Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Noninvasiiviset mutaation testaus käyttäen kiertävien kasvaimen DNA (ctDNA) on houkutteleva lähtökohta. Tämä voisi mahdollistaa potilaiden ilman käytettävissä kasvainnäyte käyttää enemmän hoitovaihtoehtoja.

Materiaalit Menetelmät

Perifeerisen veren ja Hyväksytty kasvaimia analysoitiin 45 NSCLC potilaiden. Olemme tutkineet vaikutus preanalyyttiset muuttujia DNA tuotto ja /tai

KRAS

mutaation havaitseminen: Näytekokoelmatodistuksen sisärenkaallisten, inkubaatioaika, sentrifugointivaiheissa, plasma panosvolyymi ja DNA: n uuttaminen sarjat.

tulokset

2 tunnin inkubaatioajan ja kaksinkertainen plasman sentrifugoimalla (2000 x g) vähennetään kokonais- DNA tuoton seurauksena alentuneet kontaminoivaa genomista DNA (gDNA). Alennettu ”saastuminen” ja lisääntynyt

KRAS

mutaation havaitseminen havaittiin käyttäen solutonta DNA Veren Collection Putket (cfDNA BCT) (Streck), kun 72 tunnin veren- draw verrattuna EDTA-putkiin. Plasma panosvolyymi ja käyttää erilaisia ​​DNA: n eristämiseksi sarjoja vaikutti DNA tuotto.

Johtopäätös

Tämä tutkimus osoitti, että onnistunut ctDNA elpyminen mutaation havaitsemiseksi NSCLC riippuu preanalyyttiset vaiheita. Kehittäminen standardoituja menetelmiä havaitsemiseksi

KRAS

mutaatiot ctDNA yksilöitä suositellaan minimoida preanalyyttiset vaiheet mutaation havaitseminen hinnat. Kun nopea näytteen käsittely ei ole mahdollista käyttää cfDNA BCT putket olisivat edullisia.

Citation: Sherwood JL, Corcoran C, Brown H, Sharpe AD, Musilova M, Kohlmann A (2016) Optimaalinen Pre-analyysimenetelmät Paranna

KRAS

mutaatio Detection in Circulating kasvainten DNA (ctDNA) potilailta, joilla ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). PLoS ONE 11 (2): e0150197. doi: 10,1371 /journal.pone.0150197

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 24 joulukuu 2015; Hyväksytty: 10 helmikuu 2016; Julkaistu: 26 helmikuu 2016

Copyright: © 2016 Sherwood et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat AstraZeneca. Rahoittaja antoi tukea muodossa palkoista kaikille tekijöille, mutta ei ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu tai analysointi päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat: JLS, CC, HB, AS, MM ja AK ovat työntekijöitä ja osakkaina AstraZeneca, jonka yhtiö rahoitetaan tässä tutkimuksessa. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Tarve tarkka mutaation havaitsemiseen peräisin ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) kasvainkudoksen on vakiintunut, sekä tarvetta tunnistaa mahdolliset vaste yksilöllisiä lääkkeitä, kuten tyrosiinikinaasin estäjät (TKI); esim.

EGFR

TKI, erlotinibi, gefitinibi ja T790M suunnattu TKI osimertinib) [1]. Kuitenkin arvioitavissa kasvain kudos ei ole aina saatavilla pienisoluista keuhkosyöpää [2]. Esimerkiksi viime IRESSA seurantatoimet (IFUM) tutkimus, kasvain mutaatiostatus voinut määritettävä 19% soveltuvista potilaista [3]. Isossa-Britanniassa vain 71% keuhkosyöpäpotilaiden on histologista vahvistusta heidän sairautensa [4].

Koska huono saatavuus sopivien kudosnäytteiden, verenkierrossa kasvaimen DNA (ctDNA) on yhä tärkeämpää kuin vaihtoehtoinen toteamiseen käytännöllisiä mutaatioiden [5]. Tulee suurempaa kysyntää biomarkkereiden testaus näytteille etenkin keuhkosyövän jossa kohdennetumpia lääkkeet ovat kehitteillä [6], kuten MEK1 /2-estäjät; selumetinib [7], cobimetinib (GDC-0973, XL-518) ja trametinib sekä T790M suunnattu EGFR TKI, osimertinib (AZD9291) [8] ja rociletinib (CO-1686) [9]. Mutaatio testaus plasma tarjoaa myös invasiivisia vaihtoehto kuvaamaan metastaattista ja /tai kestävät tautimekanismien kun kudos tai uudelleen biopsia tai saatavilla.

kliininen hyöty havaitsemista TKI herkistävä

EGFR

mutaatiot ctDNA on osoittautunut hoidettaessa potilaita gefitinibin [3] NSCLC ja erlotinibin kolorektaalisyövässä (CRC) [10]. Seulonta

KRAS

mutaatiot CRC ja haimasyövän avulla ctDNA on myös tutkittu yhdessä

BRAF

melanooman näytteissä [11-14]. ctDNA on tyypillisesti hajotettu pituus 166 emäsparia, todennäköisimmin johtuen nukleolyyttiset prosessit, jotka tapahtuvat apoptoosin aikana [15,16]. On jonkin verran näyttöä ehdottaa ctDNA taas liikkeellä on puoliintumisajan välillä 16 minuuttia [17] ja noin 2 tuntia [18,19], mutta vaihtelee huomattavasti tapauksia. Tämä johtuu todennäköisesti veren välityksellä nukleaasiaktiivisuus mikä huonontaa fragmentit [20] 10 emäsparin välein [18] ja maksan myös tyhjentää fragmentteja verenkierrosta [21]. Mutaatioiden detektoimiseksi ctDNA on vaikeaa, koska pieni määrä mutantti alleeli taustalla villityypin DNA: ta. Se on läsnä hyvin pieniä määriä (alle 1%) [22] ja voivat vaihdella potilaskohtaisesti johtuu monimutkaisten biologisten prosessien kuten geenimonistuman nähdään

EGFR

[23]. Sensitive menetelmät ovat välttämättömiä antaa luotettavia tuloksia. Pre-analyyttinen muuttujia kuten ääreisverenkierron keräämistä, käsittelyä, kuljetusta ja varastointia menetelmät voivat vaikuttaa havaitseminen hinnat.

Tällä hetkellä kasvainkudoksen jää suositellun kultakantaan näytetyyppiä johtuen suhteellisen alhainen tunnistus korko ctDNA verrattuna kasvain kudos [3,24]. Havaitseminen ctDNA vaihtelee 62%: sta 65,7% herkkyys

EGFR

mutaatioita NSCLC [3,25] ja 25%: sta 41% herkkyys

KRAS

mutaatioita CRC [26,27 ].

Yksi suurimmista haasteista havaitsemiseen käytännöllisiä mutaatioiden ctDNA on epävakaus valkosolujen keräämisen jälkeen. Valkosolut hajottaa postitse veri piirtää, mikä johtaa kasvuun gDNA (genomista DNA) [28,29]. Runsastuminen normaalin sivullisten gDNA laimentaa Kasvaimen aiheuttamien ctDNA vaikeuttaa havaita käytännöllisiä mutaatioiden [30] ja vaatii, että tekniikat herkempi kuin ne, joita käytetään mutaation havaitsemiseen kudosnäytteistä käyttää. Aiemmat tutkimukset ovat tutkineet käyttö parantamismenetelmät mutta rajoitettu näytenumeroita [30-32]. Nykyiset suositukset arvioimiseksi ctDNA ovat: plasma sijasta seeruminäytteistä, käyttö EDTA tai soluttoman DNA kokoelma putket käsittely 4 tuntia, kaksinkertainen sentrifugoimalla ja enintään kolme jäädytys sulatus-jaksolla plasman yksilöiden [31].

tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia eri menetelmiä, joilla parannetaan mutaation havaitsemiseksi ctDNA tavallisesta 10 ml potilaan verta piirtää. Olemme erityisesti tutkittu käyttämällä erilaisia ​​veriputkea. Käyttämällä plasma 45 pienisoluista keuhkosyöpää yhteensopivat kasvainkudospalasta me arvioitiin myös vaikutuksia DNA tuotto ja /tai

KRAS

havaitseminen seuraavissa olosuhteissa: 1) inkubaatioaika huoneenlämpötilassa ennen plasman eristämistä; 2) yhden tai kahden sentrifugoimalla; 3) plasman panosvolyymi ja 4) eri DNA: n uuttaminen sarjat.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

eettinen toimikunta hyväksyntää ei vaadita tapauksessa tämän tietyn työn näytteet kerättiin kaupallisesti Manchester Cancer Research Centre (MCRC) Biopankkiverkosto, UK tai Asterand Bioscience Royston, Iso-Britannia, joilla on yleinen eettinen hyväksyntä: https://www.asterandbio.com/company/ethics/. Täysi kirjallinen tietoinen suostumus saatiin kaikkien näytteiden Tässä tutkimuksessa käytetyt.

MCRC Biopankkiverkosto on lisensoitu Human Tissue Authority (ajokortin numero: 30004) ja on eettisesti hyväksytty tutkimus kudospankkia jota Etelä Manchester tutkimus eettisen komitean (Ref: 07 /H1003 /161 + 5). Kokoelma standardin Potilasinformaatio Levyt ja Potilaan suostumus lomakkeet on kehitetty ja hyväksytty ja ilmoitti potilaan suostumus on aina saatava ennen potilaan näytteitä otetaan. Biopankin omistaa niin sanottu yleinen etiikka hyväksyntää.

Tämä antaa hyväksyntänsä kuka tahansa näytteitä MCRC Biopankkiverkosto, joten tutkijat eivät tarvitse hankkia omia eettisiä hyväksyntää asianomaisten hankkeiden avulla Biopankkiverkosto näytteitä: http: //www.mcrc.manchester.ac.uk/Biobank/Ethics-and-Licensing.

Kaikki menetelmät suoritettiin mukaisesti Helsingin julistuksen (1964, muutettu vuonna 1975, 1983, 1989, 1996 ja 2000 ) Maailman lääkäriliiton ja kaikki potilaiden toimitetut näytteet analysoitavaksi tehtiin niin täydellä suostumus potilaista.

kaikki kliiniset tiedot ja näytteet saatiin anonyymisti.

potilaat

kaksi kokoelmaa NSCLC näytteiden koostuu formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) kudosten ja täsmäsi plasmaa käytettiin tässä tutkimuksessa (kuvio 1). Kun arvioidaan eri plasman vakauttaminen menetelmiä, kokoelma Hyväksytty plasman ja FFPE kudoksen painotettu valkoihoinen potilailla, joilla adenokarsinooma ja tupakointi historia käytettiin (n = 20; MCRC Biopankkiverkosto yhteistyössä NHS uskoo). Hyväksytty plasma ja FFPE kudosta käytettiin vertailtaessa eri määriä plasmaa (n = 15; Asterand Bioscience, Royston, UK) ja verrataan erilaisia ​​plasman DNA: n eristämiseksi sarjat (n = 10; Asterand Bioscience).

Kaavio kokeellinen työnkulun eri näytteen ikäryhmät. Paneeli A. Vertailu Streck Cell Free (BCT) ja EDTA-putkiin lisäksi yhden ja kahden sentrifugointi DNA tuotto ja mutaation havaitsemiseen. B. vertailu eri plasman tilavuudet ja ctDNA louhinta sarjat DNA tuotto ja mutaation havaitsemiseen.

Verenkeruu, plasma eristäminen ja varastointi

Kun arvioidaan eri plasman vakauttamisen menetelmiä, 10 ml ääreisverenkierron kerättiin EDTA verenkeruukampanjoiden putkeen (Vacutainer K2EDTA) (Becton, Dickinson, Oxford, UK) ja 10 ml Cell-Free DNA ™ BCT (cfDNA BCT) (Streck, Omaha, NE) 20 potilaalla, mukaan käyttöohjeet (kääntelemällä 10 kertaa). Kukin 10 ml: n tilavuuteen sitten jaettu 2 x 5 ml: n erillä ja sitten inkuboitiin huoneen lämpötilassa joko 2 tuntia tai 72 tuntia. Plasma eristettiin sitten verinäytteen suorittamalla 2000 x g sentrifugoinnin 10 minuuttia ja poistetaan varovasti plasman. Poistettu plasmaa sentrifugoitiin sen jälkeen 2000 x g 10 minuuttia ennen supernatantin poisto plasmaa ctDNA uuttamalla. 5 20 potilaiden lisäksi 10 ml verta piirtää kerättiin EDTA- ja jakaa 2 x 5 ml tilavuutta. Veri inkuboitiin sitten huoneenlämpötilassa joko 2 tuntia tai 72 tuntia ennen yksinäinen sentrifugiin spin nopeudella 2000 x g: eristämiseksi plasmasta (kuvio 1A). Pitkäaikaisessa varastointi, kaikki plasmaa säilytettiin -80 ° C: ssa 1 ml: n jakeet ennen DNA: n uuttaminen.

Vertailun eri plasman tilavuudet ja eri DNA: n eristämiseksi sarjoja, veri kerättiin EDTA-putkiin ja sentrifugoitiin kerran 10 min ajan 1300 x g:. Plasma korjattiin 1 ml eriin ja säilytettiin -80 ° C: ssa alle 1 h verinäytteen. Alikvootit samasta potilaasta sulatettiin jäillä ja yhdistettiin potilasta kohden tuottaa 6 ml yhteensä. Yhdistettiin plasma sekoitettiin sitten perusteellisesti ja jaetaan 1, 2 ja 3 ml: volyymit plasman tilavuus vertailututkimus (n = 15), ja 3 x 2 ml: n erillä, että DNA Extraction Kit vertailututkimus (n = 10) (kuvio 1B) . Kaikki plasmanäytteet jäädytettiin sitten -80 ° C: ssa.

Kaikki kudosta kokoelmista suoritettiin samanaikaisesti vaikka ne kerättiin Asterand Bioscience tehtiin niiden rajoitusten saatavuuteen liittyvä Hyväksytty näytesarjan, siksi jotkut kokoelma parametrit olivat ole ihanteellinen for cfDNA esim kokoelma yhdellä sentrifugointivaiheessa kuten edellä.

DNA: n eristys plasmasta

Vertailun veren vakautus- ja plasman tilavuudessa QIAamp Kiertävä Nucleic Acid Kit (Qiagen, Hilden, Saksa) käytettiin. Lisäksi vertailu kolme DNA: n uutto sarjat suoritettiin yhtä suuret tilavuudet plasmaa (2 ml kumpaakin) (kuvio 1B). Seuraavat setit käytettiin: PME vapaasti kiertävä DNA Extraction Kit-protokollaa (Analytik Jena, Jena, Saksa) 2-5 ml uuttoja käyttämällä lyysausliuoksessa GS /sidonta ratkaisu VL järjestelmä ja DSP Virus /Patogeenittomia Midi Kit suoritetaan QIAsymphony (Qiagen) ja QIAamp Kiertävä Nucleic Acid Kit (QIAGEN). QIAsymphony otot suoritettiin klo Qiagen sovelluksia laboratorio (Hilden). Kaikki plasmanäytteet käsiteltiin mukaan valmistajien protokollien kanssa lukuun ottamatta PME kit, jossa ensimmäinen 20 min inkuboinnin sijasta 10 min tehtiin ja plasma sentrifugointivaiheet suoritettiin 3750 x g vs 4500 x g. Kaikki DNA eluoitiin 80 ul alueella määrittämän kit.

DNA uutetaan FFPE kudoksesta

DNA uutettiin 2 x 5 pm juuri leikattu FFPE kudosleikkeiden mukaan valmistajan protokollan avulla QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen) ja eluoitiin 100 ul: aan puskuria.

DNA: n kvantifiointiin

Kaikki eluoitunut DNA sekoitettiin perusteellisesti (vorteksoitiin) ennen mittausta kvantitatiivisen PCR (qPCR ), joka suoritettiin käyttäen ABI TaqMan® RNaasi P Detection Reagents Kit ja TaqMan® Universal PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) on Quantstudio Dx väline (Life Technologies, CA USA). Reaktiot valmistettiin käyttäen 10 ui Master Mix, 1 ui Assay Mix, 5 ui DNA: ta ja 4 ui nukleaasia vapaan veden (Qiagen, Hilden, Saksa). Sykliolosuhteet olivat 95 ° C: ssa 10 minuuttia, sitten 94 ° C: ssa 15 sekunnin ajan ja 60 ° C: ssa 1 minuutin kierrätetään 40x. Sarja 10 sarjalaimennoksia ihmisen genomista DNA: ta (Roche Diagnostics, Mannheim, Saksa) 100 ng /ul ja 0,195 ng /ul käytettiin kahtena tuottaa standardikäyrän. Amplikoni koko RNaasi P määritys oli 87 emäsparia, joka on sopiva käytettäväksi ctDNA.

KRAS

testaus

KRAS

mutaatiostatus on tunnettu siitä, mistä FFPE kudoksesta peräisin olevan DNA: lla käyttäen

therascreen KRAS

RGQ PCR -kittiä (Qiagen) mukaan valmistajan protokollaa. Therascreen kit työllistää vahvistus tulenkestävä mutaatio järjestelmä (ARMS) PCR-tekniikan yhdistettynä Scorpions Detection Technology [33]. Mutaatio asema Tietyn näytteet muodostetaan vertaamalla tietyn

KRAS

mutaatiokokeessa vastaan ​​ohjaus määritystä

KRAS

eksoni 4 tuottaa muutoksen Cycle Threshold (ACt). ACt on saatu vähentämällä kontrolli CT mutaatiosta määritys CT. ACt sitten verrataan validoitu katkaista kriteerit ACt luomiseksi mutaatio aseman.

KRAS

mutaation havaitseminen suoritettiin samalla tavalla ctDNA näytteitä potilaista, joilla oli

KRAS

mutaatiot havaitaan matching FFPE kudokseen johdettu DNA: ta. Näytteet käsitellään eri ennalta analyysimenetelmiä testattiin samalla RotorGeneQ (RGQ) aikavälillä. Plasman näytteitä arvioitiin vain tunnettujen

KRAS

mutaatio saatuna sovitetussa kudoksessa.

Tilastollinen

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen pariksi Studentin

t

-testi Microsoft Excel jossa p 0,05 katsottiin merkittäväksi. Lineaarinen regressio analyysiä ja R

2 suoritettiin GraphPad Prism (versio 6.01) ja p-arvot lasketaan poikkeama nollasta. Käyrät syntyi GraphPad Prism.

Tulokset

kvantifiointi DNA seuraavissa eri plasma käsittely vaiheet

Kun haluat selvittää, menetelmiä plasman käsittely voi vaikuttaa tasot kontaminoivien gDNA läsnä keräsimme veren 20 pienisoluista keuhkosyöpää ja käsitelty plasma eri olosuhteissa (kuvio 1A ja kuvio 2). EDTA keräysputkiloita ja pidemmän inkubointiaika oli merkitsevästi (p 0,01) liittyy lisääntynyt DNA tuotto, keskiarvo ± SD: EDTA putki /2 tunnin inkuboinnin (2,49 ± 1,60 ng /ul) versus EDTA putki /72 tunnin inkuboinnin (15.12 ± 16.44 ng /ul) (kuvio 2A). Pieni mutta merkitsevä (p 0,01) kasvaa DNA saannon havaittiin myös solutonta DNA veriputkea (cfDNA BCT) 72 tunnin (3,31 ± 1,82 ng /ul) verrataan cfDNA BCT /2 h (2,39 ± 1,42 ng /ul) (kuvio 2B). Ei ollut merkitsevää eroa yhteensä DNA saannot havaittu, kun plasmaa käsiteltyinä 2 h käyttäen joko sisärenkaallisten (kuvio 2C). DNA saanto plasmasta jälkeen käsitellyt 72 tunnin käyttäen cfDNA BCT putkia oli merkitsevästi (p 0,01) alempi kuin plasman käsitellään käyttämällä EDTA-putkiin (kuvio 2D). ”

Kokoveri kerättiin 20 pienisoluista keuhkosyöpää ja käsitellään käyttäen eri putkityyppeihin, inkubointiajat ja sentrifugointivaiheissa. Osaa näistä potilaista (n = 5) oli kokoverta käsitellään arvioida yhden vs. kaksinkertainen sentrifugointivaiheessa. DNA mitattiin käyttäen ABI TaqMan® RNaasi P Detection Reagent Kit: blood kerättiin EDTA verinäytteen putki (EDTA) ja käsitellään sen jälkeen 2 h tai 72 h. B: verta kerättiin solu- vapaan DNA verinäytteen putki (cfDNA BCT) ja käsitellään sen jälkeen 2 h tai 72 h. C: veri kerättiin EDTA tai cfDNA BCT putket ja käsitellä sen jälkeen 2 tuntia. D: Veri kerättiin EDTA tai cfDNA BCT putket ja käsitellä sen jälkeen 72 tunnin ajan. E: Veri kerätään EDTA-putkiin sen jälkeen 2 tunnin inkuboinnin ja käsitellään käyttäen joko yhden tai kahden sentrifugoimalla. F: veri kerätään EDTA-putkiin sen jälkeen 72 tunnin inkuboinnin ja käsitellään käyttäen joko yhden tai kahden sentrifugoimalla. Tulokset näkyvät kullekin potilaalle. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen pariksi Studentin t-testi, jossa; ** P 0,01.

Osaa näistä potilaiden näytteistä (n = 5) oli edelleen arvioitiin vaikutuksen yhden tai kahden hengen sentrifugointivaihe DNA tuotokset (kuvio 2E ja 2F). Kun käsiteltyinä 2 h, sentrifugoimalla plasmanäytteet kahdesti ei ollut merkittävää vaikutusta DNA tuotto verrattuna yhdellä pyöräytyksellä (kuvio 2E). Kuitenkin, kun käsitellään jälkeen 72 tunnin, kaksinkertainen sentrifugointivaihe alensivat tarkoittaa DNA tuotto (19,35 ± 24,3 ng /ul) verrattuna yhteen sentrifugointi käsittelyyn (35,47 ± 32,1 ng /ul). Väheneminen saannon todettiin 4 ulos 5 tutkitusta näytteestä (kuvio 2F) kuitenkaan tämä ei ollut tilastollisesti merkitsevä (p = 0,058). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että taso DNA tuotosten voi vaihdella riippuen menetelmästä, jolla plasma käsitellään ei-optimaalisia menetelmiä.

KRAS

mutaation havaitseminen seuraavissa eri plasma käsittelyvaiheita

soveltaminen eri plasma käsittelymenetelmiä tutkittiin myös varten

KRAS

mutaation havaitsemiseksi 20 potilasnäytteistä (kuvio 1A). Ennen suorittamista

KRAS

mutaation havaitsemisen millä tahansa plasmasta peräisin DNA: sta, vastaava sovitettu FFPE kudos seulottiin käyttämällä

therascreen KRAS

RGQ PCR -kittiä tunnistamiseksi potilailla, joilla on mutaatio kasvaimia (n = 10 /20; tuloksia ei ole esitetty). Tässä kohortissa, 50% (n = 5) oli

KRAS

mutaatioita tunnistettiin sovitetussa plasman käsitellä cfDNA BCT keräysputkiloita sisällä 2 h ja 40% (n = 4) 72 tuntia. Kuitenkin tämä tunnistus laski verrattuna harkitun ei-optimaalista menetelmää, esim. EDTA keräysputkia jälkeen 2h, 40% (n = 4) mutaatioita havaittiin pudottamalla 20% (n = 2) sen jälkeen, kun 72 tuntia (taulukko 1) samoissa näytteissä. Yksilöllinen (CT) arvoista, yhteensä monistettavissa KRAS DNA (KRAS kontrolli) ja ACt arvot kaikille 10 plasmanäytteet näkyvät S1 taulukossa. On syytä huomata, että

KRAS

mutaatiostatus määritettiin käyttäen Qiagen therascreen

KRAS

RGQ PCR käsikirja, ACt katkaisi arvot vaihtelevat 6,6-8 varten mutaatioiden havaittu. Koska näytteiden vähäisen määrän kanssa

KRAS

mutaatioita, jotka olivat havaittavissa ctDNA, ei ole mahdollista liittää tilastollista merkittävyyttä.

Yhteensä monistettavissa

KRAS

DNA (

KRAS

ohjaus) tunnistus kaikissa näytteissä osoitti samanlaista suuntausta kuin havaittiin DNA tuotto (qPCR) kuvassa 2 (S1 taulukko). Väheneminen CT arvon osoitettiin ei-optimaaliset menetelmät osoittaa suurempaa kontaminoivan DNA pitoisuus; keskiarvo CT ± SD: EDTA putki /2h inkubaation (29,0 ± 1,0), EDTA putki /72 tuntia inkubaation (25,5 ± 1,5), cfDNA BCT /2h inkubaation (29,4 ± 1,1), ja cfDNA BCT /72 tunnin inkuboinnin (28,5 ± 1,0) , vastaavasti (S1 taulukko). Nämä tulokset osoittavat, että sekä

KRAS

mutaation havaitseminen ja myös koko monistettavan

KRAS

DNA voidaan vaikuttaa menetelmästä riippuen plasman prosessoinnista.

kvantifiointi DNA seuraavissa eri plasma input

Kuten odotettua, merkittävä kasvu DNA saannon havaittiin yhä näytteen tilavuus (p 0,01) 15 potilaalla (kuvio 3). Lisääntyminen tuotto kasvaa pitoisuuden ja ehdoton kopio numerot ctDNA analysoitaviksi jolloin mutaation havaitsemiseen todennäköisempää. Keskimääräinen DNA saanto 3 ml plasmasta oli 4,39 ± 4,55 ng /ul verrattuna 3,03 ± 3,24 ng /ul (2 ml plasmaa) ja 1,79 ± 1,81 ng /ul (1 ml plasmaa). Näistä 15 potilaasta 7 oli

KRAS

mutaatioiden vastaava Hyväksytty kudoksessa Tässä kohortissa, yksi potilas (numero 23) oli havaittavissa

KRAS

mutaatio plasmassa kaikkien kolmen volyymit loput potilaan näytteitä ottaa ACt arvot ulkopuolelta katkaisi kriteerit testin (S2 taulukko). Tämä saattaa johtua tämän nimenomaisen kokoelman sovitetun plasmanäytteistä vedetään tavallisia EDTA-putkiin, joissa vain yhdellä pyöräytyksellä heijastaa tavanomaista detektioprosentti joka syntyy ei-optimaalisia menetelmiä [34]. Lisäksi nämä erityiset näytteet pääasiassa peräisin vaiheen I tai II NSCLC (13/20), jotka voivat sisältää alempia ctDNA kasvain [35]. Mielenkiintoista,

KRAS

vahvistuksenohjaussignaalin osoitti samanlaista suuntausta DNA tuotto (qPCR) kuvassa 2. Laske tarkoittaa CT-arvot

KRAS

ohjaus havaittiin kohonnut plasman tilavuus. Alempi CT-arvot osoittivat merkittävää kasvua (p 0,001)

KRAS

ohjaus tunnistus (keskiarvo CT ± SD) 3 ml plasmaa (26,5 ± 1,7) verrattuna 2 ml plasmaa (27,1 ± 1,8) ja 1 ml plasmaa (28,1 ± 1,7) näytteitä (S2 taulukko). Nämä tiedot osoittavat, että vaihteleva panos plasman tilavuus voi vaikuttaa DNA: n saanto ja koko monistettavan

KRAS

. Sillä

KRAS

mutaation havaitsemiseen, kuitenkin suurempi kohortin havaittavissa mutantti näytteitä tarvitaan tarkempaa analysointia varten.

Kolme tilavuutta plasmaa (1 ml, 2 ml ja 3 ml), käsiteltiin kustakin näyte kohortin 15 NSCLC potilaiden. DNA uutettiin käyttämällä QIAamp CNA Kit ja mitattiin qPCR käyttäen ABI TaqMan® RNaasi P Detection Reagent Kit. Tulokset näkyvät kullekin potilaalle. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen pariksi Studentin t-testi, jossa; ** P 0,01.

Vaikka mitään johtopäätöstä ei voida tehdä yhdestä näytteestä, kaikki näytteet lisääntyneet DNA saannon odotetusti. Lisääntynyt määrä

KRAS

monistettavan DNA kopiota saadaan uuttamalla enemmän plasmaa, voisi vaikuttaa detektioprosentti näistä näytteistä jos herkempiä menetelmiä, esim. digitaalinen PCR käytettiin.

DNA Extraction Kit vertailu

Yhtä suuret tilavuudet (2 ml) plasmassa 10 potilasta alistettiin DNA: n uuttaminen käyttämällä kolmea eri menetelmää. Kaikki kolme menetelmää osoitti onnistuneen DNA: n eristäminen (kuvio 4), jossa Qiagenin QIAamp Kiertävä Nucleic Acid Kit saadaan korkein DNA tuotto eli keskiarvo ± SD (3,03 ± 2.19ng /ul) verrattuna Analyyttinen Jena PME vapaasti kiertävä DNA Extraction Kit-protokollaa ( 0,83 ± 0.88ng /ui; p 0,001) ja verrattuna Qiagen DSP Virus /Patogeenittomia Midi Kit suoritetaan QIAsymphony (0,53 ± 0.53ng /ul; p 0,01). Manuaalinen Pakit ovat helppokäyttöisiä ja sopivat pk eräkokoihin taas QIAsymphony vaatii erityistä koulutusta, mutta sopii paremmin suurikapasiteettisten ja jatkuvaan käsittelyyn.

Yhtäläiset tilavuudet plasmaa (2 ml) 10 pienisoluista keuhkosyöpää käsiteltiin käyttäen kolmea erilaista DNA uuttamismenetelmiä: QIAamp Kiertävä Nucleic Acid Kit (Qiagen CNA Kit); PME vapaa-kiertävä DNA Extraction Kit (Analytik Jena) ja DSP Virus /Patogeenittomia Midi Kit suoritetaan QIAsymphony (QIAsymphony). DNA mitattiin qPCR käyttäen ABI TaqMan® RNaasi P Detection Reagent Kit. Tulokset näkyvät kullekin potilaalle. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen pariksi Studentin t-testi, jossa; ** P 0,01, *** p 0,001.

Keskustelu

Yksilöllinen hoito syövän perustuu usein testaus DNA mutaatioita käyttäen kumppani diagnostinen määritys tunnistaa potilaat, jotka tulevat todennäköisemmin vastata kohdennettuja hoitoja. Tällä hetkellä yleisimmin käytetty näytteen havaitsemiseen käytännöllisiä DNA-mutaation muutoksia on kasvainkudoksen, tyypillisesti FFPE kudosta. Kuitenkin kudosnäyte ei ole aina saatavilla [3] joko ehtymisen vuoksi diagnostisen lohkon muita molekyyli- patologian tutkimuksiin tai koska potilas ei ole koskaan koepala muista kliinisistä syistä. Missä kudosta saatavuus on kysymys huolellinen valinta erittäin rinnakkaisia ​​diagnostisten alustoilla kuten Next Generation Sequencing (NGS) tai Matrix laserdesorptio /Ionisation Time of Flight (MALDI-TOF), voivat viivästyttää ehtyminen lohkon [36].

Liquid koepaloja (esim plasma) tarjota vaihtoehto, ajallista ja vähemmän invasiivisia vaihtoehto tarkka mutaatio testaus. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että mutaatio testaus ctDNA on suuri spesifisyys ( 95%), mutta herkkyys on alhaisempi (60%) verrattuna kudokseen [3,37]. Useimmat dokumentoitua näyttöä NSCLC tasalla koskee

EGFR

testaus. Jotkut tutkimukset ovat tutkineet

KRAS

mutaatiot ctDNA peräsuolen syöpäpotilailla [12,26,34].

Technologies ja menetelmiä, joilla voidaan parantaa eristämisen ctDNA ja vähentää villityypin DNA saastuminen ovat syntymässä [31]: välttäminen hepariini putket [38], käyttö plasman sijasta seerumi [39] ja välttäminen jäätymisen näytteiden [28]. Näitä ovat askel muutoksia plasman käsittelyyn esimerkiksi sentrifugointivaiheissa (nopeus ja määrä pyörii) [40] ja kehittyneempiä parannuksia, kuten erikoistunut keräysputkien eli solu vapaa DNA veriputkea että vakauttaa valkosoluja veressä [30, 32]. Vaikka mahdollinen kliininen hyöty

KRAS

mutaation havaitseminen plasmasta on myös tutkittu [41] NSCLC, vaikutus näiden käsittelyn muutostöitä

KRAS

mutaation havaitseminen NSCLC ei ole vielä erikseen tutkittu.

tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tunnistaa optimaaliset preanalyyttiset käsittely toimenpiteisiin saadakseen ctDNA plasmasta keuhkosyöpään potilailla. Tässä tutkimuksessa mitattiin vaikutukset nämä vaiheet DNA tuotosten ja

KRAS

mutaation havaitseminen hinnat.

kvantitatiivinen PCR (qPCR) oli ajatellut olevan sopivin DNA kvantitointimenetelmä koska se luonnehtii monistettavissa DNA-molekyylit vain [28]. Käytetty menetelmä palveluksessa 87 emäsparin amplikoni, joka monistaa ctDNA jota tyypillisesti hajoaa 166 emäsparia (40). Huomattakoon kuitenkin, että käyttämällä muita menetelmiä on sopiva, kun käytetään osana aiemmin validoitu menetelmä.

Kiertävä DNA olemassa luonnossa, mutta on usein koholla syöpäpotilailla [19]. Määrä ctDNA näytteessä vaihtelee riippuen taudin asetus ja vaiheessa [35]. Havaitseminen mutaatiot ctDNA nojaa vahvasti vakautta näytteen. On ollut syntyy vaihtoehtoisia veriputkea että vakauttaa verisoluja, esim. CellSave Säilöntäaine Putket (Cell haku, South Ritan, NJ, USA) ja cfDNA BCT (Streck). Tässä tutkimuksessa keskityttiin arviointiin cfDNA BCT putkia, koska nämä olivat ainoat kaupallisesti saatavilla oleva tuote on erityisesti suunniteltu vakauttamaan verta ctDNA arviointia. Vakauttava ratkaisu sisältämät cfDNA BCT putkissa ei vaikuta alavirran molekyylitason analyysi PCR [42] kuten myös tässä tutkimuksessa havaitut. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että cfDNA BCT putket säilyttää veren mahdollistaa havaitsemisen kiertävän vapaan DNA käyttää plasmaa terveiltä luovuttajilta [30,32] tai plasmaa, johon oli lisätty syöpäsoluja [43]. Kuitenkin parhaan tietomme ei ole olemassa tutkimuksia, jotka ovat käyttäneet näitä putkia arvioida DNA saannon ja spesifisiä mutaatioita plasmassa pienisoluista keuhkosyöpää.

Me täällä osoittaneet, että kun käytetään eri käsittelymenetelmät, kuten 72 h inkuboinnin ennen käsittelyä, cfDNA BCT putket olivat parempia vakauttamiseksi veren verrattuna EDTA keräysputkiloita näkemää väheneminen DNA tuotokset. Sellaisenaan, kun jalostetaan välittömästi ( 2 h), plasman ei ole mahdollista, cfDNA BCT putket tarjoavat erinomaisen vaihtoehdon perinteiselle EDTA keräysputkia. Tämä on erityisen tärkeää kliinisessä ympäristössä, jossa veri kerätään, mutta ei pysty käsitellä välittömästi.

On raportoitu, että ensimmäinen sentrifugoimalla hitaasti ( 1600 x g 10 minuutin ajan) ja sen jälkeen toisella sentrifugoinnilla, suurella nopeudella ( 16000 xg 10 min) on tarpeen eristää soluttoman plasma [40,44] katsottuna väheneminen DNA saannon. Tärkeää on, kliiniset laboratoriot eivät aina ole kykyä suorittaa nopeammin toisella sentrifugoinnilla. Tutkimuksemme vahvisti, että gDNA saastuminen oli alhaisempi plasmasta eristetty kaksinkertainen sentrifugointi verrattuna yhden sentrifugointi tukeva edellinen havaintoja. Näissä olosuhteissa on suositeltavaa, että toisella sentrifugoinnilla alhaisemmassa nopeudessa on tehokkaampi poistamaan solut kuin yhden sentrifugointi [45]. Lisäksi lisäämällä plasman tilavuutta, lisäsi DNA: n saanto ja lasketaan

KRAS

valvonnan odotetaan [45].

On olemassa useita DNA: n uutto vaihtoehtoja, jotka voidaan käyttää ctDNA analyysi plasma tai seerumi (S3 taulukko). Päätimme vertailla kolme menetelmää, kaikki suunniteltu erityisesti uuttamalla kiertävän DNA, joka mahdollisti käytön 2 ml tulo plasmaa. Valitsimme yksi automatisoitu menetelmä (QIAsymphony), yksi yleisesti käytetty menetelmä (QIAamp CNA kit) ja yksi vähemmän dokumentoituja menetelmä (Analytik Jena). Vaikka havaitsimme, että menetelmät tuottanut riittävästi DNA alavirtaan sovellus mutta saannot erosivat merkittävästi eri määrityksiä. Eri saannot mitattuna qPCR saattanut aiheuttaa fragmentit eristettiin erilaisia ​​kokojakauma takia kokoeksluusiokromatografian nukleiinihappojen tietyn kit. Johtuen vaihtelu suorituskyvyn kaupallisten sarjat, validoitu menetelmä tulisi käyttää analysoitaessa kliinisistä näytteistä. Siksi huolellinen olisi harkittava valittaessa optimaalista ctDNA uuttomenetelmä.

Vaikka siis erikseen jotkut optimointi vaiheita oli vähäinen vaikutus tässä tutkimuksessa, kertyminen useita muutoksia lopulta johtaa parempiin mutaation havaitseminen hinnat in ctDNA. Erityisesti sisällyttäminen cfDNA BCT putket oli osoitettu parantavan vakauttamiseen ääreisverenkierron verrattuna EDTA-putkiin sen jälkeen 72 tunnin inkuboinnin.