Krooninen sairaus

tiivistelmä

Integrated genomi ja transcriptomic tason muutokset sisältyy lupaava parempaa ymmärtämistä peräsuolen syöpä (CRC) biologia. On olennainen tarvetta selittää toiminnallinen vaikutus genomin tasoeroja integroimalla tietoja transkriptio tasolla. Käyttämällä korkean resoluution sytogenetiikka array, meillä oli aikaisemmin tunnistettu kuljettajan geenejä ”Perimän merkityksellisten tavoitteiden Cancer (synergisillä)” analyysi pariksi kasvaimeen normaalia näytettä peräsuolen syöpäpotilailla. Tässä tutkimuksessa analysoimme näitä ajaja geenit kolmella tasolla käyttäen eksonin array data – geeni, eksoni ja verkko. Gene tason analyysi paljasti pieni joukko kokea ero ilmaisua. Nämä tulokset vahvistettiin suorittamalla erillinen differentiaalikaavojen analyysejä (SAM ja Limma). ATP8B1 havaittiin olevan uuden liittyvän geenin CRC, joka osoittaa muutokset sytogeneettisen, geenin ja eksonin tasolla. Splice indeksi 29 eksonien vastaavat 13 geenien havaittiin olevan merkittävästi muuttunut Tuumorinäytteissä. Kuljettajan geenejä käytettiin rakentaa säätelyverkkojen kasvainten ja normaaliryhmää. Oli uudelleenjärjestelyihin transkriptiotekijän geenien, jotka viittaavat sääntelyn kytkentä. Sääntely malli AHR-geenin havaittiin olevan merkittävin muutos. Tuloksemme integroida tietoja keskittyen kuljettajan geenejä johtaen korkeasti rikastettua uusia molekyylejä, jotka tarvitsevat lisätutkimuksia perustaa niiden merkitys CRC.

Citation: Aziz MA, Periyasamy S, Al Yousef Z, AlAbdulkarim I, Al Otaibi M , Alfahed A, et al. (2014) Integrated eksoni taso Expression analysointi Kuljettajan Genes selkoa omasta roolistaan ​​peräsuolen syövän. PLoS ONE 9 (10): e110134. doi: 10,1371 /journal.pone.0110134

Editor: Osman El-Maarri, University of Bonn, Institut kokeellisen hematologian ja verensiirtoja, Saksa

vastaanotettu: 20 helmikuu 2014; Hyväksytty: 16 syyskuu 2014; Julkaistu: 21 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Aziz et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat kuningas Abdullah International Medical Research Center tutkimuksen apurahan RC10 /083 myönnetty MAA. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

on runsaasti tietoa omiikka tasolla, assosioi sytogenetiikka ja geeniekspression muutokset johtavat peräsuolen syöpä (CRC). Integrointi geenien ilmentymisen ja kopioluku (CN) tiedot tunnistamiseksi DNA CN muutoksia, jotka aiheuttavat muutoksia ekspressiotasot liittyvän geenien on yhteinen tehtävä syövän tutkimuksiin [1] – [3]. Keskeinen oppi molekyylibiologia on siis käsiteltävä kahta tärkeää tasolla. On ollut monia raportteja osoittava muutoksia genomin tasolla muodossa kopioluvun poikkeamia [4], yhden emäksen monimuotoisuus, Heterotsygotian menetys, jotka yrittävät ymmärtää molekyylitasolla liittyviä tapahtumia peräsuolen syöpään. Nämä somaattiset tai perinnöllinen muutokset ovat eri mekanismi edistää aloittamista ja etenemistä CRC. Menetys ja voitto ratkaisevan kromosomialueita johtaa poistamista tai vahvistusta syöpään liittyvien geenien on hyvin vakiintunut. Toiminnallinen merkitys näissä molekyyli tapahtumia on mitattu käyttämällä erilaisia ​​työkaluja ja algoritmeja. Geenit kohteena somaattiset kopioluvun muutokset (SCNAs), erityisesti, pelata keskeinen rooli onkogeneesiin ja syövän hoidossa [5]. Useita välineitä on käytettävissä voidaan arvioida geenien saada vaikuttaa SCNAs aiheuttamisessa peräsuolen syöpä. ”Perimän merkityksellisten Targets in Cancer” (synergisillä) työkalu on onnistuneesti käytetty tunnistamisessa ”kuljettajan SCNAs” perustuu taajuus ja amplitudi havaittujen tapahtumien [6], [7]. Toisen aspektin tapahtuviin muutoksiin kasvainsoluissa on transkription tasolla. Differentiaalikaavojen analyysi on tehty selvittää tärkeitä geenejä pelaa rooli aiheuttaa peräsuolen syöpä. Tähän voi olla useita mekanismeja, joilla SCNA vaikuttaa geenien vaikutus perustuu niiden vaikutusta toiminnallisella tasolla. Monistukset ja deleetioita genomin alueella heijastuvat transkriptipitoisuuksissa ja voitiin havaita suorittamalla ilmaisu microarray perustuva tutkimuksiin. Käyttämällä eksonin paneelit, saamme uuden ulottuvuuden tapahtumista tapahtuu eksonin tasolle, mikä voi johtaa vaihtoehtoisen silmukoinnin seurauksena eri geenistä isoformeja. Vaihtoehtoinen silmukointi on ratkaiseva askel sukupolven proteiinin monimuotoisuutta ja sen misregulation havaitaan monissa ihmisen syövän tyypit [8].

pyrkimys tutkia suhdetta kopiomäärä muutoksia ja ilmentymistason vaikuttaa geenien /eksonit on saanut vähän menestystä johtuen useista syistä [9]. Teknisiä parannuksia array suunnittelu sytogenetiikaltaan sekä transkriptomiikka ovat parantaneet tarkkuuden ja tuottamat tiedot. Yhdistämällä tämä parempia analyysimenetelmiä ja algoritmeja, mahdollisuuksia saada kohdegeenien vastuussa aiheuttaa peräsuolen syöpä on edelleen lisääntynyt.

viime vuosikymmenen aikana pyrkimys löytää uusia geenejä, jotka voivat toimia terapeuttisina kohteina tai biomarkkereita. Kuitenkin geenejä tai proteiineja, eivät toimi yksin, mutta ovat vuorovaikutuksessa toistensa kanssa muodostaen verkkoja tai reittejä niin suorittamaan biologisiin toimintoihin [10]. Verkko-lähestymistavat löytää biomarkkerit tiiviimmin edustavat

in vivo

molekyylibiologian jossa häiriön yhdessä geenissä voivat vaikuttaa monet loppupään geenejä. Syöpä on näin ollen aivan oikein puututtu systeemibiologiaan tauti [11] vastakohtana aiheuttamia sairauksia muutoksia muutaman geenejä tai mutaatioita. Uudelleenrakentava geeni säätelyverkkojen terveillä ja sairaiden kudosten on siis kriittinen ymmärtäminen syövän fenotyypit ja suunnitella tehokkaita hoitomuotoja [12].

saatavuus työkaluja ja tekniikoita kaapata molekyylitason muutoksia tapahtuu eri vaiheissa keskeinen dogmi lisääntynyt tarkkuus ja täsmällisyys, olemme vielä kehittää yhdennetty kattava kuva, joka voisi auttaa meitä löytämään parempia tavoitteita peräsuolen syöpä. Tässä tutkimuksessa, pyrimme integroimaan tiedot sytogeneenisuustutkimuksiin kanssa eksonin ilmentymistä dataa pariksi normaali-kasvain näytteet peräsuolen syöpäpotilailla. Joukko kuljettajan geenejä ehdottamia synergisillä analyysi (kutsutaan nimellä ”kuljettajan geenejä” tästä eteenpäin) tiedusteltiin at geeni, eksoni ja verkon tasolla. Sekä DNA että RNA sytogenetiikkaan ja transcriptomic tutkimuksia vastaavasti poimittiin samasta kudoksesta yhden työnkulun vaihtelun vähentämiseksi. Tämä tutkimus antaa näyttöä selitettäessä erilaisia ​​mahdollisia mekanismeja, joilla SCNA vaikuttaa kuljettajan geenejä voidaan käyttää toiminnallista vaikutusta. Käytettäessä ajurin geenien havaittiin olevan geeni tasolle muutoksia ilmaisua. Useimmat näistä geeneistä on myös merkitty eksonin tasoeroja jolloin muodostuu eri isoformeja. Verkoston synergisillä geenien osoitti selvästi muutos transkriptiotekijät (TF) sääntelyä. ATP8B1 geeni havaittiin uusia yhdessä peräsuolen syövän sytogeneettisen, geeni ja eksoni tasolla.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkimus on hyväksynyt eettinen komitea ja Institutional Review Board (IRB) ja kuningas Abdullah International Medical Research Centerin jälkeen johtuu arviointiprosessin eettisistä näkökohtiin. Tarvittavat menettelytavat ja eettiset suostumuslomakkeet allekirjoitti kunkin potilaan ennen näytteenottoa.

Näytteiden keräys ja RNA

Näytteiden kerääminen suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [13]. Tyyppi ja vaihe kaikkien potilaiden näytteistä esitetään taulukossa S1. Tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board jälkeen asianmukaista menettelyä. Potilaat suostunut ja kirjanpidon ylläpidetään hyväksytyllä tavalla. RNA uutettiin samasta pala kudosta, jota käytetään erottamaan DNA sytogeneettinen tutkimuksia yhdessä työnkulun. Maceherey Nagel trio prep kit (Saksa) käytettiin purkaa DNA ja RNA samassa protokollaa. Laatu ja määrä tarkastettiin käyttämällä Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, USA).

eksoni mikrosirujen

GeneChip- Human eksoni 1.0 ST Arrays yhdessä WT Terminal merkinnöistä ja säätimet Kit ja hybridisaatio, pesu, ja Stain Kit saatiin Affymetrix USA. Ambion WT Expression Kit saatiin Ambion, USA. 31 Kasvaimen ja 29 normaalia näytettä 32 potilasta käsitellään. Aineisto uutettiin käyttäen Expression Console ohjelmistoa Affymetrix, USA. Laadunvalvonta suoritettiin käyttäen Principal Component Analysis (PCA) ja Integromics biologisten merkkiaineiden Suite (TIBCO Spotfire). Kaikki tiedot on talletettu GEO tietokantaan annetaan viitenumero GSE50421.

Data Analysis

Ennen mitään geeniä /eksoni tason analyysi, pääkomponenttianalyysi (PCA) tehtiin esiin poikkeavia. Tiedot 4 normaalista näytteitä ja 7 Tuumorinäytteissä myöhemmin poistaa.

Tietojen analysointi nimenomaan kuljettajan geenejä

Gene tason analyysi.

tarkkailun ekspressiotasot 144 kuljettaja geenin lista tuottamat synergisillä analyysi (13), käytimme kahta eri ohjelmistot – Expression konsoli ja AltAnalyze [14]. Kaksi eri ohjelmistoja käytettiin vahvistamaan tuloksemme käyttää riippumattomia menetelmiä. Signaalin arviot olivat peräisin CEL tiedostoja 60 näytettä (29 normaali ja 31 kasvaimen) käyttäen Vankka Multi-Array Average (RMA) normalisoida datan. Ydin eksoni-tason koetinsarjojen käytettiin yhteenvedon geeniekspressiotasot.

Sama lista 144 kuljettajan geenien ilmentymistä arvot lasketaan käyttäen ”Altanalyze ’käytettiin päättely perustuu (GENIE3) reittiin /verkostoanalyysiä.

eksoni ilmentymisen analyysi.

Altanalyze ohjelmaa käytettiin arvioimaan vaihtoehtoisen silmukoinnin kuljettajan geenejä. Raakadata suodatettiin poistamaan koetin asetetaan, jotka katsottiin olevan ei-ilmaistu. Silmukointioperaation pisteet suodatetun eksonia laskettiin liitos indeksin menetelmällä ja eksoni /introni /liitos merkintä oli määrätty näitä tuloksia. Silmukointi indeksin p-arvo cut-off 0,05 käytettiin suodattaa vaihtoehtoinen eksoni tuloksia. AltExonViewer – komponentti Altanalyze ja DomainGraph – Cytoscape plugin käytettiin havainnollistamaan liitos indeksin arvoja ja vaihtoehtoisesti saumattu eksonit. Silmukoinnin-indeksi (SI) laskettiin, kuten on kuvattu [15]. Lyhyesti, SI on log

2 suhde normalisoitu intensiteettejä kasvain ja normaali näytteitä. Meidän analyysi ”näyte 1 ’osoittajassa oli normaali ja” näyte 2 ”nimittäjään oli kasvain.

Syy verkostoanalyysiä.

verkkoanalyysissa, tietoon ja päättelyyn perustuvia lähestymistapoja käytettiin . Sillä päättely lähestymistavat, GENIE3 [16], [17] käytettiin synnyttämään geeniregulatiivista verkkojen tuumorin ja normaalin näytteitä. Voit luoda verkko, kuljettajan geenejä luokiteltiin TF geenit ja kohdegeenien. Vaikka 1000 yhteisvaikutuksia päätellä kunkin ryhmän vuorovaikutuksen pisteet 0,1 valittiin cut-off-arvo. Näiden tietojen perusteella säätelyverkkoja olivat itsenäisesti päätellä kasvainten ja normaali näytteitä Cytoscape.

Tietojen analysointi kanssa koko probeset

Integromics biomarkkereiden Discovery Suite.

Jotta löydetään differentiaalisesti ilmaistuna geenejä meidän aineisto, ilman aiempaa ennakkoluuloja, tiedot CEL tiedostoja analysoitiin käyttämällä Integromics ohjelmistoa (TIBCO Spotfire, USA) valmisteilla Affymetrix eksonissa 1,0 ST taulukot. Rikvantiilin normalisointi tehtiin poistamisen jälkeen vieraat havainnot käyttämällä PCA. Molemmat merkitys analyysi mikrosirujen (SAM) ja Linear Models for microarray data (Limma) analyysit suoritettiin cut-off 0,01 Soviteltua p-arvon ja kertainen muutos 1 tai -1. Kaksi erilaista mutta ne täydentävät menetelmiä käytettiin tekemään tuloksemme varmempia. Gene ontologia rikastaminen toteutettiin lista 760 differentiaalisesti ilmentyvien geenien saatujen Limma analyysiin.

Ingenuity koulutusjakson Analysis.

Luettelo 760 geenien SAM /Limma analyysi tehdään käyttämällä Integromics käytettiin suorita ”ydin” ja ”biomarkkereiden” analyysit. Core-analyysi suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [13]. Sillä biomarkkereiden analyysi seuraavia suodattimia käytettiin: Tarkastellaan ainoastaan ​​molekyylejä, joissa (laji = Human) JA (kudokset /solulinjoissa = KM-12 OR HCT-116 OR RKO TAI koolonsyöpäsolulinjaa ei ole mainittu tai Colo205 TAI HT29 TAI HCC-2998 OR HCT-15 OR SW-480 tai muu koolonsyöpäsolulinjaa tai kudosten ja ensiöparit ei ole mainittu OR SW-620) ja (taudit = Cancer) jA ((biomarkkereiden sovellukset = Kaikki biomarkkereiden Applications) jA (biomarkkereiden taudit = paksusuolensyöpä OR paksusuolisyöpä TAI paksusuolen kasvain tai suolen kasvainten tai peräsuolen syöpä tai peräsuolen syöpä)).

tulokset

analyysi johtavan strategian seuraavat tulokset on esitetty kuvassa 1a b.

A) koko analyysit on luokiteltu nelosta vaiheissa ”Data Generation” muotoon ”Network analyysit”. B) analyysi strategia käytetään eri ohjelmia näkyy tässä kaaviossa. On kolme komponenttia Analyysin – Gene, eksoni ja Network käsitellään eri ohjelmia. Gene tason analyysit tehdään käyttäen ”Affymetrix, Expression /transcriptome analyysi konsoli” ja ”Tibco Spotfire”. Eksoni tason analyysi suoritetaan ”AltAnalyze” ja ”Affymetrix sähkötyökaluja”. Verkko analyysit palveluksessa ”GENIE3 ’,’ IPA ’ja’ Cytoscape”. ”Nexus Copy Number” on ohjelma käytetään aikaisemmissa tutkimuksissa lopulta tuottaa listan 144 kuljettajan geenejä.

pieni joukko geenejä tunnistaa synergisillä osoittavat merkittävää muutosta ilmaisun tasolla.

Tutkimme ekspressiomalleja kuljettajan geenien geenin tasolla käyttäen AltAnalyze ja Expression Console ohjelmistot. Nämä analyysit tuottanut ilmainen tulosta ja saatiin luettelo 20 geenit, joiden havaittiin olevan merkittävää kertainen muutos on suurempi kuin 2 ja p-arvo 0,01 [Taulukko 1]. 9 geenit kokenut alas asetuksella. BCAS1 korkeimmalla synergisillä pistemäärä 5.323 oli kaikkein merkittävästi vaimentua geenejä. 11 geenit osoittivat säätelyyn ylöspäin kanssa IL6- ja INHBA, jolla on suurin kertainen muutos [Kuva 2a (AltAnalyze), 2b (Expression Console)]. Kertainen muutos arvot kaikista 144 kuljettaja geenit on esitetty taulukossa S2.

Kaksi erilaista algoritmeja käytettiin mittaamaan ilmaisua arvot eksoni array tietoja, jotka tukevat tulokset. AltAnalyze (1a) ja Expression Console (1b) esittävät ilmainen tulokset mahdollisimman havaitut muutokset BCAS1, INHBA, IL6- ja MUC4 geenejä.

Kolme merkittävästi alas geenien (BCAS1, ABP1 ja AGR3 ) havaittiin monistettiin genomin alueita taas voimistunut HTRA1 löydettiin lähinnä alueilla menetys. Nämä geenit kokenut muutosta heidän transkriptiotekijän kasvaimen ja normaalissa näytteet [Taulukko 2].

Differential ilmentymisen analyysi käyttäen kasvaimen normaaliin pariksi näytedatan eksonin paneelit 32 potilaista suoritettiin. Poistamisen jälkeen harha käyttäen PCA [Kuva 3], 25 normaali ja 24 kasvaimen näytteen havaittiin sopivan jatkotutkimuksiin. Meillä työskentelee ei-parametrinen (SAM) ja parametrinen (Limma) menetelmät ja löysi ilmainen tuloksia. 6242 geenit ilmentyvät differentiaalisesti muokatuilla p-arvo 0,01. 760 geenejä havaittiin säädellään eri tavalla (fold muutos 1 tai -1), josta 15 geenit olivat yhteisiä kuljettajan kanssa geenien synergisillä analyysi [Kuva 4a-c ja kuvio S1]. BCAS1, AURKA, ATP8B1, IL6- ja INHBA olivat differentiaalisesti geenien havaittiin olevan joukossa maalintekijät lista kuljettajan geenejä.

60 näytettä 32 potilasta altistettiin PCA ja harha poistettiin. 4 normaalia ja 7 kasvaimen näytteet poistettiin kädessä.

(a) Venn-kaavio yhteisten geenien joukossa synergisillä, SAM ja Limma analyysit. Kaikki geenit selityksin ja verrattiin käyttäen IPA ”vertailla” -toiminto. 43 geenit Integromics analyysit eivät kartoitettu IPA.15 geenit ovat yleisiä kaikkien kolmen analyysit. (B) binned kertaluokkamuutos pylväskaavio Limma analyysi. Yhteensä 6242 geenejä Säädettyään p-arvo 0,01 joista 759 osoittivat merkittävää kertainen muutos ( -1 tai 1). (C) Volcano käyrä, joka esittää erittäin merkittäviä geenejä (vaaleanpunainen = vaimentua, oranssi = ilmen- tymisen lisääntymisen) mitattuna p- arvon ja taita muutos.

Merkittävät muutokset isoformin ilmentyminen on näytteillä geenit tunnistetaan synergisillä analyysi .

n eksoni tason analyysi 144 kuljettaja geenien suoritettiin. 29 eksonit kuuluvat 13 geenien osoitettu olevan merkittäviä muutoksia isoformin ilmentyminen mikä näkyy niiden liitos indeksipistelukua [Taulukko 3]. Vaikka eksonit E25-1 of MUC4 ja E3-2 of PTP4A3 osoitti korkea negatiivinen SI arvot, eksonit E2-2 IL6 ja E21-2 sekä ADAM12 osoittivat korkea positiivinen SI arvot. Negatiiviset SI arvot osoittavat eksonit rikastetaan Tuumorinäytteissä ja ohitetaan tai tukahdutettu normaaleissa näytteissä ja päinvastoin positiivisen SI arvoja. Sillä MUC4 geeni, eksonit E25-1, E2-2, E2-1, I4-6 ja I3-6 negatiivisia SI arvot ja eksonin E8-1 oli positiivinen SI arvo. Eksonit E2-2 ja E4-3 IL6 Positiivinen SI arvoja. [Kuva 5 ai-ii bi-ii ja kuva S2]. Eksonien MYLK ja ANK3 osoittivat merkittävä muutos silmukoinnin mutta eivät osoittaneet merkittävää kertainen muutos geenien ilmentyminen arvon. Microarray havaitseminen Alternative Jatkaminen (MiDAS) p-arvo välillä 0,01-0,04 havaittiin suodatettu tuloksiin.

eksoni lauseke (i) ja liitos-indeksi (ii) arvot kartoitettiin sekä kasvaimen ja normaali näytteet kaksikymmentäyhdeksän eksonit vaikuttavat kolmetoista geenejä. Eksoni 25-1 of MUC4 geenin (a) esittää eniten negatiivinen liitos indeksin arvo (a ii) kun taas eksoni 2-2 IL6 (b) osoitti suurin arvo 2,44 (b ii). Eksoni ilmaisun ja liitos indeksin arvot loput 27 eksonit tarjotaan täydentäviä kuva 1.

Syy Verkko analyysi näytöt vaihtuvat transkriptiotekijöitä Tuumorinäytteissä.

Syy Network analyysi näytöt vaihtuvat transkriptiotekijöitä tuumorinäytteissä. Merkittävin vaikutus TF geenien kasvain ja normaali näytteissä näkyi muutosta Kohdistettujen reunojen [taulukko 4]. CHAF1A, AHR, PRPF4B, ZNF200, Smad2, RUVBL1, Smad4, TSHZ1, CTCFL ja CEBPE olivat kärjessä vaikuttajia. Sääntely hierarkia näiden ryhmien välillä muuttuneet suhteessa TF: ille. Vaikka RUVBL1 muuntuu master säädin kasvaimissa, TSHZ1 on menettänyt kyky hallita säädellä muiden geenien kasvaimiin [Kuva 6a]. Merkittävät uudelleenjärjestelystä modulaarisuus on myös havaittu näiden kahden ryhmän. Enemmän kohdegeenien toimivat moduuleina kasvaimissa havaittu moduulit säätelevät AHR, CHAF1A ja PRPF4B. Lisäksi on huomattava sääntelyn ylikuulumisen joukossa geenit normaalissa ryhmässä [Kuva 6b]. Vaikka kasvaimet ovat menettäneet mittakaavasta ominaisuuksia sen sääntelyn vuorovaikutusta, normaali ryhmä esiintyy likimäärin mittakaavasta out asteen jakaumia, merkitsee potentiaalia TF säädellä monia kohdegeenien. Kasvaimet eivät näytä tällaisia ​​järjestelyjä, jotka osoittavat yksisuuntaisia ​​eteenpäinsyöttövahvistinjärjestelmään sääntelyn tilassa.

Hierarkkinen verkkotopologia käytetään havainnollistamaan astetta vuorovaikutuksen transkriptiotekijän geenien ja kohdegeenien. (A) Päätellä verkko kasvainten ryhmä esittää RUVBL1 päällikön säädin. (B) Päätellä verkko normaali ryhmä esittää TSHZ1as master säädin.

Funktionaalianalyysi erilaisesti ilmaisivat geenien vahvistaa niiden roolia peräsuolen syövän ja paljastavat tärkeitä reittejä ja biomarkkereita.

Gene ontologia rikastamista 760 differentiaalisesti ilmentyvien geenien saatu SAM /Limma analyysit osoittivat solunjakautumisen mitoosin ja soluadheesiota merkittävin biologiset prosessit vaikuttavat [kuva S3]. Nerokkuus polku analyysi 760 geenien osoitti syövän ja ruoansulatuskanavan sairauksien joukossa tehtävät seurasi solujen liikkumisen kasvua ja lisääntymistä [Kuva 7a]. NF-kB signalointi, solusyklin G

2 /M DNA-vaurioita tarkastuspiste sääntelyä, peräsuolen syövän etäpesäkkeiden olivat alkuun pisteytyksen reitit seuraa agranulocyte tarttuvuus [kuvio 7b]. TGFB1 oli kärjessä ylävirtaan sääntelyviranomaisten. Verkko analyysi viittaa MYC, MMP ja IL6 geenejä tärkeinä solmut [Kuva 7c-e]. Biomarkkereiden analyysi paljastaa 28 oleellisia molekyylejä ja peräsuolen syöpään [Taulukko 5]. INHBA, CLDN7 ja MUC4 olivat oikeutettuja biomarkkereina ja ovat yleisiä synergisillä, SAM ja Limma analyysien tuloksia.

Core analyysi käyttäen IPA suoritettiin käyttäen joukkoa 760 geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti Tuumorinäytteissä. Tärkeitä biologisia toimintoja (a) väyliä (b) ja verkkojen (ce) paljastuivat tämän analyysin.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa pyritään ymmärtämään transkription tasolla muutokset kuljettajan geenejä vaikuttaa SCNAs kolorektaalisyövässä. Me kysellä nämä geenit kolmesta näkökulmasta käyttämällä geeniä /eksoni /verkkotasolla analyysityökaluja. Integroitu analyysi genomisen /transcriptomic tasot johtivat löytää geenit etusijalle voidaan kokeellisesti määrittää niiden merkitys peräsuolen syöpä. Toiminnallinen merkitys erilaisesti ilmaisi geenien vahvisti tuloksen analyysien.

Koska ei ole saatavilla korkean resoluution sytogeneettisten paneelit suuri koko kromosomialueita olivat osallisina aiheuttavat peräsuolen syöpä kopioluvun muutoksia. Kaupallinen SNP genotyypityksen paneelit keskittyä variantit, jotka ovat läsnä vähintään 5% väestöstä ja niissä on rajallinen määrä CNV koettimia. Siksi sub mikroskooppinen rakenteellisia variantteja huonosti vangiksi käytettävissä SNP genotyypitys paneelit, jotka on suunniteltu arvioimaan SNP. Viimeaikaiset käyttöönotto Affymetrix CytoScan HD Array (CNV kohdistetun array), joka perustuu validoitu genominlaajuisia Human SNP Array 6,0 ja sisältää yli 2,6 miljoonaa merkkiaineita kopiomäärä varianttien ja noin 750000 SNP, on mahdollistanut havaitseminen kopioluvun kromosomipoikkeavuuksien korkean resoluution koko genomin [18]. Data tätä alustaa käytettiin saamiseksi luettelon kuljettajan geenejä, jotka voidaan näin ollen katsoa olevan tarkin ja tarkka. Aiemmin tulokset eri ryhmien johtavat usein korkeatasoinen eripuraisuus n limityksellä 5% joissakin tapauksissa. Synergisillä analyysi pystyi käsittelemään tätä kysymystä ja erottamaan kuljettajan ja matkustajan mutaatiot korkeatasoinen tarkkuus ja täsmällisyys [6]. Korrelaatio ilmaisun ja CN data on hyvin monimutkainen [19] ja on hyvin paljon vaikuttaa Lavatyypin tuottamiseen käytettyjen tiedot sekä analyysin strategioihin. Analyysimme strategia, jolla pyritään vähentämään sekoittavat tekijät. Me uutettu DNA /RNA samasta pala kudosta yhdessä protokolla [20]. Käytimme Hyväksytty pariksi kasvaimeen normaali valvonta, joka on todennäköisesti paras tapa tehdä vertailevan tutkimuksen [21]. Useita lähestymistapoja on käytetty syövän geeni priorisointia integroiva analyysi [22], [23]. Käytimme modifioitua kaksivaiheista lähestymistapaa suodattamalla syövän geenien avulla synergisillä ja sitten suorittaa eksoni ilmentymisanalyysiä.

Gene Level.

vaikutus kromosomimuutoksia ei aina suoraan. Globaali vahvistus on genomista tasolla johtaisi korkeamman tason ilmentymistä valittujen geenien [9]. Meidän geeni tason analyysi osoitti ainoastaan ​​20 144 kuljettajan geenejä kokea merkittävää muutosta transkriptio tasolla. 5 näistä geeneistä oli lueteltu parhaan joukkoon pisteytyksen kuljettaja geenejä. Tuloksemme korreloivat polttoväli monistamisia lisääntynyt ekspressiotasot ja on raportoitu aikaisemmin käyttäen array CGH (aCGH) varten FGFR2, Gnas ja AURKA geenit [24]. Kun keskimääräinen amplikonin koko 4,56 Mb, se voi olla harhaanjohtava ilmoittamaan kaikista vaikuttavat geenit /ei-koodaavat alueet liittyvän CRC. FAM46C, EGFR2 ja IL6 geenit analyysimme on myös lueteltu päivitetyn syövän geeni väestönlaskenta [5], [25]. BCAS1 geeni, joka teki korkein synergisillä analyysi aikaisemmin raportoitu tehdään vaihtoehtoisen silmukoinnin ja downregulation [26], joka on sopusoinnussa tuloksemme. Säätelyä ihmisen SLC7A11 mRNA strooman fibroblastisoluissa maksametastaaseista liittyy metastasoituneen kolorektaalisyövän ihmisen [27]. PTP4A3 raportoitu merkittävästi yliaktiivista Tässä tutkimuksessa on äskettäin ollut mukana paksusuolen kasvainten synnyssä [28]. ATP8B1 on geeni, joka ei ole vielä raportoitu olevan mitään yhteyttä peräsuolen syövän ja olisi tärkeä molekyyli jatkotutkimuksiin.

ero ilmentymisen analyysi kasvaimen ja normaali eksonin array aineistoja käyttäen kahta itsenäistä välineitä (SAM ja Limma) osoitti limityksellä 15 geenien kuljettajan geenejä. Analyysi 44000 antureista johtaen differentiaalisesti ilmentyvien geenien tarjota puolueetonta lähestymistapaa ja antaa lisää luottamusta luetteloon päällekkäisten geenien. Sekä Limma ja SAM lähestymistapoja syntyy samat tulokset toiminnallisella tasolla osoituksena Ingenuity Pathway Analysis (IPA).

ABP1, AGR3 ja BCAS1 osoitti downregulation huolimatta monistaminen genomin tasolla. Tätä tukevat aikaisempien tutkimusten BCAS1in MCF7 solulinjan [29]. Havaitsimme, että vaikutus Smad4 transkriptiotekijän katosi kasvainsoluissa ja se voi olla vastuussa tästä havainnosta. Samanlaisia ​​muutoksia transkriptiotekijöiden tarkkailtiin kahden muita geenejä osoittaa taipumusta vaihtaa kuten alla.

eksoni Level.

eksoni tason analyysi mittaamiseksi geenien ilmentymisen muutoksia on haastavaa mutta palkitsevaa. Jopa parantunut algoritmit olla rajoituksia tarjoamalla absoluuttisia transkriptin tasot. Aiemmin menetelmät ovat löytäneet eksoni tason tietojen olevan enemmän informatiivinen luonteesta ja tasosta selostukset [30]. Nyt tiedetään, että yli 90% kaikista geeneistä läpikäyvät vaihtoehtoisen silmukoinnin tuottamaan enemmän kuin yksi transkriptin geenin, potentiaalin eksonin tason dataa toteutuu enemmän kuin koskaan [31] – [33]. Gene keskeinen lähestymistapa suorittamiseksi integroitua analyysiä käyttäen aCGH ja eksonin array data on kuitenkin tuottanut enemmän vahvistavia tuloksia ja puuttuu käytön koko potentiaalia koko genomin paneelit [34]. FGFR2 geeni osoitettiin vahvistetaan ja voimistuvan joka on harhaanjohtava, koska typistetty muoto FGFR2. Wt FGFR2 geeniä ei mitata ja näin ollen ei voida verrata tutkimuksemme [34].

eksoni opinnot kolorektaalisyövässä ollut muutamia ja kuljettaa useita rajoituksia kannalta tietojen analysoinnin. Monet näistä tutkimuksista verrattuna kasvaimen ja normaali eri lähteistä [35]. Tuloksemme osoittavat alijoukon differentiaalisesti ilmentyvien geenien kokea muutoksen silmukoinnin. 29 eksonit kuuluvat 13 geenien havaittiin huomattavia liitos (SI) ja MiDAS p-arvot. Molemmat arvot ovat vahvoja indikaattoreita mittaamaan vaihtoehtoisen silmukoinnin. MUC4 on hyvin tiedetään käyvän läpi vaihtoehtoisen silmukoinnin ja aiheuttavat syöpää [36], mutta vaihtoehtoinen silmukointi IL6 on romaani yhdessä CRC. ADAM12 että teki suuren SI-arvo on liitetty aiemmin keuhkosyövän [37]. 5 geenit (ACTN1, CALD1, SLC3A2, CTTN ja FN1) on raportoitu aikaisemmin erilailla saumattu [38] on todettu, että tutkimuksessamme sekä jota käytetään erilaista analyysiä strategiaa.

ANK3 on tunnettua käyttää vaihtoehtoisia transkription alkavat sivustot kolorektaalisyövässä [8] ja se voisi myös olla mekanismi muiden geenin MYLK josta meillä ei nähnyt merkittävää muutosta geenien ilmentymistä.

Verkon Level.

Pathways analyysi on käytetty mittaamaan merkitystä geenien vaikuttavat CNAs luomalla verkostoja joukossa [1]. Nämä verkot ovat rajoittuneita hyödyllisen tulkinnan puuttumisen vuoksi suuntautuneisuutta. Meidän syy verkko analyysi antaa enemmän hyödyllistä tietoa geenien mukana näissä verkoissa. Havaitsimme merkittävän eron määrä kohdegeenien välillä kasvain ja normaali. Siinä tapauksessa, että geenien löytyy monistettu alue, mutta ne vaimentua havaitsimme menetys transkriptiotekijän asetus, kun taas ilmen- tymisen lisääntymisen geeni löytyy poistetaan alueella oli kytkin transkriptiotekijä. Luettelosta kuljettajan geenejä valitsimme transkriptiotekijät ja tutkittiin niiden käyttäytymisen muutos Tuumorinäytteissä. AHR on perustettu tuumorisuppressorigeenin paksusuolen ja muissa syövissä [39]. Tutkimuksessa selittää edelleen vahvistunut asema AHR lisääntynyt määrä lähtevän (kohde) geenejä kasvain. Tutkimuksemme antaa näyttöä, että TSHZ1 menettää sen asemaa master säädin normaaleissa soluissa, kun taas RUVBL1 olettaa rooli. Nämä tarjoavat mielenkiintoisia mahdollisuuksia mekaaniset tutkimukset verkko /vaikuttavia reittejä CRC. Se on suunniteltu integroitujen tutkimusten että monet eri genomista muutoksiin mahdollisesti dys-säätelevät samat reittejä monimutkaisia ​​sairauksia [40]. Lisätutkimukset sääntely tason muutokset tässä tutkimuksessa pystyy luomaan tätä käsitettä CRC.

toiminnallinen rooli differentiaalisesti ilmentyvien geenien ja tunnistaminen MYC, MMP ja IL6 tärkeinä solmuja vaikuttaa verkot tarjoavat johdot, jotka on validoitu todistamaan yhdessä CRC. Biomarkkereiden varsinkin MUC4 on tärkeä molekyyli tutkia mekanistisesti ja vahvistaa niiden käyttöä kliinisissä tutkimuksissa. Tutkimus tarjoaa runsaasti analysoi tiedot ja rikastettu luettelo geenejä, jotka voivat toimia mahdollisina vihjeitä ymmärtää biologian paksusuolen syövän.

tukeminen Information

Kuva S1.

merkitys mikrosiruanalyysillä. SAM-analyysi suoritettiin käyttäen Integromics biomarkkereiden löytö sviittiä kaikissa näytteissä. Tulokset olivat hintaan sisältyvä Limma analyysin heijastuu määrä differentiaalisesti ilmentyvien geenien.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0110134.s001

(TIF) B Kuva S2.

Splice indeksi ja eksoni ilmaisun tontteja Loput 11 geenejä. Splice indeksi ja eksoni ilmaisun arvot kaikkien 13 geeniä, jotka havaittiin merkittävä joukossa kuljettajan geenejä piirrettiin. Vertailu ”Normal” ja ”Kasvain” näytteet on kuvattu tarkkailla muutoksen liitos indeksin sekä ekspressiokuviota klo eksonissa tasolla.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0110134.s002

(DOCX)

Kuva S3.

biologiset prosessit rikastamiseen kaavioon ilmentyvät eri geenit. Tämä palkki juoni näyttää ilmentyvät eri geenit (kuten saatu Integromics) rikastetaan kolme tehtävää eli., Solunjakautumisen, mitoosin ja solujen tarttumista.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0110134.s003

(PNG)

Taulukko S1.

tyypit ja vaiheissa kaikkien potilaiden näytteitä käytetään tutkimuksessa.

doi: 10,1371 /journal.pone.0110134.s004

(DOCX)

Taulukko S2.