Krooninen sairaus

tiivistelmä

Suurin ongelma johtuvat eturauhassyöpä (PCA) on sen taipumus ja etäpesäkkeitä luuhun. MikroRNA (miRNA) on ratkaiseva rooli monissa kasvainten etäpesäkkeitä. Tärkeys miRNA luun etäpesäke Eturauhassyövän ei ole selvitetty tasalla. Me tutkimme, ilmentymistä tiettyjen miRNA liittyi luumetastaasipotilailla Eturauhassyövän. Tutkimme miRNA ilmaisun profiilit 6 ensisijainen ja 7 luun metastasoituneen PCa näytteiden miRNA mikrosiruanalyysillä. Ilmaisu 5 miRNA merkittävästi vähentynyt luun etäpesäkkeitä verrattuna ensisijaisen PCA lukien Mirs-508-5p, -145, -143, -33a ja -100. Olemme lisäksi tutkittiin muita näytteitä 16 ensisijaisen PCa ja 13 luustometastaaseja käyttäen reaaliaikaista PCR-analyysillä. Ilmaisut Mirs-143 ja -145 todennettu alas-säädellä merkittävästi etäpesäkkeitä näytteissä. Tutkimalla suhde tasojen Mirs-143 ja -145 kanssa kliinis-Eturauhassyövän potilaita, löysimme alas-asetusten Mirs-143 ja -145 negatiivisesti korreloivat luun etäpesäke, Gleason pisteet ja taso vapaan PSA ensisijainen PCa . Yli-ilmentyminen miR-143 ja -145 retrovirus transfektiolla vähensi kykyä muuttoliikkeen ja invaasion

in vitro

sekä kasvainten kehittymiseen ja luuhun invaasio

in vivo

PC-3-solut, ihmisen Eturauhassyövän solulinja alkunsa luusta metastaattinen PCa yksilö. Heidän ylössäätely myös lisääntynyt E-kadheriinin ilmentymisen ja vähentää fibronektiinin ekspressio PC-3-soluja, jotka paljastivat vähemmän invasiivisia morfologinen fenotyyppi. Nämä havainnot osoittavat, että Mirs-143 ja -145 liittyvät luumetastaasipotilailla Eturauhassyövän ja ehdottaa, että he voivat pelata tärkeitä rooleja luumetastaasipotilailla olla mukana säätelyssä EMT Molemmat voidaan myös kliinisesti käyttää uusien biomarkkereiden vuonna erotteleva eri vaiheissa ihmisen PCa ja ennustamiseen luun etäpesäke.

Citation: Peng X, Guo W, Liu T, Wang X, Tu X, Xiong D, et al. (2011) tunnistaminen Mirs-143 ja -145, joka liittyy luumetastaasipotilailla Eturauhassyöpä ja Osallisena asetukseen EMT. PLoS ONE 6 (5): e20341. doi: 10,1371 /journal.pone.0020341

Editor: Jean-Marc A. Lobaccaro, Clermont Université, Ranska

vastaanotettu: 27 tammikuu 2011; Hyväksytty: 21 huhtikuu 2011; Julkaistu: toukokuu 27, 2011

Copyright: © 2011 Peng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: NSFC- Guangdong yhteinen rahoitus, Kiina (nro u0732001); Natural Science Foundation of Guangdong, Kiina (nro 06021290); Science and Technology suunnittelu projekti Guangdong, Kiina (nro 2008B030301037) ja tieteen ja teknologian suunnittelu projekti Zhuhai, Kiina (2009). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittaja Tiejian Liu työskentelee kaupallinen yhtiö, Laura Biotech Co., Ltd ., ja liittyi tekijöiden tutkimusryhmä henkilökohtaisista syistä. Koska hänen työn tutkimusryhmä, hän saavat merkittävää kokemusta, joka on hyödyllinen hakemuksen hänen PhD. Tässä asiakirjassa ei ole kaupallista merkitystä kannalta Laura Biotech, sekä tiedot ja tulokset yksityiskohtaisesti tässä ei ole mitään tekemistä kyseisen yhtiön. Kirjoittajat vahvistavat, että tämä ei muuta niiden noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PCA) on useimmin diagnosoitu pahanlaatuinen kasvain ja toinen johtava syy syöpäkuolemista länsimaissa [1]. Suurin ongelma johtuvat PCa on sen taipumus etäpesäkkeitä luuhun. Luuston etäpesäkkeet esiintyy jopa 90%: lla potilaista, joilla on edennyt PCa. Tärkeää on, kun kasvaimet etäpesäkkeitä luuhun, ne ovat lähes parantumaton ja aiheuttavat huomattavia sairastavuus ennen potilaan kuolemaa [2], [3]. On erittäin tärkeää ymmärtää mekanismia etäpesäkkeiden muodostumisen ehkäisemiseksi etäpesäkkeiden ja kehittämällä antimetastaattisia hoitoja, jotka voivat antaa lisäalennusta sairastuvuutta ja kuolleisuutta Eturauhassyövän potilaista.

Luuston etäpesäkkeiden kasvain on monimutkainen monivaiheinen prosessi, joka sisältää solujen vetäytymisen ja liikkuvuus paikallisen microenvironment, hajoaminen ympäröivän soluväliaineen, solu liike, pidätettiin distaalisessa hiussuonia, ekstravasoitumaan ja lopulta lisääntyä muodostaa kaukainen toissijainen luukasvaimet. Kaikki nämä prosessit säätelevät useat tekijät ja molekyylitason reitit [4]. Vaikka perustiedot liittyvät tähän jäsennelty prosessi on kiihtynyt viime aikoina useat keskeiset tekijät tunnetaan edelleen huonosti.

MikroRNA (miRNA) ovat luokan pienen Koodaamattomat sääntelyn RNA: iden (19-25 nukleotidia) ilmaistaan ​​kasveja ja eläinten mukana geenin ilmentymisen säätelyyn. He käyttävät niiden toiminta sitoutumalla 3′-alueen osajoukko mRNA: iden seurauksena niiden hajoamisen tai tukahduttamisen käännös [5]. Bioinformatiikka analyysit ovat ennustaneet, että yksittäinen miRNA on useita tavoitteita, ja näin miRNA voisi välittää säätelyssä suuri määrä proteiinia koodaavan geenien. Viimeaikaiset arvioiden mukaan kolmasosa ihmisen mRNA: iden voidaan säädellä miRNA [6], [7]. miRNA on osoitettu häiritsevän solun toimintoja, kuten solujen proliferaatiota ja erilaistumista, ja apoptoosin [8].

Monet raportit ovat selvitetty rooli tiettyjen miRNA kuten promoottoreita tai vaimentimia kasvainten [9], [10] , [11]. Yhä useampi havaintoja myös antaa kollektiivinen todisteita siitä, että miRNA koordinoi joitakin monimutkainen geeni-ilmentymisen ohjelmia ja ratkaiseva rooli tuumorimetastaasissa [12]. miRNA voivat vaikuttaa moniportaisuudesta metastaattisen cascade, kuten kasvainsolun muuttoliike, invaasiota ja intravasation. Esimerkiksi rintasyöpä on yksi merkittävimpiä luuetäispesäkkeitä [13]. Useita MikroRNA on todettu etäpesäkkeitä promoottoreita, mukaan lukien anna-7, miR-9, miR-10b, miR-21, miR-373, miR-520c, ja miR-103/107 [12], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20]. Toisaalta miR-335, miR-206, miR-31, miR-145, miR-661 ja miR-126 on tunnistettu etäpesäke vaimentimen miRNA ihmisen rintasyövän [21], [22], [23], [24 ], [25], [26], [27].

PCA, useat miRNA on todettu välittäjinä etäpesäke. On osoitettu, että sääntelyn purkaminen miR-221 ja miR-222 liittyi PCa etenemiseen, huono ennuste, ja etäpesäkkeiden kehittymisessä [28]. miR-21 oli myös yli-ilmentynyt PCa ja toimii keskeisenä kasvaimia synnyttävän säädin, joka vaikuttaa tuumorin kasvua, invasiivisuus ja etäpesäkkeiden [29], [30], [31]. Tutkimus on osoittanut, että miR-146a tavoitteet ROCK1, ja kohonnut ROCK1 tasoilla edistävät solujen lisääntymistä, invaasiota ja etäpesäkkeiden PCA soluissa [32]. Lisäksi, genomisen menetys miR-101 ihmisen PCa, osallisina syövän etenemisen johtaa yli-ilmentyminen EZH2 [33], [34]. Kuitenkin merkitys miRNA luun etäpesäke Eturauhassyövän ei ole selvitetty tasalla.

epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon (EMT) on tietty signaalireitin kuvata yhden avaimen vaiheen etenemisen kasvainsolun etäpesäke, joka sisältää peräkkäisen prosesseja solu-irrotus, siirto, tunkeutuvat, hajotus ja lopullinen asuvat [35]. Se on tunnistettu tunnusmerkki etäpesäkkeiden useita kasvaimia, yhteyden runsaasti transkriptiotekijöitä [36], [37], [38], [39]. miRNA ovat myös komponentteja solusignalointi piiri, joka säätelee EMT-ohjelman [40]. Viimeaikainen työ on osoittanut useita miRNA, kuten miR-200 perhe ja miR-205, pelataan kriittinen rooli EMT [41], [42]. Tähän asti tarkka rooli miRNA säätelyssä EMT on vielä epäselvä.

roolin tutkimiseksi miRNA luun etäpesäke Eturauhassyövän ja niiden suhde EMT on ensinnäkin tarvitse tietää miRNA ilmentymisen profilointi perusterveydenhuollossa ja luu metastaattinen PCa. Tässä tutkimuksessa vertasimme miRNA ekspressioprofiileja perus- ja luun metastaattisen PCa ihmisten ja tunnistettu MIRS-143 ja -145 liittyvät luun etäpesäke. Lisäksi osoitimme, että upregulations Mirs-143 ja -145 tukahdutettu muuttoliike ja invaasion

in vitro

, kasvainten kehittymiseen ja luuhun invaasio

in vivo

, ja EMT PC-3-soluja, ihmisen PCa solulinja alkunsa luusta metastaattinen PCa yksilö.

Materiaalit ja menetelmät

kudosnäytteitä

kudosnäytteitä kaksi ryhmää Eturauhassyövän potilaat tutkittiin. Ensisijainen PCa kudokset olivat prostatektomia tai höyläysleikkaus hoidossa paikallisen eturauhassyövän. Luuston metastaattisen kudokset Eturauhassyövän olivat toiminnasta hoidossa luun etäpesäke. Kaikki näytteet olivat formaliinilla kiinnitetyt ja parafinoidut (FFPE) tavallisella menettelyjä. Alueet kudosnäytteiden 70% syöpäkudoksen käytettiin uuttamalla kokonais-RNA. Histologinen diagnoosi tehtiin patologi ja on uudelleen vahvistettava toisella patologi (D. H.). Luumetastaasipotilailla oli diagnosoitu kliinisen oireen ja merkin, luukuvaus, röntgen, tietokonetomografia, ja MRI. Yksikään potilaista ei ollut saanut neoadjuvant hormoni, säteilyä tai kemoterapiaa ennen saada tuumorikudoksissa. Kliiniset tiedot tarkasteli noin ikä, luun etäpesäke, yhteensä PSA taso, vapaa PSA taso ja Gleason pisteet ensisijainen PCa potilailla. Tutkimuksen hyväksyi Institutional Ethical Board (IRB) ensimmäisessä Affiliated sairaala Sun Yat-sen yliopiston ja suostumuksensa potilaat mukana.

RNA

Kaikki näytteet lähetettiin CapitalBio Corp . ja kokonais-RNA: FFPE kudosnäytteistä eristettiin kuten aiemmin on kuvattu [43]. Lyhyesti, kudosnäytteet leikattiin viipaleet parafiiniblokit ja laitettiin 1,5 ml nukleaasivapaata mikrosentrifugiputkiin (Eppendorf), sitten parafiini kolme kertaa 1 ml: limoneeni, mitä seurasi pesu 1 ml: lla 100% etanolia kahdesti ja ilmakuivauksen huoneenlämpötilassa lämpötila. Näytteet inkuboitiin sitten hajotuspuskuria (20 mM Tris-HCI, 10 mM EDTA, 1% SDS) ja proteinaasi K: n (Merck) 55 ° C: ssa yön yli, jotta saadaan täydellinen digestio näytteitä. Myöhemmin TRIzol reagenssia (Invitrogen) lisättiin, ja loppuosa protokollaa suoritettiin valmistajan ohjeiden. RNA-näytteet suspendoitiin uudelleen RNaasi-vapaaseen veteen sen jälkeen, kun lopullinen saostusvaiheessa. RNA laatu ja määrä arvioitiin käyttämällä biophotometer (Eppendorf).

mikrosiruanalyysi

Yhteensä RNA-näytteet analysoitiin CapitalBio (CapitalBio Corp.) ja miRNA microarray kokeiluja. Jokainen miRNA mikromatriisisiru sisältyvä 924 antureista kolmena kappaleena, joka vastaa 677 ihmisen (mukaan lukien 122 ennustettu miRNA), 461 hiiri, ja 292 rotta miRNA löytyy miRNA rekisterin (https://microrna.sanger.ac.uk; miRBase Release 10,0, 2007). Suoritettiin, kuten on kuvattu yksityiskohtaisesti verkkosivuilla CapitalBio (https://www.capitalbio.com). Lyhyesti, alhaisen molekyylipainon RNA (LMW-RNA) eristettiin käyttämällä PEG-liuosta, saostamalla mukainen menetelmä edellisen protokollan [44]. LMW-RNA defosforyloitiin alkalisella fosfataasilla (NEB) ensimmäisessä seuraavan protokollan antama Wang H, et al. [45]. Sitten Defosforyloitujen LMW-RNA leimattiin 500 ng 5′-fosfaatti-cytidyl-uridyl-cy3-3 ”(Dharmacon) 2 yksikköä T4 RNA-ligaasia (NEB) [44]. Leimattu RNA saostettiin 0,3 M natriumasetaatilla, 2,5 tilavuutta etanolia ja suspendoitiin uudelleen 20 ul: aan hybridisaatiopuskuria, joka sisälsi 3 x SSC, 0,2% SDS: ää ja 15% formamidia. Array hybridisoitiin 42 ° C: ssa yön yli ja pestiin kaksi peräkkäistä pesuliuoksilla (0,2% SDS, 2 x SSC: ssä 42 ° C: ssa 4 minuutin ajan, ja 0,2% SSC: ssa 4 minuutin ajan huoneenlämpötilassa). Arrays skannattiin kaksinkertaisen kanavan laserskannerin (LuxScan 10K /A, CapitalBio). Skannausasetuksesta säädettiin saamiseksi visualisoitu yhtä suuri intensiteetti U6 paikkoja ympäri taulukot. Tiedot uutettiin TIFF avulla LuxScanTM 3.0 ohjelmistoa (CapitalBio Corp). Raakadataa normalisoituivat ja analysoitiin käyttämällä merkitys Analysis mikrosirujen (SAM, versio 2.1, Stanford University, CA, USA) ohjelmiston. Klusterointi analyysi suoritettiin Cluster 3.0 [46]. Kaikki tiedot on MIAME mukainen ja että raaka data on talletettu on MIAME yhteensopiva tietokanta (GEO, liittymistä ID: GSE26964).

Quantitative käänteistranskriptio-PCR

cDNA saatiin käyttämällä TaqMan miRNA Q-PCR Detection Kit (GeneCopoeia). Lyhyesti, miRNA käänteiskopioitiin käyttäen sekvenssispesifisiä varsi-silmukka-alukkeita (Invitrogen) seuraavaan miRNA: HSA-miR-125b, HSA-miR-145, HSA-miR-153, HSA-miR-210, HSA-miR-143 HSA-miR-100, HSA-miR-363, HSA-miR-451, HSA-miR-572: n ja HSA-miR-508-5p, joka perustuu mikrosiruanalyysi ja arvioidun kohdegeenien. Reaktio suoritettiin seuraavien parametrien arvot: 15 min 37 ° C: ssa, 10 minuutin ajan 65 ° C: ssa, 5 min 85 ° C: ssa, ja -20 ° C: ssa käyttöön asti. Reaaliaikainen PCR-analyysi suoritettiin koskevasta iQ5 Real Time PCR Detection System (Bio-Rad) 20 ui tilavuus reaktiossa, joka sisälsi 2 ui käänteiskopioinnin tuote, 10 ui 2 × All-in-One ™ Q-PCR Mix, 2 ui PCR Forward Primer (2 uM), 2 ui Universal Adaptor PCR Primer (2 uM), 4 ui ddH 2O: lla. Reaktioita inkuboitiin 96-kuoppaisilla levyillä 95 ° C: ssa 10 minuutin ajan, seuraavat 40 sykliä, ja sitten nostettiin 66 ° C: sta 95 ° C: ssa, jolloin saatiin sulamiskäyrä. Kukin näyte analysoitiin kolmena kappaleena. Templaattia eikä käänteisen transkription otettiin mukaan negatiivisina kontrolleina. U6 snRNA käytettiin normalisointia ohjaus. Suhteellinen ilmentyminen arvot kolmen erillisen kokeen laskettiin seuraavan 2

-ΔΔCt menetelmä Schmittgen ja Livak [47].

Lukittu nukleiinihappo (LNA) in situ -hybridisaatio

Menettely oli suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [48]. Lyhyesti, parafiini-kudosleikkeet poistettiin parafiini, kuivattu, käsiteltiin sitten proteinaasi K: lla (20 ug /ml; Roche), 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Sen jälkeen pestiin 0,2% glysiini /PBS: ssä 1 minuutin ajan ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä, leikkeitä inkuboitiin hybridisaatiopuskuriin (50% formamidia, 5 x SSC, 0,1% Tween, 9,2 mM sitruunahappoa pH oli säädetty arvoon 6,0, 50 ug /ml hepariinia, 500 ug /ml hiivan RNA: ta) 37 ° C: ssa 2 tuntia. Digoksigeniini-leimatulla, LNA-modifioitu koettimet miR-143 (20 nmol /l; 5′-GAGCTACAGTGCTTCATCTCA-3 ’, Exiqon) ja miR-145 (20 nmol /l; 5′-AGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC-3’, Exiqon) lisättiin vastaavasti ja inkuboitiin 55 ° C: ssa 18 tuntia. Leikkeitä pestiin 2 x SSC kahdesti, sitten 2 x SSC ja 50% formamidia 50 ° C: ssa kolme kertaa (kulloinkin 30 min). Anti-DIG-AP (1:1000, Roche) lisättiin sen jälkeen, PBS-T (0,1% Tween 20) pesun ja inkuboitiin 4 ° C: ssa yön yli. Leikkeitä pestiin neljä kertaa PBS-T, ja nitrosinitetratsoliumia kloridi /5-bromi-4-kloori-3-indonyl fosfaatti käytettiin tahra.

Cell Culture

Metastaattinen PCa solulinjoja sisältyi PC-3 ja LNCaP esillä olevassa tutkimuksessa. PC-3 hankittiin American Type Culture Collection (ATCC), ja pidettiin F-12 viljelyalustaan ​​(Hyclone), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone). LNCaP ostettiin Shanghai Cell Bank, Kiinan tiedeakatemia, ja RPMI-1640-viljelyalustaan ​​(Gibico, Invitrogen) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone). Stabiilisti transfektoidut solut ylläpidettiin median läsnäolon kanssa puromysiinin (Sigma-Aldrich). Soluja kasvatettiin kosteutetussa atmosfäärissä 5% CO

2 37 ° C: ssa.

Generation stabiilisti transfektoitujen solulinjojen

sekvenssi pri-miR-143 ja pri-miR -145 kloonattiin pMSCV-puromysiini plasmidi restriktioentsyymillä Bgl II ja EcoRI (New England Biolabs). 293FT solut transfektoitiin edellä mainittujen rakennettu plasmideilla yhdessä PIK vektoriin tai tyhjä pMSCV-vektorin ohjaus, käyttäen kalsiumfosfaattimenetelmää kuten aiemmin on kuvattu [49]. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 6 h transfektion jälkeen, media vaihdettiin ja soluja inkuboitiin yli yön. Tuottaa uusi virus, media kerättiin kolmasti päivässä, kunnes 293FT solut tavoittaa koko yhtymäkohta. Viruksia käytetään infektoimaan PC-3 ja LNCaP. 24 h lisäyksen jälkeen virusten, infektoidut solut valittiin lisäämällä puromysiini kasvualustaan. Vakaa solulinjat varmistettiin qRT-PCR. Sekä pMSCV ja PIK plasmidit myöntänyt antelias professori Song LB, Sun Yat-Senin yliopistossa Cancer Center, Guangzhou, Kiina.

Haavan paranemista määritys

Yksi päivä ennen naarmu, stabiileja solulinjoja PC-3 ja LNCaP-solut trypsinoitiin ja ympättiin tasan 6-kuoppaisiin kudosviljelylevyihin, ja kasvoi saavuttaa lähes täydellistä konfluenssiin 24 tuntia. Kun ei-seerumistarvaatio pidetään 24 tunnin kuluttua solujen yksikerroksista muodostetaan keinotekoinen homogeeninen haava luotiin päälle yksikerroksista steriilillä 100 ui kärkeä. Jälkeen raapiminen, solut pestiin seerumittomassa elatusaineessa. Kuvia liikkuvien solujen haavaan vangittiin ajankohtina 0 h, 6 h, 12 h ja 24 h käännettyä mikroskooppia (40 x).

In vitro

invaasiomääritys

invaasiomääritys tehtiin käyttämällä TranswellTM kammio koostuu 8 um kalvosuodattimella insertit (Corning) päällystetty matrigeelin (BD Biosciences), kuten aikaisemmin on kuvattu [50]. Lyhyesti, solut trypsinoitiin ja suspendoitiin seerumittomassa elatusaineessa. Sitten 1,5 × 10

5 solua lisättiin ylempään kammioon, kun taas alempi kammio täytettiin väliaineessa 10% FBS. Sen jälkeen inkuboitiin 48 h, solut tunkeutuneet läpi päällystetyn kalvon alapintaan, jossa solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja värjättiin hematoksyliinillä. Solumäärä tehtiin mikroskoopilla (100 x).

Adhesion määrityksessä

adheesion määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [51]. Lyhyesti, 96-kuoppaisia ​​levyjä päällystettiin 50 ul: fibronektiinin (50 ug /ml) alkuperäisessä median soluinkubaattorissa 1 tunti. Sen jälkeen pestiin lämpimällä media, levyt blokattiin 1% BSA: ta 37 ° C: ssa 1 h ja pestiin kahdesti. Jälkeen trypsiinikäsittelyllä, suspendoidut solut ympättiin kuhunkin hyvin seerumittomassa alustassa, jonka tiheys on 1,5 x 10

4 solua kuoppaa kohti. Kun inkuboitiin levyillä 30 minuuttia, tarttumattomat solut poistettiin, ja levyt pestiin varovasti kaksi kertaa PBS: llä. Tarttuneet solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 20 min ajan huoneenlämpötilassa, sitten värjättiin hematoksyliinillä ja laskettiin käännettyä mikroskooppia (100 x).

Western blotting

ilmentymisen analyysi EMT- liittyviä proteiineja, immunoblottaus-määritys suoritettiin. Kaikki stabiileja solulinjoja, mukaan lukien PC-3 /vektori, PC-3 /miR-143, PC-3 /miR-145, LNCaP /vektori, LNCaP /miR-143 ja LNCaP /miR-145, ympättiin 100 mm kudosviljelyastioihin. 24 tunnin kuluttua solut pestiin esijäähdytetty PBS kun yhtymäkohta saavutettu 60-70%, jonka jälkeen korjataan talteen näytepuskuriin [62,5 mmol /L Tris-HCI (pH 6,8), 2% SDS: ää, 10% glyserolia, ja 5 % 2-β-merkaptoetanolia]. Yhtä suuret määrät proteiinia supernatanttia ladattiin kaistaa kohti ja SDS-polyakryyliamidielektroforeesilla. Peräkkäin proteiini siirrettiin PVDF-kalvolle (Millipore), salvattiin 5% rasvaton maito 1 h huoneen lämpötilassa, ja tutkittiin primaarisilla vasta-aineilla (1:1000) 3 h, mukaan lukien hiiren anti-E-kadheriini (BD Biosciences ), hiiren anti-fibronektiinin (BD Biosciences) ja hiiren anti-vimentiinista (BD Biosciences). Membraanit pestiin kolme kertaa (10 min kukin) TBS-T-puskuria, ja inkuboitiin 40 minuuttia huoneen lämpötilassa piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-hiiri-vasta-aineita. Blotit pestiin kolmesti (10 min kukin) TBS-T: n ja kehitettiin käyttäen ECL-järjestelmää. Proteiini lastaus normalisoitiin reprobing täpliä hiiren anti-α-Tubulin vasta-aine (Abcam).

In vivo

malleissa eturauhassyövän luumetastaasin

sisäiset sääriluun injektio mallin avulla. Kymmenen mies sekamuotoinen immuunivajavuustila (SCID) hiiriä 3~4 viikkoa vanhoja hankittiin HFK Bio-Technology.CO., LTD (Peking, Kiina). Ennen inokulointia, PC-3-solut suspendoitiin uudelleen 40 ui serun-free-F-12-väliaineessa tiheys 2 x 10

5 solua per 40 ui, ja injektoitiin 26 gaugen neulaa sääriluun käyttäen poraus liikkeellä . Eläimet jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään yhtä, jossa kukin 5 eläimiä käsiteltiin PC-3 /miR-143 tai PC-3 /miR-145 oikealla sääriluu vastaavasti. Kaikki 10 hiirtä injisoitiin PC-3 /vektorin vasemmalla sääriluu kuin itsehillintää. Hiiriä seurattiin viikoittain kasvaimen kasvua. Viikolla 5, hindlimbs oli pivalaistaan ​​käyttäen Faxitron-yksikköön röntgenlaite (Faxitron-yksikköön röntgen Corp, USA) havaitsemiseksi luun vaurioita. Sitten hiiret tapettiin, ja sääriluu kerättiin, kalkittomat ja kiinnitettiin formaliiniin edelleen histologinen analyysi. Luuleesioita arvioitiin ja laskettiin edellä kuvatulla aikaisemmin kuvatulla [52], jossa 0 arvosana ei vaurion, 1 pieniä vaurioita, 2 pieniä vaurioita, 3 merkittäviä vaurioita pieniä tauko marginaalit, ja 4 merkittäviä vaurioita suurten tauko reuna vaurioita.

tilastollinen

määrää muita ilmentymisen miRNA vuonna Microarray, merkitys analyysi mikrosirujen (SAM, versio 2.1) suoritettiin käyttäen kahta luokkaa parittomia vertailu SAM menettelyyn. Merkittävästi ilmentyvät eri miRNA valittiin seuraavat vaatimukset: | Score (d) | ≥2 [Numerator (r) /nimittäjä (t + s0)], Taita Change≥2 tai ≤0.5 ja q-arvo (%) ≤5 ( vääriä löytö korko, FDR) luun etäpesäke Eturauhassyövän verrattuna ensisijaisen PCa.

tiedot ilmaistiin keskiarvona ± keskihajonta (SD). Tilastot arvioitiin käyttäen SPSS 17.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, USA). In reaaliaikainen PCR ja eläinkokeissa, data verrattiin Studentin

t-testi

. Suhde alassäädetty miRNA ilmaisun ja kliinis-ala- ja luun metastaattinen PCa analysoitiin käyttämällä Spearmanin testi. In etäpesäke määrityksessä perustuvia kokeita, tiedot analysoitiin yksisuuntaisella ANOVA. Ymmärtämiseksi suhde miRNA, merkittävät korrelaatiot määritettiin käyttämällä Kendall listalla korrelaatio testi.

p

-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

miRNA ilmaisun profilointi välillä ensisijaisen PCa ja luun etäpesäke mukaan mikrosiruanalyysillä

tutkimiseksi onko miRNA ilmentyvät eri perusterveydenhuollossa PCa ja luun metastaattinen kudoksia, keräsimme kuusi Hyväksytty-paria primaarinen ja metastaattinen kudokset (samasta potilaan) ja verrattiin niiden ekspressioprofiileja käyttäen miRNA mikrosirulla. Koska koko RNA viisi paria näytettä ei riittänyt microarray kokeilu, vain sovitetun parin Näytteiden menestyksellisesti microarray kokeilu. Havaitsimme ilmeisen lisääntyneen ilmentymisen 18 miRNA luuston etäpesäkkeitä verrattuna ensisijaisen PCA lukien Mirs-451, -210, -141, -19b, -29b, -16, -20a, -30b, -193a-3p, -15a , -181a, -26b, -200a, -106b, -20b, -486-5p, -15b, -363. Ilmaisu Kolmen miRNA (Mirs-145, -143, -612) oli ilmeisesti vähentynyt luun etäpesäke, erityisesti ilmaus miR-145 ja miR-143 vähentämistä 5,4-kertaiseksi ja 2,7-kertaiseksi.

jotta edelleen selvittää ilmaus miRNA oli tilastollisesti eroa ensisijaisen PCa ja luun metastaattinen kudoksissa, vertasimme miRNA ilmaisua 6 ensisijainen PCa näytteitä ja 7 luun metastaattinen näytettä seulotaan miRNA mikrosirulla. Huomasimme, että ilmaus 5 miRNA oli tilastollisesti merkitsevä vähentynyt luun etäpesäkkeitä verrattuna ensisijaisen PCA lukien Mirs-508-5p, -145, -143, -33a ja -100 vähentämistä 4,1-kertainen, 8,1-kertaiseksi, 5,7-kertainen, 3,2-kertaiseksi ja 5,3-kertaiseksi. Ei miRNA ilmentyminen merkittävästi lisääntynyt (taulukko 1).

Otettu kaikki tiedot yhdessä, olemme analysoitiin uudelleen ilmaisua tiedot 10 miRNA, kuten Mirs-508-5p, -143, -145, -100 , -125b, -153, -210, -363, -451 ja -572, klusterin analyysi (kuvio 1

).

A,

sertifioitu tuloksena mikrosiruanalyysi.

B,

Reaaliaikainen RT-PCR määritykset miR-143 (vasen paneeli), miR-145 (oikea paneeli), ja miR-125b (alapaneeli) 16 ensisijaisen eturauhassyövän ja 13 luumetastaasi kudoksia . Järjestystä kudosnäytteet on sama kaikille kolmelle koealojen.

p

-arvot by

t-testi

.

tarkastaminen miRNA microarray tietojen reaaliaikaista PCR-analyysiä perusterveydenhuollossa PCa ja luun etäpesäke

vahvista meidän microarray data, reaaliaikaisia ​​PCR suoritettiin analysoida ilmaus merkittävimmin säännelty miRNA, kuten Mirs-508-5p, -143, -145, -33a ja -100. Tutkimme ilmaus miRNA edellä riippumattomien näytteistä 16 ensisijaisen PCa ja 13 etäpesäkkeitä luustossa, joita ei ollut käytetty mikrosiruanalyysillä. Sen jälkeen yksittäisiä miRNA tasolla kussakin näytteessä kvantitoitiin ja normalisoitiin U6 ilmaisua, reaaliaikainen PCR tiedot vahvistivat, että ilmentyminen Mirs-145, -143, -33a ja -100 vähentämistä 17,3-kertainen, 12,9-kertainen, 1,7 kertainen ja 1,7-kertaisesti luun metastaattisen kudoksiin, vastaavasti. Ilmaisu tasot Mirs-143 ja -145 olivat alassäädetty merkittävästi etäpesäkkeitä näytteissä verrattuna ensisijaisen PCa (

p

= 0,012 ja p = 0,014, vastaavasti) (kuvio 1

B

). Ilmaisulla Mirs-33a ja -100 ollut tilastollinen merkitystä (

p

= 0,236 ja

p

= 0,448, tässä järjestyksessä). miR-508-5p eivät ilmaisseet kaikissa ensisijainen PCa näytteet ja luun metastaattisen näytteitä. Vaikka ilmaus Mirs-125b, -153, -210, -363, -451 ja -572 oli yli 2-kertainen muutokset luun etäpesäkkeitä verrattuna perusasteen PCa näytettä mikrosiruanalyysi, ei ollut tilastollisesti merkittävää eroa lukuun ottamatta ilmentyminen miR-125b kanssa vähentää 3-kertaiseksi luun metastaattisen kudoksiin reaaliaikaista PCR-analyysillä. Tämä oli tilastollisesti merkitsevä alassäätöä luun metastaattisen näytteissä (

p

= 0,012) (kuvio 1

B

). Siten tulokset osoittivat, että oli merkittävä alas-säätely Mirs-145, -143, ja -125b kun PCa kasvainten etäpesäkkeitä luussa.

lisäksi täsmentää ilmensi lähteistä ensisijainen PCa näytteissä LNA-ISH tekniikkaa on sovellettu. Tulokset osoittivat, että MIRS-143 ja -145 ilmentyy pääasiassa syöpäsoluissa, ja niiden ekspressio stroomasoluissa olivat pienempiä tai puuttuvat (kuvio 2).

Osiot on yläpaneeli osoitti tunnistus kasvainsolujen ja strooman soluissa H 0,001) ja etäpesäkkeitä luustossa (Kendall korrelaatio = 0,765,

p

Spearmanin korrelaatio = -0,536,

p

= 0,010. Kuvio 4,

B

ja

E

), ja merkittävä käänteinen korrelaatio ilmentymisen miR-145 ja kokonais- PSA (Spearman korrelaatio = -0,456,

p

= 0,033, kuva 4

F

); kun taas mitään korrelaatiota ilmentymisen miR-143 ja kokonais- PSA (Spearman korrelaatio = -0,403,

p

= 0,063). Lopuksi tutkimme, onko ilmaus Mirs-143 ja -145 liittyi Gleason perusterveydenhuollossa PCa. Myös tilastollisesti merkittävä käänteinen korrelaatio ilmentymisen Mirs-143 ja -145 sekä Gleason (Spearman korrelaatio = -0,574,

p

= 0,005; Spearmanin korrelaatio = -0,546,

p

= 0,009, kuva 4,

C

ja

G

). Nämä tulokset osoittivat, että downregulations Mirs-143 ja -145 liittyi kasvainprogression ja luun etäpesäke. Downregulation mir-125b ei korreloi luun etäpesäke, PSA ja Gleason pisteet ensisijaisen PCa (tuloksia ei ole esitetty).

A ja D,

ilmentyminen Mirs-143 tai -145 potilaiden luuetäpesäkkeistä oli merkitsevästi pienempi kuin ilman etäpesäkkeitä (

t-testi

,

p

= 0.039,

p

= 0,041, tässä järjestyksessä).

B ja E,

kasvain näytteet jaettiin neljään ryhmään, joissa suunnilleen yhtä otoskoot perustuvat tasoon vapaan PSA. Taso vapaan PSA potilailla, joilla on primaarikasvaimen on esitetty x-akselilla. Y-akseli on keskiarvo Mirs-143 tai -145 kussakin ryhmässä. Palkit edustavat keskivirheet. Tilastollisesti merkitsevä Spearmanin korrelaatiota että tunnettu käänteinen suhde MIRS-143 tai -145 ilmaisun ja vapaa PSA (Spearman korrelaatio = -0,501,

p

= 0,018; Spearmanin korrelaatio = -0,536,

p

= 0,010).

F,

taso koko PSA myös korreloi miR-145 (Spearman korrelaatio = -0,456,

p

= 0,033).

C ja G,

Gleason tulokset primaarituumorin ryhmään esitetään x-akselilla. Y-akseli on keskiarvo Mirs-143 tai -145 kussakin ryhmässä. Palkit edustavat keskivirheet.