Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Tensin perhe solunsisäisten proteiinien (Tensin1, – 2, -3 ja -4) arvellaan toimivan yhteyksiä soluväliaineen ja solun tukirangan ja siten välittää signaloinnin solujen liikkumiseen ja muodon. Häiriöstä Tensin ilmaisun on aiemmin liitetty ihmisen syöpään. Täällä meillä on ensimmäistä kertaa arvioitu merkitys kaikkien neljän Tensins tutkimuksessa ihmisen munuaissyövän (RCC), sekä probed biologisen toiminnan Tensin3.

Keskeiset havainnot

ilmentäminen Tensin2 ja Tensin3 mRNA ja proteiini tasoilla oli selvästi vähemmän paneelin monipuolinen ihmisen syövän solulinjoissa. Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi paljasti mRNA ilmaus kaikkien neljän Tensin geenien merkittävästi vaimentua ihmisen munuaisen kasvaimissa (50-100%: n vähennys verrattuna normaalin munuaisen kuorikerroksen;

P

0,001). Lisäksi mRNA: ta ilmauksia Tensins enimmäkseen korreloivat positiivisesti keskenään ja negatiivisesti kasvaimen, mutta ei tuumorin koon. Immunohistokemiallinen analyysi paljasti Tensin3 olla läsnä sytoplasmassa epiteelissä normaaleissa ihmisen munuaisen osat, kun taas ekspressio oli heikompi tai puuttuu 41% munuaisten kasvaimia. Osajoukko tuumorisektioiden osoitti etuoikeutettu solukalvon ilmentymä Tensin3, joka selkeästi solu RCC potilailla korreloi elinajan pitenemiseen. Pysyvää ilmentymistä Tensin3 HEK293-soluissa merkittävästi esti sekä solumigraatioon ja matriisi invaasio, toiminnallisesti itsenäinen otaksuttu fosfataasiaktiivisuus Tensin3. Kääntäen, siRNA knockdown endogeenisen Tensin3 ihmisen syöpäsoluissa huomattavasti muuton.

Johtopäätökset

tulokset osoittavat, että Tensins voi edustaa uutta ryhmää etäpesäke vaimentimet munuaisissa, menetys mikä johtaa suurempaan kasvaimen soluliikkuvuus ja seurauksena etäpesäkkeitä. Lisäksi kasvaimen kehittymisen ihmisen munuaisen voidaan helpottaa yleisellä downregulation Tensins. Näin ollen, anti-metastaattinen hoidot voivat hyötyä palauttaa tai säilyttää Tensin ilmentymisen ensisijaisen kasvaimia.

Citation: Martuszewska D, Ljungberg B, Johansson M, Landberg G, Oslakovic C, Dahlbäck B, et ai. (2009) Tensin3 Onko negatiivinen säätelijä Cell Migration ja kaikki neljä Tensin perheenjäsenet ovat vaimentua Human Kidney Cancer. PLoS ONE 4 (2): e4350. doi: 10,1371 /journal.pone.0004350

Editor: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Saksa

vastaanotettu: 20 elokuu 2008; Hyväksytty 15 joulukuuta 2008; Julkaistu 4 helmikuuta 2009

Copyright: © 2009 Martuszewska et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: Swedish Research neuvosto (Vetenskapsrådet), Cancer Foundation, Alfred Österlund Trust, Malmö University Hospital Trust, Malmö University Hospital Cancer Trust, Greta ja Johan Kock Trust, Crafoord Trust, ja Royal physiographic Society Lund. D.M. tukivat apurahan päässä Anna-Greta Crafoord Trust. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Tensins muodostavat perheen solunsisäisiä proteiineja, jotka tulevat esiin uutena säätelijöinä solun liikkuvuus ja kasvuun. Tensin perhe koostuu neljästä jäsenestä: Tensin1, Tensin2, Tensin3 ja Tensin4 (TNS1, TNS2, tNS3, TNS4) jokaisessa diskreetti ekspressiokuvioita ihmiskehossa [1], [2]. Perustuen niiden yhteisestä alueiden osalta Tensins on mahdollista vuorovaikutuksessa solukalvon (C1 domain) sekä sitoutuvat tyrosiinit (SH2 ja PTB domain) in integriinit [3] ja reseptorin (RTK: t) [1].

lisäksi, Tensins 1-3, mutta ei -4, sisältää fosfataasi (PTPaasi) C2-domain pari, joka on homologinen, että PTEN tuumorisuppressoriproteiinia [4], [5]. Kuitenkin mahdollinen lipidi- PTPaasi aktiivisuus Tensins 1-3, sekä niiden oletetun vuorovaikutus aktiinisytoskeletonin, on vielä määrittämättä. Tensin1 oli ensimmäinen jäsen tunnistettu, ja on lokalisoitu paikallisia tarttumista soluissa [6]. Havaitsimme Tensin2 (tunnetaan myös C1-TEN, TENC1) sitovana kumppanina Axl RTK kautta SH2-PTB alue [1]. Tensin3 on käytännössä sama verkkotunnus organisaation C1-TEN, ja vuorovaikutuksessa EGF-reseptorin [7]. Tensin4 on lyhyempi proteiini, joka ei odoteta vuorovaikutuksessa solun tukirangan kanssa, vaikka se sisältää SH2-PTB verkkotunnuksia samanlainen kuin muiden Tensins [8].

toiminnallinen seurauksena Tensin vuorovaikutus viittaa siihen, sääntely kalvon reseptorin signalointi joka liittyy valvontaan solun tukirangan dynamiikkaa. Tämä vaikuttaa siten myös soluliikkuvuus Metastasoituneessa prosessissa. Esimerkiksi rintasyövän soluissa, Tensin3 osoitettiin ankkuri integriinien solun tukirangan, mikä tekee solun vähemmän liikkuvia ja siten vähemmän kykenee metastasizing [9]. Toisaalta, stimulaatio epidermaalinen kasvutekijä (EGF) ylössäätelee Tensin4, joka on lyhyempi proteiini, joka voisi ei ole aktiini-sitovien alueiden mutta joka silti on vuorovaikutuksessa integriinien. Tämä mobilisointi Tensin4 johtaa sen siirtymän Tensin3 peräisin integriinin, mikä horjuttaa solun tukirangan ja parantaa solun liikkuvuus. Olemme raportoineet, että Tensin2 ilmentyminen munuaissoluissa estää solujen lisääntymistä, eloonjääntiä ja muuttoliike, samanaikainen valikoivalla tukahduttamisesta Akt signalointireitin [5]. Lopuksi, vuorovaikutus ilmeisesti yhteinen kaikille neljälle Tensins on, että DLC-1 tuumorisuppressoriproteiinia, joka voi olla välittäjänä mahdollisten anti-kasvain vaikutuksia Tensins [10] – [12].

Yhdysvalloissa, 54390 uutta tapausta munuaissyövän ennustetaan tapahtuvan vuonna 2008 aiheuttaen arviolta 13010 kuolemantapausta [13]. Munuaissolukarsinooma (RCC) on syöpä peräisin munuaisten epiteelin ja noin 85% munuaisten syövistä ja liittyvät kuolleisuutta. RCC voidaan jakaa edelleen eri alatyyppeihin: tavanomainen tai kirkas solu RCC (ccRCC), joka edustaa valtaosaa RCC tapauksissa seurasi papillaarinen (pRCC) ja kromofobista leikettä (chRCC). Myös tässä tutkimuksessa on oncocytoma, joka on ei-RCC, hyvänlaatuinen kasvain tyyppi. Kukin näistä kasvaintyyppien on erillinen synnyssä. Esimerkiksi kaksi kolmasosaa ccRCC tapaukset liittyvät kanssa vika von Hippel-Lindaun (VHL) tuumorisuppressorigeeniä [14].

Kuitenkin epiteelisolujen muutos, joka esiintyy yhteisiä näille kasvaintyypit liittyy useita prosesseja, kuten mutaatiot, jotka mahdollistavat suotuisat syövän solujen selviytymisen, proliferaatio ja migraatio. Lisäksi parannettu syöpä soluliikkuvuus on pääasiallinen ominaisuus alussa metastaattisen prosessin. Koska neljännes RCC potilailla esiintyy paikallisesti invasiivisia tai etäpesäkkeitä, on välttämätöntä tunnistaa tekijöitä ja mekanismeihin, jotka ovat metastaattinen prosessi.

munuainen on elin, jossa useimmat Tensins ensisijassa ilmaistaan ​​[1], [6], [7]. Poistetaan

Tensin2

geenin osoitettiin olevan takana hiirimallissa nefroottinen oireyhtymä [15], ja hiirten varten Tensins -1 ja -3 osoittavat munuaisten putkimainen kystamuodostusta ja munuaisten vajaatoiminta [16], [17 ]. Näin ollen, on olemassa selkeä tarve tutkia Tensins niiden ilmaisun ja toimintoja ihmisen munuaisen sekä normaali tautitilojen. Tavoitteena tässä tutkimuksessa oli tutkia roolia koko Tensin perheen ihmisen RCC.

Methods

Soluviljely

Seuraavat ihmisen syövän solulinjoja viljeltiin ja valmisteltu qRT-PCR ja western blot-analyysi: rinta (MCF-7, MDA-MB231), eturauhasen (DU145, PC3, PNT-1A), peräsuolen adenokarsinooma (SW480), kohdunkaulan karsinooma (HeLa S3), osteosarkooma (U20S), melanooma (WM9, WM266-4, WM793), ei-pieni keuhkosyöpä (H358, H2087, H226, H727) ja B-solujen lymfooma (U629, U2932). Erilaisia ​​ihmisen ei-syöpäsolulinjoissa analysoitiin myös: endoteelisolulinjaa (EAhy926), ihon fibroblasteista (AG52), munuaisten proksimaalisten tubulusten solut (HK-2), rinta- epiteelisolut (MCF-10A). Soluja kasvatettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 20 mM glutamiinia, 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 ilmassa.

potilaat

tutkimus käsitti 260 potilasta histopatologisesti varmistettu munuaissolukarsinooma (RCC) jälkeen nephrectomy suoritetaan Department of Urology, Uumajan yliopistollisessa sairaalassa, välillä 1982-2003. Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea Uumajan yliopiston ja Institutional Review Board, ja kutakin potilasta osallistui ilmoitettuaan tietoon perustuvan suostumuksen. Kliinis potilaiden ominaisuuksiin on koottu taulukkoon 1.

Staging menettelyt sisältyvät lääkärintarkastus, rintakehän röntgenkuvaus, ultraääni ja tietokonetomografia vatsan. Kasvaimia järjestetään mukaan TNM luokitusjärjestelmän 2002 [18], ja histopatologiset luokittelu tehtiin mukainen Skinner

et al.

[19]. RCC tyyppi määriteltiin Heidelberg konsensuskonferenssi [20]. Kasvaimen koko mitattiin kirurgisen yksilöitä ja /tai tietokonetomografia. Kasvaimen koko vaihteli 0,6 cm 25 cm (mediaani: 7,0 cm). Laskimoiden invaasio määriteltiin kasvaimen invaasio suurissa munuaislaskimo todennettu mikroskooppisen kudoksessa viipaleita alkaen munuaisportti. Potilaiden seurantaan tila arvioitiin vähintään vuosittain rutiini kliinistä seurantaa Uumajan yliopistollisessa sairaalassa tai ottamalla yhteyttä potilaiden suoraan. Aikana seuranta-ajan, joukossa 260 potilasta, 139 oli kuollut tautiin, 61 oli kuollut muista syistä, 7 oli elossa sairaus, ja 53 olivat elossa ja tautivapaita. Kasvain ja munuaisen kuorikerroksen kudos otettiin näytteet heti nephrectomy. Näytteet histopatologisesti ei-pahanlaatuisten munuaiskuoresta kudosta etäällä kasvaimen vyöhyke saatiin myös 48 potilasta ja sitä käytettiin vertaileva arviointi.

Elektroforeesi ja Western blot

Solut lyysattiin lyysipuskurissa (1% NP -40, 1% deoksikolaatti, 5 mM EDTA, 1 mM EGTA: ta PBS: ssä, pH 7,4) ja erotettiin 5% ja 8% polyakryyliamidi-SDS-geeleillä pelkistävissä olosuhteissa, ja siirrettiin sitten PVDF-membraanille. Membraanit blokattiin 3% kalagelatiinia 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 1,5 M NaCl: a ja 0,5% Tween 20: tä (pesupuskuri), koettimena primaarista vasta-ainetta vastaan ​​Tensin2 (1:1000 laimennos) ja Tensin3 (1:1000 ), vastaavasti, 1 h, pestiin pesupuskurilla ja sen jälkeen inkuboitiin 1 h kanssa sekundaarisen vasta-aineen yhdistetty joko piparjuuriperoksidaasiin (HRP) tai alkalisen fosfataasin (AP). Tämän jälkeen kalvot visualisoitiin kemiluminesenssimittaus menetelmällä (HRP) tai pelkistämällä 4-nitrosininen-tetratsoliumsuolaa (NBT), kun läsnä oli 5-bromi-4 kloori-3-indol-fosfaatti (BCIP) 0,1 M Tris- HCl: ää, 0,05 M MgCl

2, 0,1 M NaCl, pH 9,5 (AP).

vasta-aineet, joita käytetään havaitsemiseen Tensin2 ja Tensin3 olivat sekä talon kanin polyklonaalisia vasta-aineita tuotetaan peptidejä vastaan, jotka vastaavat C-pää kunkin proteiinin. Raaka antiseerumit puhdistettiin peräkkäin, ensin affiniteettikromatografialla proteiini A ja G-Sepharose-kolonnit ja sen jälkeen edelleen affiniteettipuhdistuksella käyttämällä immobilisoitua peptidiä antigeenejä, kuten aiemmin on kuvattu anti-Tensin2 [5]. Anti-Tensin3 vasta-aineet testattiin spesifisyyden käyttäen solulysaateista ekspressoivat täyspitkän rekombinantin Tensin3, sekä estämällä kanssa Tensin3 C-terminaalinen peptidi-antigeeni (kuvio S1). Kaupallinen kanin polyklonaalista anti-Tensin3 vasta-ainetta (Sigma) käytetään western blotit stabiilisti transfektoitujen Tensin3 solulysaateista. Optimaalinen laimennukset määritettiin western blottauksella.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen käänteistranskriptio-PCR: llä (qRT-PCR) B

qRT-PCR-analyysi munuaissyöpäpotilaan näytteitä, elinkelpoinen alueen kunkin kasvaimen kudosta käytettiin saamiseksi korkealaatuisen RNA uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Tukholma, Ruotsi). Viljellyistä soluista, kokonais-RNA uutettiin käyttäen CellDirect ™ One-Step qRT-PCR Kit (Invitrogen, Lidingö, Ruotsi). RNA pitoisuudet kvantitoitiin spektrofotometrisesti mittaus 260 nm: n aallonpituudella (DU640-spektrofotometri, Beckman Coulter, Bromma, Ruotsi) ja RNA: n eheys varmistettiin etidiumbromidivärjäyksellä 28S ja 18S rRNA jälkeen agaroosigeelielektroforeesilla.

One-step multiplex reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR käytettiin, jossa vahvistus sekä kiinnostuksen kohteena olevan geenin ja endogeenisen kontrolligeenin suoritettiin samassa reaktioputkeen. Gene-spesifisiä alukkeita ja Taqman hankittiin Applied Biosystems (Applera Ruotsi, Tukholma, Ruotsi). Kustakin näytteestä 40 ng kokonais-RNA: ta sekoitettiin käänteistranskriptaasin ja polymeraasientsyymin master mix, ja TaqMan® MGB koettimia ja alukkeita lisättiin tähän sekoitetaan lopulliseen tilavuuteen 25 ui. QRT-PCR-reaktio suoritettiin ABI PRISM 7900HT järjestelmän (Applera Ruotsi, Tukholma, Ruotsi), käyttämällä seuraavaa sykliolosuhteita: käänteistranskriptio 15 minuutin ajan 50 ° C: ssa; 2 min 95 ° C: ssa, ja 40 sykliä: 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C 60 sekunnin ajan. Kukin mittaus suoritettiin kahtena ja kynnyssykli (C

t) määritettiin kullekin monistuskäyrää.

Jotta tuottaa Standardikäyrien kvantitatiivinen analyysi kustakin geenistä, solulinja valittiin joka oli luotettava ja tarkasti lähde mRNA kyseisen geenin. RNA-templaatin jätettiin pois negatiiviset kontrollit, ja standardi käyrä sarjalaimennoksia kokonais-RNA asiaa solulinja saatiin kaikissa ajoissa ja jokainen geeni. Kunkin näytteen keskimääräinen päällekkäisiä Ct-arvoja muutettiin ng RNA lineaarisella regressioanalyysillä käyttäen suhteellisen standardikäyrän menetelmää käyttäen Excel-paketti (Microsoft, Redmond, Washington). Jokainen määritetään RNA-arvo oli sitten normalisoidaan endogeenisen viite geenin pitoisuus samasta näytteestä. Ruudusta 11 ehdokkaan taloudenhoito geenit, ihmisen β2-mikroglobuliinin (

B2M

) ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasin (

GAPDH

) geenit määrittää empiirisesti meidän olevan vahvimmista endogeenisen kontrolligeenin ihmisen munuaisessa ja ihmisen solulinjoja, vastaavasti (tuloksia ei ole esitetty). Saadut tulokset olivat mielivaltaisesti ilmaistiin ng Tensin RNA /ng endogeeninen kontrolli-RNA.

Northern blot-analyysi

Ihmisen usean kudoksen Northern (MTN) blotteja (BD Biosciences, Tukholma, Ruotsi), joka sisälsi 2 ug poly-A + RNA: ta kunkin kahdeksan syöpäsolulinjasta, koetettiin ekspression Tensin2 mRNA. 1,6 kb: n 3-terminaalinen cDNA-sekvenssi on yhteinen kaikille silmukoitumisvariantteja Tensin2 käytettiin

32P-leimattua koetinta. CDNA-sekvenssi ihmisen β-aktiini käytettiin kontrollina koetin. Radioleimattiin kanssa [

32P] dCTP: tä saavutettu Rediprime II DNA merkintäjärjestelmä (GE Healthcare, Uppsala, Ruotsi). Hybridisaatio suoritettiin yön yli 42 ° C: ssa ULTRAhyb hybridisaatiopuskurissa (Ambion, Tukholma, Ruotsi), minkä jälkeen pesua korkean tiukkuuden. Kalvot altistettiin fosfori-Imager näytön ainakin yön yli ennen vizualization.

immunohistokemiallinen analyysi Tensin3 ihmisen munuaisen kasvaimissa

rakentamiseksi kudossiruina (TMA), RCC osat kerättiin kuten edellä on kuvattu, ja seulottiin ensisijainen arviointi hematoksyliini /eosiini-värjättyä liukuu ennen TMA valmisteen kuten aiemmin on kuvattu [21]. Lyhyesti, kaksi 0,6 mm halkaisijaltaan kudoksen ytimiä kerättiin kustakin kasvainblokki ja järjestetty vastaanottoblokissa manuaalisella kudosta ryhmittäjällä (Beecher Inc., Sun Prairie, WI). TMA kohdat 4 pm: n paksuudelta poistettiin parafiini ja mikroaaltouuni käsiteltiin antigeenin haku standardimenetelmien mukaisesti. Laatu ja kestävyys RCC TMA on testattu muiden tekijöiden ja raportoinut meille aiemmin [22]. Kanin polyklonaalista anti-Tensin3 käytetty vasta-aine TMA immunovärjäys on kuvattu edellä, ja on tarkastettava spesifisyys analyysi vale- ja Tensin3-transfektoidut solut sekä antigeenin esto (kuvio S1). Immunovärjäystä, vasta-aine käytetään optimaalisesti määritetään laimentamalla 1:300. Detection suoritettiin piparjuuriperoksidaasiin käyttäen Dako EnVision ja Techmate 500 järjestelmät, ja counterstaining hematoksyliinillä ja eosiinilla. TMA osastoja 148 potilasta analysoitiin ja värjäys ryhmiteltiin no, pieni, keskisuuri tai suuri ilmentyminen Tensin3 sekä lisäksi läsnäolon tai värjäytymisen puuttuminen solukalvon (PM). Kaikki TMA arvioitiin itsenäisesti kaksi tarkkailijaa.

Generation rekombinantti Tensin3 ilmentävien solujen

täydellinen cDNA-sekvenssi Tensin3 (1409 aminohappoa; NCBI-no. NM_022748) kloonattiin pcDNA3 nisäkkään ekspressiovektoriin (Gibco Invitrogen, Lidingö, Ruotsi) stabiili ilmentyminen ihmisalkion munuaisten (HEK) 293-soluissa, kuten aiemmin on kuvattu [5]. Plasmidi-kantavien solujen valittiin kasvun läsnä G418-neomysiinianalogille (400 ug /ml). Samanaikaisesti, mock-transfektoituja solu- kloonit on myös kehitetty, joissa tyhjän vektorin vain, samoin kuin mutantin kloonia, jotka sisälsivät oletetun PTPaasi-dead-mutantin Tensin3 (tNS3 Mut) cDNA: ta. Tämä mutantti tuotettiin otaksuttu PTPaasi aktiiviseen kohtaan Tensin3 kysteiinin asemassa 107 korvataan seriinillä. Mutaatio villityypin Tensin3 cDNA pcDNA3-vektoriin tehtiin QuikChange mutageneesillä (Stratagene, Amsterdam, Alankomaat) mukaisesti valmistajan ohjeiden, käyttäen seuraavia alukkeita (kytketty nukleotidi alleviivattu): 5′-CATGTGGTCGTCATTCACAGCAGGGGCGGGAAAGGAC-3 ’(sense ) ja 5’-GTCCTTTCCCGCCCCTGCTGTGAATGACGACCACATG-3 ’(antisense).

soluproliferaatiomäärityksissä

Solulisääntyminen arvioitiin kahdella tavalla. Ensimmäinen oli mittaaminen mitokondrioiden toimintaa osoituksena elinkelpoisten solujen määrä, kuten aiemmin on kuvattu [23]. Lyhyesti, erilliset kloonit stabiilisti transfektoitujen mock 293-soluja, villityypin Tensin3 solut (tNS3 wt) ja Tensin3 PTPaasi mutanttisoluja (tNS3 Mut) ympättiin harvaan 0,5 x 10

4 solua per kuoppa 96-kuoppaiselle mikrotiitterilevylle, ja väliaineessa, joka sisälsi 0,5% seerumia (päivä -1). Seuraavana päivänä (päivä 0), väliaine korvattiin että joka sisälsi 5% seerumia, ja soluja inkuboitiin edelleen jopa 7 päivää. Kunkin peräkkäisen päivän, numerot elävät solut mitattiin niiden muuntamisen aikana 3 h tetratsoliumyhdiste [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -5- (3-karboksimetoksifenyyli) -2- (4- sulfofenyyli) -2H-tetratsolium (MTS, Sigma) liukoiseen formatsaanituotteeksi, että mitattiin spektrofotometrisesti 490 nm: ssä. Neljänä kaivoja käytettiin kutakin mittausta.

Toinen menetelmä solujen lisääntymisen oli kvantitoimiseksi ehdoton solujen määrä tuottaa kasvua käyrä yli 5 päivää. Erilliset kloonit transfektoitiin stabiilisti mock 293-soluja, villityypin Tensin3 solut (tNS3 wt) ja Tensin3 PTPaasi mutanttisoluja (tNS3 Mut) ympättiin 1 x 10

4 solua per kuoppa 48-kuoppaiselle levylle, elatusaineessa, joka sisälsi 0,5% seerumin (päivä -1). Seuraavana päivänä (päivä 0), väliaine korvattiin että joka sisälsi 5% seerumia, ja soluja inkuboitiin vielä 5 päivää. Kunkin peräkkäisen päivän solujen lukumäärä kuoppaa kohti määritettiin trypsinoimalla solut kuopista ja laskenta hemosytometrillä kammiossa. Kunkin kloonin, solujen lukumäärä määritettiin keskiarvo lasketaan alkaen yhdeksän kenttää. Molemmissa kokeissa tilastollinen erot solutyyppien jokaisena päivänä määritettiin ANOVA Bonferroni post-hoc korjaus.

Solun kulkeutumista ja solujen matriisi invaasio määrityksissä

modifioitu Boyden kammion määritysjärjestelmää käytettiin määrittämään muuttoliike /haptotaxis of Tensin3-transfektoitujen solujen, kuten aiemmin on kuvattu [5]. Lyhyesti, soluviljelmä lisätään 8 um huokoskoko kalvoja (Nunclon, Roskilde, Tanska) esipäällystettiin fibronektiinin kanssa (10 ug /ml; Sigma, Tukholma, Ruotsi) alapuolella. Insertit pantiin kuoppiin 24-kuoppaisilla levyillä, jotka sisältävät täydellisen kasvualustaa, ja 10

5-solut ympättiin kuhunkin lisätä sisätilojen täydelliseen alustaan. Monista insertit käytettiin kunkin erillisen solulinjaa analysoitiin. Solujen annettiin kulkeutua 37 ° C: ssa soluviljelmässä inkubaattorissa 18 tuntia. Jälkeenpäin insertit poistettiin ja keskisuurten sisälle imetään pois. Kaikki solut vasemmalle yläpinnan kalvo pyyhittiin pois ja insertin membraanit huuhdeltiin lyhyesti, kiinnitettiin 10% formaliinilla ja värjättiin gram-kristalliviolettiliuoksella (Fluka, Tukholma, Ruotsi). Solut vähintään kolme HPF kohti insertin laskettiin valomikroskoopilla (Olympus, Solna, Ruotsi). Tilastolliset vertailut migraatio yksittäisen solun klooneja suorittaa ANOVA Bonferroni post-hoc korjaus.

matriisi invaasio testeissä haptotaxis määritys edellä on muutettu siten, että sen sijaan, fibronektiinin, tyvikalvon matriisin seokseen Matrigel ( BD Biosciences, Bedford, MA) käytettiin kattamaan yläosaan soluviljelmässä insertit 8 um huokosia. Erilliset kloonit Mock ja Tensin3-transfektoidut 293-solut ympättiin kammioon sisätilat väliaineessa, joka sisälsi 0,5% seerumia, kun taas kuoppiin 24-kuoppalevyille sisälsi täydellistä kasvualustaa, mikä luo seerumin kaltevuus. Monista insertit käytettiin kunkin erillisen solulinjaa analysoitiin. Solujen annettiin tunkeutua matriisi ja vaeltavat läpi toiselle puolelle kalvon yli 30 tuntia 37 ° C: ssa. Sen jälkeen solut kiinnitettiin, värjättiin ja laskettiin kuten edellä on kuvattu.

knockdovvn Tensin3 siRNA hiljentäminen

Melanoomasolulinjaa WM793 valittiin Tensin3 geenien kuin se ilmaistaan ​​mahdollisimman paljon Tensin3 pois kaikki syöpäsolun linjat testattiin (kuvio 1 B). Solut siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille 24 tuntia ennen siRNA transfektiota. Solut erikseen transfektoitu 5 nM kutakin kolmesta eri Tensin3 siRNA konstruktioita, siRNA I, II (ON-KOHDE plus siRNA reagenssit; Dharmacon, Täby, Ruotsi) ja III (HP validoitu siRNA, Qiagen, Solna, Ruotsi). Negatiiviset kontrollit sisälsivät transfektioseos vain ja ei-hiljentäminen siRNA, joka oli osoitettu olevan vähän vaikutusta maailmanlaajuiseen geenien ilmentymisen (AllStars, Qiagen, Solna, Ruotsi). SiRNA sekoitettiin Lipofectamine 2000 ja OptiMEM I seerumittomalle väliaineessa (Invitrogen, Lidingö, Ruotsi), ja Transfektiomenetelmätapa seosta inkuboitiin solujen kanssa 24 tunnin ajan. Tämän jälkeen solut trypsinoitiin, laskettiin ja saatettiin Siirron /haptotaxis määrityksessä juuri kuten edellä on kuvattu, paitsi että 0,5 x 10

5 WM793 solua inserttiä käytettiin ja siirtyminen annettiin tapahtua 16 tunnin ajan.

(A) Northern blot-analyysi Tensin2 (TNS2) mRNA: n ihmisen syöpäsolulinjoissa. Ihmisen syöpäsolulinjoissa MTN blot koetettiin hyvin ankarissa radioaktiivisesti cDNA spesifisiä Tensin2. Kaistat ovat seuraavasti: 1, promyelosyyttinen leukemia HL-60; 2, HeLa S3; 3, krooninen myelooinen leukemia K-562; 4, lymfaattinen leukemia MOLT-4; 5, Burkittin lymfooma Raji; 6 ja peräsuolen adenokarsinooma SW480; 7, keuhkojen A549 ja 8, melanooma G-361. Sama kalvo koetettiin myös ihmisen β-aktiini (alin paneeli) osoittaa yhtä suuri RNA lastaus. Edustava blot on esitetty kahden riippumattoman hybridisaatioita. (B) mRNA ilmauksia Tensin2 ja Tensin3 analysoitiin qRT-PCR. Paneeli ihmisen syöpäsolujen linjat sekä ihmisen normaalia epiteeli- ja endoteelisolujen linjoja seulottiin Tensin2 (TNS2) lauseke (vasen akseli, tyhjät pylväät) ja Tensin3 (tNS3) lauseke (oikea akseli, mustat palkit). Tulokset on esitetty suhteellisena ilmentymisen jälkeen annetaan normalisointi kiinnostavan geenin viittaus geenin

GAPDH

(ng geeni /ng viite-geeni). (C, D) Expression of Tensin2 ja Tensin3 proteiineja ihmisen syöpäsolulinjoissa. Kokosolulysaateille suoritettiin 8% SDS-PAGE ja western blot havaitseminen Tensin2 ja Tensin3 proteiineja. Kaistat ovat seuraavasti: 1, HEK 293-solut, jotka on transfektoitu stabiilisti Tensin2 (C); 1, HEK 293-solut transfektoitiin stabiilisti Tensin3 (D) 2, munuaissyöpä SKRC-52; 3, HeLa S3; 4 ja peräsuolen adenokarsinooma SW480; 5, rinta adenokarsinooma MCF-7; 6, eturauhasen karsinooma DU145; 7, melanooma WM793; 8, keuhkokarsinooma H727.

Tilastollinen

Kaikki kliiniset tiedot analysoitiin SPSS ohjelmistopakettia (versio 16.0.2 Macintosh, SPSS Institute, Chicago, IL). Mean eroja kuin normaalisti jakautunut data analysoitiin Mann-Whitney testi. Kruskal-Wallisin testiä käytettiin vertailussa enemmän kuin kaksi ryhmää. Korrelaatiot arvioitiin Spearmanin testi. Survival käyrät arvioitiin Kaplan-Meierin menetelmällä ja elossaoloaika verrattiin käyttäen log-rank-testi.

solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion määrityksissä, tilastollinen vertailu eri solun klooneja tai käsittelyt tehtiin ANOVA jossa Bonferroni post-hoc korjaus. Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia ja

P

arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Tensin ilme ei juuri esiinny ihmisen syöpäsolu linjat

seulotaan ensin paneelin ihmisen syöpäsolujen linjat Tensin ilme. Valikoima erilaisia ​​ihmisen syöpäsolulinjojen seulottiin Northern blot -analyysillä ekspression Tensin2 mRNA. Odotettavissa bändi 5 kb Tensin2, kuten aiemmin raportoitu ihmisen elinten [1], oli tuskin havaittavissa vain 2 ulos 8 solulinjoja: HeLa ja SW480 (kuvio 1A). Menimme suorittamaan kvantitatiivinen RT-PCR lisätutkimuksia mRNA ekspressiotasot Tensin2 ja Tensin3 on suurempi valikoima ihmisen syövän solulinjoista ja verrattiin niitä suoraan RNA: sta koko ihmisen munuainen kudosta otteita. Kuten kuviossa 1B on esitetty, Tensin2 mRNA oli poissa useimmissa solulinjoissa. Vain peräsuolen adenokarsinoomasolulinjaan SW480 ilmaisi Tensin2 mRNA havaittavia määriä, mikä näkyi myös Northern blot (kuvio 1A). Merkittävästi sekä Tensin2 ja Tensin3 ilmaisun olivat alemmat yhdessä RCC potilaan munuaisen tuumoriekstraktin kuin verrata sen viereiseen normaaliin vastine (sovitettu). Tulokset osoittavat, että Tensin3 ilmaisu on suurempi ja laajempi kuin Tensin2 keskuudessa tutkittu solulinjoissa, mutta että molemmat geenit näyttävät vaimentua RCC. Tutkimme myös Tensin1 ja Tensin4 mRNA: sama paneeli näytteiden ja ilmaistu näiden Tensins olevan suurelta osin havaittavissa tai puuttuvat kokonaan (tietoja ei esitetty).

suoritettiin immunoblot analysoida proteiinin ilmentymistä Tensin2 ja Tensin3 (Kuvio 1C, D). Noudattaen mRNA tuloksia, ilmentyminen Tensin2 proteiinitasolla (molekyylipaino 160 kDa), ei juurikaan havaittu ihmisen syöpäsolulinjoissa, kun taas Tensin3 (180 kDa), ilmentyminen oli havaittavissa ainakin kahdella solulinjalla: melanoomasolulinjaa WM793 ja keuhkokarsinooma linja H727. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ilmaus kaikkien Tensins ei juuri esiinny ihmisen syöpäsolujen linjat sekä parhaillaan vaimentua ihmisen munuaisen kasvaimissa.

Tensins 1-4 mRNA tasot ovat huomattavasti pienemmät munuaissyövän ja normaalissa munuaisessa

sovelletaan multiplex yhden askeleen qRT-PCR arvioida mRNA ekspressiotasoja kaikista neljästä Tensins tässä kliinisessä tutkimuksessa yhteensä RNA: sta 223 RCC ja 48 normaalia munuaisen kuorikerroksen kudosnäytteitä. Kliiniset ja patologiset ominaisuudet RCC tämän tutkimuksen potilailla on esitetty taulukossa 1. Normaalin näytteet saatiin täsmäsi kasvaimen lähteistä ja jakelu kasvaintyypeissä näiden joukossa oli samanlainen kuin koko väestön, eli. 75% oli kirkasta solutyypin (taulukko 1). Ruudusta 11 ehdokkaan taloudenhoito geenejä (Applera Ruotsi, Tukholma, Ruotsi), me empiirisesti määritetty

B2M

geeni kaikkein johdonmukainen ja kestävä sisäinen standardi käyttää ihmisen munuaisessa (tuloksia ei ole esitetty).

Kuten kuviossa 2A, mRNA ilmaus Tensin2 223 RCC otteet oli merkittävästi alhaisempi kuin otteita normaalista munuaisen kuorikerroksen (48 tapausta;

p

0,001). Tulokset ovat suurelta osin heijastuvat ccRCC, joka edusti useimmissa tapauksissa; kuitenkin alempien tasojen pRCC oli myös vahva merkitys (

p

0,001). Lisäksi analyysi ainoastaan ​​alaryhmä kasvaimen materiaalia, joka oli sovitettu tavanomaisen kollegansa tuotti myös huomattavasti pienempi Tensin2 ja -3 ilmentyminen kasvainkudoksessa (n = 48;

p

0,001). Lisäksi oli myös tilastollisesti merkittävä pudotus Tensin1 ilmentymisen tuumorinäytteessä (n = 134) verrattuna normaaleihin (n = 21) (kuvio 2B). Samanlainen ja erittäin merkittävä väheneminen Tensin3 mRNA ilmentyminen havaittiin myös (kuvio 2C). Erityisesti, Tensins -1, -2 ja -3 ekspressiota havaittiin kaikissa näytteissä mitattiin. Sen sijaan, Tensin4 ekspressio oli selvästi vähemmän useimpien RCC näytteistä mitattiin (n = 134), kun se oli läsnä kaikissa tavanomaisissa munuaiskuoresta näytteitä (n = 21) (kuvio 2D). Nämä havainnot, yhdessä edellä kuvattujen, osoittavat, että yleinen lasku ilmentymisen Tensins tapahtuu RCC, ja se voisi siten olla suotuisat RCC kasvaimia.

(A, C) mRNA-tasot Tensin2 (TNS2) ja Tensin3 (tNS3), vastaavasti 223 RCC potilailla ryhmitelty kasvaimen tyypin, vs normaali munuaisten cortex näytteitä 48 potilaista. Tulokset esitetään suhteellinen ilmaisu (ng Tensin2 /ng B2M ja ng Tensin3 /ng B2M, vastaavasti). Tensin2 ja Tensin3 ilmaisun suhteessa kasvaimen tyypin sekä kontrolliryhmässä näkyvät yhdessä mediaanin.

***

P

0,001 normaali vs. papillaarikuvioiden ja normaalin vs. ccRCC. (B, D) mRNA tasot Tensin1 (TNS1) ja Tensin4 (TNS4), vastaavasti 134 RCC tapauksissa (kasvain) ja 21 munuaiskuoresta näytettä (normaali) normalisoinnin jälkeen viittaamaan geeni (suhteellinen ilmentyminen). Mediaanit näkyvät sekä Tensin1 ja Tensin4 ilmentymistä normaalissa ja kasvaimen näytteitä. Paneelissa D, arvo n = 123 on merkitty lukumäärä kasvaimen näytteitä, joilla ei ole Tensin4 ilme.

***

P

0,001 normaali vs. kasvain.

korrelaatio Tensin ilmaisun ja kliinisten muuttujien RCC potilailla

suoritetaan korrelaatio analyysit arvioitaessa potentiaalisen suhde Tensin mRNA: n ekspression RCC ja kliiniset ominaisuudet potilailla. Tärkeimmät korrelaatiot on esitetty taulukossa 2. Ensinnäkin, mRNA: n ekspressio on Tensins 1-3 tuumoreissa korreloivat positiivisesti keskenään, vaikka ei kanssa Tensin4, koska se oli pitkälti havaita RCC näytteissä. Mitään merkittävää korrelaatiota oli ilmeinen välillä Tensins mRNA ekspressiotasot ja kliinisten muuttujien kuten kasvaimen koko, kasvain laskimoiden tunkeutuminen, alueellinen imusolmuke tunkeutumisen, iän tai sukupuolen.