Krooninen sairaus

tiivistelmä

tp53 geeni todettu mutatoitunut 50% kaikista syövistä. P53-proteiini, tuote tp53 geenin, on multi-domain-proteiinia. Se koostuu ytimestä DNA sitovan domeenin (DBD), joka on vastuussa sitomisesta ja transkription alavirtaan kohdegeenien. Mutaatiot p53-proteiini ovat vastuussa luoda syöpätiloihin ja on todettu tapahtuvan korkealla taajuudella on DBD alueella p53. Jotkut näistä mutaatioista tiedetään myös herkkiä lämpötilan vaihteluille (

ts

) luonnossa. Ne tiedetään olevan osittain tai voimakas sitoutumisaffiniteetti DNA: n kanssa lämpötila-alueella (298-306 K). Ottaa huomioon, että 310 K ja yläpuolella ne osoittavat täydellistä menetystä sitoutumisessa. Olemme analysoineet muutokset sitova ja konformationaalisten käyttäytyminen 300 K ja 310 K kolmelle

ts

-mutants

nimittäin

., V143A, R249S ja R175H. QM-MM simulaatiot on suoritettu villityypin ja edellä mainittuja

ts

-mutants 30 ns jokaiselle. Optimaalinen arvio vapaan energian sitoo tiettyä määrää käyttöliittymän vetysidosten laskettiin käyttämällä suurimman uskottavuuden menetelmää, kuten ovat kuvanneet Chodera et. al (2007). Tämä parametri on havaittu pystyä matkimaan sitoutumisaffiniteetti p53

ts

-mutants 300 K ja 310 K. Siten korrelaatio MM-GBSA vapaan energian sitomisesta ja vetysidokset muodostuvat rajapinnan jäämien p53 ja DNA on paljastanut lämpötila riippuvuus näiden mutantteja. Rooli pääketjun dihedrals saatiin suorittamalla dihedral pääkomponenttianalyysi (PCA). Tämä analyysi viittaa siihen, että konformationaalisen vaihtelut pääketjussa dihedrals (

φ

ja

ψ

) p53

ts

-mutants saattanut aiheuttaa väheneminen yleistä vakautta proteiinin. Liuotin altistuminen sivuketjujen rajapinnan tähteet havaittiin estää sitoutumisen p53-DNA: han. Liuotinpääsyisellä pinta-ala (SASA) osoittautui myös ratkaiseva kiinteistön erottaa konformeria saatu 300 K ja 310 K kolmen

ts

-mutants villityypin 300 K.

Citation: Koulgi S, Achalere A, Sonavane U, Joshi R (2015) tutkitaan DNA Sidonta ja Conformational Lämpötilan vaihtelut Sensitive p53 Cancer Mutants käyttäminen QM-MM Simulaatiot. PLoS ONE 10 (11): e0143065. doi: 10,1371 /journal.pone.0143065

Editor: Freddie Salsbury Jr, Wake Forest University, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 24 heinäkuu 2015; Hyväksytty: 30 lokakuu 2015; Julkaistu: 18 marraskuu 2015

Copyright: © 2015 Koulgi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen tietokantojen.

rahoitus: kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

p53-reitin on ratkaiseva merkitys tehokkaalle tuumorisuppressiogeeneksi joka aktivoi geenejä vastauksena solustressiä [1, 2]. Mutaatiot p53 kuitenkin estää tämän reitin haitallinen p53: n toiminnallinen aktiivisuus [3]. Lähes 50% ihmisen syövissä, mutaatiot havaitaan p53-proteiini [4, 5], [6]. Suurin osa näistä mutaatioista löytyy sekvenssin spesifisten DNA-sitovan ydindomeeni (DBD) p53 [7-10]. Nämä mutaatiot tiedetään vaikuttavan termodynaamisen vakauden DBD ja koko proteiini samoin. Kiderakenne p53 paljastaa, että suuri

β

sandwich tarjoaa tukirakenteen konservoituneen DBD alueella. Tämä DBD alue koostuu loop-levyn heliksimotiivin ja kaksi suurta silmukat kytkettyinä sinkki-ionin (kuvio 1A) [11]. DNA: ta sitovaa aktiivisuutta p53 liittyy yhdistyksen sinkki-ionin, jonka tiedetään muodostamaan tetraedrielementtiverkossa koordinointia monimutkainen CYS 176, CYS 238, CYS 242 ja HIS 179 jäämiä proteiinin. Sinkki-ioni on tärkeä rooli vakauttamiseen silmukat liittyvät sen tetraedrisessa monimutkainen ja korjata sitoutuminen p53 pienessä urassa spesifisen DNA ehjien solujen [12, 13]. Vaikka suurin osa jäämistä DNA: ta sitovan domeenin p53 ovat erittäin herkkiä mutaatioita on seitsemän kriisipesäkkeisiin jossa mutaatiot tapahtuvat hyvin korkealla taajuudella [14-19]. Ymmärtäminen rakenteelliset ja toiminnalliset seuraus näistä mutaatioista on ollut suuri kiinnostus syöpä tutkimuksissa [14], [20].

Koska puolet ihmisen syövistä liittyy mutaatioita p53, tulevaisuudessa syövän terapeuttista strategiat ovat suunnattu lääkkeitä, jotka stabiloivat mutantti p53 ydindomeenin [10]. Kuitenkin monet kokeelliset tutkimukset hot spot mutantteja ovat paljastaneet niiden lämpötilariippuvuus DNA sitoutumisaffiniteetin [21-23]. Viimeisten kahden vuosikymmenen aikana laajan kokeellista työtä on keskittynyt ymmärtää lämpötilan herkkä (

ts

) luonne eri p53 mutanttien ja niiden konformationaaliset mekanismi [21-24] [25, 26]. Ensimmäinen yksityiskohtainen kokeellinen tutkimus on

ts

-p53 mutanttien raportoineet Zhang et. al. ja Friedlander et. al. ovat selittäneet niiden DNA: ta sitovaa 310 K [21, 22]. He havaitsivat, että 298 K

ts

-mutants osoittaa sitova kyky, joka tuhoutuu peruuttamattomasti kuumennettaessa 310 K [22]. Näiden kokeiden oli selvää, että hot spot p53-mutantit V143A, R248Q, R249S, R273H paitsi R175H kykenivät sitomaan DNA alemmilla fysiologinen lämpötila-alueella (298-306 K) ja menettävät sitovan täysin 310 K. sitova vakaus ja konformationaaliset valtioiden näistä

ts

-p53 mutantteja on myös tutkittu sitomalla monoklonaalisia vasta-aineita, kuten PAB 1620 ja PAB 1801 [21, 22]. Samoin yksi teosten Bullock et. al. osoittivat, että käyttö DSC-tai spektroskopia johtaa peruuttamattomaan denaturointi p53 mutantti ydin verkkotunnus lämpötilan muutoksen [23]. Kokeet p53-mutantit eri lämpötila-alueille ovat löytäneet takaisin osan tasolle transaktivaation kun ilmaistu alhaisissa lämpötiloissa [21, 24]. Perusteella riippuu lämpötilasta määrällinen taitto p53 jäämien ja DNA ainesitoutumistutkimukset, p53-mutantit on luokiteltu erillisiin luokkiin [25]. Laaja työ Shiraishi et. al. osoittivat lämpötilasta riippuvat molekyylin sisäisiä mekanismi noin 2000 missense mutantteja. Siihen sisältyi myös transaktivointidomainien tutkimuksessa 303 K ja 310 K [26]. Osittain aktiivinen riippuvainen lämpötilasta p53 mutantteja on raportoitu esiintyy uudelleen aktivoituminen mekanismi amifostiinin hiiva [27]. Viimeaikaiset kokeet lobulaarinen rintojen syöpäsolut ovat paljastaneet lämpötila herkkä toiminnallinen aktiivisuus p53 mutanttien ja siellä rooli klonaalisia evoluutioreitin [28].

Huolimatta syvällinen kokeellista huomautuksen DNA: ta sitovaa aktiivisuutta

ts

-mutants p53 harvoja teoreettisen ja laskennallisen tutkimukset ovat keskittyneet ymmärtämään tätä ilmiötä. Molekyylidynamiikan simulointi on nykytilaa tekniikan menetelmän koetin koukerot rakenteeltaan-toiminnalliset suhteet bio-molekyylejä. Se täydentää myös koehavainnot antamalla käsityksen atomitasolla vuorovaikutusta. Viime aiemmin, harvat analyysi on raportoitu käyttäen molekyylidynamiikan simulaatioita tutkia lämpötila herkkiä käyttäytymistä p53 syövän mutantteja. Tan ja työtovereiden analysoi missensemutaatio on DBD 310 K perustuu DBD vakauteen korrelaatio sekvenssin rakenne ja molekyylitason yhteystiedot niihin [29]. Kattava vakaus korrelaatio oli ehdotettu myös kliinisen ja funktionaaliset tiedot [29]. Äskettäin fenotyyppinen vaikutus kuin synonyymi yhden nukleotidin polymorfismien tp53 geeni on tutkittu käyttäen MD simulaatioita mutantti ja WT p53-proteiinien [30]. Toisaalta MD simulaatioita R248Q mutantti ovat paljastaneet lämpötila herkkä luonne mutantti DNA sitova vuorovaikutus ja sen dynaamista käyttäytymistä [31]. Kuitenkin on tarpeen koetin syvemmälle, jotta pin pisteen rakennetta toiminnalliset suhteet

ts

-mutants. Yrityksenä tämän paperin esittelee QM-MM simulointitutkimus lämpötilasta riippuvainen p53 mutantteja. Sinkki koordinointi kompleksi on erittäin tärkeää DNA: ta sitovaa p53 kuten edellä on selitetty [12, 13]. On vaikeaa ylläpitää tämä koordinoinnin monimutkainen klassisen MD simulaatioita. Siksi monet edelliset simulaatiotutkimuksia p53, eri strategioita, kuten nukke atomi, liimattu ja muokattu voimakentän lähestymistapaa on käytetty säilyttää sinkki koordinoinnin monimutkainen [32-34]. Samoin esillä olevassa tutkimuksessa yritettiin säilyttää tämän monimutkaisen käsittelemällä sitä kvanttimekaniikan (QM) hakemisen sijasta ilmanvirtausta rajoituksia. Performing QM näin tärkeästä funktionaalinen osa proteiinin auttaisi matkii todellista biologista käyttäytymistä [35]. Käyttö QM-MM lähestymistapa säilyttää sinkki koordinoinnin kompleksi on sisällytetty yksi meidän aikaisemmat tutkimukset p53-mutantit [36]. Siten säilyttäen sinkki koordinoinnin monimutkainen oli ainoana tarkoituksena on ottaa käyttöön quantum hoitoon.

Tavoitteena tätä paperia on antaa tietoa siitä konformationaaliselle vaihtelut ja DNA sitoutumisominaisuuksia

ts

-p53 variantteja. Kolme tunnettua

ts

-mutants

nimittäin

., V143A, R249S ja R175H on tutkittu käyttäen QM-MM simulaatioita. Lämpötila herkkä luonto on tutkittu kahdessa lämpötilassa

nimittäin

., 300 K (huoneenlämmössä) ja 310 K (fysiologinen lämpötila).

V143A, R249S ja R175H ovat rakenteellisia mutantteja ja ovat tiedossa vääristää konformationaaliselle vakautta p53-DBD. V143A sijaitsee

β

-sandwich alueen silmukan arkin-helix motiivi p53-DBD, joka on vastuussa suurten uran DNA: ta sitovan (kuvio 1B). Tämä

ts

-mutant tiedetään luoda onteloita hydrofobisen ytimen muodosti johtuen

β

-sandwich. Se myös merkittävästi destabilizes p53 ydindomeenin erolla 4 kcal /mol [14]. V143A ollessa

ts

-mutant sitoo paremmin kuin villityypin p53 300 K. Tämä sitova kyky puuttuu kokonaan 310 K [21].

R249S sijaitsee DNA sitova pinta, sivuketju arginiini 249 on mukana vakauttaa silmukan L3, joka on osa pieni ura DNA: ta sitovan domeenin (kuvio 1B). Tämä arginiini pääsemisestä korvattu Serine johtaa ei-natiivi konformaatio silmukan L3, joka edelleen vaikuttaa DNA: ta sitovan. R249S

ts

-mutant tiedetään osoittavan osittaista sitoutuminen DNA: 300 K ottaa huomioon, että sama on poistettu kokonaan 310 K [22].

R175H sijaitsee lähellä sinkki-ioni tetraedrisen monimutkainen , joka vastaa pieneen uraan sitoutumisen yhdessä kaksi suurta silmukkaa L2 ja L3 (kuva 1 B). Oletetaan, että tämä

ts

-mutant häiritsee sinkkiä sitova alue. Minimaalinen määrä rakenteellisia tutkimukset ovat saatavilla tämän

ts

-mutant. Sen lämpötila riippuvuus osoittaa, että 300 K on heikentynyt sitoutuminen DNA, joka myöhemmin menetetään 310 K. perusteellinen käsitys lämpötilan riippuvuus näiden mutanttien edellyttää laajoja konformaatioanalyysi. Näin ollen työssä käsitellään rakenne- ja DNA: ta sitovan vaihtelua esiintyy näissä kolmessa

ts

-mutants

nimittäin

., V143A, R249S ja R175H.

Methods

Järjestelmän valmistelu

koordinaatit alkaa rakenne valittiin ketjun B ja koko kaksijuosteisen DNA ATE ID 1TSR [11]. Jokainen syöpä mutantti valmistettiin harkitsee tämän rakenteen koska viittaus käyttämällä

xleap

moduuli AmberTools 1,5 [37]. Sinkin ioni oli läsnä tetraedrielementtiverkossa koordinoinnin monimutkainen CYS 176, CYS 238, CYS 242 ja HIS 179. bond etäisyyden ja kulman tietoja tetraedrielementtiverkossa kompleksi saatiin raportoineet Lu et al. vuonna 2007 [32]. Koko p53-DNA-sinkki monimutkainen alun perin neutraloitiin lisäämällä Na + ionien seurasi nimenomaisen solvaatiota käyttäen TIP3P vesi malli [37]. Solvaatioenergia suoritettiin sisällä octahedron, vähimmäisetäisyys liuenneen aineen (p53-DNA-kompleksi) ja reunan simulointi laatikko oli 12

Å

. Rakenteeseen ja koordinaatit kaikille p53-muunnelmista valmistettiin käyttäen Amber FF03 voimakenttä [37]. Järjestelmän koko kunkin p53 varianttien oli noin 63300 atomia.

QM-MM simulaatiot

Kussakin solvatoitunut p53-DNA-järjestelmän, sinkki koordinointia kompleksi säilytetään sitoutumattomien muodossa käyttäen kvanttimekaniikan (QM) menetelmä. Loput simulaatio järjestelmän oli käsitelty käyttäen molekyylimekaniikkaa (MM) lähestymistapaa. Siksi jokainen minimointi, lämpötila riehua, tasapainotus ja tuotantolinjalta protokollat ​​olivat QM-MM simulaatioita. PM3 menetelmä [38] valittiin QM alueella taas, Amber FF03 voimakenttä levitettiin MM alueelle [37]. Kokonaisvaraus on QM alueen pidettiin +2 liittämällä maksu on sinkki-ioni. Joukkovelkakirjat sisältävä vetyatomit QM ja MM alue rajoitti käyttämällä SHAKE algoritmia [39]. Kanoninen ensemble, NVT on sovellettu, jossa atomien lukumäärä, laatikko tilavuus ja lämpötila kunkin järjestelmän pidettiin koko simulointi [40]. QM-MM käyttöliittymä käsiteltiin mukaan yhteyden atomin lähestymistapaa ennalta määritellyn oletusparametrit [41-43]. Simuloinnit suoritettiin kerrallaan vaiheessa 2 FS käyttäen Langevin dynamiikan ja törmäyksen taajuus 0,1 ps

-1 [40]. Jaksollisen reunaehto (PBC) levitettiin suorittaa vakiotilavuudessa dynamiikkaa. Particle Mesh Ewald (PME) menetelmää käytettiin ei-sidottu cut-off 12

Å

. Minimointi suoritettiin kahdessa vaiheessa. Aluksi liuotin minimoida käyttämällä jyrkimmän laskeutumisen menetelmä 20000 vaiheita. Seuraaja, p53-DNA-Zn kompleksi on luovutettu minimointia seuraavassa 50000 vaiheet. Simulointi protokolla oli sama kaikille p53-varianttien kunnes tämä vaihe. Koska simulaatiot suoritettiin kahdessa eri lämpötilassa

nimittäin

., 300 K ja 310 K, lämpötila ramping suoritettiin 40 ps kutakin saada näissä lämpötiloissa, vastaavasti. Tasapainotustun- 2 ns ja tuotanto kestää 30 ns jokaiselle, tehtiin kaikille p53 variantit 300 K ja 310 K. Amber 10 simulointi paketti käytettiin kaikkiin simulaatiot. Kaiken kuusi QM-MM suoritettiin simulointeja, joka käsittää villityypin p53 310 K, V143A 300 K ja 310 K, R249S 310 K ja R175H 300 K ja 310 K. Tulokset WT ja R249S 300 K saatiin meidän aikaisempi työ [36].

Nämä simulaatiot analysoitiin tarkemmin eri moduulien AmberTools 1,5 [44]. Cpptraj ja MMGBSA moduuli AmberTools 1,5 käytettiin laskemiseen vetysidoksen ja ilmaista energiaa parametrit simulaatioita. Työkalu nimeltään GeoPCA, käytettiin suorittamaan dihedral PCA [45]. PCA on monimuuttuja tilastollinen tekniikka, joka edustaa joukko korreloi muuttujien kuten ortogonaalisten pääkomponentteina. Nämä pääkomponentit auttavat analysoinnissa vaihtelua läsnä tahansa tietoja. PCA osoittautuu erittäin hyödylliseksi välineeksi tutkimaan erilaisia ​​paikallisia liikkeet, jotka ovat vastuussa konformaatiomuutoksia simuloidussa proteiineja. Lisäksi liuotin pääsee pinta-ala (SASA) laskettiin käyttäen ohjelmaa NACCESS [46].

Tulokset ja keskustelu

Vaikutus DNA: ta sitovaa p53

ts

-mutants

DNA: ta sitova kyky kaikkien p53-muunnokset arvioidaan laskemalla muutoksen vapaan energian sitoutumisen ja vetysidosten lukumäärä (hbonds) muodostetaan rajapinnan tähteet välillä p53 DNA: ta. Vapaan energian arvot laskettiin käyttäen MMPBSA moduuli AmberTools 1,5 [44]. Muutos vapaa energia laskettiin seuraavasti, (1) (2) AE

kaasu

, (

com

,

rec

,

lig

) on molekyylimekaniikka energia- ja AG-

sol

(

com

,

rec

,

ty

) on solvaatioenergia laskettu by Yleistynyt Born (GB) solvaatiota malli monimutkainen, reseptori ja ligandi vastaavasti. Nämä kaksi käsitettä edistävät entalpia osan vapaan energian laskentaan. TΔ S

(

com

,

rec

,

ty

) termi näyttää entropic osuus laskettua vapaa energia. Entropy laskelma on raskaasti laskea intensiivinen, ohitettiin ilmaiseksi energialaskelmat. Siksi seuraavaa yhtälöä käytettiin esillä olevassa työssä, (3) kuitenkin MM-GBSA vapaa energia ja ilman entropic osuus laskettiin viimeisen 10 ns simulaatioiden (S1 ja S2 kuviot). Vapaan energian arvot havaittiin samanlainen suuntaus molemmissa tapauksissa. Siksi TΔ S

(

com

,

rec

,

ty

) määritteet entropian osa vapaa energia ei ole sisällytetty vapaan energian kannalta laskettu. Nämä vapaan energian arvot edelleen optimoitu saada laadukkain arvio vapaan energian tietty määrä hbonds välillä p53 ja DNA käyttäen suurimman uskottavuuden menetelmällä [47]. Yhtälö käytetään johtamiseksi optimaalisen arvio vapaa energia oli seuraava, (4) (5) on optimaalinen arvio ΔΔ

G

sitoa

(

opt

ΔΔ

G

bind

) kun k määrä rajapinnan hbonds välillä p53 ja DNA [47]. Katsovat,

x

n

on Δ Δ G

bind

varten tilannekuvan numero n ja

δ

2

x

k

on mitta epävarmuus havaittu vapaan energian arvot

x

n

k määrä rajapinnan hbonds (yhtälö 5).

määrä hbonds laskettiin käyttäen cpptraj moduuli AmberTools 1,5 [44]. Cut-off luovuttaja-vastaanottaja bindningsavståndet ja kulma pidettiin 3

Å

ja 135 ° vastaavasti. Hbonds muodostama kahdeksan rajapinnan tähteet

nimittäin

., LYS 120, SER 241, ARG 248, ARG 273, ALA 276, CYS 277, ARG 280 ja ARG 283 DNA katsottiin käyttöliittymä hbonds varten kaikki p53 variantteja. Myös yksi aiempien teosten samantyyppinen lähestymistapaa käytettiin perustuen MM-GBSA vapaan energian sitoutumisen ja hbonds muodostettu p53 ja DNA. Tässä vertailussa oli paljastanut ero DNA: ta sitovaa omaisuutta villityypin, syöpä ja pelastus mutantit p53 [36]. Samoin suorittaman analyysin tässä asiakirjassa edustaa optimaalisen arvioinnin MM-GBSA vapaan energian sitoutuminen (

opt

ΔΔ

G

bind

) spesifisiä vetysidokset muodostaman käyttöliittymä jäämiä.

opt

ΔΔ

G

sitoa

laskettiin villityypin (WT) ja kaikki kolme

ts

-mutants p53 300 K ja 310 K. koko 30 ns lentorata pidettiin tähän analyysiin. Vertailu on

ts

-mutants WT 300 K ja 310 K on kuvattu kuviossa 2. Kuvio 2A ja 2D osoittaa tulokset V143A ja WT 300 K ja 310 K vastaavasti. Havaittiin, että 300 K, vapaa energia-arvot olivat matalammat V143A verrattuna WT, mikä viittaa siihen, parempi sitoutuminen V143A (kuvio 2A). Toisaalta havaittiin heikentävän 310 K (kuvio 2D). Kuvio 2B ja 2E esittää vapaan energian sitoutumisen R249S ja WT 300 K ja 310 K vastaavasti. Se oli selvästi havaittavissa, että molemmissa lämpötiloissa vapaan energian arvot R249S olivat korkeammat kuin WT. Kuvio 2C ja 2F esittää vertailun R175H ja WT 300 K ja 310 K vastaavasti. Tässäkin R175H oli korkeampi vapaa energia-arvot kuin WT molemmissa lämpötiloissa.

Nämä havainnot on saatu laskemalla

opt

ΔΔ

G

sitoa

perusteella vetysidoksen, osoittaa, että kaikki kolme

ts

-mutants menettävät sitoutumisaffiniteetti 310 K verrattuna WT. Kuitenkin V143A osoittaa parantuneen sitoutumisen kuin WT 300 K, joka on myös raportoinut kokeita

ts

-p53 mutantteja

nimittäin

., Friedlander et. al (1996), Bullock et. al (1997, 2000) ja Zhang et. al. (1994) [22], [23], [25], [21]. Nämä kokeelliset tutkimukset viittaavat myös siihen, että R249S ja R175H sitoutuvat heikosti 300 K, mutta toiminta on täysin menetetty 310 K. Näin saadut tulokset R249S ja R175H simulaatioista tutkimuksessa käsitellään tässä paperissa, sopivat havainnot raportoitu näissä kokeellisissa tutkimuksissa [22], [23], [25], [21].

jotta lisätä tukea näitä havaintoja tontin MM-GBSA peräisin ΔΔ

G

sitoa

aikaa vastaan ​​on annettu täydentävän datan S3 Fig. Lämpötila vertailu näistä

ts

-mutants on myös annettu täydentävissä datan S4 Fig. Nämä tulokset myös täydentämään edellä mainittuja kokeellinen havainnoista kertoi

ts

-mutants p53.

opt

ΔΔ

G

sitoa

on tilastollinen parametri osoittautuisi merkittävämpi kanssa useita havaintoja. Siksi samanlainen simulointi WT 300 K suoritettiin 30 ns ja tilannekuvia otettiin kiinni jokaista 10 ps mikä lisää mittauspisteiden 6000 valokuviin. S5 Kuvio esittää vertailu

opt

ΔΔ

G

bind

WT 300 K 3000 (Run1) ja 6000 (Run1 + Run2) tilannekuvia vastaavasti.

Lämpötila mutantteja vakautta ja pääketjun dihedrals

ts

-mutants p53 tiedetään aiheuttavan menetyksiä DNA sitova sekä rakenteellisia vääristymiä p53 DBD. Voidakseen tarjota käsityksen rakenteellisiin muutoksiin johtuen mutaatioista pääketjun dihedrals

φ

ja

ψ

alistettiin Principal Component Analysis (PCA). PCA osoittautuu erittäin hyödylliseksi välineeksi tutkimaan erilaisia ​​paikallisia liikkeet, jotka ovat vastuussa konformaatiomuutoksia simuloidussa proteiineja. Tärkeimmät ketju dihedrals (

φ

ja

ψ

) käytettiin reaktion koordinoi ja PCA tehtiin käyttämällä GeoPCA [45]. Principal Component 1 (PC1) ja 2 (PC2) laskettiin mutanttien ja villityypin. Tontit varten PC2 vastaan ​​PC1 on säädetty täydentävissä tietoja S6-S9 kuviot. S6 ja S7 kuvissa näkyy jakautuminen konformeerien perustuu PC1 ja PC2 on

φ

dihedrals 300 K ja 310 K vastaavasti. Samoin S8 ja S9 kuviot esittävät jakelun konformeerien perustuu PC1 ja PC2 on

ψ

dihedrals 300 K ja 310 K vastaavasti. Varianssi havaittu PC1 ja PC2 sekä

φ

ja

ψ

kulmat kaikissa tapauksissa on esitetty S10 kuvassa. Se näkyi, että sekä

φ

ja

ψ

kulmia osoittivat suurempaa vaihtelua PC2 sekä arvoilla lämpötiloissa.

φ

dihedrals osoitti muutos PC2 lämpötilan kohotessa WT ja kaikki kolme p53-mutantit. Kuitenkin

ψ

dihedrals paitsi WT kaikissa kolmessa

ts

mutanttien määrässä ole merkittäviä muutoksia lämpötilan suhteen. Jotta tarkkailla vaikutuksia tällä muutoksen

φ

ja

ψ

dihedrals yleisestä vakautta proteiinin Δ

G

proteiinia

piirrettiin PC2 arvot WT ja kunkin p53

ts

-mutants (kuviot 3 ja 4). Kuviot 3 ja 4 selittää väestön jakautuminen konformeerien perustuu PC2 on

φ

ja

ψ

kulmat WRT vapaan energian yleisen proteiinin (Δ G

proteiini

) vastaavasti. Analyysi tehtiin otoksia kuvaväli 10 ps viimeisen 10 ns simuloinnin. Kuvio 3A ja 3D näyttää jakelu WT ja V143A 300 K ja 310 K vastaavasti. Jakauma väestöstä V143A osoittaa päällekkäisiä WT molemmissa lämpötiloissa. WT ja V143A saavuttaa cis-konformaatiossa 300 K, joka edelleen asteittain ajautuu kohti trans alueella 310 K. kuitenkin Δ G

proteiini

arvot nousivat 310 K molemmille verrattuna 300 K. Kuva 3B ja 3E esitetään jakelu R249S ja WT 300 K ja 310 K vastaavasti. 300 K, WT saavuttaa cis ja R249S on hajallaan trans alueen korkeampi vapaa energia-arvot. 310 K, R249S taipumus kansoittavat cis-muoto on ilmainen energia on suurempi kuin WT 310 K ja itse 300 K. Kuviossa 3C ja 3F kuvastaa käyttäytymistä R175H verrattuna WT 300 K ja 310 K vastaavasti. Väestön näyttää voimakkaasti hajallaan pitkin koko valikoiman

φ

kanssa vapaan energian arvot korkeammat kuin WT molemmissa lämpötiloissa.

Nämä havainnot viittaavat siihen, että V143A konformaatioita yleensä kansoittavat saman alueen samanlaisia ​​vapaan energian arvot nähdään WT 300 K ja 310 K. Tällöin inferring samanlainen konformaatioita hankkima

φ

kulmat V143A ja WT molemmissa lämpötiloissa. Kuitenkin R249S

φ

kulmia voitaisiin menestyksekkäästi osoittaa geometrisesti päinvastainen konformaatioita saadaan 300 K ja 310 K verrattuna WT ja itsensä. Jossa, 310 K vapaan energian arvot olivat korkeammat kuin WT kanssa ero 1000 kcal /mol. Jäykkyys saama

φ

kulmat R249S 310 K voinut johtaa kasvuun vapaa energia, joka päättelee menetys vakautta. R175H osoittanut mitään erityistä hallitseva konformaatioon saama

φ

kulmista väestön näytti täysin levitä. Kuitenkin molemmissa lämpötiloissa R175H näytti olevan vähemmän stabiileja kuin WT suhteen vapaan energian p53-molekyylin. Siksi kuvio 3 päättelee, että lämpötila nousee indusoi muutoksen

φ

kulmien WT, V143A, R249S ja R175H mikä puolestaan ​​vähentää niiden vakautta.

Kuva 4A ja 4D esittävät

ψ

kulmat jakelu WT ja V143A 300 K ja 310 K vastaan ​​Δ G

proteiinia

. Konformaatiot sekä WT ja V143A näyttävät hajallaan ja span jostain vapaasta energiatasot. Kuitenkin 310 K WT pyrkii asuttamaan cis alue taas V143A edelleen hajallaan. Vapaa vireystasoonsa 310 K olivat samanlaiset sekä V143A ja WT ja korkeampi kuin mitä havaittiin 300 K. Kuvio 4B ja 4E puhuu konformationaaliseen jakelusta WT ja R249S 300 K ja 310 K vastaavasti. 300 K, väestö on levinnyt koko alueella

ψ

mutta vapaan energian arvot ovat korkeammat verrattuna WT. 310 K, hajallaan käyttäytymistä R249S säilytettiin jopa suuremmilla vapaa energian tasoilla verrattuna itse ja WT. Kuvio 4C ja 4F kuvaa väestön jakauma R175H 300 K ja 310 K vastaavasti. 300 K, kunnes konformeria varten R175H levitettiin koko alueella -180 ° -180 ° ja korkeammalla vapaa energiatasolla verrattuna WT. 310 K, kunnes konformeria taipumus keskittyä osaksi cis- ja trans-alueiden R175H vaikka vapaan energian tasot ovat korkeammat kuin WT. Kaiken kaikkiaan kaikki kolme mutantit

ψ

kulmat johti konformaatioita, jotka lisäävät vapaan energian p53 molekyylin 310 K verrattuna WT ja itsensä 300 K.

Jos WT sekä

φ

ja

ψ

kulmat osoitti muutos lämpötilan kohotessa. V143A, R249S ja R175H osoittivat muutokset

φ

kulma jakauman kasvu vapaan energian arvot 200 kcal /mol 310 K verrattuna 300 K. Jos kuitenkin kaikista kolmesta

ts

-mutants

ψ

kulma jakelu oli samanlainen molemmissa lämpötiloissa mutta vapaan energian arvot näytti olevan korkeampi 200 kcal /mol 310 K. Nämä jakaumat konformeerien perustuu vapaan energian p53-molekyylin ja PC2 pääketjun dihedrals viittaa siihen, että joko

φ

tai

ψ

tai molemmat voivat olla vastuussa muutoksesta vakautta. Siksi konformationaalista jakaminen perustuu pääketjussa dihedrals ja vapaa energia p53-molekyylin avulla päätellä, että lämpötila voi aiheuttaa muutoksen yleistä rakennetta p53. Tämä mukauttaminen eri konformaatioita korkeammassa lämpötilassa aiheuttaa menetystä vakauden V143A, R249S ja R175H suhteen vapaan energian.

Lämpötilan vaikutus käyttöliittymän jäämiä

ts

-mutants

DBD p53 tiedetään olevan kaksi erillistä aluetta, jotka vaikuttavat sitoutumiseen DNA

nimittäin

., loop-levyn heliksimotiivin ja silmukat 2, 3 Sinkki koordinointia monimutkainen. Nämä kaksi aluetta on kahdeksan tärkeitä jäämiä

nimittäin

., LYS 120, SER 241, ARG 248, ARG 273, ALA 276, CYS 277, ARG 280 ja ARG 283, joka on ratkaiseva rooli muodostettaessa p53-DNA vuorovaikutusta. Jotta tarkistaa lämpötilan vaikutusta niiden osallistumisesta sitoutuu DNA: han, sivuketjun liuotinpääsyisellä pinta-ala (SASA) ja vapaa energia panos sitovien laskettiin nämä kahdeksan jäämiä. Tämä analyysi suoritettiin viimeisen 10 ns simulaatiot.

liuotinainealtistumisesta käyttöliittymän jäämiä.

On ollut erilaisia ​​tutkimuksia raportoitu malleja eri proteiinia järjestelmiä, jotka keskustelevat liuotinainealtistumisesta yhtenä Merkittävä tekijä ylläpitämisessä proteiinin stabiilisuutta [25, 48, 49]. Varsinkin jos p53 muutoksista sen liuotinainealtistumisesta tiedetään olevan tärkeä merkitys määritettäessä vakautta sen mutanttien [25]. Kuitenkin altistuminen haudattu jäämät helposti aiheuttaa proteiinin enemmän verrattuna niihin, jotka sijaitsevat pinnalla proteiinin. Tutkiakseen Näiden kokeellisten havaintojen sivuketjun SASA kahdeksan rajapinnan tähteet laskettiin.

Kuva 5 kuvaa keskimääräistä sivuketjun SASA kaikille kahdeksalle rajapinnan tähteet 300 K (kuvio 5A) ja 310 K (kuvio 5B). Virhepalkit näissä kahdessa luvut osoittavat keskihajonnan arvot. Käyttäytymistä sivuketjun SASA kullekin kahdeksasta rajapinnan tähteet w.r.t aikaa kaikille p53-varianttien 300 ja 310 K on järjestetty täydentävä data (S11-S18 kuvioissa). Ottaen huomioon WT 300 K niin lähellä natiivi konformaatio p53, vertailua muihin p53 variantteja on keskusteltu täällä. Ero SASA arvot on ilmoitettu suluissa. Kun tämä ero SASA oli suurempi kuin keskihajonta p53 variantin katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä. V143A oli neljä kahdeksasta jäämien

nimittäin

., LYS 120, ARG 273, CYS 277 ja ARG 280 enemmän alttiina (10-30

Å

2) sivuketjut 300 K ja 310 K kuin WT 300 K. näistä neljästä paitsi ARG 273 loput kolmen osoittivat tilastollisesti merkitsevä SASA eroa. Liuotin altistuminen ARG 248 300 K oli pienempi kuin WT 300 K (20

Å

2), jonka havaittiin kasvavan 310 K. Tämä lisäys SASA varten ARG 248 310 K oli mukana suuri keskihajonta (noin 20

Å

2). Loput kolme tähteet

nimittäin

., SER 241, ALA 276 ja CYS 277 erosivat hieman (alle 15

Å

2) verrattuna WT 300 K. R249S oli kuusi al. al. al.