Krooninen sairaus

tiivistelmä

monilääkeaineresistenssin vetämänä ABC kalvo kuljettajat on yksi tärkeimmistä syistä hoidon epäonnistuminen ihmisen maligniteetti. Jonkin verran näyttöä on aiemmin raportoinut solusyklin riippuvuudesta ABC transporter ilmaisua. Kuitenkin se ei ole koskaan osoitettu, että toiminnallinen aktiivisuus näiden kuljettajat korreloi solusyklin asentoon. Täällä tutkimme nopeus luontainen ABC liikenteen eri vaiheissa solusyklin viljellyissä MCF-7 rintasyövän soluja. Nopeutta leimasi kannalta ulosvirtausta kinetiikan soluista ladattu ABC transporter alustaan. Kuten keskiarvo kinetiikan solupopulaatio voisi johtaa virheisiin, tutkittiin kinetiikka ABC liikenteen yhden solutasolla. Huomasimme, että korko ABC liikenteen MCF-7-solut voidaan kuvata Michaelis-Menten-kinetiikka kaksi klassista parametreja,

V

max ja

K

M. Kunkin arvon osoitti samanlaista unimodaalinen jakaumat eri kantojen enimmäismääriä solualapopulaatioiden että 2c ja 4c toteaa. Verrattuna 2c solujen 4c solut osoittivat suurempaa

V

max arvot, mikä osoittaa suurempaa

aktiivisuutta

liikenteen. He myös osoittivat suuremman

V

max /

K

M-suhde, mikä osoittaa suurempaa

tehokkuuden

liikenteen. Tuloksemme viittaavat siihen, että solusyklin liittyvät modulaatio MDR voi olla tarpeen ottaa huomioon, kun suunnitellaan kemoterapiahoitoihin, jotka sisältävät sytostaatit.

Citation: Koshkin V, Krylov SN (2012) välinen vastaavuus Multi-Drug resistenssiin Associated Membrane Transport in Clonal Syöpäsolut ja solusyklin vaihe. PLoS ONE 7 (7): e41368. doi: 10,1371 /journal.pone.0041368

Editor: Henning Ulrich, University of São Paulo, Brasilia

vastaanotettu: 12 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 20 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 25 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Koshkin, Krylov. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: lähde rahoitus: luonnontieteiden ja tekniikan tutkimuksen toimikunta Kanadan (https://www.nserc-crsng.gc.ca/), Grant numero: 238990-1011. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Yksi suurimmista ongelmista syövän hoidossa on vähentynyt tai se poistetaan kasvain vastaus chemotherapies, joka liittyy niin sanottu moniresistenssin (MDR)

1, ohjaa superperheen ATP-sitova kasetti (ABC) solukalvon kuljettajat [1]. Nämä ABC kuljettajat suorittavat energiariippuvainen ulospäin kuljetusta monenlaisia ​​kseno- ja endo-biotics soluista; erityisesti, syöpälääkkeiden syöpäsolujen. Yritykset hallita MDR syöpäsoluissa ovat toistaiseksi ole tuottanut kliinisesti hyviin tuloksiin.

Se oli aiemmin ehdottanut, että monilääkeresistenssiä korreloi solun asemaa solusyklin [2]. Tämä korrelaatio voisi olla hyötyä nykyinen kemoterapia, joissa yhdistyvät sekä sytotoksiset ja sytostaattiset aineet [3], jotta suosivista kertymistä kasvainsolujen yhden tai toisen vaiheen solusyklin. Ymmärtäminen suhde MDR ja solusyklin on tärkeää varmistaa, että solut eivät kehotetaan osaksi sytotoksiiniin kestävä vaihe solusyklin.

Nykyinen näyttö yhdistää solusyklin etenemisen kanssa MDR on hajanaisia ​​tai epätäydellisiä, ja esitti pääasiassa korrelaatio dataa solusyklivaiheista ja ekspressiotasot tiettyjen ABC kuljettajat [2], [4], [5]. Ilmaisu data voi olla ratkaiseva, koska MDR kapasiteetti syöpäsoluissa määräytyy paitsi ilmaus solukalvon kuljettajat ABC perhe, vaan monia muita tekijöitä, kuten koostumus ja fluidisella tilan plasman kalvo, läsnäolo asiaan kofaktoreita, modulaattorit, jne. Näin ollen, yleisesti käytetty arvioitaessa MDR kapasiteettia analyysi kuljettimen ilmentymisen havaittiin olevan epäluotettavia useissa tapauksissa [6] – [8]. Työmme motiivina oli oivallukseen, että suora kineettinen mittauksia MDR liikenteen voisi toimia lopullisena indikaattorina solujen chemoresistance. Oletimme, että solut etenemistä solusyklin läpi voidaan liittää kanssa moduloinnin lääkevuoto- kinetiikka – nettotuloksen solusykliaktiivisuuden liittyvien proteomic, kalvo, ja aineenvaihdunnan muutoksia solussa. Pyrkiessään paljastaa hienovarainen solujen väliset erotteluja MDR toimintaa, olemme viime aikoina kehittänyt yksisoluiset levät lähestymistapaa ja osoittivat sen suuri herkkyys havaita solujen välisen vaihtelun kalvo liikenteen [9]. Tässä esittelemme yksityiskohtaisen tutkimuksen solusyklin modulaation MDR liikenteen käyttämällä yksisoluiset levät lähestymistapaa (Fig. 1). Se tarjoaa käytännöllistä näyttöä solusyklin liittyvää modulaatiota MDR toimintaa ja ehdottaa, että tämä vaikutus olisi mahdollisesti otettava huomioon suunnittelussa yhdistelmän sytostaattihoitoon.

määritys

V

max ja

K

M solujen väestön keskiarvon: (i) yksisoluisia

V

max ja

K

M (yksin- solumenetelmällä) ja (ii) yksisoluisia raaka signaaleja (väestö lähestymistapa).

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja materiaalit

MCF-7-solut (ihmisen rintasyövän solulinjassa [10], [11]) hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, ATCC # HTB-22), kasvatettiin suositellussa median ja täydentää 37 ° C: ssa kostutetussa 5% CO

2 ympäristöä ja käytetään 6 kuukauden ajan. Fluoresoiva MDR mittapäät rodamiini 123, fluoreseiini, mithoxantrone, sekä propidiumjodidilla (PI), ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Kaikki muut reagenssit saatiin Sigma-Aldrich, Fluka AG Buchs (Sveitsi), ja BDH Chemicals Ltd. (Poole, Englanti).

mittaus kertyminen ja ulosvirtaus loisteputki MDR Probes solupopulaatioissa virtaussytometrialla

Cellular sisältö fluoresoivat MDR koettimet määritettiin virtaussytometrialla (BD FACSCanto II virtaussytometrillä, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) väliaineessa, joka koostuu 140 mM NaCl, 3 mM KCI, 10 mM Na

2HPO

4, 2 mM KH

2PO

4 2 mM CaCl

2, 1 mM MgCI

2, ja 10 mM glukoosia. Sen jälkeen, kun ladataan koettimen kanssa (1-5 uM, 30-45 min, 37 ° C), soluja (noin 10

6 solua /ml) sedimentoitiin, pestään, suspendoidaan uudelleen tuoreeseen elatusaineeseen (joka sisälsi 5 uM PI), ja tutkittiin solunsisäisen koetin sisältöä tavallisella argon-ioni emittoi 488 nm varten fluoresenssivirityk- ja 530/30 nm kaistanpäästö- päästöjen suodatin fluoresenssin havaitsemiseen rodamiini 123, calcein ja fluoreseiini ja 585/42 bändi pass emissiosuotimen havaitsemiseksi PI. Arvioida kertyminen mitoksantroni, näytteet olivat heräte 635 nm: n punainen laserin, ja 680/32 nm: n kaistanpäästösuodattimen emissiosuodatinta käytettiin havaitsemaan fluoresenssi. Kvantitatiiviseksi kineettinen MDR tutkimuksen etenemisen väriaine ulosvirtausta seurattiin virtaussytometrisellä toistuva näytteenotto Solususpensioiden sopivina ajankohtina.

mittaus MDR Transport yksittäiset solut fluoresoivalla Kinetic Microscopy

soluja kasvatettiin 50-60% konfluenssiin täydennettiin 10 uM glyburidi (MDR-inhibiittoria), ja ladattiin 5 uM fluoreseiini 30 min ajan 37 ° C: ssa. Sitten solut pestiin vapaaksi solunulkoisen fluoreseiini ja glibenklamidin ja sijoitetaan KRB puskuriin. Kinetiikka fluoreseiini ulosvirtaus seurattiin 5 minuutin välein käyttäen laserskannaus confocal fluoresenssimikroskooppia (Fluoview FV300, Olympus, Japani), ja argon-ioni laservirityksellä 488 nm ja XF75 Omega suodatin sarja (Omega Optical Inc Brattleboro , VT) jälkeen lähestymistapa on kuvattu muualla [12].

määritys elinkykyyn ja Cell Cycle kanta

päättymisen jälkeen fluoreseiini ulosvirtausta, solut ladattiin PI (10 uM, 10 min ) tunnistaa apoptoottiset solut. Solut käsiteltiin sitten solukalvon erityisiä pesuainetta, saponiinia (80 ug /ml) ja RNaasi A: ta (0,02 mg /ml), jotta PI interkalaatioon tuman DNA. Fluoresenssin PI-käsitellyt solut olivat innoissaan vihreä Kr laser ja havaita kanssa XF35 Omega suodatin sarja (Omega Optical Inc Brattleboro, VT). Fluoresenssin intensiteetti PI käytettiin määrittämään solujen asema solusyklin [12] – [14].

Kinetic Sovitus ja simulaatiomenetelmät

kinetiikka MDR liikenteen kuvattiin edistyminen käyrät fluoreseiinin ulosvirtaus joka asennettiin integroidun Michaelis-Menten yhtälö yhden alustan peruuttamattomia reaktio: jossa [S]

0 ja [S] ovat alkuperäisen ja nykyisen substraattikonsentraatioita vastaavasti [15], [16]. Tämä yhtälö käytettiin myös rakennuksen väestöstä kinetiikka malleja. Sovitus ja mallisimulaatiot tehtiin KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) ja alkuperä (Microcalin Software, Northampton, MA) ohjelmistoja.

Tulokset

Yleinen karakterisointi Luonnostaan ​​monilääkeresistenssin MCF -7 solut

Ensimmäinen tutkimus luontainen chemoresistance MCF-7-soluissa suoritettiin käyttämällä virtaussytometria-mittauksia MDR substraatin kertymisen soluihin ja sen riippuvuus MDR-inhibiittorit. Solut ladattiin yhdistelmiä klassisesti käytetty fluoresoiva alustoille (rodamiini 123, mitoksantroni, ja fluoreseiini) ja estäjien (syklosporiini A, verapamiili, ja glibenklamidin) spesifisiä erilaiselle MDR kuljettajat [17], [18]. Nämä mittaukset osoittivat, että vain fluoreskeiini /glyburidi pari esillä estäjä (glyburidi) -dependence in ottoa solun sisään fluoresoiva koetin (fluoreseiini) MCF-7-solut (Fig. 2A). Solujen kyky sulkea fluoreseiini (mutta ei rodamiini 123 ja mitoxanthrone) on ominaista, että MRP-tyypin liikenteen [17], [19]. Tämä sopii varhain raportteja luontainen huumeisiin effluksiaktiivisuus MCF-7-solujen [20] – [22] ja rintasyöpiä [23]. Näin ollen ainoastaan ​​MRP liikenteen tyyppi ja sen sääntely tutkittiin edelleen perusteellisesti.

, läsnäolo luontainen MDR toiminnan MCF-7-solut arvioitiin kertyminen: rodamiini 123 ilman tai syklosporiini A (- /+ inh) – MDR perheen kuljettajat; fluoreseiini ilman tai glibenklamidi – for MRP perhe; mithoxantrone ilman tai syklosporiini A – for BCRP perheelle.

B

, edustava sekvenssi virtaussytometristen histogrammien aikana fluoreseiini ulosvirtausta, osti 0, 30, 60 ja 90 min jälkeen lastaus.

C

, kinetiikka fluoreseiini ulosvirtausta, vaikutus glibenklamidin soveltaminen (estäjä MRP-tyyppinen kuljettajat), glukoosi peruuttamista, ja soveltaminen etyyliesteriä GSH.

D

, Michaelis sopivat etenemistä fluoreseiinin ulosvirtaus solupopulaatiossa.

kineettinen karakterisointi MDR MCF-7 solupopulaatioiden, solut ensin ladattu fluoreskeiinin läsnäolo glyburidia ja annettiin sitten suulakepuristaa sen poistamisen jälkeen solunulkoinen fluoreseiini ja glibenklamidin toistuvasti sentrifugoimalla ja pesemällä. Kinetiikka fluoreseiini ulosvirtausta oli peräisin keskiarvot fluoresenssin voimakkuus on saatu virtaussytometrillä mittauksia sopivin aikavälein (kuviot. 2B, 2C). Kaikki virtaussytometrillä histogrammeja hankittu tässä tutkimuksessa, joka osoitti asteittainen karkotus fluoreseiini MCF-7 solut tuottivat unimodaaliseksi kuvio (Fig. 2B). Tämä viittaa siihen, että havaittu fluoresenssi kinetiikka kuvastaa lähinnä fluoreseiini liikenteen irtotavarana solupopulaation, joka on tasainen jakautuminen MDR toimintaa. Tällä tavalla joitakin tärkeitä näkökohtia luontainen MDR liikenteen MCF-7-solut perustettiin jäljempänä kuvatulla tavalla.

Ensin määritellään suhde havaittiin yhteensä membraanien välisen virtauksen fluoreseiinin ja MDR liikenne. Vahva glibenklamidi inhiboivan vaikutuksen liikenteen, kuvassa. 2C osoittaa, että lähes koko fluoreseiini vuo MCF-7-solujen johtui MDR pumput (glyburidi inhiboitavissa kuljettajat), kuten on havaittu joissakin muissa solutyypeissä [24], [25] Kineettinen jälkiä fluoreseiini ulosvirtaus voidaan asentaa yhdysrakenteisella Michaelis-Menten yhtälö (Fig. 2D), joka on yhtäpitävä aiemmin raportoitu Michaelis käyttäytymisen ABC kuljettajat [26], [27]. Siten Michaelis kineettinen parametrit fluoreseiinin ulosvirtausta,

V

max ja

V

max /

K

M, voidaan käyttää indikaattorina MDR toimintaa ja tehokkuutta, tässä järjestyksessä.

Toiseksi meidän harkita tekijät (muu kuin kuljettaja ja substraattikonsentraatioita), jotka olivat mahdollisesti omiaan vaikuttamaan ajankul- fluoreseiinin ulosvirtausta. Nämä tekijät ovat: energian (ATP) aktiivista kuljetusta ja tarjonta todennäköisesti co-alustan (pelkistetty glutationi, GSH) ja MRP kuljettajat. Poissulkemiseksi näitä mahdollisuuksia, me vaihteli keskipitkällä pitoisuus ATP tuottavien glukoosin ja kalvon läpäisevän etyyliesteri GSH (Fig. 2C). Tulokset osoittivat, että nämä tekijät eivät rajoita kuljetusta fluoreseiini MCF-7-solut olosuhteissa palveluksessa. Nämä seikat edelleen vahvistanut, käyttämällä kineettistä parametrit fluoreseiinin ulosvirtaus näissä soluissa luonnehtimiseksi MDR toimintaan.

Population vs yksisoluiset lähestymistavan Kinetic Studies of yksihuippuisesta solupopulaatioiden

Kinetics MDR liikenne on tyypillisesti tutkitaan käyttäen kokonaisia ​​solupopulaatioiden [25], [28], [29], lähestymistapa, joka pidetään tarkasti perustamisessa pääsuuntaukset yksihuippuisesta solun kokoonpanoille [30]. Kuitenkin viime työtä Wong ja tekijäkumppaneina olivat osoittaneet, että keskimäärin solu kinetiikan solupopulaatio voi merkittävästi häiritä reaktiota, jotta määritys, kun solu-solu vaihtelua populaatiossa on korkea (25-160-kertaiseksi entsyymin aktiivisuutta ja /tai substraatin pitoisuus) [31]. Meidän järjestelmä, olimme kiinnostuneita onko väestön keskiarvon voitaisiin ottaa käyttöön huomattavia virheitä osaksi mittaukset Michaelis-Menten parametrien kohtalaisessa (2-10-kertainen) solu-solu vaihtelua kuljettajan toimintaa. Voit vastata tähän kysymykseen, me aluksi suoritetaan kineettinen simulaatio solupopulaation mallia. Mietimme solujen ryhmä identtisillä

K

M arvot ja alkuperäisestä alustan tasoa mutta vaihtelevalla

V

max (jaettu Gaussin tavalla yli 9-kertainen alue ) (Fig. 3A, taulukko 1). Kineettinen jälkiä alustan puristamiseen jokaista solua simuloitiin integroidun Michaelis-Menten yhtälö (Fig. 3B). Kinetics yksittäisten solujen voitaisiin käsitellä kahdella tavalla alla on kuvattu (ks. 1).

simulointi yksisoluiset ja väestön kinetiikka on Michaelis-Menten-tyyppistä reaktiota.

, muunnelma

V

max populaatiossa 10 yksittäisen solun solua.

B

, simuloitu yksisoluiset ja keskimäärin väestö kinetiikka, simulointi suoritetaan käyttämällä integroitua Michaelis-Menten yhtälö:

V

max

t

= ([S]

0 – [S]) +

K

M ln ([S]

0 /([S]

0 – [S])).

Ensinnäkin kineettiset parametrit jokainen solu voidaan päätellä yksisoluiset kineettisen jälkiä sovittamalla integroidun Michaelis-Menten yhtälö ja keskiarvossa väestöstä. Nämä keskiarvot on sama kuin keskiarvoja parametreista käytetään simulaatiot (taulukko 1, rivi 6). Erityisesti keskimäärin

V

max on sama kuin

V

max arvo liikennemuotojen solutyypin (Fig. 3A, Keski bin). Siten keskimäärin kineettiset parametrit väestön sama parametrien modaalinen solutyypin, joka on odotettavissa Gaussin jakaumat.

Toiseksi, sen sijaan, että keskimäärin Michaelis-Menten parametrit, voidaan keskimäärin kineettistä jälkiä (Fig. 3B). Huomaa, että kokeilu, tämä tapahtuu, kun koko signaali solupopulaation rekisteröidään menetelmillä kuten kineettinen virtaussytometrialla, spectrofluorometry, ja koko-kentän mikroskopia. Kuviosta. 3B, voidaan nähdä, että keskimäärin väestön kinetiikka tällä tavoin tuotetun poikkeaa merkittävästi kinetiikka modaalinen solutyypin (Fig. 3B, paksumpi jäljittää vastaa solujen tyyppi 3). Keskiarvoistetut väestö jälki poikkeaa modaalinen väestöstä jälki koska nopein solut taipumus hidastaa ja täydentää reaktion aikaisemmin kuin hitain niitä, ja lisäksi reaktio etenee kohti loppuun, sitä suurempi osuus hitaasti soluilla on sen keskimäärin väestöstä kinetiikka. Tästä syystä keskimäärin väestö jälkiä syntyy näin on suurempi kaarevuus kuin modaalinen väestö jälkiä, ja johtaa virheelliseen käsitykseen solun kinetiikan. Tämän seurauksena vaikka kukin yksittäinen solu tarkasti noudattaa Michaelis-Menten kinetiikka, sillä 9-kertainen vaihtelu

V

max, väestön keskimääräisiä jäljittää sopii tähän kinetiikkaa erittäin huonosti. Saat 3-kertainen vaihtelu, Michaelis asentamisesta näyttää olevan tyydyttävä visuaalisesti, mutta tuottaa moninkertainen yliarviointi

V

max ja

K

M (taulukko 1, rivi 7).

Kaksi muuta kineettiset parametrit,

K

M ja [S]

0, alistettiin analogisia vaihtelu yhden solutasolla, ja aiheutti laadullisesti samanlainen, mutta määrällisesti pienempiä liian suuriksi niiden keskimäärin kantojen arvoja (20-50% keskiarvosta parametrin arvoon 3-kertainen vaihtelu, tuloksia ei ole esitetty). Tällainen ero voi olla rajallinen merkitys analyysissä todellisia hajallaan kokeelliset tiedot. Samaan aikaan, moninkertainen yliarvioimista väestöstä

V

max ja

K

M aiheuttama solusta soluun

V

max vaihtelu, antaisi täysin väärän kuvan prosessin tutkittavana.

on ne huomattava, että sekä väestön ja yksisoluiset lähestymistapa antaisi samanlaisiin tuloksiin, jos solupopulaatio analysoitiin olivat täysin samat , joka on, tietysti, ei ole. Väestön lähestymistapa aina johtaa systemaattista virhettä sovellettuna heterogeeninen solupopulaatio ja virheet lisäävät yhä heterogeenisuutta. Yhden solun lähestymistapa on oikea kannalta matemaattista tilastojen ja siten palauttaa aina kineettisen tiedon oikein kuvaavat solupopulaation analysoitiin ei väliä kuinka heterogeeninen on väestöstä. Siten selvittäminen mahdollisten kineettisen eroja solujen eri vaiheissa solusyklin olemme soveltaneet yksisoluiset lähestymistapa.

modulaatio MDR Kinetics aikana soluilla ”Progression solusyklin läpi

kinetiikka fluoreseiinin ulosvirtausta yksittäisistä soluista mitattiin käyttämällä kvantitatiivista nopeutus fluoresenssin konfokaalimikroskopia. Kalibrointi solujen fluoresenssi tehtiin kahdessa vaiheessa. Ensinnäkin, fluoresenssi intrasellulaarisen fluoreseiinin ja fluoreseiinin liuoksessa verrattiin. Tätä tarkoitusta varten, testasimme emission keskeyttäminen fluoreseiini-sisältävistä soluista ennen ja jälkeen solujen hajoamisen ja 0,1% Triton X-100. Vapautuminen väriaine soluista ei ollut merkittävää vaikutusta sen fluoresenssi, joka osoittaa, että fluoresoiva signaali solunsisäiseen fluoreseiini voitaisiin kvantitatiivisesti käyttäen fluoreseiini ratkaisuja kalibrointia. Toiseksi, jokaisen sarjan solun mittauksen, standardiliuokset fluoreseiinin pantiin kennokammiota, ja niiden signaalit tallennetaan samalla optisella asetuksia. Lineaarinen päästöjen pitoisuuden riippuvuus syntyy tällä tavalla (tuloksia ei ole esitetty), salli meidän määritellä absoluuttisen pitoisuuksien solunsisäisen fluoreseiinin (polttovälin tilavuus oli pienempi kuin solun tilavuus).

Fluoreseiini ulosvirtausta aloitettiin poistamalla glibenklamidin, joka estää kalvopumppu, ja seurataan kunnes näennäinen loppuun (kuviot. 4 aa ja 4 ba). Jälkeenpäin solut käsiteltiin PI tunnistaa apoptoottiset solut, jotta jättää ne kvantitatiivisen analyysin. Lopuksi, lisäämällä saponiinia (joka leimaa solukalvon) ja RNaasi (joka poistaa häiritseviä RNA), PI sai syöttää kaikki solut ja värjää DNA (Kuva. 4AB). Fluoresenssi-intensiteetti PI on käytetty osoittamaan soluihin joko 2c (G1 /G0) vaihe tai 4c (G2 /M) vaiheessa (Fig. 4BB), niin että kinetiikka väriaine ulosvirtausta yksittäisistä soluista, jotka kuuluvat ensimmäisen ja toisen puoliskon solusyklin (ennen ja jälkeen DNA päällekkäisyyttä) voitiin arvioida

edustaja fluoresenssikuvia (skannauskoko 100 x 100 m) fluoreseiinin ulosvirtausta seuraa PI värjäys (b) MCF-7-solujen mittauksissa käytetään liikenteen kinetiikkaa ja solusyklin etenemisen, vastaavasti.

B

, (a) tyypillinen kineettinen jälki osoittaa kuljetusta fluoreseiinin yhdestä solusta ja sen Michaelis-Menten sovi, ja (b) solusyklin histogrammi saadaan päätyttyä fluoreseiinin liikenteen.

C

, taajuus polygoneja havaita karakteristisia jakaumia

V

max (a), ja

V

max /

K

M (b) arvot keskuudessa solujen 2c ja 4c valtiot (tyypillinen jakaumat edustaa 4 itsenäistä solupopulaatioiden näkyvät). Nuolet osoittavat keskiarvo ja modaalinen tehtävissä jakaumat MDR parametrien (paksu ja ohut nuolet vastaavat 2c ja 4c soluja, tässä järjestyksessä).

D

, 4c /2c keskiarvojen suhteina ja

V

max, ja

V

max /

K

M saadaan rinnakkaista soveltamista yhden solu- (tyhjät pylväät) ja väestöpohjainen (täytetään sarakkeet) suuntautunut analyysi MDR kinetiikka 2c ja 4c -alapopulaatioiksi, joka edustaa 4 itsenäistä soluvalmisteilla.

Fluoreseiini ulosvirtausta enemmistön yhden MCF-7-solujen noudatettiin Michaelis-Menten-kinetiikka, lukuun ottamatta n. 5% soluista, jotka olivat osoittaneet PI-värjäys ennen läpäisyä ja /tai epänormaali ulosvirtauksen kinetiikka; nämä solut jätettiin analyysin ulkopuolelle. Kuvio 4C esittää, että solusyklin siirtyminen 2c faasista 4c faasi liitettävä siirtymän MDR aktiivisuuden (ominaista

V

max) ja tehokkuus (ominaista

V

max /

K

M) jakaumat kohti korkeampia laadut. Näin ollen 4 N solut osoittivat kohonneet keskiarvot

V

max ja

V

max /

K

M (ylempi nuolilla . 4C taajuus polygoneja, ja tilastollinen yhteenveto kuvassa. 4D). Tämä ero oli vielä suurempi suhteen modaalisen tasojen MDR vuonna 4c ja 2c -alapopulaatioiksi (alempi nuolilla. 4C taajuus polygoneja). Modaalinen arvot MDR toimintaa luonnehtivat runsain solutyyppi väestön ja määrittää usein kasvaimen käyttäytymisen [32]. Täällä ei pitänyt todennäköinen esiintyminen puoli väestöstä laajennetuilla MDR aktiivisuus (

V

max), jotka voivat käyttää vain vähäinen osa yleistä jakelua MDR toimintaa koko väestöstä.

Jos haluat vertailla erotuskyky väestön ja yksisoluiset kinetiikka lähestymistapoja, toteutimme rinnakkain analyysin samasta raaka data käyttäen molempia menetelmiä. Kuvio 4D esittää MDR kineettiset parametrit 4c ja 2c valtiot, määritettiin kaksi lähestymistapaa. Yhden solun peräisin 4c /2c suhteet

V

max ja

V

max /

K

M olivat korkeammat kuin ne, jotka saatiin populaatiosta keskiarvon laskelmat, ja vain yhden solun arvot olivat merkittävästi erilaisia ​​kuin yhtenäisyys, mikä viittaa suuremman erotuskyky varten yksisoluiset lähestymistapa.

keskustelu

paljous huumeisiin valitut lääkeresistenttiä solutyyppejä käytetään laajasti MDR tutkimuksissa hankkivat yleensä vaikutusta suurempi fysiologinen vastuksen tasoa, ja todennäköisesti säänneltävä muuttujaan muodista [33], joten niiden merkitys MDR toimivan in vivo keskusteltu laajasti [34], [35]. Siksi tässä työssä, tutkimme fysiologisesti esiintyvä luontainen monilääkeresistenttisyyttä, joka määrittelee huumeiden valinta ja lopputulos ensimmäisen kierroksen kemoterapiaa.

Suurin osa soluprosesseja moduloidaan solun etenemistä solusyklin läpi [ ,,,0],36], ja voidaan odottaa, että luontainen aktiivisuus MDR liikenteen syöpäsoluissa ei ole poikkeus. Harvat tutkimukset, joissa tätä kysymystä käsiteltiin, pidetään spesifisten ABC kuljettajat eri vaiheissa solusyklin [2], [4], [5]. Samalla, huomattiin, että yleisesti käytetty mittaukset MDR-geenin ilmentymisen Tuumorinäytteissä ei aina kliinisesti tehokkaita, koska ne eivät välttämättä tarjoa tietoa toiminnallinen aktiivisuus lääkkeen effluksipumppujen [6], [37]. Kiistelty kliinisiä tuloksia korrelaatio chemoresistance ja ilmaus ABC kuljettajat [38], [39] heijastavat todennäköisesti osuus tekijöistä, muu kuin kuljettaja ilmaisun määritettäessä MDR toimintaa. Erityisesti eteneminen solujen solusyklin läpi liittyy muutoksia monia parametreja (cellular energinen tila, fyysinen tila plasmamembraanin, ja tasot kofaktori), jotka voivat mahdollisesti vaikuttaa kineettiset parametrit MDR kuljettajat. Oletimme, että intensiteetti lääkevuoto- on eniten merkitystä indikaattorina solujen chemoresistance kapasiteetti ja heijastaa sekä MDR pumppu ilmaisun ja molekyylitason katalyyttinen aktiivisuus kokonaisuudessaan. Havaitut tässä MDR kuljetusta MRP-tyypistä vain MCF-7-solujen yhtyy luontainen ilmaus MRP1 proteiinien ja puute MDR1 proteiinien raportoitu aiemmin (24).

Muutamat toiminnallisesti suuntautuneita tutkimuksia aikaisemmin suoritettu että oli käytetty epäsuora, semikvantitatiivinen arviointi MDR tehokkuuden ja ehdotti aktivoitumisen MDR liikenteen S ja G2 /M vaiheita leukemiasoluja [40]. Täällä sovellettu tiukkaa määrällisten menetelmien tutkimiseen solukierron liittyviä MDR modulaatiota.

Viime vuosikymmenen aikana, eli neoadjuvant terapeuttinen lähestymistapa, jonka tavoitteena on alentaa kasvaimen massan helpottaa jatkokäsittelyä, on löytää yhä käyttää. Tämän valossa lähestymistavan chemoresistance valtaväestön syöpäsolujen yhdessä, että kasvain-aloittamisen solut, ovat ratkaisevan tärkeitä. Niinpä tässä työssä tutkittiin koko väestö MCF-7-soluihin.

soveltaminen yksisoluiset lähestymistapaa 2c ja 4c alaryhmien Klonaalisten rintasyöpäsolujen paljasti lisääntyminen keskiarvoja molempien MDR aktiivisuuden ja tehokkuutta 4N soluissa; tämä tarjoaa ensimmäisen määrälliset kineettinen todiste muutoksia MDR liikenteen aikana solusyklin etenemisen. MDR aktivaatio 4N soluissa oli vieläkin selvempi, kun ominaista modaalinen (sijasta keskiarvo) arvoista MDR muuttujia alapopulaatiot (Fig. 4C). Karakterisointi MDR on runsain solutyyppi kasvaimen olisi tärkeää, että ennusteen kasvaimen välitön vastaus kemoterapiaa, joka soittaa pohjapinta rooli neoadjuvant terapeuttinen lähestymistapa. Tutkiminen varren kaltainen subpopulaatio syöpäsolujen tarvitaan ymmärtää, jos kasvu pitkällä aikavälillä tehokkuuden solusyklin valikoiva kemoterapia voidaan odottaa.

edut yksisoluiset kinetiikan lähestymistapa tutkimuksiin että yhden liikennemuodon solupopulaatioiden käytetty meidän kokeissa testattiin vertaamalla tuloksia yksisoluiset ja väestön (Fig. 1) analyysit samat tietuekokonaisuudet (Fig. 4D). Väestön kineettiset parametrit (

V

max ja

V

max /

K

M) saatu yksisoluiset lähestymistapa kasvoi merkittävästi upon solujen siirtymistä 2c on 4c tilaan. Samalla nämä parametrit saadaan väestöstä lähestymistapa pysyi lähes ennallaan, kun tällaisesta muutoksesta.

Useimmat kasvaimet uskotaan olevan peräisin yhdestä ainoasta solusta, mutta useita klooneja valitaan tyypillisesti aikana kasvaimen kehittymisen ja koettu on edennyt pitkälle . Näin ollen todellinen tuumorikudokset odotetaan olevan monipuolisempia kuin yhden viljellyt klooni. Tämän seurauksena väestö lähestymistapa, joka antaa virheet yhden viljellyt klooni, johtaa vielä suurempia virheitä oikeasti kasvaimia. Näin ollen hyöty käyttämällä yksisoluiset lähestymistapa on vielä suurempi, jos todellinen tuumorikudoksia analysoidaan.

Kun yksisoluiset lähestymistapaa sovelletaan todellisiin tuumorikudoksia, analysoidun solupopulaatio voi sisältää soluja eri klooneja. Vaikka yksisoluiset lähestymistapa oikein määrittää kineettisen kuvaava analysoi väestön tulosten tulkinta on aina tehtävä huolellisesti. Esimerkiksi jos yksisoluiset lähestymistapa paljastaa, että MDR ulosvirtaus korreloi solusyklin seosta varten klooneja, voimme päätellä suurella varmuudella, että kaikki kloonit käyttäytyvät samalla tavalla suhteessa MDR ulosvirtausta. Jos mitään korrelaatiota löytyy, kaksi tulkinnat ovat mahdollisia: (i) MDR ei korreloi solusyklin tai (ii) MDR korreloi eri tavalla eri kloonia ja korrelaatiot kumoavat toisensa, kun sekoitus kloonien vedetään yhteen. Löytää oikea vastaus, kohdalla pitäisi tehdä laajaa lisätutkimuksia MDR kinetiikkaan yksittäisten kloonien. Mielestämme vertaamalla eri viljellyt kloonien pitäisi olla seuraava askel yrittää selvittää, jos eri kloonia saman kasvain vaihtelevat suhteessa MDR-solukierron korrelaatio. Vaikka on hyvin hankala tavallisella mikroskoopilla, tällaista tutkimusta voisi olla täysin mahdollista, jos automatisoitua kuva sytometriaa käytetään.

kokeellisesti löydetyn suurta vaihtelua Michaelis-Menten parametrien yksittäiset solut on yhdenmukainen muutamia raportteja jossa yksisoluiset Michaelis parametrit käsiteltiin [41]. Yksi syy tähän vaihtelu voisi olla olemassa kahta kuljettajaa, joilla kullakin on ainutlaatuiset ominaisuudet [42], [43].

On osoitettu, että monissa solutyypeissä pidätetty solukierron [ ,,,0],44], jotka pidätettiin G2 vaiheessa [3], [45], voivat osoittaa kohonnut vastustuskykyä syöpähoidon, joka on yleensä selittyy modulaatio apoptoottisten ja mitoottisten mekanismeja. Käsite solusyklin välittämän lääkeresistensseihin johdettu näistä tutkimuksista pyritään ymmärtämiseksi ja optimoimiseksi solukierron perustuvien lääkkeiden yhteisvaikutuksia [3]. Tuloksemme viittaavat siihen, että vaihtelu monilääke liikenne voi voimakkaasti edistää solusyklin liittyvää modulaatiota chemoresistance.

Mahdolliset käännös meidän kokeellisen lähestymistavan kliiniseen käytäntöön vaatii vielä paljon työtä, erityisesti tutkimalla suhteet välillä erityisesti ABC kuljettajat ja sytostaatit. Koska voidaan olettaa, että heterogeenisyys kasvain kudosten on korkeampi kuin solulinjojen yksisoluiset lähestymistapa olisi erityisen hyödyllistä tässä tapauksessa.

läsnäolo ja aktiivisuus MDR kuljettajat kliinisistä näytteistä katsotaan olla arvokas prognostinen indikaattori monet syövän muotoja [8], [46].