoottisten vaikutusten uusilla mahdollisuus, että Huaier kykenee anti-invasiivisen vaikutus munasarjan syöpäsolujen kautta AKT /GSK3p: n /β-kateniinin signalointireitin tutkittiin.

materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja reagenssit

RPMI-1640-väliaine hankittiin Jinuo Co., Ltd (Shanghai, Kiina). Naudan sikiön seerumia (FBS) toimitti Gibco-BRL (Rockville, IN, USA). Vasta-aineita AKT (1:1000), Pakt-Thr308 (1:1000), PS6-S235 (1:1000), PS6-S240 (1:1000), sykliini D1 (1:2000), sykliini A (1:2000 ), E-kadheriinin (1:1000), glykogeenisyntaasikinaasi 3 beta (GSK3p, 1:1000), GSK3p fosfori S9 (1:500, Epitomics, CA, USA.) ja β-kateniinin (1:1000) hankittiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Anti-histoni H1 (1:300) ja anti-hiiri-anti-kani-IgG piparjuuriperoksidaasi (HRP) (1:5000) vasta-aineet saatiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Anti-GAPDH (1:3000) ja anti-β-aktiini (1:3000) ostettiin Biyuntian Biotech Co., Ltd (Shanghai, Kiina). Kaikki muut kemikaalit hankittiin Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA) ja Biyuntian Biotech Co., Ltd.

valmistaminen Huaier vesiuutteen

lääkepuurona voide Huaier oli lahja alkaen Gaitianli Medicine Co. Ltd (Jiangsu, Kiina). Valmistelu menetelmät Huaier uutetta ja sen ainesosat on kuvattu muualla [4], [5], yhteensä 2 g lääkepuurona voidetta liuotettiin 50 ml: aan täydellistä alustaa ja steriloitiin, jossa on 0,22 um: n suodattimen, jolloin saatiin 40 mg /ml kantaliuosta, joka säilytettiin -20 ° C: ssa.

Soluviljely

kolme munasarjojen epiteelin syövän solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa. SKOV3- ja Hei-solut saatiin American Type Culture Collection. SKOV3.ip1 solut olivat lahjoja University of Texas MD Anderson Cancer Center (Houston, TX) [10]. Solulinjoja ylläpidettiin rutiinisti RPMI-1640-väliaineessa, joka sisälsi 10% FBS: ää, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

Soluproliferaatiomääritys

kasvua estävä vaikutus Huaier määritettiin käyttämällä sulforodamiini B (SRB) määritys. Lyhyesti, SKOV3–soluja (2,5 x 10

3), SKOV3.ip1 soluja (2 x 10

3) ja Hei-soluja (1,5 x 10

3) ympättiin 96-kuoppalevyille ja käsitelty Huaier uutteen vesiliuosta eri pitoisuuksina. Ilmoitettuina aikoina, solut pestiin, kiinnitettiin 30% (paino /tilavuus) trikloorietikkahappoa, ja värjättiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa 0,4% sulforodamiini B (SRB) 1% etikkahapossa. Väriaine pestiin pois 1% (tilavuus /tilavuus) etikkahappoa ja sitten liuotettiin 10 mM Tris-emästä liuokseen. Levyt luettiin mikrolevylukijalla (Bio-Rad) 570 nm: ssä. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena ja toistettiin ainakin kolme kertaa.

anneksiini V /PI-värjäys

Dead solukuoleman Kit anneksiini V Alexa Fluor® 488 Propidiumjodidia (PI) (Invitrogen, CA, USA) käytettiin tutkimaan, onko hoito Huaier indusoi SKOV3- solut, SKOV3.ip1 solut ja Hei-solujen apoptoosiin. Solut fluoresoivasti leimattu ohjeiden valmistajalta. Lyhyesti, viljellyt SKOV3- soluja (2 x 10

5), SKOV3.ip1 (2 x 10

5) soluissa ja Hei-soluja (5 x 10

3) 35 mm: n malja käsiteltiin eri pitoisuudet Huaier 48 tuntia. Solut otettiin talteen ja suspendoitiin uudelleen 1 x 10

6 solua /ml sitoutumispuskurissa. Sitten, vihreä fluoresoiva väriaine (AlexaFluor® 488) konjugoitua anneksiini V: ja PI ja inkuboitiin pimeässä 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Näytteet analysoitiin käyttäen FACScan-virtaussytometrillä (Beckman) varustettu CellQuest-ohjelmaa. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen laskettiin solujen prosenttiosuus oikeassa alakulmassa (LR) kvadrantissa dot plot, joka edustaa määrää alussa apoptoottisten solujen (anneksiini V + /PI) jaettuna solujen määrä. Jokainen koe toistettiin ainakin kolme kertaa.

In vitro naarmu määrityksessä

In vitro scratch määritys suoritettiin sen arvioimiseksi, miten solujen vaeltamiseen vaikutti anto Huaier vesiuute. Yhteensä 2 x 10

4-solut ympättiin 24-kuoppalevylle. Viite pistettä lähellä ”scratch” merkittiin varmistaa käytön samalla alueella kuvan hankinnan. Sen jälkeen 24 tunnin itämisaika, konfluentteja yksisolukerrokset on SKOV3, SKOV3.ip1 ja Hey solut naarmuuntunut käyttäen 200 ui pipetin kärki luoda suora ”tyhjästä”. Kun oli pesty 2 kertaa PBS: llä, seerumittomassa alustassa, joka sisälsi Huaier poimia (5 mg /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Scratch leveys mitattiin neljästä ennalta paikoissa alussa ja 12 ja 24 tunnin kuluttua tyhjästä SKOV3- ja SKOV3.ip1 soluja. Ja naarmu leveys mitattiin Hei soluissa alussa sekä 6 ja 12 tunnin kuluttua alusta. Väliset etäisyydet 2 reunojen tyhjästä mitattiin viitearvot ja analysoitiin tilastollisesti.

matrigeelin invaasio määrityksissä

TranswellTM järjestelmä (24-kuoppaiset insertin, huokoskoko, 8 um; Corning Costar, Lowell, MA, USA) käytettiin tutkimaan vaikutusta Huaier vesipitoinen uute on invasiivisuus ja SKOV3, SKOV3.ip1 ja Heycells. Insertit päällystettiin 30 ui matrigeelin (B. D. Biosciences Pharmingen). Yhteensä 3 x 10

4 SKOV3, SKOV3.ip1 ja Hei solujen kunkin suspendoitiin 0,2 ml: aan tuoretta väliainetta ilman naudan sikiön seerumia lisättiin ylempään hyvin kammion. Kontrolliryhmässä, 600 ulissa täydellistä väliainetta lisättiin alempaan hyvin, kun taas koeryhmä, väliaine sisälsi 5 mg /ml Huaier. Kun oli inkuboitu 24 tuntia, solut yläpinnan membraania Luettu vanutupoilla. Sitten solut kiinni alapinnan insertit kiinnitettiin ja värjättiin hematoksyliinillä. Kuusi edustaja kenttiä kunkin insertin satunnaistettiin laskettiin käyttäen Olympus valomikroskoopilla.

Käänteisfaasi proteiinijärjestelmäksi

SKOV3- solut ja SKOV3.ip1 soluja (5 x 10

5) viljeltiin 6 cm: halkaisija ruokia. Sen jälkeen, kun 24 tunnin inkubaation jälkeen solut jaettiin neljään ryhmään saada erilaisia ​​hoitoja: täydellistä alustaa vain 72 tunnin ajan, Huaier vesiuute (5 mg /ml) 72 tunnin ajan, täydellisessä alustassa 60 tunnin ajan ja yön yli nälkään ja 10 min stimuloinnin epidermaalisen kasvutekijän (EGF, 20 ng /ml) ja Huaier vesipitoinen uute (5 mg /ml) 60 tunnin ajan ja yön yli nälkään ja 10 minuutin stimulaation EGF: ää (20 ng /ml). Käänteisfaasin proteiinijärjestelmäksi (RPPA) määritys suoritetaan Functional proteomiikka Reverse Phase Protein Array Core Facility MD- Anderson Cancer Center. Lyhyesti, solulysaatteja säädettiin niiden proteiinien pitoisuuksien, denaturoitiin SDS, ja laimennettiin sarjassa (välillä laimentamattomana 1:16 laimennus) määrittää lineaarisen alueen kunkin antigeeni-vasta-reaktio. Lysaatteja täplikäs nitroselluloosalle päällystettyjä dioja (Whatman, Inc.) käyttäen GeneTAC G3 microarrayer (Perimän Solutions) sekä positiivisten ja negatiivisten kontrollien. Kaikkiaan 153 validoitu spesifisten vasta-aineiden proteiineja tai niiden fosforyloitu sivustoja, jotka ovat mukana erilaisissa signalointireitteihin oli saatavilla ja käytetään RPPA (katso taulukko S1 proteiineille ja fosforylaatiopaikat käytetään RPPA tutkimukset). Kukin dia koettimena primaarisen vasta-aineen ja konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen avulla Dako CSA (tyramide) vahvistus lähestymistapaa ja visualisoitiin käyttäen DAB kolorimetrisen reaktion. Kerätyt tiedot kvantitoitiin käyttäen kvantitatiivisia ohjelmistoa MicroVigene, joka oli kehitetty erityisesti tätä lähestymistapaa. Proteiinin fosforylaatio tasot ilmaistiin suhteena vastaavaan kokonaisproteiinista. Saatuja arvoja käyrä ja sieppaa ilmaistiin suhteessa standardin ohjaus solulysaatteja sirussa. Kaikki arvot verrattiin keskiarvo kussakin vasta-aineen koetin ja visualisoitiin lämpökarttoja ohjelmisto luo Matlab (Mathworks Inc.).

Cell fraktiointi

Nuclear proteiinit eristettiin käyttäen BestBio Nuclear ja sytoplasmisia uuttoreagenssit (BestBio, Shanghai, Kiina) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, 1 x 10

6 solut pestiin kahdesti kylmällä PBS: llä ja hajotettiin 100 ul: lla jääkylmää sytoplasminen uuttoreagenssin (CER) ja 1 ui proteaasiestäjäseostabletit. Keräämisen jälkeen solulimafraktio (supernatantti), ydin- uuttoreagenssi (NER) ja proteaasiestäjäseostabletit lisättiin liukenemattomaan fraktioon, säilyttäen tilavuussuhde CER: NER: proteaasin cocktailin 100:500:1. Sen jälkeen 60 min inkuboinnin ja 5 min sentrifugoinnilla (16,000 x

g

4 ° C), tumafraktios- kerättiin. Supernatantti ja tumafraktios- tehtiin Western blot analyysi β-kateniinin.

Western blot-analyysi

Solut maljattiin tiheydellä 2 x 10

5 per 3,5 cm halkaisija lautasen ja kerätään jälkeen ilmoitettu hoidon. Solut hajotettiin hajotuspuskuria (Biyuntian Biotech Co., Ltd, Shanghai, Kiina) ohjeiden valmistajalta. Yhtä suuret määrät proteiinia (20 ug per kaista) erotettiin 12% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Millipore, Billerica, MA). Blokkauksen jälkeen blotteja tutkittiin primaaristen vasta-aineiden ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa, minkä jälkeen merkintöjen sopivan sekundaarisen vasta-aineita on konjugoitu HRP. Immuno-reaktiiviset vyöhykkeet visualisoitiin käyttämällä ECL-detektointijärjestelmällä (Pierce, Rockford, IL, USA). GAPDH, β-aktiini ja histoni H1 käytettiin lastaus valvontaa.

Immunosytokemia

Viljellyt solut pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä. Objektilasit pestiin jälleen, käsiteltiin 1% Triton 15 minuuttia ja blokattiin 3% H

2O

2: ssa 20 minuutin ajan. Pesun jälkeen objektilasit peitettiin normaalia vuohen seerumia 10 minuuttia RT: ssä ja niitä inkuboitiin ensin 1:200 anti-ihmisen E-kadheriinin-vasta-ainetta (Epitomics, CA, USA) 4 ° C: ssa yön yli ja sitten biotinyloidun anti-kani- sekundaarinen vasta-aine 30 minuutin ajan RT: ssä. Sitten laseja inkuboitiin avidiini-biotiini-peroksidaasi-järjestelmään 10 minuuttia RT: ssä ja värjättiin diaminobentsidiini (DAB) 2 minuuttia. Lopuksi ne vastavärjättiin hematoksyliinillä ja tarkastella valomikroskoopilla.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR-

Soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 7,5 mg /ml Huaier 48 tuntia. Kokonais-RNA uutettiin käsiteltyjen ja kontrolli-soluihin käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA syntetisoitiin 1 ug RNA: sta käyttäen RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, St-Leon-Rot, Saksa). Ilmentymistasojen liittyvien geenien Wnt-signalointireitin [DIX domeenin, joka sisältää-1 (

DIXDC1) B], LDL-reseptoriin liittyvä proteiini 6 (

LRP6) B, ja wingless-tyyppinen MMTV integraatiokohdan perhe, 5A (

WNT5A) B) arvioitiin kanssa Illumina Eco Reaaliaikainen järjestelmän avulla Perfect Real Time Kit (Takara). β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina kussakin reaktiossa. Alukesarjat Näiden geenien toimitetaan pyynnöstä. Suhteellinen kertainen muutokset laskettiin ΔΔCt menetelmää.

Hiiri ksenografti ja tuumorin koon mittaus

eläinkokeiden hyväksyi eettinen komitea on Naistenklinikka sairaala Fudanin yliopistossa. Kuusi viikkoa vanhoja BALB /c-hiiret hankittiin Kiinan ja Britannian SIPPR /BK Lab Animal Ltd, Co (Shanghai, Kiina). SKOV3- soluja (4 x 10

6) injektoitiin ihonalaisesti oikeaan kylkeen kunkin hiiren. Sitten hiiret jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään (n = 6 hiirtä /ryhmä) saamaan joko fysiologista suolaliuosta (NS) kontrollina, Huaier (4 g /kg kehon painoa), sisplatiinia (DDP) (5 mg /kg ruumiinpainoa ) tai Huaier plus DDP. Huaier annettiin suun kautta päivittäin. DDP ruiskutettiin kerran viikossa kolmen viikon ajan. Ohjaus hiiriä käsiteltiin samalla tilavuudella NS vain. Tuumoritilavuudet mitattiin kaksi kertaa viikossa käyttämällä digitaalista paksuus ja lasketaan käyttäen seuraavaa kaavaa: kasvaimen tilavuus (mm

3) = (kasvaimen pituus [mm] x kasvaimen leveys x korkeus [mm]) fl /6. Hiiret tapettiin päivänä 42 sen jälkeen, kun kasvainsolujen injektion jälkeen. Kehon painot mitattiin myös arvioida sivuvaikutuksia. Välineet kolmen itsenäisen mittauksen keskiarvo laskettiin.

siRNA-välitteinen geenien

GSK3p siRNA-dupleksit, jotka kohdistuvat sekvenssit: (5′-GAGCAAAUCAGAGAAAUGAdtdt-3 ’) syntetisoitiin Genechem (Shanghai , Kiina), For siRNA transfektiota, 5 x 10

5 solua /malja maljattiin 60 mm viljelymaljoille. Seuraavana päivänä 10 ui Lipofectamine 2000 reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA), lisättiin 0,5 ml Opti-MEM-see- väliaineessa (Invitrogen, Carlsbad, CA) ilman antibiootteja ja seerumin, ja inkuboitiin huoneenlämmössä 5 min (liuos A). 200 pmol siRNA lisättiin 0,5 ml Opti-MEM ilman antibiootteja ja seerumia (liuos B). Liuos A ja liuos B sekoitettiin sitten ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 20 minuuttia. Soluviljelmän elatusaine poistettiin, ja sen jälkeen 1 ml Lipofectamine 2000-siRNA seoksen ja 4 ml tuoretta 1640 väliaineessa ilman antibiootteja lisättiin kuhunkin viljelymaljaan ja sekoitettiin varovasti. 24 tuntia myöhemmin väliaine korvattiin tuoreella viljelyalustalla tai 5 mg /ml Huaier vesipitoinen uute. Solut kerättiin western blot-analyysi 24 tunnin inkubaation jälkeen.

Tilastollinen

Tiedot esitetään keskiarvoina ± keskihajonta. Kokeet toistettiin kolme kertaa. Tulokset analysoitiin SPSS 11.5 ohjelmistolla. p 0,05 hyväksyttiin merkittävä.

Tulokset

Huaier esti solujen elinkelpoisuutta SKOV3, SKOV3.ip1 ja Hey solujen

arvioimiseksi vaikutuksen Huaier ote on SKOV3, SKOV3.ip1 ja Hei soluja, mittasimme solujen elinkelpoisuus käyttäen SRB-määritystä. Sen jälkeen, kun soluja käsiteltiin Huaier 24, 48, 72 ja 96 tunnin ajan eri pitoisuuksilla (0, 0,625, 1,25, 2,5, 5 ja 10 mg /ml), Huaier estivät merkittävästi kasvua SKOV3, SKOV3.ip1 ja Hey solut ajasta ja annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1). Sytotoksinen vaikutus alkoi 24 tuntia sen jälkeen, kun 5 mg /ml Huaier hoitoon ja tuli ilmi 48, 72 ja 96 tuntia SKOV3- ja Hei soluja, kun se alkoi 48 tuntia SKOV3.ip1 soluissa. Hey ja SKOV3.ip1 solut olivat herkempiä Huaier hoitoon, kuten elinkelpoisuus hinnat olivat laski 31,94% (72 tuntia, p 0,001), ja 20,43% (96 tuntia, p 0,001) SKOV3.ip1 soluissa, 4,9% (72 tuntia, p 0,001) ja 3,1% (96 tuntia, p 0,001) Hei soluissa verrattuna 61,1% (72 tuntia, p = 0,01) ja 40,1% (96 tuntia, p 0,001) SKOV3- soluja. Merkittävä väheneminen solujen elinkykyisyys havaittiin, kun soluja käsiteltiin 10 mg /ml Huaier riippumatta hoidon kestosta.

kasvua estävä vaikutus Huaier mitattiin käyttämällä SRB-määritystä. SKOV3 (A) SKOV3.ip1 (B) ja Hey (C) Soluja käsiteltiin Huaier 24, 48, 72 ja 96 h. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena, ja tiedot on esitetty keskiarvoina ± SD kolmesta erillisestä kokeesta.

Cell apoptoosin analysoitiin käyttäen PI-anneksiini-V-värjäyksellä

Koska Huaier poimia merkittävästi esti solun kasvua, olemme edelleen tutkia, onko tämä vaikutus saavutettiin aiheuttamaan apoptoosin. PI-anneksiini V värjäys testi osoitti, että kun Huaier hoidon 48 tuntia, myöhäinen apoptoosin tai solukuolema rate (UR) ja varhaisen apoptoosin rate (LR) sekä kasvoi annoksesta riippuvalla tavalla SKOV3, SKOV3.ip1 ja Hey -soluja (kuvio 2 ja taulukko 1).

prosenttiosuus apoptoottisten solujen mitattiin virtaussytometrialla käyttämällä PI-anneksiini V-määrityksellä. (A, B, C) dot plotit osoittaa apoptoosin SKOV3 (A), SKOV3.ip1 (B) ja Hey (C) solujen Huaier hoitoa 0, 2,5, 5 ja 10 mg /ml 48 tuntia.

soluliikkuvuus laskivat altistumisesta Huaier poimia

Tutkitaan onko Huaier poimia vaikuttaa solun liikkuvuus, soluinvaasiota ja scratch määritykset suoritettiin. Kun SKOV3- soluja käsiteltiin 5 mg /ml Huaier uutteen määrä tunkeutuvat soluihin Matrigel-päällystetty kalvo oli merkittävästi vähentynyt verrattuna käsittelemättömän ryhmän (218 ± 35 versus 18 ± 7, p 0,001,), joka osoittaa, että invaasio kyky estyi. Samanlaisia ​​tuloksia löydettiin SKOV3.ip1 ja Hey soluja (SKOV3.ip1: 438 ± 26 versus 83 ± 25; Hey: 264 ± 21 versus 62 ± 16 p 0,001, kuva 3).

(A ) vaikutus Huaier on hyökkäyksen SKOV3, SKOV3.ip1 ja Hey soluja tutkittiin käyttämällä Transwell järjestelmää. Kuvat ovat esittelyyn. (B) Sen jälkeen 24 tunnin hoidon 5 mg /ml Huaier määrä onnistuneesti tunkeutumaan SKOV3, SKOV3.ip1 ja Hey solut laskettiin. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD. ** P 0,01 verrattuna kontrolliryhmään.

naarmu määritys suoritettiin arvioimaan solumigraatiota in vitro. Kuten kuviossa 4, siirtyminen indeksi (vastaa haavojen kapasiteetti) estyi merkittävästi SKOV3- käsitellyissä soluissa Huaier 48 tuntia verrattuna käsittelemättömiin soluihin (23,3% vs. 69,8%, p 0,01), kun taas se oli samanlainen soluissa käsiteltiin Huaier 24 tuntia ja käsittelemättömien solujen (17,5% vs. 24,7%, p 0,05). Kuitenkin siirtyminen indeksi laski jo 24 tunnin kuluttua Huaier hoidon SKOV3.ip1 soluissa verrattuna käsittelemättömiin soluihin (19,3% vs. 60,6%, p 0,05). Hey soluja, haava voi melkein suljettuna vain 12 tuntia parantavan käsittelemättömissä soluissa, ja siirtyminen indeksi estyi merkittävästi käsiteltyjen solujen kanssa Huaier pelkästä 6 h (58,2% vs. 29,1%. P 0,01).

(A) suoraan haava-alueella tuotettiin kussakin kulttuuri hyvin alussa, ja anto Huaier (5 mg /ml) osoitti viivästetty prosessi haavan verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Edustavat kuvat kontrollisolujen ja 5 mg /ml Huaier-käsitellyt solut hankittiin 0, 12,24 h (SKOV3, SKOV3.ip1) tai 0, 6, 12 h (Hei). (B) Siirtymisen indeksit olivat merkitsevästi inhiboi Huaier. Palkit edustavat siirtymisen indeksin kunkin hoitoon, ilmaistu arvo suhteessa etäisyyden liikuttaa yksisolukerrosta. Tiedot esitetään keskiarvoina ± SD. Kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa. ** P 0,01 verrattuna kontrolliryhmään.

Solulisääntyminen, apoptoosin ja soluadheesio tai invaasio signalointi proteiineja alas-säätelee Huaier hoito

tutkimiseksi signalointireittejä, jotka saattavat edistää Huaier estävä vaikutus liikkuvuuteen, käytimme RPPA analyysi, jossa arvioidaan proteiinin muutoksiin SKOV3- ja SKOV3.ip1 soluja käsiteltiin Huaier. RPPA on uusi suurikapasiteettisten teknologia, joka tarkkailee muutoksia proteiinin ilmentymistä ajan, ennen ja jälkeen hoitojen välillä tauti ja ei-tautitilojen välillä vastanneiden ja vastaamattomia [11]. Käyttäen RPPA, olemme analysoineet ilmentymisen taso 153-proteiinien ja /tai fosforylaatio sivustoja Huaier-käsitellyt tai käsittelemättömät munasarjasyövän solulinjoissa tai ilman EGF stimulaatiota. Jokaisesta näytteestä ja kukin vasta-aine, signaali ero käsittelemättömän ja Huaier käsiteltyjä soluja laskettiin seuraavasti: [12] ([keskiarvo käsiteltyjä soluja – avulla ei-käsiteltyjen solujen] /[avulla ei-käsiteltyjen solujen]) x 100%.

153-proteiinit ja fosforylaatiopaikkaa analysoidaan, 7 ja 10 erosivat yli 30%, että käsiteltyjen ja käsittelemättömien olosuhteet SKOV3- ja SKOV3.ip1 soluja, vastaavasti. Edustaja lämpökarttoja on esitetty kuviossa 5A. Vuonna SKOV3- soluissa, Huaier hoito esti solujen lisääntymistä ja muuttanut tasot liittyvien proteiinien /fosforylaatiokohdat; Esimerkiksi se laski HER2 fosforylaation Y1248 ja ER-proteiinin tasot mutta säädelty p53 ja Taz fosforylaation S79. Vuonna SKOV3.ip1 soluissa, enemmän pro-proliferatiivisia proteiineja, kuten ER, c-kit ja fosforyloidun S6 (ribosomaalisen proteiinin S6-kinaasi; fosforyloitiin S235-236 ja S240-244) on alas-säädellä Huaier. Lisäksi, Huaier esti ilmaus enää isoformin Bcl (Bcl-x L) ja ylöspäin säädelty ilmentyminen pro-apoptoottiset proteiinit, kuten p53 ja katkaistun poly (ADP-riboosi) polymeraasin (PARP_cleaved), in SKOV3.ip1 solut (kuvio 5B).

(A) Hierarkkinen klusterianalyysillä neljä näytettä (kontrolli, Huaier saaneilla 72 tuntia, nälkään + EGF stimulaatio, nälkään + EGF stimulaatio + Huaier 60 tuntia) in SKOV3 ja SKOV3 .ip1 solut ilmaisun mukaisesti 16 signalointimolekyylien. Cluster väripainike: punainen – sääteli; green – alassäädetty; musta – ennallaan. (B ja C): Käännä muutokset ilmentymiseen tai fosforylaatio erilaisten proteiinien jälkeen Huaier hoidon ja lisääminen EGF analysoitiin käyttämällä RPPA määritystä on SKOV3 (B) ja SKOV3.ip1 (C) solut. Arvojen suhteen kontrolliryhmän ja nälkään + EGF stimulaation ryhmät asetettiin 1,0. *: Kertaluokkamuutos 30%.

Olemme myös havainneet, että Huaier voi säädellä soluadheesiota ja invaasio, joka perustuu säätely alaspäin fibronektiinin, β-kateniinin ja caveolin-1 ilmentymisen molemmissa solulinjoissa ja säätely ylöspäin klaudiini 7 SKOV3.ip1 soluissa jälkeen Huaier hoidon (kuvio 5B).

osallisuus Pakt /mTOR /S6 väylän Huaier aiheuttama munasarjasyövän solukasvuneston

käyttäminen RPPA, huomasimme, että ribosomaalinen S6 kinaasin fosforylaatiota oli tukahdutettu Huaier hoitoa. S6-kinaasi on merkittävä kohde mTOR reitin, ja se edistää solujen kasvua ja proliferaatiota. Akt reitti on ylävirran aktivaattori on mTOR kautta. Näin ollen, olemme analysoineet proteiinin tasot Pakt, AKT, PS6 (S235-236) ja PS6 (S240-244) western-blottauksella. Huomasimme, että AKT fosforylaatio väheni merkittävästi SKOV3.ip1 soluissa kuluttua 72 h Huaier hoidon kanssa tai ilman EGF stimulaatiota. Mukaisesti väheneminen Pakt, fosforylaatio S6 S235-236 ja S240-244 myös alas-säädellä. Kuitenkin SKOV3- soluissa, fosforylaatiota S6 S235-236 ja S240-244 oli säädellä vähentävästi käsitelty solu Huaier vain mutta ei EGR stimulaatio ryhmiä, kun taas Pakt oli hieman lisääntynyt Huaier käsiteltyjen SKOV3- soluissa. Huaier alas-säännelty fosforylaatiossa on S6 S240-244 sekä Huaier hoidetuilla vain ja EGF stimulaatiota ryhmien Hei soluissa. (Kuvio 6).

AKT-fosforylaation, yhteensä AKT tasoilla, ja S6 fosforylaation S235 ja S240 mitattiin western blotting näytteitä kustakin neljästä hoitoryhmästä (kontrolli, Huaier-käsiteltiin 72 tunnin ajan, nälkään + EGF stimulaatio, nälkään + EGF stimulaatio + Huaier 60 tuntia). Numerot proteiinin bändit edustavat kertaiseksi muutoksia, jossa pohjapinta tasoilla ohjaus tai nälkään + EGF ryhmien annetaan arvo 1,0.

Huaier estää solujen invaasion välityksellä GSK3p /β-kateniinin reitin

Koska tulokset anneksiini V /PI-värjäyksen osoitti, että Huaier indusoi apoptoosia ja RPPA lisäksi tulokset osoittivat, että useita pro- ja anti-apoptoottiset proteiinit moduloidaan Huaier hoitoon, tuloksemme tukevat pro-apoptoottinen vaikutus of Huaier muissa tutkimuksissa havaitut. Kuitenkin RPPA analyysi osoitti myös, että proteiineja, jotka liittyvät soluadheesioon ja invaasiota oli moduloidaan Huaier käsittely (kuvio 5). Tämä viittaa siihen, että Huaier voi olla muun terapeuttisesti tärkeä vaikutus, varsinkin koska epiteelin munasarjasyöpäsoluja on ainutlaatuinen invasiivisen /metastaattinen kapasiteetti ja usein implantti osaksi lantion tai vatsaonteloon.

Niistä proteiineja, β-kateniinin on keskeinen osa E-kadheriinin välittämä solu-solu-adheesion cascade. Käyttämällä western blotit, me edelleen todentaa muutoksia β-kateniinin ilmentymistä SKOV3, SKOV3ip1 ja Hey soluja. Kuten kuviossa 7 on esitetty, Huaier laski jyrkästi sytosolin kertymistä β-kateniinin ajasta riippuvalla tavalla SKOV3, SKOV3.ip1 ja Hei soluja. Ydin- ilmentyminen β-kateniinin väheni myös. Meidän tiedot osoittavat, että Huaier tukahduttaa ei ainoastaan ​​proteiinin ekspressiota, mutta myös tumaansiirtymiseen ja β-kateniinin.

Sekä sytoplasminen ilmentyminen ja tumaansiirtymiseen ja β-kateniinin n vaikutuksesta inhiboitui merkittävästi, kun Huaier hoitoon. (A) SKOV3, (B) SKOV3.ip1 ja (C) Hei soluja käsiteltiin 5 mg /ml ja 7,5 mg /ml Huaier 24, 48 ja 72 tuntia. Sytoplasmisen ja ydin- proteiinit uutettiin erikseen. Edustava Western blot on esitetty. Sillä densitometrinen analyysi β-kateniinin tasoilla, tulokset normalisoitiin tasolle GAPDH (sytoplasmaan proteiinit) tai histoni 1 (tumaproteiinien). Pohjapinta taso käsittelemättömän ryhmille kussakin aikapisteessä annettiin arvo 1,0.

Täsmennetään mekanismi aiheuttaa säätely alaspäin β-kateniinin, me arvioidaan edelleen ilmaisua GSK3p (glykogeenin kogeenisyntaasikinaasi 3β), jonka tiedetään säädellä negatiivisesti klassinen Wnt /β-kateniinin signalointireitin fosforyloimalla β-kateniinin, joka johtaa sen hajoamiseen [13]. Koska fosforylaatio GSK3p on S9 estää sen toiminnan ja estää kohdentamista β-kateniinin hajoamiselle, kokosolulysaateista tutkittiin sekä täydellistä GSK3p ja fosforyloitua GSK3p at S9 tasoille Huaier hoitoa.