Krooninen sairaus

tiivistelmä

geenitekniikalla bakteerien proteiinitoksiinit ovat houkuttelevia järjestelmiä toimituksen eksogeenisten proteiinien sytosoliin nisäkässoluissa. Binary C2 toksiini

C. botulinum

on tullut voimakas toimitus ajoneuvo, joka lepää sen sitova /translokaatio komponentti C2IIa ja muuntogeeninen sovittimen verkkotunnuksen C2IN että toimia yhdessä laukaista soluun ottoa. P53 tuumorisuppressoriproteiinia on ratkaisevan tärkeä tehtävä tukahduttamaan karsinogeneesissä ja usein inaktivoituu erilaisia ​​mekanismeja ihmisen kasvainsoluissa. Siksi rakensimme C2IN-p53-fuusioproteiini, joka on internalisoituu syöpäsolujen C2IIa. Tätä varten C2IN-p53 -fuusiorakenteen yliekspressoitiin

E. coli

hyvä liukoisuus, puhdistettiin hepariini affiniteettikromatografialla ja proteiinia identiteetti varmistettiin immunoblottauksella. Olemme osoittaneet, että fuusioproteiini kykenee sitoutumaan p53-konsensus-DNA: ta, joilla on korkea affiniteetti p53-spesifisellä tavalla

in vitro

. Seuraavaksi sisäistämisen C2IN-p53 seurattiin HeLa-soluissa solun fraktioinnin ja immunoblot-analyysi, joka osoitti C2IIa-välitteisen translokaatio fuusioproteiinin sytosoliin. Otto on myös esitetty A549 ja Saos-2-solut, joilla on samanlaiset tehokkuutta. Näitä havaintoja tukee myös konfokaali immunofluoresenssimenetelmällä analyysit C2IN-p53 /C2IIa hoidetuista HeLa ja A549-soluja, näytetään pääasiassa sytoplasmisen paikallistaminen Fuusiokonstruktin.

Citation: Fahrer J, Rausch J, Barth H (2013) Cell-Permeable rifuusioproteiini Perustuu

Clostridium botulinum

C2 myrkyllinen Toimitus p53 Tumorsuppressor osaksi syöpäsoluja. PLoS ONE 8 (9): e72455. doi: 10,1371 /journal.pone.0072455

Editor: Mark Isalan, Center for Genomic asetus, Espanja

vastaanotettu: 02 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 18 heinäkuu 2013; Julkaistu: 05 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Fahrer et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat lääketieteellisen tiedekunnan yliopiston Ulm (Bausteinprojekt L.SBN.0060 JF) ja tutkimuksen stipendi päässä Experimental Medicine Program Ulm JR. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

C2 toksiini

Clostridium botulinum

on prototyyppi binary aktiini-ADP-ribosyloivaan toksiineja [1] ja koostuu entsyymikomponenttia C2i, joka mono-ADP-ribosylates G-aktiini ja erilliset sitova /translokaatio komponentti C2II. C2II on tehtävä proteolyyttisellä katkaisulla, jonka N-terminuksessa tuottaa biologisesti aktiivinen C2IIa, joka välittää soluunoton C2i isäntäsolun sytosoliin [1]. Liuoksessa, C2IIa muodostaa heptameeriä merkitty ennalta huokosten ja sitoutuu sen reseptoriin löytyy solun pinnalla kaikkien nisäkässolutyypeissä tähän mennessä testatuissa [2]. Sen jälkeen kokoonpano C2i, The C2i /C2IIa kompleksi siirtyy solun clathrin endosytoosin on PI3K- ja Akt riippuvaisella tavalla [3], [4]. Vastauksena happamoitumisen esiintyvät varhain endosomeihin, C2IIa alistetaan konformaation kytkin, liipaisu se on liitetty endosomimembraanin jossa se muodostaa transmembraaninen huokosia [5]. Tämä mahdollistaa translokaatiota C2i sytosoliin, jota edistetään isäntäsolun chaperones kuten Hsp90 ja peptidyyli prolyyli

cis /trans

isomeraaseille [6], [7]. Myöhemmin C2i katalysoi kovalenttinen siirtoa ADP-riboosin päälle G-aktiini käyttäen NAD

+ toisena alustan [8]. Tämä kovalenttinen muuttamisen seurauksena romahdus aktiinisytoskeletonin ja lopuksi laukaisee kaspaasiriippuvaisen solukuolemaa [9].

Koska sen ominaisuuksia, binary C2 toksiini on käytetty lukuisissa tutkimuksissa monipuolisena jakelujärjestelmä helpottaminen käyttöönottoa eksogeenisten proteiinien isäntäsolun sytosoliin [10]. N-terminaalinen domeeni C2i (C2IN) sitoutuu C2IIa ja on ratkaisevan tärkeää C2IIa-välitteisen sisäistämisen, mutta se ei sisällä entsyymiä domeeni, joka on vastuussa sytotoksisia vaikutuksia. Näin ollen C2IN sovitin voidaan liittää kiinnostuksen kohteena olevia proteiineja geneettisen avulla, jota seuraa ilmentyminen yhdistelmä-DNA-fuusioproteiineja. Aiemmin C2IN on fuusioitu virulenssitekijä SpvB päässä

Salmonella enterica

laukaista sen sisäistämisen nisäkässoluihin [11]. Toinen merkittävä esimerkki liittyy bakteeri- C3 ADP-ribosyylitransferaasi, selektiivinen estäjä Rho GTPaasi, joka ilmaistaan ​​myös C2IN fuusioproteiinina ja pohjustettiin valaista Rho-välitteistä signalointia eukaryoottisoluissa [10], [12]. Äskettäin C2IN on yhdistetty biotiinia sitovan proteiinin streptavidiini, tuottaa monipuolinen nisäkkään antojärjestelmän biotiini-leimattu (makro-) molekyylejä, [13].

tuumorisuppressoriproteiinia p53 on transkriptiotekijä, joka on aktivoituvat vasteena erilaisiin stressin ärsykkeille, kuten genotoksinen solvauksia ja hypoksia [14]. p53 on keskeinen toimija ylläpito genomisen koskemattomuuden ja kykenee syövän vastaisen aktiivisuuden säätelevät solusyklin etenemisen ja houkutella apoptoottisen solukuoleman pahoin vaurioituneita soluja. Se pääasiassa toimii transkription indusoijana laajan valikoiman liittyvien geenien solusyklin pysähtymiseen ja vanhenemista, apoptoosin ja DNA korjaukseen [15], mutta kykenee myös laukaista apoptoosin transkriptio-riippumattomalla tavalla [16]. On tärkeää, p53 löytyy inaktivoitu monissa ihmisen kasvaimissa takia hankittu mutaatioista sen keskeinen DNA: ta sitovan domeenin [17] ja lisääntynyt proteolyyttisen hajoamisen jälkeen (poly) ubikinaa- [18]. Koska sen keskeinen toimintoja tuumorisuppressiogeeneksi, p53 on painopiste biolääketieteen ja kliinisen tutkimuksen ja lukuisia strategiat on kehitetty palauttamaan p53 p53 puutteesta kasvainsolujen [19]. Eräs lupaava lähestymistapa tähtää p53- geeni kasvainsoluihin eri ajoneuvoja. Se on äskettäin osoitettu, että polymeerinen: llä ladattuja mikropalloja kitosaani-DNA nanohiukkasten kätkeminen ihmisen p53-geenin tehokkaasti sisäistetään ihmisen hepatoomasoluja [20]. Toinen tutkimus kertoo samanaikainen otto p53-geenin ja antineoplastinen aine doksorubisiini kautta hybridi nanohiukkasten järjestelmän HeLa-solut [21]. Toinen mielenkiintoinen strategia nojaa sisäistämisen p53-proteiinin liittyvät (poly-) peptidit, jotka helpottavat sen sisäänottoa. Tätä varten, p53 on fuusioitu gonadotropiinia vapauttavan hormonin (GnRH), joka mahdollistaa oton fuusioproteiinien osaksi GnRH-positiivisia kasvainsoluja reseptorivälitteisen endosytoosin [22]. Lisäksi olemme osoittaneet, aivan äskettäin, että biotiini-konjugoitu p53-proteiini on sisäistetään ei-kovalenttisen tavalla C2-streptavidiini liikennejärjestelmän [23].

Kirjoittajat raportoivat, että muodostuu fuusioproteiini, jossa ihmisen p53 liittyi sovittimen domain C2IN geenitekniikan, mikä helpottaa sen toimituksen jota C2IIa sitova /translokaatiota yksikkö syöpäsoluja. Osoitamme, että yhdistelmä-DNA-C2IN-p53-fuusioproteiinia näyttää tietyn DNA: ta sitova aktiivisuus

in vitro

ja osoittaa C2IIa riippuvainen imeytymistä C2IN-p53 sytosoliin erilaisia ​​syöpäsolulinjoissa, kuten HeLa kohdunkaula syöpä ja A549 keuhkoadenokarsinooma soluja.

tulokset

Geenitekniikka, ilmentyminen ja puhdistus GST-merkitty C2IN-p53

Ihmisen p53-cDNA kloonattiin lukukehyksessä sovittimen domain C2IN järjestyksessä tuottaa ekspressioplasmidin p-GEX2T-C2IN-p53, joka suhtautuu GST-merkityn C2IN-p53 fuusio- konstruktin (Fig. 1A). Tässä C2IN domain välittää C2IIa riippuvainen oton fuusioproteiinin isäntäsolun sytosoliin, kun taas p53-osa on tarkoitus käyttää antiproliferatiivisia vaikutuksia, kun internalisaation. Fuusioproteiini jälkeen yli-ilmentyy 16 ° C: ssa

E. coli

Rosetta solut ja ajasta riippuvia ilmentyminen analysoitiin Coomassie-värjäys ja Western-blottauksella (kuvio. 1 B). Coomassie-värjäys paljasti puolin 97 kDa mukaisesti odotettavissa molekyylipainoa GST-C2IN-p53, joka kasvoi ajan mittaan. Koostumuksen, immunoblot-tunnistus monoklonaalisella vasta-aineella on suunnattu ihmisen p53 näytetään myös kehittyvien proteiinin kaista, joilla on samankaltaisia ​​molekyylipaino. Enintään fuusio-proteiinin havaittiin sen jälkeen, kun 20 tuntia, mutta joidenkin heikkenemiseen tuotteita. Expression of konstruktin korkeammassa lämpötilassa (29 ° C) johti suurempi ekspressio tasolle helppous huomattavasti hajoamistuotteiden (tuloksia ei ole esitetty). Näin ollen, bakteeriviljelmät korjattu 20 h kuluttua lyysattiin sonikoimalla ja lysaatti saatu ladattiin anioninvaihtopylvästä. GST-C2IN-p53 otettiin talteen läpi (tuloksia ei ole esitetty), ja sitten ruiskutettiin hepariini-Sepharose-pylvääseen. Sitoutunut GST-C2IN-p53 eluoitiin suolagradientilla seurattiin UV-absorbanssilla ja fraktioita kerättiin, analysoitiin p53 sisällön Western blottauksella (kuvio. 1C). GST-merkitty fuusioproteiini havaittiin pääasiassa fraktioissa C4-C6, joka vastaa kolmatta huippu FPLC-kromatogrammi. Nämä fraktiot yhdistettiin ja dialysoitiin vähäsuolainen puskuria, jolloin keskimääräinen pitoisuus 250 ng fuusioproteiinia /ml. Huomata, affiniteettipuhdistuksen fuusioproteiini glutationi-sepharose ei ollut mahdollista. Lisäksi trombiinikatkaisun poistaa tunnisteen ollut tehokas, minkä vuoksi tämä puhdistus jätettiin pois.

. Scheme of GST-C2IN-p53 fuusiokonstruktilla.

B

. Ajankulku GST-C2IN-p53 ilmentymistä

E. coli

Rosetta. Näytteet kerättiin talteen sen jälkeen, kun aika osoittamassa (0, 1, 3, 6 ja 20 h) ja alistettiin SDS-PAGE ja sen jälkeen Coomassie-värjäys (ylhäällä) tai Western blot -analyysillä käyttäen p53-vasta-ainetta (alhaalla). GST-C2IN-p53 on merkitty nuolella.

C

. Puhdistus GST-C2IN-p53-fuusioproteiinin hepariini-affiniteettikromatografialla. GST-C2IN-p53 eristettiin kokosoluekstraktien hepariini-pohjainen kromatografialla ja eluoitiin lineaarisella suolagradientilla seurattuna UV-absorbanssilla. Myöhemmin aikana kerätyissä fraktioissa affiniteettikromatografiaa leimasi immunoblottausanalyysillä kanssa p53-aineella.

Yhteenvetona fuusio konstruktio koostuu C2IN ja p53 onnistuneesti kloonattu ilmaistuna ja puhdistetaan hepariini affiniteettikromatografialla riittävän tuoton .

In vitro

luonnehdinta GST-C2IN-p53

eristetty rekombinantti GST-C2IN-p53 ensin tyypillistä Western blottauksella anti-C2IN, anti-p53 ja anti-GST-vasta-aineita (Fig. 2A). Sen lisäksi, että fuusioproteiinin, pieniä hajoamista fragmentit olivat myös nähtävissä, mutta erityisesti pitkien valotusajoilla. Seuraavaksi erityinen DNA-sitomiskyky GST-C2IN-p53 määritettiin

in vitro

avulla elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän määrityksellä (EMSA), koska tämä on erittäin tärkeä ominaisuus sen transkriptiosta riippuvan toimintoja. Tämä määritys perustuu sitoutumiseen p53 biotinyloidun oligonukleotidin duplex, joka sisältää konsensussekvenssin, joka löytyy MDM2-promoottorin. Inkubointi tämän duplex GST-C2IN-p53 johti muodostumista suuren molekyylipainon DNA: ta /GST-C2IN-p53 komplekseja konsentraatiosta riippuvalla tavalla, häviäminen vapaan oligonukleotidin jo 250 ng ja esiintyminen spesifisen DNA- -proteiini monimutkainen 500 ng fuusioproteiinia. Samanaikaisesti, GST-C2IN-p53 havaittiin anti-C2IN vasta-aine. Kontrollina, rekombinantti C2IN (noin 26 kDa) on sisällytetty, joka ei tuottanut mitään näkyvää monimutkainen, mikä todisteet p53-riippuvaisen DNA-sitovan fuusioproteiinin. On myös syytä mainita, että DNA-sitoutumisen C2IN-p53 oli samanlainen kuin villityypin p53 (tuloksia ei ole esitetty), mikä osoittaa ei heikkene DNA: ta sitova aktiivisuus johtuu geenitekniikkaa.

A.

havaitseminen eri aloilla fuusioproteiinin Western-blottauksella. Kasvavia määriä GST-C2IN-p53 (50, 100 ja 200 ng) erotettiin elektroforeesilla ja sen jälkeen analysoitiin Western-blottauksella eri vasta-aineita (anti-C2IN, anti-p53, anti-GST).

B

. DNA: ta sitova ja puhdistettiin GST-C2IN-p53. Kasvavia määriä GST-C2IN-p53 inkuboitiin biotiinilla leimatun oligonukleotidin duplex sisältävät p53: een reagoiva elementti (p53-RE). Kompleksin muodostumisen jälkeen seurattiin natiivi PAGE seurasi havaitseminen streptavidiiniliitetyillä POD (Stv-POD). C2IN toimi negatiivisena kontrollina ja sai visualisoidaan C2IN vasta-ainetta. Tähti tarkoittaa biotiiniosa, kun taas ympyrä edustaa GST-tag fuusioproteiinin.

Yhdessä identiteetti GST-C2IN-p53 vahvistettiin spesifisten vasta-aineiden ja fuusioproteiinin oli aktiivinen

in vitro

, koska se kohdistuu erityisiä DNA-sitoutumisaktiivisuutta.

C2IIa välittämää sisäistämisen GST-C2IN-p53 syöpäsoluiksi

sitten käsiteltiin kysymystä siitä, onko GST-C2IN-p53 on sisäistetty osaksi syöpäsoluja kautta C2IIa. Suoritettiin alustavia kokeita, HeLa-soluissa, koska ne voimakkaasti vähentää endogeenisen p53: n [24]. HeLa-soluja inkuboitiin eri aikoina GST-C2IN-p53 plus C2IIa ja alistetaan sitten Digitonin-pohjainen solufraktioinnin. Immunoblot tunnistus p53-vasta paljasti ajasta riippuva nousu GST-C2IN-p53 uutettu HeLa-soluissa (kuvio. 3 A, vasen paneeli), joka sisältää solu- kalvoon sitoutuneita ja sisäistetty proteiini asuvat rakkulat. GST-C2IN-p53: n osoitettiin translokoida sytosoliin, jossa on enintään 5 h kuluttua (kuvio. 3A, oikea paneeli), mikä havaittiin myös anti-C2IN (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin, GST-C2IN-p53 ei ollut havaittavissa sytosoliin 24 tunnin kuluttua (tuloksia ei ole esitetty), mikä saattaa olla seurausta sen proteasomaalisten hajoamista. Negatiivisena kontrollina solut altistettiin GST-C2IN-p53: n puuttuessa C2IIa. Tässä, GST-C2IN-p53 havaittiin uutettiin soluissa, mutta ei sytosoliin, mikä saattaa olla seurausta ei-spesifisen sitoutumisen. Early endosomissa antigeeni 1 (EEA1), merkkiaine proteiini varhaisen endosomaalista rakkuloiden [25] löydetty vain uutettu soluissa, mutta ei sytosoliin, mikä osoittaa onnistuneen valmistelun sytosolifraktion ilman ristikontaminaation varhainen endosomien (Fig. 3A, top paneeli).

a.

otto C2IN-p53 HeLa kohdunkaula karsinoomasoluja valvoo solufraktioinnin. HeLa-soluja inkuboitiin GST-C2IN-p53 ja C2IIa jopa 5 tuntia. Sen jälkeen, digitoniini-pohjainen solujen suoritettiin fraktiointi ja uutettiin solujen sekä sytosolin fraktioille tehtiin SDS-PAGE ja sitä seuraava Western blottaus. Sisäistetty GST-C2IN-p53 havaittiin anti-p53. Hsp90 detektoitiin latauskontrollina, kun taas EEA1 tehtiin näkyväksi sulkea pois ristikontaminaation sytosolifraktion aikaisin endosomeihin.

B

. C2IIa riippuva sisäistämisen GST-C2IN-p53 A549 keuhkoadenokarsinooma ja Saos-2 luusarkoomasoluissa (

C

). Soluja käsiteltiin ja käsitellään kuten edellä on kuvattu, paitsi että Rab5 havaittiin merkkiaineena alussa endosomien.

herättämänä nämä tulokset lisäksi syövän solulinjojen A549 keuhkoadenokarsinooma solujen (p53-wt) ja Saos -2 luusarkoomasoluissa (p53-negatiivinen) analysoitiin. C2IIa-riippuvainen toimitus GST-C2IN-p53 sytosoliin oli verrattavissa niihin, HeLa-soluissa (kuvio. 3B ja C). On syytä mainita, että jotkin GST-C2IN-p53 oli myös havaittavissa uutettiin Saos-2-solujen puuttuessa C2IIa, joka voi johtua ei-spesifinen sitoutuminen solun pintaan ja sen jälkeen pinosytoosiksi (Fig. 3C). Vain vähäisiä määriä fuusioproteiinia saatiin näkyviin digitoniinipuskuriliuoksella-läpäiseviksi A549-soluja ilman C2IIa, osoittaa erityiset C2IIa riippuvainen oton näissä soluissa (kuvio. 3B). Huomaa, että havaitseminen pienten GTPaasi Rab5, vakiintunut markkeriproteiinina varhaisen endosomeista [26], käytettiin laadunvalvonta solulimaan valmistelua.

Lisäksi spesifisyys oton ja solunosasijaintia GST-C2IN -p53 analysoitiin tarkemmin konfokaalisella immunofluoresenssimikroskopialla HeLa-solujen käsiteltiin 5 h GST-C2IN-p53 puuttuessa tai läsnä C2IIa. Visualisoida ytimien solut vastavärjättiin varten PARP-1 ja 0,75 um: optiset osat hankittiin ja arvioitiin GST-C2IN-p53 käyttäen C2IN vasta-ainetta. Vain hyvin pieniä määriä GST-C2IN-p53 havaittiin ilman C2IIa, jossa korostetaan spesifisyyden C2IIa riippuvaisten oton. Pääosa internalized GST-C2IN-p53 näkyvissä sytoplasman lokalisointi, mutta havaittiin myös tumaan, jossa se yhteistyössä paikallistaa PARP-1 osoituksena keltainen värjäytyminen yhdistetyssä kanavalla (Fig. 4A.). Lisäksi olemme vahvistaneet C2IIa-riippuvainen toimitus GST-C2IN-p53 A549-soluja, jotka osoittivat verrattavissa solunsisäistä jakelua, kuten havaittiin HeLa-soluissa (kuvio. 4B).

. Konfokaalimikroskopia GST-C2IN-p53 otto HeLa-soluissa. Soluja käsiteltiin GST-C2IN-p53 ja C2IIa 5 tuntia. Kontrollina solut jätetään hoitamatta tai inkuboidaan ilman C2IIa. Sen jälkeen solut kiinnitettiin, permeabilisoitiin ja värjättiin C2IN polyklonaalisella vasta-aineella, jonka jälkeen Alexa 633-kytketty sekundaarinen vasta-aine (punainen). PARP-1 havaittiin monoklonaalisella vasta-aineella ja sen jälkeen värjäys Alexa 488-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen visualisoida ytimet (vihreä). Z-Stack kuvat kirjattiin 0,75 um optisen kohdat ja käsitellyt ImageJ. Kuvat ovat esitetty sen. Mitta-asteikko: 10 um.

B

. Toimitus GST-C2IN-p53 A549-soluihin. Soluja käsiteltiin ja käsitellään kuten edellä on kuvattu. Z-Stack kuvat hankittiin 0,75 um optisen kohdat ja käsitellyt ImageJ. Kuvat ovat esitetty sen. Mitta-asteikko: 10 um.

Yhteenvetona osoitettiin, että GST-C2IN-p53 on tehokkaasti sisäistetään sytosoliin erilaisten syöpäsolujen rivejä tietyssä C2IIa-riippuvaisella tavalla.

keskustelu

esillä oleva tutkimus tukeutuu geneettisesti muokattu fuusioproteiini, joka perustuu ei-myrkyllisiä C2 toksiini, joka tuottaa p53 tuumorisuppressoriproteiinia sytosoliin eri syöpäsolulinjoissa. Tässä p53 kloonattiin kehyksessä sovittimen domain C2IN, joka välittää vuorovaikutuksen C2IIa sitovan /translokaatiota yksikkö, joka johtaa sen myöhempää sisäänottoa soluihin. Konstrukti ilmaistiin GST-merkitty fuusioproteiini ja puhdistettiin hepariini-affiniteettikromatografialla. Kuitenkin GST-tag osoitettiin olevan puutteellinen glutationin sitova eikä sitä voitu poistaa trombiinikatkaisun, joka voisi olla steerisen estymisen vuoksi estää muiden trombiinin sen pilkkomiskohtaan. Vielä jäljellä olevat GST-osan N-terminaaliseen päähän fuusioproteiinin ei estänyt p53-välitteinen DNA: ta sitova fuusioproteiinin

in vitro

, eikä sen C2IIa riippuvaisen sisäänoton sytosoliin kohdesolujen . Tämä on yhdenmukaista aiempien havaintojen osoittaa, että N-pään GST-tag ei ​​ole estää tehokkaan C2II antolaitteen GST-C2i [27] tai että GST-C2IN-C3lim fuusio toksiini [28] sytosoliin HeLa solut. Tämä on merkittävää, koska oikea laskostuminen p53 on olennainen sen DNA-sitoutumisaktiivisuutta ja vaikuttaa lukuisia tekijöitä, kuten redoksitilassa [29] ja muut [30].

Vaihtoehtoinen strategia edellyttää biotiini-merkitseminen yhdistelmä-p53 ja sen myöhempi konjugoitumalla C2-streptavidiini kuljettaja, kuten aivan äskettäin osoittaneet ryhmämme [23]. Kuitenkin, kovalenttinen kiinnittyminen p53 on C2IN sovittimen esitetään tässä tarjoaa erinomaisen vakauden verrattuna konjugaation biotiini-p53 C2IN-streptavidiini ei-kovalenttisella tavalla [23], koska se perustuu streptavidiini osa, jossa pienentynyt biotiini- sitoutumisaffiniteetti [13], [31]. Toisaalta tämä mahdollistaa solunsisäisen vapauttamisen biotiini-leimattua ligandia,

esim

. kilpailu endogeenisen biotiinin.

Seuraavaksi osoittanut C2IIa-välitteistä sisäänottoa GST-C2IN-p53-fuusioproteiinia erilaisiin syöpäsoluihin viivoja, joissa se kulkeutua sytosoliin on vahvistettu immunoblot-tunnistus, kun solu fraktiointi. Tämä on mielenkiintoinen havainto ottaen huomioon, että tanslocation huokosten muodostama C2IIa kalvoissa Hapatettujen endosomaalista rakkulat on melko kapea [32], ja ne voivat rajoittaa translokaatio GST-C2IN-p53. Näin ollen, osittainen laajenevasta, fuusioproteiini voi olla tarpeen, kuten havaittiin muiden C2IN perustuva fuusio-osapuolet, [33]. Emme ole analysoineet p53 toiminnallisuutta fuusioproteiinin elävissä soluissa upon sisäistämisen ja siten voi sulkea pois, että translokaatio prosessin otaksuttu piirtyy C2IN-p53 saattanut vaikuttaa se voi toimia transkriptiotekijä, joka on tutkittava tulevissa tutkimuksissa . Ei merkittäviä eroja ei havaittu koskien sytosolin sisäistämisen joukossa testatut solulinjat. Huomattavaa on, että endogeenisen p53 oli havaittavissa sen enempää uutettu soluista eikä sytosolissa kaikkien solulinjoissa asetuksia käytetään Western blot-analyysi. Tämä ei ole merkittävä, koska HeLa ja Saos-2-solut raportoitu näyttää hyvin alhainen jopa havaittavissa p53-proteiinin tasot [24], [34]. Lisäksi olemme hiljattain osoittaneet endogeenistä p53: jännittämättömässä A549-soluja konfokaalimikroskopialla käyttämällä vain korkean laser-intensiteetti [35], tai induktion DNA-vaurion doksorubisiinilla (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin jotkut epäspesifinen sitoutuminen fuusioproteiinin puuttuessa C2IIa paljastui uutettiin HeLa ja Saos-2-soluissa. GST-C2IN-p53 kertynyt sytosoliin jälkeen 5 h, mutta ei ollut enää havaittavissa 24 tunnin kuluttua (tuloksia ei ole esitetty). Koostumuksen, sytosolinen hajoaminen on myös raportoitu muita C2IN-pohjainen fuusioproteiineja, kuten C2IN-C3 [36], C2IN-SpvB [37] ja C2IN-streptavidiini [38]. Kun sisäistäminen HeLa- ja A549-soluja GST-C2IN-p53 havaittu ensisijassa sytoplasmassa ja vähemmän näkyvästi tumassa havaittuna konfokaalimikroskopiaa. Tämä on linjassa sen käsityksen kanssa, että p53 löytyy solulimassa stressaamattomista soluissa johtuen Crm1 riippuvan tumasta yhdessä MDM2 [39], [40]. Kuitenkin yksi on pidettävä mielessä, että solunosasijaintia p53 on tarkoin säädeltyä verkosto translaation jälkeiset modifikaatiot ja proteiini vuorovaikutusten [41], mikä saattaa vaikuttaa myös GST-tunnistetta tai C2IN-verkkotunnus.

Koska läsnä ekspression C2IIa-reseptorin kaikki nisäkässoluissa testattu [42], GST-C2IN-p53-fuusioproteiinia voidaan antaa osaksi laaja kasvaimen solulinjojen ja primaaristen solujen. Saavuttamiseksi kohdennettu toimitus, on mahdollista muuttaa C2IIa sitova /translokaatio komponentti. Tätä varten C-terminaalisen domeenin C2IIa, joka on vuorovaikutuksessa solun pinnan reseptoria voidaan modifioida geenitekniikan, säilyttäen kyky C2IIa on translokoida C2IN sytosoliin [43]. Modifioitu C2IIa voidaan sitten fuusioida polypeptidien, kuten epidermaalinen kasvutekijä (EGF) tai somatostatiini, jotka edistävät sitoutumista EGF- tai somatastatin-reseptoria, jotka ovat usein yli-ilmentynyt syövän soluihin [44], [45]. Tämä strategia on kuvattu suojaava antigeeni (PA), sitovat /translokaatiota komponentti binary pernaruton myrkkyjä, jotka on läheistä sukua C2IIa. Mutatoitunut muoto, PA puutteellisia reseptorin tunnustus oli C-terminaalisesti fuusioitu ihmisen EGF ja ohjasi ottoa LF ja EF osaksi EGF-reseptorin sisältäviin soluihin [46].

Mahdollinen skenaario

vuonna vivo

anto C2IN-p53 kasvaimen hoidossa olisi kasvaimeen injektoimalla fuusioproteiinin kompleksi natiivi C2IIa tai C2IIa modifioitu kohdistusryhmiä kuten edellä. Tämä strategia voitaisiin aluksi testata hiiren ksenografteissa saatu injektion HeLa-solujen ja saattaa sitten käännettävä klinikat hoitoon kiinteä kasvain. Kuitenkin selektiivisen syöpäsoluihin ja syrjäytymisen oletettujen immunogeenisten vaikutusten aikaansaama fuusioproteiini ovat ratkaisevan tärkeitä edellytyksiä onnistuneelle

in vivo

sovellus.

Yhteenvetona olemme rakentaneet fuusioproteiini, joka säilytti p53-riippuvaisen DNA-sitoutumisaktiivisuutta

in vitro

ja sisäistetään kautta C2IN verkkotunnuksen sytosoliin eri syöpäsolulinjoissa käyttämällä C2IIa sitova /translokaatio komponentti.

Materiaalit ja menetelmät

kloonaus C2IN-p53-fuusioproteiinia

ihmisen p53-cDNA monistettiin PCR: llä plasmidista RcCMV-ihmisen p53, joka oli ystävällisesti toimittanut Dr. Michael Schwarz (University of Tübingen, Saksa). Tätä varten, alukkeita p53-I (5′-GAATTCAGATCTGAGGAGCCGCAGTC-3 ’) ja p53-II (5′-GAATTCGGATCCTCAGTCTGAGTCAGG-3’) käytettiin, joka mahdollisti insertoimalla

Bgl

II ja

Bam

H1-restriktiokohtaan. Saatu PCR-tuote ligatoitiin pCR-Blunt vektorin avulla Zero Blunt PCR kloonausta (Invitrogen, Karlsruhe, Saksa) ja transformoitiin kompetentteihin

E. coli

DH5a-soluja. PCR-p53-plasmidi eristettiin ja oikean monistumisen tarkistettiin DNA-sekvensoinnilla (GATC, Konstanz, Saksa). Tämän jälkeen eristetty plasmidi pCR-p53 digestoitiin

Bgl

II ja

Bam

H1 vapauttamaan p53 cDNA: n ja ligatoitiin plasmidiin pGEX2T-C2IN, joka oli linearisoitu

Bam

H1. Sen jälkeen muutosta toimivaltaisten

E. coli

solut Oikein asennettujen p53 cDNA saatuun plasmidiin pGEX2T-C2IN-p53 tarkistettiin pesäke-PCR ja restriktioentsyymianalyysi. Lopuksi C2IN-p53 fuusion konstrukti sekvensoitiin pGEX2T 5′- ja 3′-sekvensoinnin avulla alukkeita (GATC, Konstanz, Saksa).

ekspressio ja puhdistus rekombinantti C2IN-p53

Luodut C2IN-p53 -fuusiorakenteen yliekspressoitui kuin GST-merkitty fuusioproteiinin

E. coli

Rosetta ja puhdistettiin homogeenisuuteen affiniteettikromatografialla. Tätä varten

E. coli

Rosetta transformoituja pGEX2T-C2IN-p53 kasvatettiin optiseen tiheyteen 0,6 ja proteiinin ilmentyminen indusoitiin lisäämällä isopropyyli-ß-D-tiogalaktopyranosidia (IPTG). Bakteeriviljelmät inkuboitiin sitten 20 tunnin ajan 16 ° C: ssa ja kerättiin sentrifugoimalla. Solulyysi suoritettiin sonikoimalla puskurissa, joka sisälsi 0,1% Triton X-100, ja solujätteet sedimentoitiin sentrifugoimalla 20 000

g

15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Kirkastettu lysaatti ladattiin Q-Sepharose Fast Flow -pylvääseen (GE Healthcare, Munchen, Saksa) ja virtaavat sisältävien GST-C2IN-p53 kerättiin. Sen jälkeen, näyte ruiskutettiin hepariini-Sepharose-kolonniin (GE Healthcare Saksa) ja eluoitiin lineaarisella suolagradientilla välillä 0 enintään 1 M NaCl. Fraktiot, joissa GST-C2IN-p53 sitten yhdistetään ja dialysoidaan puskurissa, joka koostui 20 mM HEPES /KOH, pH 7,4, 50 mM NaCl: a ja 5 mM DTT: tä. Proteiini identiteetti eristetty GST-C2IN-p53 varmistettiin 10% SDS-PAGE ja sitä seuraava Western blot -analyysillä käyttämällä polyklonaalista C2IN vasta-ainetta kaneissa [10], joka on monoklonaalinen p53-vasta-ainetta (DO-1; Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Saksa ) ja GST-aineella (BD Biosciences, Heidelberg, Saksa), tässä järjestyksessä. Analysoida ajasta riippuva ekspressio GST-C2IN-p53, 100 ul: n bakteeriviljelmää kerättiin ja altistettiin 10% SDS-PAGE ja sen jälkeen Coomassie-värjäys ja immunoblottauksella edellä kuvatulla tavalla.

ilmentäminen ja puhdistus C2IN ja C2IIa

C2IN (noin 26 kDa) ja C2II (~81 kDa) ilmaistiin GST-merkittyjen proteiinien in

E. coli

BL21 ja puhdistettiin glutationiaffiniteettikromatografialla kuten aiemmin on kuvattu [1], [10]. Eristämisen jälkeen proteiinien, GST-osasta poistettiin trombiinin lohkominen ja C2II (~61 kDa) aktivoitiin trypsiinillä pilkkomalla, jolloin saadaan C2IIa raportoitu [1]. Puhtaus proteiinit analysoitiin 12,5% SDS-PAGE ja sen jälkeen Coomassie-värjäys.

p53 DNA: ta sitovan määrityksessä

spesifinen DNA: ta sitova GST-merkityn C2IN-p53 määritettiin elektroforeettisen liikkuvuuden siirtymän (EMSA). Tätä varten oligonukleotidi duplex kätkeminen p53-sitoutumiskohtaa MDM2-promoottorin käytettiin kuten aiemmin on kuvattu [47]. Sitoutuminen C2IN-p53 on Oligonukleotididupleksi johtaa korkean molekyylipainon DNA-p53 komplekseja alentunut elektroforeettinen liikkuvuus. Kasvavia määriä GST-C2IN-p53 (0-2000 ng proteiinia) esi-inkuboitiin DNA-sitomispuskurissa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen lisättiin biotiini-end leimatun oligonukleotidin duplex (6 nM). Kompleksin muodostumisen annettiin tapahtua vielä 20 minuuttia ennen reaktion päättyminen lisäämällä EMSA latauspuskuria jäällä. Näytteet erotettiin sitten 6% (w /v) natiivi-PAGE ja siirrettiin positiivisesti varatulle nailonkalvolle (GE Healthcare, Munchen, Saksa) puolikuiva blottaus. Sen jälkeen kaivoa kiinnitettiin 60 min 90 ° C: ssa ja blokattiin 2% (w /v) BSA: lla PBS-T: llä. Vapaa biotinyloitua Oligonukleotididupleksi ja DNA-C2IN-p53-kompleksit havaittiin streptavidiini-peroksidaasilla (1:15,000) käyttäen tehostettua kemiluminesenssia.

SDS-PAGE ja immunoblot-analyysillä

Proteiinit erotettiin SDS- PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraanille (Whatman, Dassel, Saksa) märässä-blot kammion (GE Healthcare, Munich, Saksa). Membraani blokattiin 5% (w /v) rasvatonta kuivamaitoa sisältävällä PBS: llä Tween-20 [0,1% (v /v), PBS-T] 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa (RT). Sen jälkeen kaivoa inkuboitiin vastaavien primaarisen vasta-aineen laimennettu PBS-T: ssa 1 tunnin ajan RT: ssä. Pesun jälkeen kalvon 3 kertaa PBS-T, se seulottiin sopivan sekundaarisen vasta-aineen, joka on kytketty piparjuuriperoksidaasiin (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Saksa) 1 tunnin ajan. Lisäpesun jälkeen vaiheet, proteiinit kemiluminesenssilla käyttämällä Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate (Millipore, Schwalbach, Saksa).

Soluviljely

HeLa kohdunkaula syöpä ja A549 keuhkoadenokarsinooma soluja ylläpidettiin 37 ° C: ssa ja 5% (v /v), CO

2 minimal essential medium (MEM), johon oli lisätty 10% (v /v) lämpö-inaktivoitua vasikan sikiön seerumia (FCS), L-glutamaattia (2 mM), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Saos-2-osteosarkooma-soluja ylläpidettiin muunnettu McCoyn 5A-väliaine, jota oli täydennetty 2 mM L-glutamiinia, 10% lämpöinaktivoitua FCS: ää ja antibiootteja. Solut rutiininomaisesti trypsinoitiin ja siirrostettiin kolme kertaa viikossa.

Digitonin-pohjainen solufraktioinnin

Cell fraktiointiin HeLa, A549 tai Saos-2-soluissa suoritettiin oleellisesti, kuten aikaisemmin on kuvattu [13], [ ,,,0],48]. Lyhyesti, soluja kasvatettiin 12-kuoppaisilla levyillä yön yli ja käsiteltiin monimutkainen GST-C2IN-p53 (2,5 ug /ml) ja C2IIa (5 ug /ml) ajan osoittamassa. Kontrollina solut jätettiin käsittelemättä tai niitä inkuboitiin GST-C2IN-p53: n puuttuessa C2IIa. Sitten väliaine aspiroitiin ja solut pestiin 3 kertaa PBS: llä.