Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

metylointi CpG saaret perimän DNA ja lysiinitähteet histoni H3 ja H4 hännät säätelee geenin transkriptiota. Esto polyamiinin synteesin ornitiinidekarboksylaa- antizyme-1 (OAZ) ihmisen suun syöpäsolulinjan johti kertymistä dekarboksyloitua

S-

adenosylmethionine (dcSAM), joka toimii kilpaileva estäjä metylaation reaktioita. Odotimme, että kertyminen dcSAM heikentynyt metylaation reaktioita ja johti hypometylaatio perimän DNA ja histoni hännät.

Menetelmät /Principal Havainnot

Global metylaatiotilaa perimän DNA ja lysiinitähteet histoni H3 ja H4 hännät analysoitiin metylointi Isoschizomers (MIAMI) menetelmä ja western-blottauksella, vastaavasti, kun läsnä on tai ei ole OAZ ilmentymisen. Kohdunulkoinen ilmaus OAZ välittämän hypometylaatio CpG saaret perimän DNA ja histoni H3 lysiinin 9 dimetyloimalla (H3K9me2). Proteiini taso DNA metyylitransferaasi 3B (DNMT3B) ja histoni H3K9me erityisiä metyylitransferaasi G9a oli säädellä vähentävästi OAZ transfektanttia.

Johtopäätökset /merkitys

OAZ aiheuttama hypometylaatio CpG-saarekkeiden globaalin genomin DNA ja H3K9me2 by alaspäin säätäminen DNMT3B ja G9a proteiinin taso. Hypometylaatio CpG saaret perimän DNA ja histoni H3K9me2 on voimakas mekanismi induktion liittyvistä geeneistä tuumorisuppressiogeeneksi ja DNA kaksijuosteisen tauon korjaus.

Citation: Yamamoto D, Shima K, Matsuo K, Nishioka T, Chen CY, Hu Gf, et al. (2010) ornitiinidekarboksylaasi Antizyme indusoi hypometylaatio Genome DNA ja histoni H3 lysiini 9 dimetyloimalla (H3K9me2) in Human Oral Cancer Cell Line. PLoS ONE 5 (9): e12554. doi: 10,1371 /journal.pone.0012554

Editor: Shuang-Yong Xu, New England Biolabs, Inc., Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 toukokuu 2010; Hyväksytty: 31 heinäkuu 2010; Julkaistu: 03 syyskuu 2010

Copyright: © 2010 Yamamoto et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: National Institutes of Health (National Cancer Institute) Research Grant RO1-CA10044 varten Takanori Tsuji. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ornitiinidekarboksylaasi (ODC, EC4.1.1.17) on ensimmäinen ja nopeutta rajoittava avain entsyymin polyamiinin biosynteesiä katalysoi L-ornitiini on putreskiiniä [1] ja on sekaantunut solujen lisääntymistä ja erilaistumista [2 ]. Ornitiinidekarboksylaa- antizyme subfamily koostuu kolmesta toisiinsa liittyvästä antizyme jäsentä ja ornitiinidekarboksylaasia antizyme-1 (OAZ) havaittiin ensimmäisen ja identifioidaan ornitiinidekarboksylaasi (ODC) estävä molekyyli stimuloimalla hajoamisen ODC proteiini [3], [4]. OAZ tiedetään sitoutuvan erilaisia ​​proteiineja ja välittävät hajoamista tai stabilointi kohdeproteiinien. Nämä proteiinit ovat ODC [5], antizyme inhibiittori [6], sykliini D1 [7], [8], ja HPV16 E2 [9]. Kuten on esitetty kuviossa. 1, esto ODC aktiivisuuden ja myöhemmin polyamiinin synteesin OAZ [10] tai kemiallista yhdistettä, α-difluorometyyliornitiini (DFMO) [5] johti kertymistä dcSAM. dcSAM toimii aminopropyyli luovuttajana polyamiinin synteesissä, mutta se toimii kilpaileva estäjä S-adenosylmethionine lähes kaikissa metylaatio reaktioita, mukaan lukien DNA: n, RNA: n, lipidien ja proteiinien [5], [11]. Ektooppinen ilmentyminen OAZ hamsterin suun syöpäsoluissa indusoitu maailmanlaajuisen hypometylaatio, ja transaktivoi liittyvien geenien tuumorisuppressiogeeneksi ja epiteelisolujen erilaistumisen [10]. Myöhemmin me profiloitu geenit aiheuttama tai säädellään ylöspäin ihmisen suun syöpäsoluissa OAZ, ja löysi induktio liittyvien geenien DNA kaksinkertainen lohkon murtuma korjaus ei-homologisella end-liittymällä mekanismi [10].

ODC on keskeinen entsyymi polyamiinin synteesin katalysoivat L-ornitiini on putreskiiniä. OAZ on estävä molekyyli ODC aktiivisuuden välittämällä hajoamiseen ODC proteiinia. SAM toimii metyylin luovuttajana metylaatiossa reaktioita sekä esiasteena dcSAM tuotantoa. dcSAM on aminopropyyli antaja polyamiini biosynteesin mutta se toimii myös kilpaileva estäjä SAM lähes kaikissa metylaatio reaktioita. Esto ODC toiminta johtaa polyamiinin ehtyminen ja dcSAM kertymistä, joka estää metylointi reaktioita.

DNA: n metylaatio CpG-saarekkeiden ja histonimodifikaation, erityisesti asetylaatio ja metylaation lysiinitähteiden histoni hännät ovat tiukasti korreloivat säännellä geenin ilmentymistä. Histoni asetylointi yleensä korreloi transkriptionaalisen aktivaation mutta histoni metylaatio säätelee transkription aktivaation tai repression riippuen päällä lysiinin metylaation [12]. Histoni lysiini metylaatio tapahtuu kuusi lysiinijäännöksissä että jätteestä histonien H3 (K4, K9, K27, K36, K79) ja H4 (K20) [13], [14]. Kukin näistä lysiiniä voi olla mono-, di- tai trimetyloidaan [13]. Metyloinnin H3K4, H3K36 ja H3K79 pääasiassa korreloivat transkription aktivaation taas metyloinnin H3K9, H3K27 ja H4K20 esiintyy pääasiassa yhdessä transkription hiljentäminen [15], [16]. Toisistaan ​​riippuvaisia ​​suhde DNA: n metylaation ja histoni metylaatio on yksi etu aiheista geenisäätelyn. H3K9 metylaatio ja DNA: n metylaatio ovat tiiviisti liittynyt heterochromatin ja kopiointia tukahdutettu euchromatic alueilla. Kasvava todisteita paljastettiin, että DNA sytosiini metylaatio kanssa rinnakkaista tukahduttavaa H3K9 metyloinnin koska DNA metyylitransferaasien, metyyli-CpG sitovan proteiinin (MeCP2), ja heterochromatin protein1 (HP1) rekrytoimaan H3K9 erityiset metyylitransferaasi metyloimaan histoni lysiinijäännöksissä [17] – [19]. Tämä mekanismi on käänteinen joissakin järjestelmissä [20]. H3K9 metylaatio on edellytys sille, että DNA: n metylaatio [21] – [24]. Oletamme, että kertyminen dcSAM mukaan kohdunulkoisen OAZ ilmaisu johtaa hypometylaatio perimän DNA: n ja histoni hännät sekä hypometylaatio genomin DNA ja histoni hännät ajan säätelee tai transaktivoi osallistuvia geenejä DNA kaksijuosteisen tauko korjaus. Genominen data jotka muodostavat perustan ymmärtää keskinäisistä suhteista transkriptiotekijän ja kromatiinin perustuvat reittejä. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme seulotaan ja tarkasti OAZ välittämää maailmanlaajuinen hypometylaatio perimän DNA: n ja histoni H3 ja H4 hännät.

Tulokset

ODC aktiviteetti

OAZ proteiini edistää hajoamista ornitiini (ODC) proteiinia ja vähentäminen ODC entsyymin aktiivisuutta. Sen tutkimiseksi, onko OAZ proteiini transkriptoidaan ja transloidaan OAZ transfektantissa (UM1-pMT /CB6

+ HuFSAZ-wt) on biologisesti aktiivinen proteiini, ODC entsyymiaktiivisuuden määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [10]. ODC toimintaa OAZ transfektantin kanssa ZnSO

4 hoitoa näytteillä vähensi ODC-entsyymin aktiivisuus (1629,0 ± 61,7 /pikomoolia CO

2 tunnissa per milligramma proteiinia) mukaan 72,6% vertaamalla kuin mock vektorin transfektantin (UM- 1pMT /CB6

+) käsiteltiin ZnSO

4 (5930,0 ± 110,7 /pikomoolia CO

2 tunnissa per milligramma proteiinia) (p 0,05). ODC aktiivisuus OAZ transfektantin ilman ZnSO

4 hoito laski (4944,1 ± 414,6 /pikomoolia CO

2 tunnissa per milligramma proteiinia) 30,3% vertaamalla kuin mock vektorin transfektantin ilman ZnSO

4 hoitoa (7084,7 ± 284,1 /pikomoolia CO

2 tunnissa per milligramma proteiinia) (Fig. 2). Tämä johtuu todennäköisesti vuoto geeniekspression aiheuttama pieni määrä Zn

2+ täydennetty viljelyalustassa. Vähentäminen ODC toiminnan OAZ transfektantin vahvistaneet OAZ proteiini indusoi ZnSO

4 hoito oli biologisesti funktionaalisen proteiinin.

ODC aktiivisuutta (pikomoolia CO

2 tunnissa per milligramma proteiinia) ja vanhempien UM1, pilkata vektori transfektantin ja OAZ transfektantin ja ilman ZnSO

4 hoitoa mitattiin. Kolmena kappaleena kvantifiointi suoritettiin. Korjattu ODC aktiivisuus arvot saatiin vähentämällä arvo tyhjäksi. ODC aktiivisuus OAZ transfektanttiyhdistelmän ilman ZnSO

4 hoito tukahdutettiin koska pienen määrän ZnSO

4 kasvatusväliaineeseen aiheutti vuodon OAZ geenin ilmentymisen.

solunsisäinen taso polyamiinien ja aineenvaihduntatuotteiden

Oletetaan, että vähentäminen ODC entsyymiaktiivisuuden johti ehtyminen polyamiinin altaan ja myöhemmin muuttaminen solunsisäisen tason polyamiinin aineenvaihduntatuotteiden. Olemme määrällisesti solunsisäistä ODC, polyamiinit ja metaboliittien taso HPLC-analyysillä, kuten aiemmin on kuvattu [5]. Kohdunulkoinen ilmentyminen OAZ alassäädetty ODC proteiinin taso 51ng /10

6 solua 8,4 ng /10

6 solua. Kuten odotettiinkin, polyamiinin tasot dramaattisesti vähentynyt seurauksena tukahduttaminen ODC toimintaa. Putreskiiniä taso laski 9 ng /10

6 solua 1,3 ng /10

6 solua. Spermidiinin taso laski 15,1 ng /10

6 solua 0,2 ng /10

6 solua. Spermiiniä taso laski 72,8 ng /10

6 solua 1,0 ng /10

6 solua (Fig. 3A). S-adenosyylimetioniini (SAM), joka on metyylin luovuttajana kaikille metylaation reaktioita, oli melko vakio läpi kokeiden. Solunsisäinen määrä SAM oli 17,8 ng /10

6 soluja OAZ transfektantin ja 14,3 ng /10

6 solujen mock vektori transfektanttia. Solunsisäinen taso dcSAM valvonnassa mock vektori transfektanttiyhdistelmän oli 1,22 ng /10

6 solua, mutta se kasvoi voimakkaasti 87,9 ng /10

6 soluja OAZ transfektanttia. Solunsisäinen taso S-adenosylhomocystein (SAH) myös nousi 0,66 ng /10

6 solua 3,76 ng /10

6 solua (Fig. 3B).

polyamiini allas oli tyhjentynyt (A ) mutta dcSAM ja SAH, jotka saattavat estää metylaation reaktiot, lisääntynyt (B) OAZ transfektantin käsitelty ZnSO

4. Cellular taso SAM oli vakio läpi kokeet (B).

metylaatiotilaa genomin DNA

Kuten olemme jo julkaistu, ektooppinen ilmentyminen OAZ hamsterin pahanlaatuinen suun keratinosyyttien aiheuttamaa maailmanlaajuinen hypometylaatio CCGG sivustoja genomin DNA [10]. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme onko sama hypometylaatio indusoitiin ihmisen OAZ ihmisen suun syöpäsolulinjan. Taso Metyloitujen sytosiineista CCGG kvantifioitiin mittaamalla radioaktiivisuuden kaksi suurta paikkoja, 5 ’[

32P] dCMP ja 5′ [

32P] dm

5CMP nestetuikelaskennalla. Tulos kvantifiointiin on esitetty kuviossa. 4 prosentteina dm

5CMP. OAZ transfektantti ja ilman ZnSO

4 hoitoa näytteillä että 26,0% ja 40,6% sekä CCGG sekvenssit olivat metyloituja, vastaavasti. Vanhempien UM1 solut ja ilman ZnSO

4 hoitoa, ja mock vektori transfektantin kanssa ja ilman ZnSO

4 hoitoa näytteillä 48,7% ja 50,2%, ja 40,4% ja 40,9% sisäisen sytosiini oli metyloitu, vastaavasti. Tämä tulos osoittaa, ektooppinen ilmentyminen OAZ liittyy genominlaajuisten DNA demetylaatio ihmisen suun syöpäsolulinjan. Genomi-DNA OAZ transfektantin on noin 60% vähemmän metyloituja kuin mock vektorin transfektantti.

Global metylaation tason 5′-metyyli-CMP (dm5’dCMP) ja 5’dCMP genomin DNA: vanhempien UM1 soluja, mock vektori ja OAZ transfektantin mitattiin tuikelaskennalla.

32P-leimattua dm

5CMP ja CMP tuotettiin katkaisemalla kunkin genomin DNA: t restriktioentsyymeillä

Msp

I ja sen metylaatioherkän isoskitsomeeri

Hpa

II ja ne olivat erotetaan ohutkerroskromatografialla.

metylointi tilan histoni H3 ja H4 hännät

metylointi tila lysiinitähteiden histoni H3 ja H4 hännät linkkejä muodostumisen transaktiivista euchromatin tai transrepressive heterochromatin riippuen metylaatiokohdan. Ehtyminen polyamiinin poolin OAZ johtivat kertyminen dcSAM, joka toimii kilpaileva estäjä SAM metylaation reaktioita. Odotimme kertyminen dcSAM välittämän globaalin hypometylaatio lysiinitähteiden histoni H3 ja H4 hännät. Koska ensimmäinen seulontaan tutkia mahdollisen yhteyden kertymisen dcSAM ja muuttaminen globaalin histoni metylaatiotila, analysoimme maailmanlaajuisia muutoksia metylaatiostatuksen histne H3 ja H4 western blottauksella. Kuusitoista vasta-aineita mono-, di- ja tri-metylaatio tietyn lysiinitähteiden histoni H3 ja H4 käytettiin. Voisimme tarkkailla laski merkittävästi maailmanlaajuisesti histoni H3 Lys-9 dimetyloimalla (H3K9me2), H3K27me1, H3K27me2, joka on H3K27me3 41,6, 14,3, 16,4 ja 17,5% vastaavasti OAZ transfektantissa (Fig. 5A ja B). Signaali voimakkuus histoni H3 oli vakio joukossa kaikki näytteet ladataan. Sen sijaan, kahdentoista muun vasta-aineita histonien H3 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3, H3K9me1, H3K9me3, H3K36me1, H3K36me2, H3K36me3, H3K79me2) ja H4 (H4K20me1, H4K20me2, H4K20me3) eivät osoittaneet mitään merkittävää eroa OAZ transfektantin ja mock vektori transfektantti (Fig. 5A ja B). Di-metyloinnin histoni H3K9 on merkki konstitutiivisen heterochromatin ja geenin tukahduttaminen. Hypometylaatio H3K9me2 merkitsee muutosta kromatiinin valtiota heterochromatin ja euchromatin, mikä tarkoittaa myös transkriptionaalista aktiivisuutta geenien muuttuu tukahduttavaa valtion aktiiviseen tilaan. Tämä demetylaation H3K9me2 mukaan OAZ spekuloi aktivointi liittyvistä geeneistä eriyttämisen [10] ja DNA kaksijuosteisen tauko korjaus [25].

Huomattava hypometylaatio H3K9me2 oli esillä OAZ transfektantin käsitelty ZnSO

4 . Metylaatiostatuksen muiden lysiinitähteiden histoni H3 ja H4 hännät ei muuttunut. Histoni H3 ja H4 proteiineja (17 kDa ja 10 kDa, vastaavasti) oli myös blotattiin samalla kalvolla, kun strippaus seurata yhtä paljon proteiinia lastaus kussakin vyöhykkeessä. Me osoitamme vain H3K9, H3K27 ja H4K20 tuloksia, koska metylointi nämä histoni hännät toimii transkription repressori (A). Arvo Merkitään suhteellinen intensiteetti metyloitu histoni proteiinin bändejä OAZ tranfectants kuin mock vektorin transfektantit normalisoinnin jälkeen PAN H3 ja H4 bändejä. Intensiteetti ohjaus (mock vektori transfektantti ilman ZnSO

4 käsittelyä) pidettiin 100 ja muiden signaalien ilmaistiin suhteellisena arvona (B).

Expression tason DNMTs ja G9a

ensimmäinen tutki OAZ muuttunut mRNA ilmentymistason DNMTs ja G9a by qRT-PCR. Tavanomaiset RT-PCR suoritettiin ennen qRT-PCR vahvistaa, että alukesettiä pystyi monistamaan yhden amplikoni. Me vahvisti nämä PCR-alukkeet voivat monistaa rapea yhden kaistan jälkeen 35 syklin PCR-reaktio (tuloksia ei ole esitetty). Myöhemmin qRT-PCR-tuloksiin osoitti, että OAZ ilmentymistä tai ZnSO

4 hoito ei vaikuta ilmentymistason DNMT1, 3A, 3B ja G9a mRNA (p 0,01) (Fig. 6). OAZ välittämä maailmanlaajuinen hypometylaatio perimän DNA ja histoni H3K9me2. DNMTs 1, 3A, 3B ja G9a /GLP histoni methyltrasferase monimutkaisia ​​ovat mukana metylaatio perimän DNA: n ja histoni H3K9me2, vastaavasti. Oletimme, että hypometylaatio histoni hännät oli yksi pleiotrooppisten tavoitteita dcSAM-välitteisen hypometylaatio, ja kaikki metyloitua lysiinien histonien hännät ovat hypometyloidut mutta todellisuudessa vain H3K9me2 on hypometyloidut. Tämä odottamaton tulos sai meidät tutkimaan proteiinin taso DNMTs ja G9a. Metylointi nisäkkään H3K9 katalysoivat G9a /GLP histoni metyylitransferaasi monimutkainen. Western blot analyysit paljastivat proteiinin taso DNMT3B (Fig. 7) ja G9a (Fig. 8) oli merkitsevästi alassäädetty mutta proteiinin taso DNMT1 ja 3A ei muuttunut vuonna OAZ transfektanttia. Tämä tulos osoittaa, että maailmanlaajuinen hypometylaatio perimän DNA ja histoni hännät johtuu paitsi pleiotrooppinen vaikutuksesta dcSAM mutta erityisellä tavalla toimii hypomethylate perimän DNA ja histoni hännät.

Expression tasolla näiden mRNA ei muuttunut OAZ. PCR Tuloksena normalisoitiin käyttäen beeta-aktiini-signaalin. Signaalin valvonnan (mock vektori transfektanttiyhdistelmän ilman ZnSO

4 hoitoa) pidettiin 100 ja muiden signaalien ilmaistiin suhteellisena arvona.

Tumauutteet immunoblotattiin anti-DNMTs vasta-aineita. Proteiini taso DNMT1 (183 kDa) ja DNMT3A (101 kDa) oli vakio, mutta proteiinin taso DNMT3B (110 kDa) oli merkittävästi vähentynyt OAZ transfektantin käsitelty ZnSO

4. Fain bändejä ilmestyi DNMT3A ja DNMT3B blotit ovat isomuotoja DNMT3A ja 3B. Okt-1 (89 kDa) käytettiin seuraamaan yhtä suuri määrä proteiinia loading kussakin vyöhykkeessä.

Tumauutteet immunoblotattiin anti-G9a vasta-aine. Expression of G9a proteiinin (140 kDa) oli vähentynyt OAZ transfektantin käsitelty ZnSO

4.

DNMT entsyymiaktiivisuuden

Käytimme poly (dl-dC) poly ( dl-dC), kuten substraattina DNMT entsyymiaktiivisuuden määritys. DNMT entsyymin aktiivisuus määritettiin mittaamalla sisällyttämällä etiketti poly (dl-dC): poly (dl-dC) substraatti. Metyyli poly (dl-dC) poly (dl-dC) tuotanto tukahdutettiin ~65% vuoden OAZ transfektantin kanssa ZnSO

4 käsittely vertaamalla niitä ohjaus- transfektantin ja OAZ transfektantin ilman ZnSO

4 hoitoa ( P 0,01) (Fig. 9). Tämä tulos paljasti, että vähentynyt DNMT3B proteiini tukahdutti osa koko DNMT aktiivisuutta ja tämä laski DNMT aktiivisuus korreloi down-regulation DNMT3B proteiinin OAZ.

Yhteensä DNMT aktiivisuuden määritys suoritettiin. DNMT aktiivisuus väheni ~65% vuonna OAZ transfektantin käsitelty ZnSO

4. Tämä tulos korreloi western blot tulos DNMT3B.

Keskustelu

Olemme raportoineet, että ektooppinen ilmentyminen OAZ hamsterin suun syöpäsoluissa johti maailmanlaajuisen hypometylaatio genomin DNA [10 ] ja indusoi tai sääteli geenien ilmentymistä, jotka liittyvät DNA kaksinkertainen lohkon murtuma korjaus ihmisen suun syöpäsoluissa [25]. Poikkeava metylaatio CpG-saarekkeiden promoottorialueella inaktivoi geenin transkription [26] – [28]. Kovalenttiset modifikaatiot histoni hännät myös tärkeä rooli transkriptio, DNA-replikaatioon, DNA tauko korjaus- ja kromatiinin tiivistyminen mitoosin [29]. Näistä histonimodifikaation, metylaatio ja asetylaatio histoni hännät osallistuvat geenien transkription säätelystä [30], [31]. Esillä olevassa tutkimuksessa tutkimme maailmanlaajuinen metylaatiotilaa genomin DNA: n ja lysiinin jäämät histoni hännät ihmisen suun syöpäsoluja puuttuessa tai läsnä ollessa OAZ ilmaisun. Esto polyamiinin synteesin OAZ kertynyt epätavallisen korkea dcSAM, joka toimii kilpaileva estäjä

S-

adenosylmethionine lähes kaikissa metylaatio reaktioita. Me ennusti kertyminen dcSAM aiheuttama hypometylaatio kystiinin jäämiä CpG-saarekkeiden ja muuttunut metylaatio jälkiä lysiinitähteiden histoni hännät. Sytosiinitähteiden of CCGG sivustojen perimän DNA: ta maailmanlaajuisesti hypometyloidut odotetusti, mutta vain H3K9me2 oli hypometyloidut joukossa methylable lysiinijäännöksissä histoni hännät. Nämä tulokset sai meidät tutkimaan proteiinin taso DNA metyylitransferaaseja (DNMTs) ja H3K9me2-spesifinen metyylitransferaasi G9a. Meidän western blot tulokset osoittivat proteiini taso DNMT3B ja G9a sen alas-säädellä OAZ transfektanteista. DNA: n metylaatio kuviot on perustettu ja ylläpitää koordinointia DNA metyylitransferaasien, DNMT1, DNMT3A ja DNMT3B. DNMT1 harjoittaa ylläpito metylaatiokuvion seuraavat DNA lisääntymään, kun taas DNMT3A ja DNMT3B ovat pääasiassa vastuussa de novo metylaation [32] ja ylläpito metylaation tietyillä alueilla genomin DNA alkionkehityksen aikana ja kehitys [33]. DNMT3B ehtyminen ihmisen syöpäsolulinjoissa uudelleen metylaatiospe- vaiennettu geeniekspressiota mutta ei aiheuttanut maailmanlaajuisesti tai juxtacentromeric satelliitin demetylaatio [34]. Ehtyminen DNMT3B mukaan OAZ voitaisiin edistää sekvenssi-spesifisen DNA demetylaatio ja indusoi tai sääteli geenien ilmentymistä, jotka liittyvät DNA: han katkoksen korjaamiseen mutta kertymistä dcSAM vaikutti myös satunnaisia, maailmanlaajuinen DNA demetylaatio.

G9a histoni metyylitransferaasin , joka ainutlaatuisesti metyloi histoni H3K9, on myös tärkeä pelaaja geenien [35] ja olennainen varhaisen alkionkehityksen säätelemään kehityshäiriöitä geenien ilmentymistä [36]. Metylaatio H3K9me2 välittämän G9a muuttaa kromatiinin rakenteen rento euchromatin kompakteihin heterochromatin ja tukahduttaa useita geenin ilmentymisen [36] – [38]. Metylointi H3K9 on tiedetty yhdistää hypermetylaatiota promoottorin CpG-saarekkeiden syöpäsoluissa [39], [40]. DNA: n metylaatio ja H3K9 metylaatio tiiviisti yhteistyössä säädellä geeniekspressiota. H3K9 metylaatio on edellytys sille, että DNA: n metylaatio [21] – [23], ja H3K9 metylaatio tarvitaan DNA: n metylaatio [22], [23]. G9a välittämä DNA: n metylaatio ei vaadi sen katalyyttinen aktiivisuus [41], mikä viittaa siihen, että se voi olla lisätoimintoja suuntaamisessa DNA: n metylaatio, kuten rekrytointi DNMTs [42]. G9a proteiini sitoutuu DNMT1 ja johtaa parantaa DNA: n ja histoni metylaatio [43]. G9a proteiini myös rekrytoi ja sitoutuu DNMT3A ja DNMT3B proteiinien kautta ankyriiniproteiinista (ANK) domain [44], ja paikantaa ne sivustoja DNA-replikaation. H3K9me2 näyttelee yhtä tärkeä rooli geenien in euchromatin ja myöhemmin de novo DNA metylaatio alkion ja ituradan geeneistä normaalin kehityksen [41], ja on tarpeen ylläpitämiseksi DNA metylaatio Endogeenisen retrotransposoneja, painettu loci ja muita geenejä eriytetty soluihin [45]. Li et al ja Deng et al raportoitu esto globaalin genomin DNA: n metylaatio 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-CDR) vähensi proteiinin ilmentymistä DNMT1 ja DNMT3B [46], [47]. Wozniak ym raportoitu, että 5-atsa-CdR hoito hypometyloidut maailmanlaajuinen H3K9me2 ihmisen rintasyövän soluja alaspäin säätäminen G9a proteiinin taso [48]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että DNA-demetylaatio voi olla signaali, joka ohjaa demetylaatiota H3K9 aikana DNA: n replikaation.

on pariton seurauksena kerääntyminen dcSAM ei muuttanut metylaatiotilan lysiinitähteiden histoni hännät muiden kuin H3K9me2, koska esto metylaation dcSAM näyttää pleiotrooppinen vaikutus. Transkriptiotekijät myös pleiotrooppista vaikutus, mutta niiden toiminta on tiukasti säännelty cis- ja trans-toimivia elementtejä säätelemään geenin ilmentymistä kudoksille kehityshäiriöitä vaiheessa-, ja tautikohtaista tavalla. Uskomme metylaatio esto dcSAM ei pleiotrooppista tavoin, mutta se säätelee myös ylimääräisiä cis- ja tras toimivia elementtejä kohdistaa tiettyihin kohtiin geenien ja histoni hännät. Tarkkaa mekanismia ei molekyylitasolla taustalla alas-säätely DNMT3B ja G9a proteiinien OAZ edelleen heikko. Ehdotamme voimakas molekyylimekanismin että OAZ proteiini suoraan tai välillisesti sitoutua DNMT3B ja /tai G9a proteiinit ja edistää niiden hajoamista. OAZ-proteiinin tiedetään sitoutuvan erilaisia ​​proteiineja ja edistää niiden hajoamista [7] – [9], [49] – [51]. Nykyinen tuloksemme korostaa monimutkainen suhde histonien metylaatio ja alttiutta DNA: n metylaatio. Nämä todisteet viittaavat siihen, että geenien ilmentymisen, jotka liittyvät DNA korjaukseen [25] voidaan aktivoida demetylaation CpG-saarekkeiden ja H3K9me2 sisällä säätelyalueita.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen suun tasyöpäsolulinja, UM1 [52] ja sinkki-indusoituva OAZ transfektantin (pMT /CB6

+ HuFSAZ-wt) ja mock vektori transfektantissa (UM1-pMT /CB6

+) viljeltiin aikaisemmin kuvatulla tavalla [25]. Ilmentymistä OAZ geenin PMT /CB6

+ HuFSAZ-wt indusoitiin 100 uM ZnSO

4 hoitoa ja proteiini näytteet kerättiin yhden viikon kuluttua ZnSO

4 hoitoa.

ODC aktiivisuusmääritys

Voit tarkistaa, onko OAZ proteiini käännetty OAZ transfektantti oli biologisesti aktiivista proteiinia U1 soluissa, ODC entsymaattinen aktiivisuus määritettiin aikaisemmin kuvatulla [10]. Lyhyesti, ODC-aktiivisuus kvantitoitiin vapauttamiseen [

14C] CO

2 aikana ODC-katalysoitu muuntaminen L-ornitiini on putreskiiniä. Reaktioseos sisälsi 50 ui solu- lysaattia valmistettu OAZ transfektantti ja mock vektori transfektantin kanssa ja ilman ZnSO

4 hoitoa, 75 ui 100 mM glysyyli-glysiini (pH 7,2), 0,2 mM pyridoksaalifosfaattia, 4 mM ditiotreitolia , 0,4 mM L-ornitiini, ja 0,25 uCi [

14C] L-ornitiini. Reaktiot suoritettiin 37 ° C: ssa 2 tunnin ajan ja pysäytettiin kuumentamalla 85 ° C: ssa 5 min. [

14C] CO

2 jäi loukkuun Whatman 3 mm: n paperi suodatin täplikäs nokkeluus 10 ui 10% w /v KOH ja kvantifioidaan tuikelaskurilla. Kolmena kappaleena määritykset suoritettiin. Kontrollinäyte oli tyhjä sisältävä hajotuspuskuria sijasta supernatantissa. Korjattu ODC toiminta-arvot saatiin vähentämällä arvot tyhjäksi ja totesi pikomoolia CO

2 tunnissa per milligramma proteiinia. Tilastollinen analyysi suoritettiin Yksi tekijä ANOVA.

HPLC-analyysi

solunsisäinen määrä ODC, polyamiinien, SAM, dcSAM ja SAH (S-adenosylhomecysteine) kvantitoitiin käänteisfaasi-HPLC-analyysi . Koko solulysaatteja OAZ transfektantti ja mock vektori transfectat kanssa ja ilman ZnSO

4 hoitoa valmistettiin 0,2 M perkloorihappoa. Solulysaatit sentrifugoitiin 13000 x g 10 min ja supernatantit altistettiin käänteisfaasi-HPLC-analyysillä Supercosil LC-18-DB kolonnia (4,6 x 250 mm, 5 um huokoskoko), joka oli tasapainotettu 0,2% trietyyliamiinia, fosfori- (pH 4,0). Eluutio saavutetaan 20 min lineaarinen gradientti 0-10% asetonitriiliä. Eriä tehtiin kromatografinen erotus. Standardit ODC, polyamiinien, SAM ja SAH ostettiin Sigma-Aldrich. Standardi dcSAM oli ystävällinen lahjoitus tri Keijiro Samejima of Josai yliopistossa Japanissa.

Western blot-analyysi metyyli-histoni hännät

metylointi tilan kunkin histoni hännät varmistettiin western blottauksella . PROTIN näytteet western blot analyysit histoni hännät valmistettiin suoraan lisäämällä 500 ui Laemmlin SDS-näytepuskuriin osaksi 100mm viljelylevyltä ja solut kerättiin romuttamalla kanssa kumikaavinta. Kerätyt solut keitettiin 15 minuuttia näytepuskurissa ja sentrifugoitiin 16000 X g 30 minuuttia. Proteiini määrä arvioitiin solujen määrä jäljennetyn kulttuuriin. Uutettu proteiinien vastaa 1 x 10

5-5 x 10

5-solut ladattiin ja erotettiin 15% SDS-PAGE-geelissä, siirrettiin PVDF-membraanille, blokattiin 5% maitoa TBS-T-puskuria, ja blotattiin vasta-aineen kukin suositellulla laimennuksen valmistaa. Signaalit kehitettiin Piercen SuperSignal® West Pico kemiluminesenssisubstraatilla ja nimikirjoituksella filmille. Poistaa mahdollinen artefakti aiheuttama sinkin, me toisti samat kokeet, joissa käytetään pCI-neo-hOAZ tarsnfectants PCI (-neo-hOAZ-UM1). Vasta-aineet Tässä tutkimuksessa käytetyt ostettiin Upstate Biotechnology. Vasta-aineet ja niiden luettelo numerot; pan-histoni H3 (07-690), pan-histoni H4 (05-858), H3K4me1 (07-436), H3K4me2 (07-030), H3K4me3 (07-473), H3K9me1 (07-450), H3K9me2 ( 07-441), H3K9me3 (07-442), H3K27me1 (07-448), H3K27me2 (07-452), H3K27me3 (05-851), H3K36me1 (05-800), H3K36me2 (07-369), H3K36me3 (05 -801), H3K79me2 (05-835), H4K20me1 (05-735), H4K20me2 (07-367), H4K20me3 (07-463). Toissijainen vasta-aineita käytettiin HRP-leimattua vuohen anti-hiiri-IgG (PerkinElmer, NEF822001EA) ja HRP-leimattua vuohen anti-kani-IgG: tä (PerkinElmer, NEF812001EA). Voimakkuus kunkin kaistan mitattiin ja analysoitiin käyttämällä ImageJ ohjelmisto tarjoaa NIH (https://rsb.info.nih.gov/ij/).

Quantitative real-time PCR määritys DNMTs ja G9a

Expression tason DNMTs ja G9a mRNA: n määrä määritettiin kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qRT-PCR). Kokonais-RNA eristettiin OAZ ja mock vektori transfektantteja käyttäen TRIzol® reagenssia (Invitrogen) noudattamalla valmistajan protokollan. PCR-alukkeet suunniteltiin käyttäen MacVector versio 7.2-ohjelmisto, joka perustuu cDNA-sekvenssit, jotka on ladattu NCBI-tietokannasta. QRT-PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen LightCycler LightCycler- FastStart DNA Master SYBR Green I kit. Monistaminen näytteestä cDNA seurattiin fluoresoivalla DNA: ta sitovan väriaineen SYBR Green yhdessä ABI 5700 järjestyksessä tunnistusjärjestelmä. β-aktiini käytettiin endogeenisen ohjaus normalisointi. PCR-alukesekvenssit, optimaalinen hehkutuslämpötiloja, ja amplikonin koot on lueteltu taulukossa 1. Tilastollinen analyysi suoritettiin Yksi tekijä ANOVA.

Western blot-analyysi DNMTs ja G9a proteiinien

tumauutteesta valmistettiin OAZ ja mock vektori transfektantteja käyttäen NE-PER® ydin- ja Sytoplasmiset Extraction reagenssit (Thermo Scientific) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Viisikymmentä ug tumauutetta kustakin näytteestä ladattiin ja erotettiin 5% SDS-PAGE geelillä ja proteiini siirrettiin PVDF-kalvolle. Sen jälkeen western-blottaus suoritettiin, kuten on kuvattu edellä. Vasta-aineet, joita käytetään tässä tutkimuksessa olivat kaniinin polyklonaalista anti-ihmis-DNMT1-vasta-ainetta (Abcam, ab19905, 1:500), kanin-polyklonaalista anti-hiiri-DNMT3A-vasta-ainetta (Abcam, ab23565, 1:200), kaniinin polyklonaalista anti-hiiri- DNMT3B vasta-ainetta (Abcam, ab16049, 1:300) ja kanin polyklonaalista anti-ihmisen G9a vasta-ainetta (Upstate Biotechnology, 07-551,1:1,000). Tasavertainen määrä näytteen lataaminen seurattiin ja vahvistettiin Oct-1signal käyttäen kaniinin polyklonaalista anti-ihmisen Oct-1 vasta-aineella (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-232, 1:1,000).

DNMT entsyymi aktiivisuusmääritys

DNMT entsyymin aktiivisuus määritettiin menetelmällä Belinsky et ai vähäisin muutoksin [53]. Solulysaattia valmistettiin lyysipuskurissa jäädyttämällä ja sulattamalla kolme kertaa ja sentrifugoitiin solujätteen poistamiseksi. Solulysaatti, joka sisälsi 20 ug proteiinia (125 ui) sekoitettiin 125 ui reaktioseosta (20 mM Tris-HCI, pH = 7,4, 25% glyserolia, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 5 uCi [metyyli-3H] -S-adenosyyli -L-metioniini, 4 ug poly [dI-dC] poly [dI-dC], 25 ug BSA) ja inkuboitiin 2 tuntia 37 ° C: ssa. Reaktiot pysäytettiin ja DNA uutettiin fenoli: chrolform uutolla. Vesipitoinen liuos, jota oli täydennetty 0,1 NaOH: lla ja inkuboitiin 2 tunnin ajan 50 ° C: ssa. Reaktioseos neutraloitiin 1N HCl: llä. DNA saostettiin 20% TCA ja loukkuun G /C-suodatin. Radioaktiivisuus laskettiin tuikelaskurilla.