Krooninen sairaus

tiivistelmä

Mismatch korjaus-puutosta kolorektaalisyövissä (CRC) näyttö laajaa epävakautta DNA mikrosatelliitti sekvenssit (MSI). Vaikka MSI on raportoitu yleisesti esiintyy koodaavan toistoja, mikä toiminnan muutokset useita geenejä, jotka koodaavat syöpään liittyvien proteiinien, ei ole tietoa oletetun vaikutuksia tähän prosessiin ei-koodaavan MikroRNA. Vuonna miRbase V15, olemme määritelleet hyvin harvat ihmisen microRNA geenien kanssa mono- tai di-nukleotidin toistoja (

n

= 27). Mutaatioanalyysin näiden sekvenssien suuri joukko MSI CRC solulinjojen ja primaarikasvaimille korostettiin epävakautta 15 24 mikroRNA geenit menestyksekkäästi tutkittu muuttuja taajuuksilla välillä 2,5%: sta 100%. Sen jälkeen kun suurimman todennäköisyyden tilastollinen menetelmä, microRNA geenit erotettiin kahteen ryhmään, jotka poikkeavat toisistaan ​​merkittävästi niiden mutaatio taajuudet ja niiden taipumus edustavat mutaatioita, jotka voivat tai eivät voi olla alle valikoiva paineita MSI kasvainten etenemiseen. Ensimmäiseen ryhmään kuului 21 geenejä, jotka näytetään vähän tai ei lainkaan mutaatioita CRC. Toinen ryhmä sisälsi kolme geeniä, eli

HSA-mir-1273c

,

HSA-mir-1303

ja

HSA-mir-567

, ja usein (≥80 %) ja joskus bi-alleelimutaatioiden in MSI kasvaimia. Sillä ainoa ilmaistuna paksusuolen kudoksissa,

HSA-mir-1303

, ei ole suoraa yhteyttä välillä havaittiin läsnäolo tai ei mono- tai bi-alleeliset muutokset ja tasot kypsän miR ilmentymisen MSI solulinjoissa määritettynä sekvensoimalla ja kvantitatiivinen PCR vastaavasti. Kaiken kaikkiaan meidän tulokset antavat näyttöä siitä, että DNA toistot sisältämä ihmisen miRNA geenit ovat melko harvinaisia ​​ja säilynyt mutaatioista johtuen MSI MMR-puutosta syöpäsoluja. Funktionaaliset tutkimukset vaaditaan nyt päätellä, mutatoitunut miRNA, ja erityisesti miR-1303, voisi olla rooli MSI kasvainten synnyssä.

Citation: El-Murr N, Abidi Z, Wanherdrick K, Svrcek M, Gaub MP , Fléjou JF, et ai. (2012)

Mirna

Geenit ovat uutta Tavoitteet mikrosatelliittimerkkien epävakaus peräsuolen syövän. PLoS ONE 7 (2): e31862. doi: 10,1371 /journal.pone.0031862

Editor: Hoguen Kim, Yonsei University College of Medicine, Korean tasavallan

vastaanotettu: 18 marraskuu 2011; Hyväksytty: 13 tammikuu 2012; Julkaistu: 14 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 EL-Murr et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: N El -Murr on vastaanottaja LNCC (Ligue Nationale Contre le Cancer) yhteyteen. Tätä työtä tukivat Institut National de la Sante et de la Recherche médicale (INSERM). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

viime vuosikymmenellä, microRNA (miRNA) geenit on laajasti tunnistettu nisäkkäillä, kasveja ja virukset. Ne koodaavat lyhyitä (~22 nukleotidia) yksijuosteisten kypsän RNA-molekyylejä (MIRS), jotka säätelevät geeniekspressiota lähinnä -emäspariutumisen 3 ’UTR: kohde-mRNA [1], [2]. Ihmisissä, on arvioitu, että yli tuhat MIRS ekspression säätelemiseksi noin 60% proteiinia koodaavan geenejä. Lukuisat toiminnalliset tutkimukset ovat raportoineet osallistumisen Mirs erilaisissa solujen prosesseissa, ja myöhemmin niiden vapauttaminen useissa ihmisen sairauksia kuten syöpää [2], [3]. MiRNA geenit voivat sijaita intronit ja harvemmin sisällä eksonit, tai geenien välinen alueet, niiden ilmaisua säännellään riippumattomien tai isäntä geenin promoottorit [4]. Lukuun ottamatta miRNA-geenit, jotka aiheutuvat kokonaan saumattu pois intronit isännän mRNA (nimetty mirtrons [5]), kukin microRNA geeni tuottaa kolmea molekyylejä, joille tehdään peräkkäisiä cleavages kaksi RNAaseja, kutsutaan Drosha ja Dicer, jolloin saadaan täysin toimiva miR: suuri ensisijainen transkripti (pri-miR, ~500 3000 emästä), hiusneula-like välilähtöainetta (pre-miR, -60 ja 80 emästä), ja ohimenevää miRNA duplex, joista kaksi eri kypsän MIRS valmistetaan yleensä eri (suuret miR /vähäinen miR *) tai vastaava (miR-5p /miR-3p) määrät [5], [6]. Jokainen kypsyminen askel nojaa vahvasti ratkaisevan rakenteellisia piirteitä, jotka määräävät oikea ja luotettava biogeneesin kypsän miRNA. Sekä koko ja sekvenssin vaihtelut eri alueilla miRNA hiusneula (pohjapinta segmentti, varsi, miRNA duplex ja silmukka) voi aiheuttaa häiriöstä miR biogeneesiä ja uskotaan tuumorigeenisia seurauksia [7], [8], [9], [10 ], [11], [12].

Useat geneettisiä ja epigeneettiset mekanismit, jotka johtavat muuttaminen miR ilmentymistä ja toimintaa on kuvattu ihmisen kasvaimissa, mukaan lukien peräsuolen syöpä (CRC) [13], [14 ], [15]. Metylointi on

miRNA-34b /c

CpG-saarekkeiden Esimerkiksi on usein havaittu CRC solulinjoissa ja ensisijainen kasvaimia [16], ja lisääntynyt ilmentymä miR-17-92 klusteri on havaittu yhdessä kromosomaalisen epävakaus (CIN) at kromosomissa bändi 13q31 sisältäville

miRNA

lokus [17]. Tärkeää on, CIN kutsutaan myös MSS (mikrosatelliittimerkkien vakaus) luonnehtii tärkein osajoukko CRC (eli 80-85% kaikista CRC). Mikrosatelliitti epävakaus (MSI), toisaalta, erityispiirteenä johtuvat DNA mismatch korjaus (MMR) puutos, on raportoitu loput 15-20% CRC [18]. Vuonna MSI CRC, joka yleensä ei näytä CIN, syövän etenemisen arvellaan johtuvat erityisesti kertyminen toissijaisen mutaatiotapahtumaa (poisto /lisäys), jotka vaikuttavat mikrosatelliittia, toistuvat sekvenssit lyhyen DNA motiivien (1-6 emäsparia), jotka sisältyvät syöpää liittyviä geenejä [19], [20]. Nämä mutaatiot vaikuttavat kohdegeenien mukana erilaisten biologisten reittien, kuten sääntely solusyklin ja /tai soluproliferaation (

TGFBR2, IGF2R, TCF4, AXIN2, PTEN, RIZ

…), apoptoosin säätelyyn (

BAX, CASP5, BCL10, APAF1, FAS …

), tai DNA-vaurion signalointi ja korjaus väyliä (

RAD50, BLM, MSH3, MSH6, MBD4, MLH3, CHK1, ATR …

). Useimmissa kohdegeenien, frame-shift mutaatioita havaittiin eksoni-toistoja, useimmiten mononukleotidi kirjoituksia, jotka johtavat tuotannon katkaistu proteiineja. Harvemmin, somaattiset mutaatiot introni mononukleotidi mallikertaa MSI kohdegeenien (

MRE11

ja

HSP110

) on osoitettu johtavan poikkeavasta silmukoinnin ja sukupolven muuttuneen proteiinien [21], [22 ].

tässä tutkimuksessa tutkimme ensimmäistä kertaa, onko miRNA geenejä, riippumatta niiden genomista sijainti, saattaa olla uusia tavoitteita MSI CRC. Kaikki ihmisen miRNA sisältävien geenien mononukleotidin (MNR) tai dinukleotidi toistoa (DNR) (≥7 toistoja) niiden hiusneula sekvenssit seulottiin mutaatioita (nukleotidit lisäykset /poistot) käyttäen suuren joukon MMR-puutosta CRC solulinjoja ja primaarisia kasvaimia, kuten sekä lymfoblastisolulinjoissa (LBLs) ja MSS CRC valvonta voitaisiin arvioida polymorfisen aseman näiden sekvenssien.

tulokset

seulonta mikrosatelliittimerkkien toistoja miRNA hiusneulat ja määrittämällä niiden polymorfismin MMR -proficient solulinjat

joukossa 940 ihmisen miRNA sekvenssit lueteltu miRbase V15, 24 sisältävät MNR ainakin seitsemän toistuvaa yksikköä (2,5%) (taulukko 1). DNR (≥7 toistoja) ovat harvemmin löytyy miRNA sekvenssit (3/940, 0,3%) (taulukko 1). Nämä miRNA geenit on jaettu useiden kromosomeja. Valtaosa löytyy proteiinia koodaavan geenien (22/27, 81,5%), enimmäkseen intronisekvensseihin (21/22, 95,5%). Toistuvat sekvenssit vaihtelevat kooltaan ja voi olla jopa 18 toistoa. Yli kaksi kolmasosaa MNR (17/24; 71%) ovat pieniä (7-8 emäsparia) ja A /T rich (16/24; 67%). Ne ulottuvat monilla alueilla hiusneula esiaste (kuvio 1) pidetään tärkeänä miR kypsymisen ja /tai toiminto. Nämä alueet koostuvat pohjapinta segmenttien, varsi, Mirna duplex ja päätelaitteen silmukka [7], [8], [9], [10]. Kaksi miRNA (

HSA

–

mir-511-1

ja

HSA

–

mir-511-2

) kaksoiskappaleita saman geenin ja näyttää ainutlaatuinen sekvenssi erottaa meidän analyysi. Paitsi

HSA

–

mir-1234

ja

HSA

–

mir-3166

, kaikki miRNA geenejä monistettiin onnistuneesti käyttämällä erilaisia ​​loisteputki alukkeiden rajoittuva hiusneula järjestyksessä. MiRNA geenit analysoitiin ensin terveillä henkilöillä (LBLs,

n

= 40) arvioinnin luontainen polymorfismi (taulukko 2). Out of 21 MNR analysoitu normaalissa DNA-näytteitä, suurin osa (17 geenit) osoitettiin olevan monomorphic (taulukko 2). Pituus polymorfismi (1 bp shift) in

HSA-mir-1303

havaittiin pienempi alleeli, jolla on korkein alleelifrekvenssi (taulukko S1, kuva S1). Yhden emäksen monimuotoisuus (SNP)

rs33982250

ja

rs34889453

, molemmat vastaten Adeniini- poisto, raportoidaan

HSA-mir-1303

ja sijaitsevat ulkopuolella MNR [ ,,,0],23]. Harvinaiset alleeleja jopa 3-ep vuorossa havaittiin myös

HSA-mir-511

,

HSA-mir-543

ja

HSA-mir-1302-7

geenit (taulukko S1, kuvio S1). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin sarjassa 25 ensisijaisen MSS Kolorektaalituumorien ja 13 MSS CRC solulinjoja (taulukko S1).

pohjapinta segmentti (BS, yksijuosteista RNA: ta), varsi (S, kaksijuosteinen RNA ) ja terminaali silmukka (L) on nimetty. Duplex (D, joka sisältää yhden tai kaksi potentiaalista MIRS) on pidettävä eri kokonaisuus ja siten erottaa varren alueella. Alueet hiusneula joita MNRs tai DNRs ovat huomattava jokaista miRNA. Vasemmalle järjestelmän ovat miRNA geenejä, joiden sekvenssi toistuu päällekkäin kaksi aluetta.

Mirna geenejä DNR näytti olevan erittäin polymorfinen (taulukko 2). Kaksi 3 geenien näkyy useita alleeleja tärkeitä pituuden muutokset: 6 ja 15 alleelien löytyi vastaavasti

HSA-mir-620

ja

HSA-mir-558

terveillä henkilöillä (taulukko S1, kuva S1). Täällä, pituus polymorfismit on raportoitu sijaittava mikrosatelliittimerkkien toistot [23].

mutaatioanalyysi miRNA geenien kanssa MNR ja DNR

epävakaus Kaikkien miRNA toistojen tutkittiin sarjassa 41 ensisijaisen MSI CRC ja 14 MSI CRC solulinjoja (taulukko 2). Ensisijainen MSS CRC (

n

= 25) ja MSS CRC solulinjoissa (

n

= 13) käytetään kontrolleina. Harvoja poikkeuksia lukuun ottamatta, MSS valvonta ei näytä koko muutoksia tahansa miRNA toistoja (3/557 ja 3/304 mutaatiotapahtumaa perusterveydenhuollossa kasvaimia ja solulinjoissa, vastaavasti), kun taas 135/913 ja 50/326 mutaatiotapahtumaa olivat havaittu MSI primaarikasvainten (

p

= 2,2 × 10

-16) ja solulinjat (

p

= 2,28 x 10

-10), tässä järjestyksessä. Analyysi DNR osoitti, että 2 miRNA 7 (

HSA-mir-1277

) ja 11 toistoa (

HSA-mir-620

) olivat muuttumattomina MSI näytteissä.

Hsa-mir-558

18 toistoa ilmestyi mutatoitunut kolmasosa MSI solulinjojen (4/13; 30,8%) ja MSI CRC (12/38; 31,6%) (taulukko 2).

Tilastolliset tutkimukset tehtiin miRNA kanssa MNR koska niiden eniten (

n

= 21). Tietojen perusteella taulukossa 2, osoitamme, että valtaosa miRNA geeneistä ovat harvoin (3/21 kanssa mutaationopeus ≤15%) tai ei muuteta (14/21, 66%) vuonna MSI CRC solulinjoissa, kun taas hyvin harvat geenit (4/21; 19%) on todettu olevan huomattavasti mutatoitunut. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin MSI CRC (taulukko 2). Kuitenkin muutokset olivat harvemmin kohdattu MSI kasvaimissa verrattuna solulinjoihin, havainto sen mukaisesti, mitä on raportoitu geeneille koodausvälineillä MNRs [24]. Lisäksi olemme huomanneet merkittävän korrelaatio koon miRNA MNRs ja mutaation taajuus MSI kasvainten (

p 0,001

, r = 0,76) (kuva 2). Tämä korrelaatio oli jo havaittavissa monien mikrosatelliittimerkkien sekvenssit riippumatta niiden genomista lokalisoinnit (geenien välisen, koodaus /eksoni, koodaus /5 ’3’ja introni MNRs) (kuva S2).

Huomaa erittäin merkittävä korrelaatio havaittu.

miRNA geenien kanssa MNR erottuvat eri ryhmiin

käyttäen suurimman todennäköisyyden tilastollinen menetelmä aiemmin kuvatulla tavalla (katso materiaalit ja menetelmät ja [24]), tunnistimme kaksi erillistä ryhmää miRNA geenejä sisältäviä MNR että erosivat toisistaan ​​mutability MSI primaarikasvainten (kuva 3). Lyhyesti, testi katsoo, että kaikki geenit kuuluvat johonkin ryhmään taajuuden ja vastustaa Tämän konfiguraation vaihtoehtoinen hypoteesi kahden toisensa poissulkevia ryhmää taajuuksia. Todennäköisyys suhde laskee mahdollisuudet jokaisen hypoteesin ja antaa kaikkein ”todennäköistä”. Ensimmäinen, suurin ryhmä koostuu miRNA geenejä todettu ollenkaan tai ei paljon mutatoitunut MSI kasvaimet (18/21; 86%). Toinen ryhmä sisälsi 3 miRNA geenejä (

HSA-mir-1273c

,

HSA-mir-567

ja

HSA-mir-1303

) usein mutatoitunut MSI CRC ( ≥75%). Samanlaisia ​​ryhmiä määritelty MSI CRC solulinjoissa (kuvio S3).

Kaksi erillistä ryhmää miRNA kanssa MNR perustetaan perustuvat niiden mutaatio taajuuksilla MSI primaarikasvaimia. Raja-arvo lasketaan suhde todennäköisyys tilastollisen menetelmän ja leimaa pystysuora katkoviiva. Huomaa, että

HSA-mir-644

sisältyy ryhmään miRNA harvoin tai ei mutatoitunut MSI CRC (

n

= 18, mutaatioita 25%) kun taas

HSA-mir-1273c

,

HSA-mir-567

ja

HSA-mir-1303

muodostavat ryhmän miRNA usein muuttunut (

n

= 3, mutaatioita 75%).

karakterisointi muutoksia ja niiden vaikutuksia kypsä miRNA ilmaisun

analyysi mahdollisti tunnistamisen 3 MSI kohdistetut miRNA:

HSA -mir-1273c, HSA-mir-567 ja HSA-mir-1303

. Näistä geeneistä, suurin osa MSI solulinjojen esitettiin jopa 3 bp poistoja (kuvio 4, taulukko S2), ja harvoin nukleotidin lisäys (taulukko S2). Kaksisuuntainen alleelinen mutaatio havaittiin myös 36%, 57% ja 83% on muuttunut MSI CRC solulinjoja mir-1273c, mir-567 tai mir-1303, vastaavasti (kuva 4, taulukko S2). Samanlaisia ​​muutoksia havaittiin MSI primaarikasvaimia lukuun ottamatta

HSA-mir-1273c

, joka yleensä näkyy pienempiä määriä muutoksia kasvainten (vain 1 bp-deleetio) (kuvio 4, taulukko S2). Mitä tulee polymorfinen

HSA-mir-1303

geeni, jonka pääalleelille näyttää A-deleetio (taulukko S1), hiusneulan edeltäjä sekvensoitiin kussakin MSI CRC solulinjaa määrittää todellista laajuutta poisto. Kuten LBL ja MSS solulinjoja (taulukko S1), MSI solulinjat näytti olevan homotsygoottisia (50%; dela /dela) tai heterotsygoottinen (50%, Dela /A) ”dela” alleeli. Merkityksellisyys ”dela” SNP

HSA-mir-1303

on kuvassa 5A, joka esittää muutoksia terminaalin lenkki mir-1303 hiusneularakenteita. Ulottuvuus silmukan sisältävän mikrosatelliittimerkkien pienenee, kun muutokset ovat suurempia ja aina hiusneularakennetta sisältää A-lisäys SNP (kuvio 5A).

Alleelisia profiilit useille MSI CRC solulinjoja ja primaarisia kasvaimia näkyvät. Normaali profiilit määritellään LBL ja MSS solulinjoissa ja ensisijainen kasvaimia. Sillä monomorphic geenejä, eli pystysuora katkoviiva osoittaa ainutlaatuinen alleeli. Polymorfinen vyöhyke

HSA-mir-1303

määritellään kahden katko- pystyviivoja menossa pitkin 2 alleelit (katso kuva S1). Koot (bp) osoitetaan alla olevaan laatikkoon jokaisen profiilin. Eri alleelinen poistot vaihtelevat 1-4 emäsparin havaittiin MSI CRC solulinjoissa ja ensisijainen kasvaimia ja on lihavoitu. Havaittu poistot olivat joskus bi-alleelinen in MSI CRC solulinjoissa. Vuonna MSI primaarikasvaimia, alleelinen profiilit olivat myös hyvin vaikuttava bi-alleelimutaatioiden. Toiminnan vuoksi polymorfismia, jotka voivat muuttaa sekvenssin pituus, hiusneula sekvenssi

HSA-mir-1303

määritettiin oikean ja luotettavan arvioinnin muutoksista MSI CRC solulinjoissa (katso taulukko S2) .

V: Muutokset toista sarjoissa

HSA-mir-1303

(A) ja sen variantti (dela) ei näytä vaikuttavan yleiseen toissijainen rakenne hiusneula mutta dimensio silmukan (annoted sisällä) pienenee hieman määritettynä mfold ohjelmisto (https://mfold.rna.albany.edu/). Aikuinen miR (lihavoitu) ja MNR (alleviivattu kirjaimet) esitetään molemmissa hiusneula sekvenssit. Nuolet osoittavat mahdollisen kannat adeniinin poistamisen, joka johtaa laajentumisen silmukan. B: vertailu suhteellisen ilmauksia kypsän miR-1303 MSS (muuttumattomana MNR) ja MSI CRC solulinjoissa mikään, mono- tai bi-alleelimutaatioiden on

HSA-mir-1303

. MiR ilmentyminen normalisoida ilmaus RNU48. Keinot esitetään kunkin ryhmän (musta vaakasuora viiva). Merkittävä kasvu ilmaus miR-1303 ei havaittu MSS solulinjojen ja normaalin paksusuolen limakalvojen (

p

= 0,012). C: puuttuminen korrelaatio koon mir-1303 silmukka ja tasot kypsän miR-1303 ilmentyminen MSI solulinjoissa ilman (HCT-8, TC7) tai bi-alleelimutaatioiden (LS411, RKO, LIM2405, KM12, LoVo HCT116) in MNR on

HSA-mir-1303

. Huomaa solulinjoja, jotka tuottavat hiusneula esiasteiden kanssa samankokoinen silmukan eivät ilmaista kypsä miR-1303 eri tasoilla.

Näiden tulosten perusteella, me arveltu, että nukleotidideleetioilla ilmenneet miRNA esiasteiden saattavat vaikuttaa biogeneesissä kypsien Mirs, muuttamatta niiden ekspressiotasoja ja /tai niiden järjestys ilmoittamat muusta miRNA geenejä [7], [8], [9], [10]. Käyttämällä erityisiä määrällisiä RT-PCR teknologioita, päätimme suhteellista ilmentymistä kunkin kypsä miR villityypin (WT) ja mutatoitunut CRC solulinjoja verrattuna ilmentymisen terveillä paksusuolen limakalvon. Expression of miR-567 ja miR-1273c ei ollut havaittavissa paksusuolen limakalvon ja peräsuolen solulinjoissa (C

T 36 sykliä) (tuloksia ei esitetty); kun taas miR-1303 näytti olevan melko ilmaistaan ​​sekä normaalissa ja kasvaimen paksusuolen solut (kuvio 5B). Ottaen huomioon epävakauteen, miR-1303 ilmentyminen analysoitiin ensin vuonna MSI CRC solulinjoissa. Tavallisella paksusuolen limakalvon palvelevat verrokkeina, eroa miR-1303 ilmentymisen välillä todettiin muuttumattomana

HSA-mir-1303

MSI solulinjat ja heterozygously mutatoitunut MSI solulinjoissa (kuvio 5B). Nostamalla ilmaus miR-1303 ekspressio kuitenkin havaittiin joitakin MSI solulinjojen mutatoitunut molemmissa alleeleissa (kuvio 5B). Lisäksi solulinjat pitäisi olla identtisiä rakenteita miRNA pinnit (kuvio 5C), eivät osoittaneet vertailukelpoisia ekspressiotasoja. Sen vuoksi on, niin kauan kuin koko silmukan ei korreloi ekspressiotasoja, että MSI muutokset eivät vaikuttaisi kypsä miR ilmentymisen. Merkittävä lisäys miR-1303 havaittiin MSS CRC solulinjoissa verrattuna normaaleihin paksusuolen limakalvon tuki tätä tulosta (kuvio 5B).

Keskustelu

Toistaiseksi ainoa vakiintunut epäsuoria vaikutuksia MSI prosessi miRNA biogeneesin on kohdentaminen ja siksi häiriöitä proteiinin koodaavan geenien miRNA käsittelyyn ja kuljetukseen [25], [26], [27], [28]. Tutkimuksemme on ensimmäinen raportoinnin somaattiset mutaatiot miRNA geenien vuoksi MSI MMR-puutosta CRC. Seulomalla lähes kokonaisuudessaan MNR ja DNR (≥7 toista yksikköä) sisältämien miRbase-V15-selityksin miRNA hiusneula sekvenssit,

HSA-mir-1273c, HSA-mir-1303 ja HSA-mir-567

olivat osoitettu olevan mutatoitunut korkealla taajuudella molemmissa CRC solulinjoissa ja ensisijainen kasvaimia. Koska korkea mutaatio taajuus on ensimmäinen kriteeri tällä hetkellä oteta huomioon voidaan tunnistaa kohde geenejä, jotka on rooli MSI-ajettu polku syöpä [19], [20], [29], [30], nämä miRNA geenit, voi siten olla todellinen tavoite MSI. Sen sijaan kaikki muut miRNA muutokset tunnistimme ovat todennäköisesti seurausta taustalla geneettinen epävakaus kuvaavat näitä kasvaimia. Niiden todettiin vaikuttaa matalilla taajuuksilla ja voi olla vain vähäinen merkitys paksusuolen kasvainten synnyssä, jos sellaisia ​​on. Lisäksi jotkut miRNA geenejä sisältäviä mikrosatelliittimerkkien todettiin koskaan mutatoitunut CRC solulinjoissa ja ensisijainen kasvaimia. He saattavat pitää selviäjä miRNA geenit, joiden mutaatiot ei valita aikana syövän etenemiseen, sillä ne voivat olla erittäin vahingollisia syöpäsoluja [19].

MSI vaikuttaa myös sekvenssin kriteerit,

esim

pituus toista. Odotetusti, havaitsimme kaiken kaikkiaan positiivinen korrelaatio pituuden miRNA toistoja ja niiden mutaatio hinnat MSI CRC, joka vahvistaa havainnon koodaukseen ja koodaamattomasta MNR. Kuten vaaditaan proteiinin koodaavan geenien [29], [30], toiminnalliset kriteerit ovat tarpeen väittää, että MSI kohdistetut miRNA geenit on rooli MSI paksusuolen kasvainten synnyssä. MiRNA ovat vahvasti mukana geeniekspression säätelyssä, on siis liittyy erilaisia ​​biologisia prosesseja. Mitään biologista roolia ei ole vielä katsottu johtuvan

HSA-mir-1303

, joka on, näiden joukossa ainoa miR, joka oli merkittävästi ilmaistu paksusuolen limakalvolla. Useita satoja mRNA voidaan määrätä

in silico

Mir-1303 riippuen käytetystä ohjelmistosta, ja edelleen analyysit ovat tarpeen määritellä niitä, joiden

in vivo

ilme riippuu oikeastaan ​​

HSA -mir-1303

. Lisäksi tärkeintä on todistaa, että MNR muutokset johtuvat MSI saattavat vaikuttaa mir-1303 toiminto. Useat joukkueet ovat jo korostaneet merkittävä rooli terminaalin silmukan sisällä ensisijainen miRNA hiusneulan miRNA biogeneesissä ja toiminto [8], [9]. Lisäksi yhden emäksen muutos (eli SNP) sisällä miRNA itse geenin (yksi-, esi- ja kypsä miRNA sekvenssit) on joskus riitä muuttamaan miRNA ilmentymisen ja /tai toiminto syöpien, estää käsittely pri-miRNA pre -miRNA [23], [31], tai päinvastoin, lisätä kypsä miR ilmaisun [32]. Me ei täällä tarkkailemassa mitään selvää korrelaatiota ilmentymisen taso kypsän miR-1303 ja mutaation DNA toista sisältyvät sen terminaalin silmukan MSI CRC soluissa riippumatta SNP vieressä silmukka. Lisätutkimukset käyttäen asianmukaisia ​​Plasmidirakennelmia kehitetään tietää MNR vaikuttavia mutaatioita tällä miRNA geeni voisi muuta käsittelyä kypsän miR-1303 tuottavien eri MIRS [33] tai toiminnan ensi- tai ennalta miRNA molekyylejä, joita viime aikoina on raportoitu by Trujillo

et al.

[34] olevan biologisesti aktiivisia.

Yhteenvetona havaintomme on kaksi pääasiallista vaikutusta roolin miRNA in MSI-ajettu syövän synnyn. Ensin osoittamaan, että MSI CRC näyttö vain muutamia somaattisia mutaatioita, jotka vaikuttavat muutamiin miRNA geenejä sisältävien DNA mallikertaa vielä epäselvä seurauksena käsittelystä ja näiden molekyylien toiminnan. Funktionaaliset tutkimukset ovat nyt tarpeen valvoa sitä ajatusta, että miR-1303 saattaa olla rooli MSI kasvainten synnyssä. Toiseksi ne osoittavat, että DNA toistot sisältämät miRNA geenit ovat suhteellisen harvinaisia ​​ja yleensä säilynyt mutaatioista johtuen MSI MMR-puutosta syöpäsoluja. Tämä tutkimus keskittyy nukleotidin toistojen sijaitsee hiusneula sekvenssit, jotka sisältävät vähintään ennalta miRNA, ja voitaisiin laajentunut MNR sijaitsevat muualla miRNA geenien tärkeitä transkription ja suurien ensisijaisen miRNA selostukset (pri-miRNA ).

Materiaalit ja menetelmät

DNA-näytteet

Normaali DNA: ta saatiin 40 terveiden yksilöiden (lymfoblastisolulinjoissa), jonka CEPH (Centre d’Etude du Polymorphisme Humain, Pariisi, Ranska). Ensisijainen tuumorikudoksista (41 MSI ja 25 MSS kasvaimet) potilailta, joille suoritetaan leikkaus CRC joko Saint-Antoine sairaala (Pariisi, Ranska) tai sairaalan Hautepierre (Strasbourg, Ranska) kerättiin biologisia Resources Centers kunkin toimielimen. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta. Ethics hyväksyntä saatiin Human Research Ethics Committee (Pariisi, Ranska) ja valitse ”Comité pour la Protection des personnes de Strasbourg” (CPPEST IV, Strasbourg, Ranska). MSI tila määritettiin fluoresoivalla multiplex-PCR, kuten aiemmin on kuvattu [35], ja annettiin arviointi prosenttiosuus epiteelikarsinooma kudoksen MSI näytteissä. Vain kasvaimista ainakin 40% kasvaimen materiaalia on sisällytetty tutkimukseen. DNA uutettiin 14 MSI ja 13 MSS CRC solulinjoissa käyttäen QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf, Ranska) mukaan valmistajan ohjeiden.

tunnistaminen mono- ja dinukleotidin toistoja

Systemaattinen seulonta mono ja dinukleotidi toistoja suoritettiin miRbase (versio 15, huhtikuu 2010 release) (https://www.mirbase.org/) [6]. Tämä tietokanta tarjoaa sekvenssit miRNA hiusneula esiasteiden ja kypsä miRNA eri lajeja. Valitsimme ihmisen miRNA, jossa on ainakin 7 toistuvaa yksikköä. Tämä vähimmäismäärä valittiin siksi mikrosatelliitteihin harvoin todettu olevan epävakaa alle 7 toistoja (katso SelTarbase, https://www.seltarbase.org/).

Mutaatio analyysi

Erityisiä reunustavia alukkeita hiuspinniribotsyymi sekvenssit suunniteltiin käyttäen Amplifix ohjelmistoa kullekin miRNA ehdokasta. PCR-monistus suoritettiin lopullisessa tilavuudessa 25 ui 5 ng DNA: ta, korkea tai matala MgCI

2-pitoisuus, tai ilman Q liuosta, ja Taq-DNA-polymeraasia (Qiagen). Alukesekvenssit on esitetty taulukossa S3. Terminen sykliolosuhteita käsittää ensimmäisen denaturaatiovaiheen 94 ° C: ssa 3 min, sitten 35 sykliä 94 ° C: ssa 45 sekuntia; 60 ° C: ssa 60 sekuntia ja 72 ° C 60 sekunnin ajan. Finnzyme Phusion High-Fidelity DNA-polymeraasia (Thermo Fisher Scientific, Illkirch, Ranska) käytettiin myös joissakin tapauksissa mukaan valmistajan protokollaa. Riittävä laimennoksia fluoresoiva PCR-tuotteita sekoitettiin formamidin ja GeneScan ™ 400HD ROX ™ Koko Standard (Life Technologies, Courtaboeuf, Ranska), kuumadenaturoitu ja ajettiin lyhyen kapillaarisen sisältävä GS Performance Optimized Polymer 7 ABI 3100 Genetic Analyzer. Tiedot visualisoitiin ja selityksin että GeneMapper 3.7 ohjelmisto (Life Technologies).

sekvensointi HSA-mir-1303 hiusneula esiaste

sekvenssi, joka sisältää HSA-mir-1303 hiusneula esiaste monistettiin Finnzyme Phusion High-Fidelity DNA-polymeraasia (Thermo Fisher Scientific) käyttäen seuraavia alukkeita: F-GTGAACTAAACGCTGCCTCTGCTA ja R-TGCAGGAACCGTACTAAGCACT (Tm = 66 ° C). PCR-tuotteet puhdistettiin sitten 96-kuoppaisille Multiscreen-PCR suodattamalla plats (Millipore, Molsheim, Ranska). Sekvensointi reaktio suoritettiin käyttäen Big Dye Terminator Kit V3.1 (Life Technologies) mukaan valmistajan protokollaa ja käyttämällä erikseen eteen tai taakse alukkeita. Sekvenssejä tuotteet puhdistetaan sitten 96 kuopan Multiscreen-DV-levyt (Millipore) Sephadex G-50 Fine ja analysoitiin ABI 3100 Genetic Analyzer (Life Technologies) B

Käänteiskopiointia ja Real-Time kvantitatiivinen PCR

Kokonais-RNA valmistettiin eksponentiaalisesti kasvaneet solut (9 MSS ja 14 MSI CRC-solut) ja normaalin paksusuolen limakalvon potilaista, joilla on CRC (

n

= 7) käyttämällä TRIzol-reagenssia (Life Technologies), sitten määrällisesti käyttäen NanoDrop spektrofotometriä. cDNA muodostettiin 10 ng tai 100 ng kokonais-RNA: sta käyttäen miRNA-spesifisiä stem-loop-RT-alukkeita (Life Technologies) ja miR-1303 tai miR-1273c, vastaavasti. RT-qPCR määritykset suoritettiin kolmena kappaleena ABI 7900 Sequence Detection System käyttäen TaqMan MicroRNA määrityksen mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Life Technologies). Havaitsemiseksi miR-567, The miScript PCR -järjestelmää (miScript RT ja miScript SYBR Green PCR-tarvikkeet) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Qiagen). Kun molemmat teknologiat, CT, syklin numero, josta määrästä monistetun kohteen saavuttaa kiinteä kynnys, määritettiin. CT edellä 36 pidettiin vääriä positiivisia. Aikuinen miRNA ilmentyminen normalisoitui kuin RNU48 (Life Technologies) tai RNU6B (Qiagen) (ACt = CT

miR-CT

RNU). Vertaileva kvantitointi suoritettiin käyttäen kalibraattori näytettä. Suhteellinen miRNA ilmentyminen ilmoitettuna 2

-ΔΔCT (2

– (ACt näyte-ΔCTcalibrator)). Lämpötilasyklit olosuhteet koostuvat 45 syklistä 95 ° C: ssa 15 s ja 60 ° C 1 min (Life Technologies) tai 45 sykliä 94 ° C: ssa 15 s, 55 ° C: ssa 30 s ja 70 ° C: ssa 30 s, edeltää alustava aktivointi vaihe 95 ° C: ssa 15 min (Qiagen).

Tilastolliset analyysit

väliset erot muuttujien arvioitiin kanssa

Chi-2

tai Fisherin tarkka testi, kun tarvitaan. Student-t-testiä käytettiin arvioimaan eroja miR ekspressiotasoja.

Kuten edellä on kuvattu Duval

et ai.

, Suhde todennäköisyys laskettiin osoittaa kullekin miRNA taajuuden ryhmä [ ,,,0],24]. Jossa

N

i

, kasvainten määrä testattiin lokuksessa

i

ja

n

i

, kasvainten määrä epävakaa tässä lokuksen

H1

vaihtoehtoinen hypoteesi että mukana kahden loci (ts. miRNA geenejä), jotka eroavat mutaatiosta taajuuksilla (a ”vakaa” ryhmä, jolla on alhainen mutaatioaste,

p

1

, ja ”epävakaa” ryhmä, jolla on korkea mutaationopeus,

p

2

. α ja 1-α ovat mittasuhteet sivustojen kanssa

p

1

ja

p

2

epävakautta vastaavasti). Sitä vastoin

H0

nollahypoteesina olettaa kaikkien miRNA geenejä voidaan ryhmitellä yhteen taajuusluokka,

p

0

, jossa ei ole merkittäviä eroja jokaisen miRNA lokuksessa. Suhde todennäköisyys saadaan:

Tämä suhde seuraa Chi-neliö jakelun kahden vapausasteen.

kaikki kokeet, 95%: n luottamusväli on sovellettu ja

P

0,05 pidettiin merkittävänä.

tukeminen Information

Kuva S1.

Allelic profiilit polymorfisten miRNA geenien LBLs. Sillä

HSA-mir-1303

(T

13),

HSA-mir-620

((TA)

11) ja

HSA-mir-558

((GT)

18) geenejä, polymorfista vyöhyke määräytyy väliin pienimmän ja suurimman alleelit (sijoitettu kahden katkoviiva pystyviivat) havaittiin suuri joukko 40 lymfoblastisolulinjoissa terveistä yksilöistä. Pituus hallitseva alleelit (ep) on merkitty alla olevaan laatikkoon kunkin profiilin.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0031862.s001

(TIF) B Kuva S2.

vertailu mutaation taajuuksia miRNA MNRs kuin eksonisekvenssit, transloimattoman, introni tai geenien välinen MNRs. MNRs koot välillä 7 ja 13 emäsparin ja eri genomista paikoissa sisällytettiin tässä vertailussa. Nämä MNRs otetaan SelTarbase (https://www.seltarbase.org/, lokakuu 2010 release), avoin tietokanta ihmisten mononucleotidic mikrosatelliittimerkkien mutaatioita MSI syövissä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0031862.s002

(TIF) B Kuva S3.

luokittelu miRNA kanssa MNR perustuu niiden mutaatio taajuuksia MSI CRC solulinjoissa.