Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpä kantasolut (CSCS) uskotaan olevan vastuussa kasvaimen aloittamista ja uusiutumisen kemoterapian jälkeen. Kohdistaminen CSCS ja ei-CSCS erityisiä yhdisteet voivat olla tehokas tapa vähentää keuhkosyöpää kasvua ja etäpesäkkeiden. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia vaikutusta salinomysiinin, selektiivinen estäjä CSCS, tai ilman yhdistettynä paklitakseliin, joka metastaattisen malli. Vaikutuksen arvioimiseksi näiden lääkkeiden etäpesäkkeiden ja kasvaimen mikroympäris- otimme etuna immunokompetenteilla ja erittäin metastaattinen LLC hiirimallissa. Aldefluor määrityksiä käytettiin analysoimaan ALDH +/- väestön hiiren LLC ja ihmisen H460- ja H1299 keuhkosyövän soluja. Salinomysiiniä vähensi osuutta ALDH + CSCS LLC soluissa, kun taas paklitakselin lisääntynyt tällaisia ​​väestöstä. Sama vaikutus havaittiin H460 ja H1299 solulinjat. Salinomysiiniä vähensi tumorsphere muodostumista kapasiteetti LLC yli 7-kertaiseksi, mutta paklitakseli ei havaittu. Vuonna

in vivo

kokeissa paklitakseli vähensi primäärikasvain volyymi mutta lisäsi etäpesäkenystyröiden (p 0,05), kun taas salinomy- ei ollut vaikutusta primaarikasvainten mutta heikentynyt keuhkojen etäpesäkkeiden (p 0,05). Molempia huumeita ei paranna vaikutusta yhden hoitoja. ALDH1A1, Sox2, CXCR4 ja SDF-1-mRNA-tasot olivat korkeampia etäpesäkeleesioita kuin ensisijainen kasvaimia, ja olivat merkittävästi koholla molemmissa paikoissa mukaan paklitakselihoidolla. Päinvastoin, tällaiset tasot alenivat (tai joissain tapauksissa ei muutu), kun hiirille annettiin salinomy-. Määrä F4 /80 + ja CD11 + soluja pienensi myös annettaessa molempien hoitojen, mutta erityisesti etäpesäkkeitä. Nämä tulokset osoittavat, että salinomysiinin tavoitteet ALDH + keuhko CSCS, jolla on tärkeitä terapeuttisia vaikutuksia

in vivo

vähentämällä etäpesäkeleesioita. Sen sijaan, paklitakseli (vaikka vähentäminen primaarikasvaimen kasvun) edistää valinnan ALDH + soluja, jotka todennäköisesti muuttavat keuhkojen microenvironment edistää etäpesäkkeiden.

Citation: Larzabal L, El-Nikhely N, Redrado M, Seeger W, Savai R, Calvo A (2013) Differential Effects of Drugs kohdistaminen Cancer Stem Cell (CSC) ja ei-CSC kantojen Lung primäärikasvaimissa ja Metastasis. PLoS ONE 8 (11): e79798. doi: 10,1371 /journal.pone.0079798

Editor: Ilja Ulasov, University of Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 25 syyskuu 2013; Julkaistu: 20 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Larzabal et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ on rahoittanut ”UTE projekti CIMA”, ISCIII-RTICC RD06 /0020/0066 avustusta, PIUNA (ref. 12028402) ja Gobierno de Navarra (vrt. 2179) (AC). LL tukivat Gobierno Vasco apurahan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yksi johtavista kuolemansyistä maailmanlaajuisesti ja yleisin kuolinsyy syöpään miehillä ja naisilla [1]. Useimmat keuhkosyöpää kuuluvat ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) tyyppi (85% niistä). Ennuste yli 60%: lla potilaista, joilla NSCLC on huono, osittain siksi pitkälle diagnoosin esteenä parantava leikkaus, ja osittain siksi, lääkehoidot ovat tehottomia. Vuonna 2007 5-vuoden eloonjäämisluvut miesten ja naisten diagnosoitu keuhkosyöpä oli 16%. Valitettavasti nämä prosenttiosuudet eivät ole muuttuneet merkittävästi useiden vuosikymmenten aikana huolimatta merkittäviä edistysaskeleita diagnosointiin ja hoitovaihtoehdot [2]. Vaikka käyttö kohdistettuja hoitomuotoja keuhkosyöpä on ollut läpimurto syöpätutkimuksessa, vain pieni osa potilaista hyötyy niistä. Siksi on olemassa selkeä tarve uusille hoitovaihtoehtoja entistä tehokkaampi käsittely tämän kasvaimen tyypistä. Yksi uusi terapeuttinen Avenue, joka on parhaillaan testattavana prekliinisissä kokeissa erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia on kohdistettu syövän kantasolut (CSCS). CSCS hypoteesi toteaa, että CSCS ovat vastuussa kasvaimen aloittamista, solujen selviytymisen jälkeen hoidon, metastaattisen leviämisen ja kasvaimen uusiutumisen [3]. Vaikka viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että ihmisen keuhkosyövässä, kuten muut kasvaimet, voivat myös satama CSC populaatioiden tunnistaminen ihmisen keuhkojen CSCS on haitannut ole luotettavia kantasolujen merkkiaineita. Expression ja toiminta aldehydidehydrogenaasit (ALDH) toimivat CSC merkkiaineiden rintojen [4] ja keuhko [5] kasvaimia. Lisäksi lisääntynyt ALDH aktiivisuus on löydetty kantasolukkoa eri kasvaintyypeissä lukien ihmisen multippelimyeloomaa akuutti myelooinen leukemia, aivot, rinta, maksa, paksusuoli, haima [6], [7] ja viime aikoina, keuhkossa, jossa ALDH1A1 ilmentyminen liittyy huono selviytyminen kohortin vaiheen I NSCLC potilaat [8]. ALDH + jae rikastetaan kasvaimen aloittamista solujen lisääntynyt maahanmuutto, tarttuvuus kyky ja metastaattista potentiaalia [9]. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että mittaus ALDH tasoja tai entsymaattinen aktiivisuus voi toimia keuhkojen CSC markkeri.

CSCS ovat vastustuskykyisiä monia nykyisiä syövän hoitoja, kuten kemoterapiaa ja sädehoitoa [10], [11]. Tämä viittaa siihen, että monet syövän hoitomuotoja, kun tappaminen pääosa kasvain, voi lopulta epäonnistua, koska ne eivät poista CSCS, jotka onnistuvat hengissä ja elvyttää uusia kasvaimia. Viimeaikaiset kokeellista näyttöä ehdottaa myös suuri plastisuus sekä CSC ja ei-CSC populaatiot [12]. Tämä on saanut jotkut kirjoittajat oletuksen, että kohteena sekä CSC ja ei-CSC populaatiot ovat todennäköisesti tarpeen tehokkaamman hoidon, vaikka asiaa ei ole kokeellisesti testattu vielä.

Salinomysiini, kalium ionofori, oli äskettäin tunnistettu selektiivinen ihmisen rintasyövän kantasoluja

in vitro

[13]. Vaikka vaikutusmekanismi salinomysiinin ei ole vielä selvää, se näyttää toimivan tehokkaan estäjän usealle lääkkeelle resistenssiä P-glykoproteiinin (P-gp /MDR1 /ABCB1) [14].

Kasvain solujen vaeltamiseen ja etäpesäke, koska tärkeitä ominaisuuksia tuumoribiologiassa on monia yhtäläisyyksiä leukosyyttiliikenteen, joka on kriittisesti säätelee kemokiinit ja niiden reseptorit. Kertyvät tiedot viittaavat siihen, että CXCR4 (CXC-kemokiinireseptori-4) ja SDF1 (stroma-soluista peräisin tekijä-1, tai CXCL12) voi säädellä maahanmuuttoa ja etäpesäkkeiden eri keuhko-, rinta- ja eturauhassyövän soluissa [15]. Lisäksi CXCR4 yliekspressio korreloi huonon ennusteen monissa kasvaintyypeissä [16]. CSCS ilmaista CXCR4-reseptoria, ja vastata kemotaktinen gradienttia sen ligandin SDF-1 [17], mikä viittaa siihen, että CSCS edustavat luultavasti alapopulaatio, joka kykenee aloittamaan etäpesäkkeiden [18]. Parempi ymmärrys muuttavien järjestelyihin syöpäsoluja ja CSCS lisäisi asianmukaiset välineet kehittää uusia hoitoja vähentää sekä paikallisten ja kaukainen toistuminen.

CSCS vuorovaikutuksessa ympäröivien ei-pahanlaatuisia soluja ja molemmat solutyypit ovat yhteistyössä säännellään kasvain microenvironment [19]. Solut kasvain microenvironment paitsi voisi lisätä kasvua primaarikasvaimen mutta myös helpottaa sen metastaattinen levittämistä kaukaisiin elimiin. Onnistunut metastaattinen kasvain riippuu siis kykyä syöpäsolujen hyödyntää ympäröivän microenvironment jokaisessa vaiheessa metastaattisen prosessin. Kasvaimen mikroympäris- käsittää useita soluja, kuten endoteelisoluja, strooman fibroblastit ja erilaisia ​​luuytimestä peräisin olevien solujen (BMDCs) kuten meille makrofagit, myeloidinen johdettuja vaimentimet soluja, Tie2-ilmentävien monosyyttien ja mesenkymaalisten kantasolujen [20]. Kun kasvainsolut saapuu paikalle etäpesäkkeiden ne on saada sopeutua uuteen mikroympäristön, joka on erilainen kuin primaarikasvaimen [21]. Tarkka kasvain-stroomavuorovaikutuksiin in primaarikasvaimen ja etäpesäkkeiden sivusto ei juuri tunneta.

Edellinen uraauurtava työ on osoittanut, että salinomysiinin ja paklitakseli näytteillä erilaisuudeen toiminta hiirimallissa rintasyöpään, jossa salinomy- jolla CSC-specific estovaikutuksista [13]. Ottaen huomioon, että CSCS voi olla keskeinen välittäjiä etäpesäkkeiden, me arveltu, että erityisesti suunnattu CSCS kanssa salinomysiinin vähentäisi metastaattisen potentiaalin jäljellä syöpäsoluja. Käsitellä tätä hypoteesia, tutkimme tehoa oletetun CSC-tiettyä lääkettä salinomysiinipitoisuus kasvuun ja metastaattisen leviämisen NSCLC. Me raportoimme tässä, että salinomysiinin differentiaalisesti vaikuttaa NSCLC primaarikasvaimen kasvun ja metastaattinen potentiaali suhteessa kuin tavanomaisen kemoterapeuttisen aineen paklitakseli, biologinen toiminta korreloi toimenpiteiden CSC piirteitä. Myös käyttämällä Lewisin keuhkokarsinooma (LLC) hiirimallissa, raportoimme miten nämä yhdisteet vaikuttavat kasvain microenvironment sekä ensimmäisen ja metastaattinen kasvain sivustoja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja yhdisteet

Solulinjat käytetty tässä tutkimuksessa olivat hiiren Lewisin keuhkokarsinooma (LLC) ja ihmisen H460- ja H1299. Kaikki solulinjat saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) ja niitä ylläpidettiin RPMI (Sigma, St Louis, MO, USA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ja 1% penisilliini-streptomysiiniä (Lonza, Basel, Sveitsi), 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 ilmakehässä. Salinomysiinin ja paklitakselin saatiin Sigma (St Louis, MO, USA) ja liuotettiin 20% DMSO PBS: ssä (ajoneuvo). Lopulliset pitoisuudet salinomysiinin ja paklitakselin käyttää kaikissa

in vitro

määrityksissä olivat 1 ug /ml salinomysiinin ja 40 ng /ml paklitakselia. Solut, joita käsiteltiin vehikkelillä, käytettiin kontrolleina. Nämä annokset käytettiin perustuu aiempiin julkaisuihin [13].

Sphere muodostumisen määritys

pallo muodostumista, soluja kasvatettiin seerumittomassa viljelyalustassa DMEM /F12 + GlutMAX ™ (Gibco, Paisley, UK ) täydennettynä kasvutekijöiden (MEGM SingleQuots, Lonza, Basel, Sveitsi) ja B27 (Gibco, Paisley, UK). Solut maljattiin 6-kuoppaisille ultra low kiinnityslevyt (Corning, Lowell, MA, USA) tiheydellä 1000-5000 solua kuoppaa kohden riippuen solulinjan ja viljeltiin 7-10 päivää. Arvioida itseuudistumisen potentiaalin näiden solujen, ensimmäisen sukupolven pallojen kerättiin varovasti sentrifugoimalla, hajotetaan yksisoluiset suspensiot, ja viljeltiin edellä kuvatuissa olosuhteissa toisen 7-10 päivää. Vaikutuksen testaamiseksi lääkkeiden alalla muodostumisen mahdollisuuden, solut maljattiin läsnä ollessa 20% DMSO: ta (vehikkeli), salinomysiini (1 ug /ml) tai paklitakselia (40 ng /ml) alussa kokeen, ilman lisäksi lääkkeen. Jälkeen 7 päivää, levyt analysoitiin keuhko- tumorspheres muodostumista ja pallojen lukumäärä kuoppaa kohti kvantitoitiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia (Olympus, Hampuri, Saksa). Arvioida vaikutuksia huumehoidon ALDH + väestön LLC johdettuja aloilla muodostunut pallojen hoidettiin paklitakselilla (40 ng /ml) tai ajoneuvon 72 tuntia. Inkuboinnin jälkeen Aldefluor määritykset suoritettiin virtaussytometrialla.

ALDH Värjäys ja Cell Sorting

Aldefluor Kit (StemCell Technologies, Durham, NC, USA) käytettiin profiloida ja erillisiä soluja, joilla on suuri ja alhainen ALDH entsyymiaktiivisuus. Kokeet tehtiin mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, 1 x 10

6 soluja inkuboitiin Aldefluor puskuriin, joka sisältää ALDH-proteiinin alusta (BAAA, BODIPY-aminoasetaldehydidietyyliasetaali, 1 mmol /l) 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Solut, jotka voisivat katalysoida BAAA sen fluoresoivan tuotteen (BAA) katsottiin ALDH +. Lajittelu portit FACS laadittiin suhteessa solujen perustason fluoresenssi, joka määritettiin lisäämällä ALDH-spesifinen estäjä diethylaminobenzaldehyde (DEAB) inkubaation aikana. 7-aminoactinomycin D (7-AAD, Sigma-Aldrich) käytettiin eloonjääneiden, apoptoottiset ja kuolleet solut (kuvio S1A). Solut lajitellaan on FACSAria Ilu (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) ja puhtauden lajitellut solut analysoitiin sen jälkeen, kun prosessi on valmis (kuvio S1B). Aineisto analysoitiin Cell Quest Pro (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) ja FlowJo ohjelmistot (Ashland, USA).

CXCR4 virtaussytometria

Kun inkubointia LLC solujen ajoneuvon, salinomysiini (1 ug /ml) tai paklitakselia (40 ng /ml) 72 tunnin kuluttua solut pestiin kerran PBS: llä ja sitten kerättiin 0,05% trypsiiniä /0,025% EDTA: ta. Erillinen solut pestiin PBS /EDTA /BSA: ta (pesupuskuri), ja suspendoitiin uudelleen pesupuskurilla (10

6 solua /100 ui). CXCR4-vasta-aine (Sigma) tai sen vastaavan isotyyppikontrolli lisättiin solususpensio 01:50 pitoisuus ja inkuboitiin 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Leimatut solut pestiin jälleen ja sekundäärisen vasta-aineen konjugoituna FITC: tä (BD Bioscience), lisättiin ja inkuboitiin 4 ° C: ssa pimeässä 30 minuutin ajan. Solut pestiin ja analysoitiin FACSCalibur (BD Biosciences).

klonogeeninen Pitoisuus

arvioimiseksi klonogeeniset potentiaalia ALDH positiivisten ja negatiivisten populaatioiden LLC solujen lajittelun jälkeen 500 solua kuoppaa kohti maljattiin osaksi 6-kuoppalevyille kiinnittynyt olosuhteissa. Kun 10 päivän viljelyn pesäkkeet kiinnitettiin 4% puskuroituun formaliiniin (Panreac, Barcelona, ​​Espanja) ja värjättiin 2% kristalliviolettia. Pesäkkeiden määrä kuoppaa kohti määritettiin.

Cell Proliferation ja Sytotoksisuusmääritys

Solulisääntyminen määritettiin MTT: llä (Roche, Palo Alto, USA). Lajitellut ALDH positiiviset ja negatiiviset populaatiot LLC-solujen tai lajittelemattoman LLC-solut ympättiin 96-kuoppaisille viljelylevyille (1000 solua per kuoppa) 100 ui väliainetta. 24, 48, 72 ja 96 tuntia myöhemmin lisättiin 10 ui MTT lisättiin. Spektrofotometrinen absorbanssi mitattiin 570 nm: ssä.

sytotoksisuusmääritys, LLC-soluja kasvatettiin kiinnittynyt tai anoikis-resistenttejä (palloja muodostavan) olosuhteissa maljattiin 96-kuoppaisille levyille (1000 solua kuoppaa kohti) ja käsiteltiin sarjalaimennettua paklitakseli (0-100 nM). Seitsemänkymmentä kaksi tuntia inkubaation jälkeen, MTT määritykset suoritettiin noudattaen valmistajan protokollaa. Prosenttiosuus solujen eloonjäämistä normalisoitiin jakamalla lopullinen absorbanssi käsiteltyjen näytteiden että käsittelemättömään kontrolliin, ja IC

50 laskettiin.

RNA uuttaminen ja Kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qRT-PCR)

Kokonais-RNA eristettiin soluista, alalla sisältäviä pellettejä, tai jäädytetyt kudosnäytteet käyttäen QIAamp RNeasy Minikit (Qiagen, Chatsworth, CA). Jälkeen DNaasi I hoidon, käänteinen transkriptio suoritettiin Superscript II käänteistranskriptaasilla (Invitrogen, Carlsbad, CA) tuottaa komplementaarisia DNA (cDNA). qRT-PCR ajettiin Applied Biosystems 7900 Reaaliaikainen PCR kone. qRT-PCR-reaktiot suoritettiin SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Forster City, CA, USA) ja GAPDH-tasojen käytettiin kontrolleina. Syklin keskimääräisen kynnysarvon (Ct) ja kiinnostuksen kohteena olevan geenin, normalisoitiin Ct-arvo on housekeeping-geeni (GAPDH) käytettiin laskettaessa geeniekspression arvoja. Määritykset suoritettiin määrittämään mRNA-tasoja hiiren ja /tai ihmisen ALDH1A1, Sox2, CXCR4, SDF-1, CD11, VEGF: n ja VEGFR1 geenejä. Alukesekvenssit on esitetty taulukossa S1. Tiedot on annettu 2

-ΔΔCt tai 2

-ΔCt.

migraatiokokeessa (Boyden jaosto) B

Migration määritykset suoritettiin Boyden kammiossa. 20000 solua per kuoppa seerumia ympättiin ylemmän transwell 24-kuoppaisilla levyillä (Costar), kun läsnä on ajoneuvon, salinomysiini (1 ug /ml) tai paklitakselia (40 ng /ml). Medium 10% seerumia, käytetään kemoattraktantti, pantiin alempaan osastoon. 48 tunnin jälkeen solut yläkammiossa pyyhittiin vanupuikolla, ja solut alemmassa osastossa kiinnitettiin 4% formaliinia ja värjättiin kristallivioletilla. Lukumäärä vaeltavia solujen arvioitiin Leica DMIL LED mikroskoopilla käyttäen LAS EZ ohjelmisto (Leica).

Eläinkokeet

Eläinkokeet suoritettiin mukaisesti eettisten ohjeiden perustettu meidän toimielimet (Navarran yliopisto), hyväksytyn eläimen protokollaa käsittelevä komitea eettisen eläinkokeiden yliopiston Navarra (069/11). Kaikki eläimet asutettiin mikroisolaattorihäkkeihin häkeissä ja SPF olosuhteissa. Kaikki kirurgia menettelyt suoritettiin nukutuksessa ja yritettiin minimoida eläinten kärsimystä.

arvioimiseksi kasvaimen aloittamista valmiudet CSC, kuuden viikon ikäiset NSG (NOD SCID IL2Rg hiiriä The Jackson Laboratory, USA) käytettiin. Tuhat tai viisi tuhatta ALDH positiivinen tai negatiivinen lajiteltu LLC solua ihonalaisesti kyljissä hiiret PBS: ssä. Kasvaimen tilavuus mitattiin 3 viikon kuluttua elektronisella jarrusatula. Lopussa Kokeen eläimet lopetettiin CO

2 hengitettynä. Neljä hiirtä ryhmää kohti käytettiin.

testaamiseksi vaikutuksen salinomysiinin ja paklitakselin

in vivo,

5 x 10

5 LLC solua injektoitiin ihon alle kylkeen 8 viikon vanhoja C57BL /6-hiiristä. Drug hoito aloitettiin 6 päivää sen jälkeen, kun kasvainsolujen injektion, aika, jolloin primaarikasvaimen saavutti noin 50 mm

3. Eläimille annettiin joko 20% DMSO PBS: ssä (ajoneuvo), salinomysiini (5 mg /kg), paklitakselin (5 mg /kg), tai näiden yhdistelmä lääkkeiden välein 2 päivää, injektoimalla intraperitoneaalisesti, ja 5 viikkoa. Nämä annokset ja hoito-ohjelmat valittiin perustuu aiempiin julkaisuihin [13]. Kasvaimet mitattiin 2 päivän välein sähköisellä jarrusatula. Kun ensisijainen kasvaimet olivat saavuttaneet noin 300 mm

3, kasvaimet poistettiin kirurgisesti ja viillot ommeltiin. Operaatio suoritettiin nukutetuilla hiirillä isofluraanilla (Esteve, Barcelona, ​​Espanja) ja aseptisissa olosuhteissa. Jotta voitaisiin vähentää kärsimystä eläimille niiden annettiin ketoprofeenia (5 mg /kg) joka 24. tunti 3 päivää leikkauksen jälkeen. Kolme viikkoa myöhemmin, eläimet lopetettiin CO

2 hengitysteitse ja keuhkot poistettiin lisäanalyysiä etäpesäkenystyröiden. Kukin ryhmä käsitti 5 hiiret ja koe toistettiin kahdesti, jotta tulosten varmistamiseksi.

Värjäys ja kuva-analyysi

Kudosleikkeet kiinnitettiin 4% puskuroituun formaliiniin, valettiin parafiiniin, ja leikattiin (5 mikrometriä paksuus). Objektilasit värjättiin H Abcam, Cambridge, UK). Inkuboinnin jälkeen ensisijaisen vasta 4 ° C: ssa yön, dioja inkuboitiin AlexaFluor 488-leimattua sekundaarista vasta-ainetta (Molecular Probes, Invitrogen, Paisley, UK), vastavärjättiin ydin- 4,6-diamino-2-fenyyli (DAPI) värjäystä ja asentaa Dako loisteputki kiinnitysväliaineet (Dako). Kvantifiointi CD11 b, F4 /80 ja toluidiinisinillä positiivisten solujen toteutettiin tietokoneavusteinen kuva-analyysin avulla Leica DMLA ja QWin 500IW järjestelmät (Leica Instruments). Ala-kasvaimia, kustakin näytteestä analysoitiin 5-10 satunnaisesti valitun optisen kentät ja positiivisten solujen prosenttiosuuden suhteessa kokonaismäärään värjättyjen solujen DAPI laskettiin. Keuhkojen kyhmyt, positiiviset solut laskettiin manuaalisesti, koska olemme huomanneet, että luotettavampia tällaisia ​​pieniä vaurioita, ja tiedot ilmaistiin prosenttiosuutena kasvaimen alueen (mm

2).

ALDH1A1 immunovärjäystä H460-soluja kasvatettiin kammiossa levyt (BD Biosciences), ja kun konfluentteja, Leikkeitä kiinnitettiin /läpäiseviksi asetoni /metanoli 01:01 5 min. Endogeeninen peroksidaasi pysäytettiin 3% vetyperoksidiliuosta ja ei-spesifinen sitoutuminen estettiin 30 minuuttia 5% vuohen normaalia seerumia. Sitten soluja inkuboitiin anti ALDH1A1 vasta-ainetta (BD), on 1:100 laimennus, 2 h RT: ssä ja huuhdeltiin TBS: llä. Primaarisen vasta- aineen detektoimiseen suoritettiin kanssa Envision anti-hiiri-järjestelmä (Dako, Glostrup, Tanska). Peroksidaasiaktiivisuuden kehitettiin DAB (3,3′-diaminobentsidiini, Dako) ja solut vastavärjättiin hematoksyliinillä. Lopuksi, diat oli kansi-liukastui glyserolilla asennus-väliaineessa.

tilastolliset menetelmät

väliset tilastolliset erot ryhmien tutkittiin Opiskelijan

t

testiä tai ANOVA parittomia muuttujien muuttujien ja Mann-Whitney

U

testi tai Kruskal-Wallis parittomia epäparametrinen muuttujia. Normaalius analysoitiin Shapiro-Wilk testi. Aineisto analysoitiin SPSS tilasto-ohjelmalla (versio 17.0 for Windows SPSS) ja GraphPad Prism 5 ohjelmisto (GraphPad). Arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM tai SD ja tilastollinen merkitsevyys määritettiin P 0,05 (*), P 0,01 (**), ja P 0,001 (***).

Tulokset

tunnistetiedot ALDH + CSC kaltainen väestö LLC solut

ja muut ovat aiemmin osoittaneet, että mittaus ALDH aktiivisuus on sopiva menetelmä tunnistamiseksi keuhkosyövän kantasolujen (CSCS) [22] , [23], mutta onko tämä merkki voidaan käyttää eristämään ja luonnehtimaan LLC CSC väestöstä oli tuntematon. Arvioida esiintyminen väestöstä LLC solulinjassa perustuu niiden ALDH entsymaattiseen aktiivisuuteen, Aldefluor määritys seuraa FACS-analyysi suoritettiin. Kuten kuviossa 1A, LLC solulinja oli keskimäärin 11,43 ± 0,38% ALDH positiivisia soluja, mikä on sopusoinnussa aiemmin julkaistu tulokset muiden ihmisen solulinjoissa ja ensiöparit potilailta [5]. Käyttö DEAB (tietyn ALDH estäjä) toimi negatiivisena kontrollina.

. ALDH + solujen fraktion (mitattuna Aldefluor määritykset) edustaa ~11% kaikista soluista LLC solulinjassa. B. Yksittäisiä LLC ALDH + soluilla itseuudistumisen kyky mistä on osoituksena niiden kyky tuottaa sekä ALDH +/- väestön kuluttua 8 päivän viljelyn, kun taas ALDH- solut ainoastaan ​​aiheuta negatiivisia soluja. C. lukumäärä kloonien tuottaman LLC ALDH + ja ALDH- solujen lajittelun jälkeen. ALDH + väestö arvo on suurempi klonogeeniset kapasiteettia kuin niiden kielteiset vastine. D. määrä palloja syntyy LLC ALDH +/- soluja. E. qRT-PCR-analyysi ALDH1A1 mRNA tasojen LLC soluissa viljeltiin kiinnittynyt olosuhteissa, ensisijaisen pallojen (S1) ja aloilla toisen sukupolven (S2). F. Chemoresistance paklitakseliin LLC kasvatettu joko tarttuu olosuhteissa tai pallojen (S1) mitattiin MTT-määritys. IC

50 kiinnittyneet LLC solut: 35,8 nM; IC

50 LLC S1 pallojen: 93,6 nM. Data ja virhepalkkeja: keskiarvo ± SD. * P 0,05. ** P 0,01. *** P 0,001. Kaikki kokeet toistettiin vähintään 3 riippumatonta kertaa (kukin niistä kolmena rinnakkaisena).

tyypillisiä ominaisuuksia CSC sisältyvät niiden valmiuksia itseuudistumiseen ja erilaistuminen,

in vivo

tuumorigeenisia potencial ja kestävyys kemoterapiaa [24]. Voit tarkistaa nämä ominaisuudet LLC soluissa, ensin tutkinut itseuudistumisen kyky ALDH + väestöstä. Sen jälkeen ALDH solulajittelulla, sekä positiiviset että negatiiviset solufraktioista maljattiin erikseen. Sen jälkeen, kun 8 päivää viljelmässä, Aldefluor määritys suoritettiin analysoida fenotyypin tuloksena solupopulaation. Viljellyt ALDH + solut pystyivät uudistua sekä ALDH positiivisia että negatiivisia solupopulaatioiden. Päinvastoin, viljellyt ALDH- solut eivät pystyneet tuottamaan ALDH + väestöstä (kuvio 1 B). Tämä tulos osoittaa, että vain ALDH + solut kykenevät liuottaa koko solupopulaatio, tyypillinen ominaisuus CSCS. MTT määritykset paljastivat, että ei ollut eroja kasvuvauhdissa välillä ALDH + ja ALDH- solupopulaatioiden (kuvio S1C). Ei havaittu mitään eroja välillä lajittelemattoman vanhempien väestö ja ALDH + tai ALDH- populaatiot (data ei näytä).

Jos haluat vertailla Tuumorigeenisuustutkimuksissa ALDH + ja ALDH- LLC soluja, NSG hiiriin ruiskutettiin ihon alle 1 x 10

3 tai 5 x 10

3-soluissa. Kuten taulukossa 1 on esitetty, kasvaimen kasvun havaittiin 3 4 hiirtä istuttamisen jälkeen 1 x 10

3 ALDH + soluja, kun taas mitään kasvaimen kasvua ei havaittu ALDH- soluissa. Injektion jälkeen 5 x 10

3 ALDH + -solujen, 3/4 hiirissä esitetään kasvaimen massan keskimääräinen kasvaimen 235,3 ± 64,6 mm

3, kun taas vain 2/4 hiirille kehittyi pieni kasvain injektion jälkeen ALDH- väestöstä (jossa on tuumorin tilavuus on 27,45 ± 5,47 mm

3).

sitten analysoimme klonogeenisten potentiaali LLC ALDH + ja ALDH- solufraktioista maljaamalla 500 solua per kuoppa 6-kuoppaiselle levylle ja viljelemällä niitä klonaalisen tiheys 10 päivää. ALDH + solut johti huomattavasti suurempi määrä pesäkkeitä kuin ALDH- soluja (p 0,05; kuvio 1 C), mikä osoittaa, että ALDH + solut näyttää lisääntynyt kyky muodostaa klooneja. Klonogeenisten kyky emosolulinjassa oli välimuoto ALDH + ja ALDH- jakeet (tietoja ei näytetä).

ALDH + solut tuottivat suuremman määrän palloja kuin ALDH- soluja (p 0,01; kuvio 1 D). Olemme myös analysoineet kykyä koko LLC väestö muodostaa palloja ja itse uudistaa, mikä aiheuttaa toissijainen pallo populaatio (S2). 7 päivän jälkeen seerumissa ja kiinnittynyt vapaa kunnossa, LLC solut muodostivat ensisijaisen palloja (S1). Disaggregaatiota S1 aloilla ja kulttuurin samoissa olosuhteissa osoitti muodostumista toissijainen (S2) pallo väestöstä. Sen varmistamiseksi, että palloja rikastuneet CSCS, me määrällisesti ALDH mRNA-tasot soluissa kasvatettu pysyvä ja ei-adherentit (S1 ja S2 aloilla) olosuhteissa. By qRT-PCR-analyysi havaitsimme, että S1 palloja oli merkittävästi suurempi (p 0,001) ALDH-mRNA-tasot kuin viljeltyjen solujen kiinnittynyt olosuhteissa, ja että S2 aloilla myös rikastunut ALDH lausekkeen (p 0,05) verrattuna S1 aloilla (kuvio 1E). Lisäksi Aldeflour analyysi osoitti suuremman määrän ALDH + -solujen aloilla (34,2% ± 6,56%) kuin kasvatettujen solujen kiinnittynyt olosuhteissa (11,43 ± 0,38%) (Suplemmentary Kuva 1D ja kuvio 1A). Siksi nämä kokeet vahvistivat, että anoikis kestävä palloja sisälsi rikastettua ALDH + CSC kaltainen väestö, joka pystyi läpikäymään itseuudistumisen.

Toinen piirre CSCS on vastustuskyky tavanomaisia ​​kemoterapia-aineiden. Siten käytimme paklitakseli, joka on yleisesti käytetty huume vastaan ​​NSCLC, arvioida chemoresistance LLC kasvatettujen solujen aloilla tai kiinnittynyt olosuhteissa. Kuten on esitetty kuviossa 1F, LLC-soluja viljeltiin, kuten palloja oli korkeampi eloonjäämisaste, kun käsiteltiin eri annoksilla paklitakselin kuin viljeltyjen solujen kiinnittynyt olosuhteissa. IC

50-arvot sekä solupopulaatioiden olivat merkitsevästi (p 0,01) eri IC

50 kiinnittyneet LLC soluissa oli 38,5 nM ja 93,6 nM LLC johdettujen aloilla (kuvio 1 F). Käsitellä onko S1 peräisin olevien solujen vastasi ALDH + väestön lisääntynyt resistenssi paklitakseliin, me analysoitiin Aldefluor prosenttiosuus ALDH + -solujen aloilla seuraavissa lääkehoitoa. Yllättäen emme noudata kasvanut merkittävästi prosenttiosuus ALDH + solujen reaktiota paklitakselille LLC mallin alalla viljelyolosuhteet. Koska kuitenkin on kuvattava alla, tämä ilmiö näkyi ihmisen NSCLC malleissa, tukevat oletuksesta, että S1 peräisin olevat solut sisältävät paklitakselia kestävä ALDH + soluja. Yhdessä kaikki nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että ALDH + osa LLC-solujen vastaa lääkkeille vastustuskykyiset CSC väestöstä.

Differential vaikutus Salinomysiini ja paklitakselin kohdistaminen CSC vs. kuin CSC populaatiot

sen jälkeen on osoittanut, että LLC solulinja on ALDH + väestöryhmästä kanssa CSCS ominaisuuksia, halusimme tutkia vaikutusta salinomysiinin, äskettäin tunnistettu yhdiste, joka estää selektiivisesti ihmisen rintasyövän kantasoluja

in vitro

[13] . Vertasimme vaikutusta salinomysiinin kanssa, paklitakselin CSC vs. muu CSC populaatiot.

Tämän jälkeen

in vitro

kokeissa käsittelimme LLC soluista 1 ug /ml salinomysiiniä tai 40 ng /ml paklitakselia, jotta he voivat toipua 24 tuntia ilman lääkettä. Määritellä konkreettisia vaikutuksia salinomysiinin ja paklitakselilla ALDH +/- solupopulaatioiden, Aldefluor määritykset seuraa FACS-analyysi suoritettiin. Sen jälkeen, kun solujen lajittelu, ALDH positiiviset ja negatiiviset solut maljattiin erikseen ja antaa yhdessä salinomysiini (1 ug /ml) tai paklitakselia (40 ng /ml) 72 tunnin ajan, ja solujen elinkyky arvioitiin MMT määrityksiä. Kuten kuviossa 2A on esitetty, eloonjäämistä ALDH + -solujen jälkeen salinomysiinin hoito oli merkittävästi pienempi kuin ALDH- solujen (p 0,05). Sen sijaan paklitakselikäsittelyn jälkeen eloonjäämisen ALDH + solujen ei ollut vaikutusta, kun taas vain 67,7% ALDH- solut olivat elossa (p 0,05). Nämä tulokset osoittavat, että salinomysiinin on erittäin sytotoksinen ALDH + soluja, mutta paklitakseli vaikuttaa ALDH negatiivinen väestökehitys.

. * P 0,05. * P 0,05. Mittakaava = 20 um. * P 0,05. ** P 0,01. ** P 0,01.