Krooninen sairaus

tiivistelmä

mesenkymaaliset kantasolut rasvakudoksesta (ADSCs) ovat tärkeä solujen regeneratiivisen lääketieteen . Terapeuttinen vaikutus kulttuuriin laajennettu rasvakudoksen kantasoluja on osoitettu; kuitenkin, optimaalinen xeno vapaa viljelyolosuhteet ovat vielä määrittämättä. Syöpäpotilaat, erityisesti niitä, joille tehdään invasiivisia leikkaus, muodostavat potilaiden alaryhmässä, jotka voisivat hyötyä autologisen kantasolusiirron. Vaikka uusiutumispotentiaali niiden ADSCs voi vaikuttaa sairauden ja /tai hoitoon, emme ole tietoisia mistään tutkimus, joka on arvioinut terapeuttista potentiaalia ADSCs eristettyjen syöpäpotilaiden viittaus kuin ADSCs peräisin terveillä koehenkilöillä. Kirjoittajat raportoivat, että ADSCs eristetyt subabdominal rasvakudos sairastavien potilaiden urologisiin kasvaimet olivat samanlaiset kasvukinetiikat esitteli vastaava mesenkymaalisten pintamerkkiaineita ja osoitti vastaavia erilaistumista potentiaali erillisiin mesodermal solulinjojen: rasvasolut, kondroblasteiksi ja osteoblastien kuin ADSCs eristettiin rasvakudoksesta ikä- Hyväksytty ei-onkogeenisiä osallistujia, kaikki alle ksenotransplantaatiolla vapaa kasvua viljelyolosuhteissa. Molecular karyotyping potilaan laajennetun ADSCs genomien osoittanut mitään sairauteen liittyviä muutoksia osoittaa niiden turvallisuus. Lisäksi, vesikkelit 100 nm todettu eksosomeiksi (Exos), joka voi olla ainakin osittain vastuussa johtuvan terapeuttisia parakriinisen vaikutuksia ADSCs oli tehokkaasti eristettiin ADSCs ja osoitti yhtä miRNA sisältöä riippumatta ne olivat peräisin syöpäpotilaiden tai ei- onkogeeniset osallistujat osoittaa, että korjaus ominaisuuksia ksenotransplantaatiolla vapaa laajeni ADSCs ei vaaranneta potilaan tilasta ja sen vuoksi niiden ksenotransplantaatiolla vapaa kulttuuri laajeni ADSCs tulisi soveltua autologisen kantasolusiirron kliinisessä ympäristössä.

Citation: García -Contreras M, Vera-Donoso CD, Hernández-Andreu JM, García-Verdugo JM, Oltra E (2014) terapeuttinen potentiaali Ihmisen Adipose-kantasoluja (ADSCs) syöpäpotilaista A Pilot Study. PLoS ONE 9 (11): e113288. doi: 10,1371 /journal.pone.0113288

Editor: Carlos Eduardo Ambrósio, Faculty of Animal Sciences ja Food Engineering, University of São Paulo, Pirassununga, SP, Brazil, Brazil

vastaanotettu: huhtikuu 11, 2014; Hyväksytty: 21 lokakuu 2014; Julkaistu: 20 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 García-Contreras et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Valencian (myöntää AP-014-10 ja AP-222-11 ja JMHA), Universidad Católica de Valencia ” San Vicente Mártir ”(avustus 2012-006-010 kohteeseen JMHA) (avustukset 2011-011-02, 2011-011-04 ja 2012-011-008 ja EO), ja AITEX Institute of Technology (avustus 2011-011-015 ja EO). MGC sai apurahan Universidad Católica de Valencia ”San Vicente Mártir”. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kaikki kirjoittajat ovat ilmoittaneet ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ihmisen rasvakudoksessa on runsas ja helposti lähde multipotentteihin mesenkymaaliset kantasolut (MSC), joka pitää suuret mahdollisuudet terapeuttinen sovelluksia regeneratiivisen lääketieteen ja kudosteknologian [1] – [3]. MSC: t on osoitettu kykenevän erilaistumaan useita solutyyppejä päässä mesodermal linjan (osteoblastit, kondrosyytit ja rasvasolut), mutta myös osaksi ei-mesodermal linjan solujen (neuronien, sydänlihassolut ja ektodermaalinen iho) [4] – [7], vähentää tulehdusta in vahingoittuneita kudoksia, stimuloivat angiogeneesiä ja vähentää apoptoosin [8] – [11]. MSC: t rooli modulaatio kudosten korjaamiseen ja immunomodulaatio syyksi on niiden paracrine tekijä eritystä potentiaalia, mitokondrioiden siirto ja eksosomi (EXO) eritys kapasiteetin [12] – [14]. Exos erittyy bilipid membraanivesikkeleitä ja ~50-100 nm kompleksin lasti, jotka ovat helposti sisäistää kohdesolujen indusoimalla monipuolinen fysiologisia vaikutuksia [15] – [17].

Ajan tasalla eri menetelmiä eristäminen ja laajentaminen MSC: eiden on sovellettu. Useimmat ovat eläinperäiset tuotteet, kuten naudan sikiön seerumia, joka on lähde kontaminoivien virusten, bakteerien, mykoplasmojen, prioneja ja muita patogeenisia tai toksisia aineita, ja ksenogeenisten antigeenejä, jotka saattavat sora- ei-toivottuja immuunivasteita, [18], [19]. Ksenotransplantaatiolla vapaa kulttuuri voisi parantaa turvallisuutta ja laatua siirrettyjen

in vitro

-expanded kantasolujen [20], [21] ja mahdollistaa luoda yhtenäisiä laajennus menetelmiä, välttäen erä-erien vaihtelut. Kuitenkin uutuus ja suuri hintaero määrää rajoitetaan tutkimuksissa on käytetty ksenotransplantaatiolla väliaineessa asti.

Vaikka allogeeninen infuusio

in vitro

laajennettu MSC: näyttää lupaava vaihtoehto tiettyihin tarkoituksiin [22] – [25] useimmat käynnissä tai valmis kliinisissä tutkimuksissa tasalla perustuvat autologisten hoidoista [26]. Tässä mielessä korkea ikä ja tautitila saattaa rajoittaa yksilöiden vaihtoehtoja, varsinkin kun numero ja uusiutumispotentiaali MSC: eiden näyttävät negatiivisesti korreloivan ikä [27], [28] ja väestön ikääntyminen on lisäys.

Urologisessa syöpäpotilaat ovat hyviä ehdokkaita kantasolun terapeuttisten. Kantasoluterapian suunnataan edistää paranemista jälkeen invasiivisen kirurgian menettelyt he joutuvat usein tai suunniteltu vähentämään virtsankarkailu, yhteinen toissijainen ongelma liittyy eturauhasen voi aiheuttaa hyötyä niistä. Myös

in vitro

laajentunut autologisten MSC: voitaisiin käyttää ohjelmoitua elimen remontin leikkauksia tai jopa kokonainen elin suunnittelu elinsiirtoihin. Emme kuitenkaan ole tietoisia mistään Tutkimuksessa keskityttiin arviointiin terapeuttista potentiaalia ja turvallisuus urologian syövän MSC: eiden autologista siirtoa.

Täällä suoritimme vertaileva analyysi MSC: saatujen vatsan rasvaa urologian syöpäpotilaiden ja ei-onkogeenisen osallistujat laajennettu

in vitro

alle xeno vapaissa olosuhteissa yritetään määrittää niiden sopivuus autologiseen solupohjaisille hoitojen avulla optimaaliset olosuhteet klinikalla. Luonnehdinta mukana klusterin eriyttämisen (CD) ekspressiokuvioiden ja morfologia, kasvukinetiikat, plastisuus, Exos vapautumisen mittana MSC: paracrine terapeuttista potentiaalia ja turvallisuutta.

Materiaalit ja menetelmät

Näytteiden keräys ja etiikka lausuma

Tämä tutkimus aloitettiin hyväksymisen paikallisen eettisen komitean Hospital Universitario y Politécnico La Fe (Valencia, Espanja). Vastaleikattu vatsan rasvakudosta kerättiin potilailta, joille suoritetaan neoplastisia urologic leikkaushoitoa tai ei-onkogeenisiä osallistujat kuluttua vastaavien tietoisen suostumuksen allekirjoittamisen.

Oppiaineet

Kaikki näytteet jätemateriaalien kerätään puoli -tuote leikkaus, syöpäpotilaista (n = 5) tehtiin elektiivinen kirurginen vatsan menettelyjä laitoksella urologian, sairaala Universitario y Politécnico La Fe, (Valencia, Espanja) tai ei-onkogeenisiä samanikäisiin (± 5 y) osallistujaa ( n = 2), joilla on samanlainen etnisen taustan (taulukko 1). Non-onkogeenisiä osallistujat vastasi useiden elinten luovuttajia. Kaikki kuvatut menettelyt ADSCs sekä syöpäsairauksien ja muiden syöpäsairauksien potilaille, kuten, vastaavasti, testi- ja kontrollinäytteiden saatiin ja analysoitiin, ellei toisin mainita.

eristäminen ADSCs

eristäminen ADSCs suoritettiin käyttäen mekaanisia ja entsymaattisella menetelmällä. Rasvakudos kuljetettiin ja pestiin suolaliuoksella NaCl 0,9% (B. Braun, kissa. 12606097), hajanaista kirurgisella terä ja hajotettiin 1 mg /ml tyypin I kollagenaasilla (Life Technologies, kissa. 17100-017), 2 h 37 ° C: ssa ravistellen. Digestoitu kudos suodatettiin harson läpi, jotta se erottuisi pilkkoutumattomiin kudosten ja sentrifugoitiin 500 g: ssa 7 minuutin ajan huoneenlämpötilassa (RT). Supernatantti (kelluva rasvasolut) heitettiin pois. Pelletti (ADSC fraktio) suspendoitiin uudelleen Hankin tasapainotettuun suolaliuokseen (HBSS + Ca + Mg) (Gibco, Cat. 14025092) + 1% BSA: ta (Sigma, cat. A2153), suodatettiin 140 um nylon mesh ja sentrifugoitiin 500 g 7 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten solut suspendoitiin uudelleen erytrosyyttien hajotuspuskuriin jään päällä 10 minuutin ajan ja sentrifugoitiin uudelleen 500 g: ssa 7 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Eristetty Sitten solut maljattiin ja laajennettiin viljelyalustassa. Viljelyalusta oli MesenCult-XF Medium (StemCell tekniikoita, cat. 05420), jota oli täydennetty 1% (v /v) penisilliiniä /streptomysiiniä (10000 U /ml penisilliiniä, 10000 ug /ml streptomysiiniä, Gibco cat.15140-122), ja 2 mM L-glutamiinia (Gibco, cat. 25030-081).

in vitro

laajentamista ja näytteenotto ADSCs

ADSCs viljeltiin 37 ° C: ssa 5 % CO

2 ilmakehässä keskitason muutoksia 3 päivän välein. Kun solut saavuttivat noin 80% konfluenssin, jatkoviljely (passage) suoritettiin jaoteltuina käyttämällä MesenCult-ACF dissosiaatio Kit (StemCell tekniikoita, cat. 05426) (6 ml /pullo), 5 min, sen jälkeen pesu fosfaattipuskurilla (PBS ). Solut laskettiin ja uudelleen pinnoitettu viljelmässä T-75 pulloon tiheydellä 250,000 soluja. Dissosiaatio Liuos neutraloitiin käyttäen samaa tilavuutta MesenCult-ACF Enzyme Inhibition Solution (StemCell tekniikoita, cat. 05428). Solususpensiot sentrifugoitiin (500 g, 7 min) ja supernatantit heitettiin pois. Pelletit suspendoitiin uudelleen täydelliseen alustaan ​​ilmoitetuilla tiheys. Laskettiin tehtiin Neubauer kammioon käyttämällä trypaanisinieksluusiolla testi eläviä soluja (Sigma Aldrich, kissa. T8154). Ennen jokaista passage, viljelmät valokuva-dokumentoitu. Populaation kaksinkertaistumista (PD) laskettiin kaavalla

x

= [log

10 (NH) – log

10 (NI)] /log

10 (2), jossa NH on solujen sato määrä ja NI ympättiin numero kuten aikaisemmin on kuvattu [29]. Saadakseen kumulatiivinen väestön kaksinkertaistamista, väestö kaksinkertaistuu kustakin tapauksesta laskettiin ja sitten lisätään edelliseen kulkua väestöstä kaksinkertaistuu numero. Sitten solut altistettiin jatkotutkimuksissa lukien ultra-morfologia, erilaistuminen potentiaali, vanhenemista ja epitooppianalyysistä. Jotkut erät pelletoitiin ja varastoidaan -80 ° C: ssa RNA: n eristämistä.

Virtaussytometria

Noin 0,5-1 x 10

6 solua leimattiin seuraavasti fluoresoivasti leimattua anti -ihmisen vasta-aineita: CD73, CD90, CD105, CD34, CD11, HLA-ABC: n ja HLA-DR: n (taulukko 2) ja analysoitiin eri yhdistelmiä. Yhteenvetona soluja inkuboitiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa ja valolta suojattuna, pestiin (3 x) PBS: llä sentrifugoimalla 500 g: llä 4 ° C: ssa 7 min. Pestyt solut suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan PBS: ää. Leimatun analysoitiin virtaussytometrialla fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu-analyysi (FACS) (Beckman Coulter Cytomics, FC 500) fluoresenssi on kanavat jokaisen fluorokromiin. Käyrät laadittiin käyttämällä CXP analyysin ohjelmisto (Beckman Coulter).

adipogeenisellä erilaistuminen

adipogeenisten erilaistumista, soluja viljeltiin 6-kuoppaisille levyille, jotka sisälsivät 2 ml Mesencult-XF pohjapinta jota on täydennetty adipogeenisiksi stimuloivia lisäravinteet (MesenCult adipogeenisellä Elvyttävään ravintolisät (Human), kissa. 05403) 15 päivää, tavanomaisissa kasvuolosuhteissa (37 ° C, 5% CO

2). Kasvatusväliaine ei muuteta, ellei keskipitkän tuli keltainen /oranssi väri, jolloin puolen väliaine muutos tehtiin. Sen jälkeen, kun 15-päivän itämisaika, elatusaine poistettiin ja solut pestiin PBS: ssä. Kiinnitys 4% paraformaldehydillä (PFA) ja 30 min seurasi kaksi pesua tislatulla vedellä ja yksi 60% isopropanolia, kukin 5 minuuttia huoneenlämpötilassa. Adipogeeniset erilaistumista vahvistettiin Oil Red O värjäystä (Sigma, cat. O0625) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, soluja inkuboitiin Oil Red O väriaine huoneenlämpötilassa 10 min 2 ml: ssa. Väriaine poistettiin varovasti, ja levy pestiin neljä kertaa tislatulla vedellä. Sitten solut havaittiin käyttämällä optista mikroskooppia (Nikon Eclipse TE2000-U valo käännettyä mikroskooppia, Nikon Inc., Melville, NY, USA) ja valokuvattiin. Rasvasolut tunnistettiin solujen punaisella värjätään lipidirakkuloihin [4], [20], [30].

osteogeeninen erilaistuminen

Soluja viljeltiin kuusi kuoppalevyillä sisältää 2 ml MesenCult MSC Basal Medium (Human) (StemCell tekniikat, kissa. 05401), johon osteogeeninen Elvyttävään Supplement (StemCell teknologioita, kissa. 05405), β-Glyserofosfaatti 1M (StemCell teknologioita, kissa. 05406), deksametasoni (StemCell teknologioita, kissa. 05407) ja askorbiinihappoa (StemCell teknologioita, kissa. 07157) 15 päivää (osteogeeninen medium). Levyjä pidettiin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 ja kasvatusalusta vaihdettiin joka kolmas päivä. Sen jälkeen, kun 15 päivän aikana, elatusaine poistettiin ja solut pestiin PBS: llä. Kiinnityksen jälkeen solut PFA 4%, 30 minuutin ajan solut pestiin kolme kertaa tislatulla vedellä. Alitsariini S värjäys (Sigma, cat. A5533), käytettiin varmistamaan osteogeeninen erilaistuminen käyttämällä valmistajan protokollaa. Lyhyesti, soluja inkuboitiin 2 ml natrium- alitsariinia huoneenlämpötilassa 30 minuutin ajan. Väriaine poistettiin varovasti ja pesty tislatulla vedellä ja sen jälkeen. Kiinteä ja värjätty solut havaittiin käyttäen optista mikroskooppia (Nikon Eclipse TE2000-U käänteismikroskooppi, Nikon Inc., Melville, NY, USA) ja valokuvattiin [20], [30].

kondrogeenisten erilaistuminen

kondrogeenistä erilaistumista, soluja viljeltiin kuuden kuoppalevyillä, jotka sisältävät 2 ml täydellistä elatusainetta, johon oli lisätty StemPro kondrogeneesin Differentiation Kit (Gibco, cat. A10071-01) ja 15 päivää. Levyjä pidettiin kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 ja viljelyväliaine vaihdettiin joka kolmas päivä. Sen jälkeen, kun 15 päivän aikana, erilaistumisen väliaine poistettiin ja solut pestiin PBS: llä. Sitten kiinnitettiin 2% glutaraldehydillä 20 minuutin ajan ja pestiin kolme kertaa PBS: llä. Sitten soluja inkuboitiin Alcian sininen 8GX liuosta (Acros orgaaniset, cat. 400460100) yön yli huoneenlämpötilassa. Väriaine oli huolellisesti poistettu, ja levy pestiin kolme kertaa 0,1 M HCI: lla ja kahdesti PBS: llä. Kiinnityksen jälkeen ja värjäys, solut havaittiin käyttäen optista mikroskooppia (Nikon Eclipse TE2000-U käänteismikroskooppi, Nikon Inc., Melville, NY, USA) ja valokuvattiin [4], [20], [30].

Vanheneminen liittyy β-galaktosidaasi-värjäys

pH-riippuvainen vanhenemista liittyy β-galaktosidaasin aktiivisuus analysoitiin käyttäen SA-β-gal-värjäyksen kit (Cell Signaling Technology, cat. 9860) mukaan valmistajan protokollaa. Lyhyesti, soluja inkuboitiin juuri valmistettua vanhenemista liittyvä β-galaktosidaasi sinistymistä liuosta (X-gal), yön yli 37 ° C: ssa. Seuraavana aamuna solut havaittiin otettua kuvaa ja alle käänteisvalomikroskoopilla Nikon Eclipse TE2000-U (Nikon Inc., Melville, NY, USA).

RT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin viljellyistä soluista kanssa Mirvana miRNA eristäminen Kit (Ambion, cat. AM1560) valmistajan protokollan. RNA saannot ja puhtaus määritettiin 260/280 ja 260/230 nm suhteet kanssa Thermo Scientific NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific, Wilmington, USA). cDNA valmistettiin käyttäen 100-200 ng kokonais-RNA: n ja M-MuLV-käänteistranskriptaasia (New England Biolabs, cat. EP0352) oligo-dT-esikäsittely. CDNA monistettiin PCR: llä käyttämällä ABI GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer, Applied Biosystems, Boston, MA) ja seuraavat sykliolosuhteita: 94 ° C 30 s, 54-60 ° C (riippuen alukkeen Tm) 30 s ja 72 ° C: ssa 30 s (35 sykliä) jälkeen yhden alkudenaturaatio sykli 94 ° C: ssa 5 min. PCR-alukesarjat on esitetty taulukossa 3. PCR-tuotteet erotettiin 2% agaroosigeelissä ja visualisoitiin realsafe tahra.

qRT-PCR

Kokonais-RNA eristettiin ADSCs ja eksosomeiksi kanssa Mirvana miRNA eristäminen Kit (Ambion, kissa. AM1560) käyttäen valmistajan protokollaa. Reverse-transkriptio suoritettiin käyttäen miScript II RT Kit (Qiagen, cat. 218161) valmistajan ohjeiden mukaisesti. cDNA käytettiin reaaliaikaista PCR käyttäen miScript SYBR Green PCR (Qiagen, kissa. 218073). Sekvenssit eteenpäin käytettyjen alukkeiden on esitetty taulukossa 4.

eksosomi eristäminen

Exos puhdistettiin xeno-free soluviljelysupernatanttia rasvakudoksen kantasoluja ultrasentrifugoimalla. Supernatantti kerättyjen fraktioiden ADSC viljelmiä sentrifugoitiin 300 g: ssä 10 min, 2000 g 20 minuutin ajan ja 10000 g 20 minuutin ajan poistamaan suuria kuolleita soluja ja roskat. Sen jälkeen, suodattamalla 0,22 um: suodattimia poistaa epäpuhtaudet, lopullinen supernatantti ultrasentrifugoitiin 110000 g 70 min pelletti Exos. Talteen Exos pestiin PBS: llä ja sentrifugoitiin jälleen 110000 g 70 minuutin ajan. Pelletti suspendoitiin uudelleen 50 ul: aan PBS: ää, jotta saadaan konsentroitu EXO osa.

Western blot-analyysi

ADSCs ja Exos lyysattiin Tissue Protein Extraction Reagent (T-PER) (Thermo Scientific, cat. 78510) seuraavat valmistajan suositusten. Proteiinipitoisuudet mitattiin Bradfordin menetelmällä (Thermo Scientific Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay, cat. PI-23200). Näytteet sekoitettiin ei-pelkistävä Tris-glysiini-SDS-näytepuskuria, ja kuumennettiin sitten 95 ° C: ssa 5 minuuttia ja ladattiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelillä. Geeli ajettiin denaturoivissa olosuhteissa 80 V: ssa 2 h, sitten siirrettiin PVDF-kalvolle (GE Healthcare Life Sciences, cat. 0485288). Siirron jälkeen kalvoja blokattiin 3% rasvatonta maitoa PBS: ssä 2 tunnin ajan ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 2 tunnin ajan kaniinin anti CD63 (Abgent, cat. AP5333b). Pesun jälkeen PBS-T: n, membraaneja inkuboitiin 1 tunnin ajan vuohen anti-kani-HRP-kytketty sekundaarinen vasta-aine (Santacruz, cat. Sc-2004) ja kehitettiin Luminata Forte Western HRP-substraattia (Millipore, kat. WBLUF0500) käyttäen ImageQuant LAS 4000 kemiluminesoimaan ilmaisinjärjestelmän.

elektronimikroskopialla

hienorakenteen analyysiä, soluja kasvatettiin permanox- peitelaseille (8 kaivokammio dioja) tiheydellä 3,5 x 10

3-soluissa /kammio. Chambers pidettiin kosteutetussa inkubaattorissa (37 ° C, 5% CO

2), ja viljelyalusta vaihdettiin joka kolmas päivä, kunnes osa konfluenssiin. Sitten solut pestiin kolme kertaa juuri valmistetulla välineellä kerran PBS: llä ja kiinnitettiin sitten 3,5% glutaraldehydillä 30 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Kiinnite-liuos poistettiin ja solut pestiin kahdesti PBS: llä. Solut jälkikiinnitettiin 2% OsO

4 30 minuuttia huoneen lämpötilassa ja värjättiin 2% uranyyliasetaatilla pimeässä 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Lopuksi solut poistettiin vesi etanolissa, huuhdellaan propyleenioksidin (Lab Baker, Deventry, Hollanti) ja sulautettujen yön yli Araldite (Durcupan, Fluka, Buchs SG, Sveitsi). Kun polymerointi, sulautetut viljelmiä irrotettiin kammiosta dia ja liimattu (Super liimaa, Loctite) ja Araldite lohkoja. Semi-ohuita leikkeitä (1,5 um) leikattiin kanssa ultramikrotomilla (Ultracut UC-6, Leica, Heidelberg, Saksa) kiinnitettiin objektilaseille ja värjättiin 1% toloudine sininen. Ultrathin osat (70 nm) valmistettiin kanssa ultramikrotomilla ja värjättiin lyijyä sitraatti. Kuvat saatiin transmissioelektronimikroskoopin (FEI Tecnai Spirit G2, Eindhoven, Hollanti), digitaalisella kameralla (Morada, Soft Imaging System, Olympus).

Puhdistetut Exos fiksoitiin 1% glutaraldehydillä PBS: ssä . Huuhtelun jälkeen, 20 ui pisara suspensiota ladattiin formvar /hiili-pinnoitettu verkkoon, värjättiin negatiivisesti 3% (w /v) vesiliuoksella fosfovolframihappoa 1 min, ja havaittiin transmissioelektronimikroskopialla (TEM) on Tecnai spirit G-2 laitteessa; (FEI, Eindhoven, Alankomaat).

Molecular karyotype

Affymetrix CytoScan750 paneelit käytettiin arvioitaessa kopioluvun voittoja ja tappioita Heterotsygoottisuuden (LOH) in ADSCs näytteitä potilaista ja ei-onkogeenisia osallistujat . Nämä paneelit sisältävät yli 2,6 miljoonaa kopioluku markkereita, jotka 750000 ovat ”genotyyppi-pystyy” SNP ja 1,9 miljoonaa eivät ole polymorfisia antureista. DNA uutettiin ADSCs kunkin kahden onkologisen potilaan näytettä analysoitiin, käyttäen QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, cat. 51306), valmistajan ohjeiden mukaisesti. DNA määrä ja laatu mitattiin spektrofotometrillä NanoDrop ND-2000 (Thermo Scientific) absorbanssilla suhteet 260/280 nm. Eheys kokonais-DNA mitattiin 0,8% agaroosigeelielektroforeesilla. Kopioi numero ja genotyypityksen analyysit suoritettiin käyttäen Affymetrix Kromosomianalyysit Suite (Chas) ohjelmisto on Array Service, Genomic yksikkö IIS La Fe.

Tilastollinen

Data analysoitiin parittomia 2-tailed opiskelijan

t

testiä tai Multiple t-testi, kuten on osoitettu. Holmin-Sidak menetelmää korjausta käytettiin määrittämään merkitystä erojen monivertailuja. Data vastasi keskiarvoja ± SD vähintään kolme riippumatonta rinnakkaista. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, USA); arvot

p

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Väestö ja solusaanto

Potilaan keski-ikä oli 60, välillä 38 ja 72 vuotta, (n = 5), ja ei-onkogeenisen osallistujien keski-ikä oli 59, vaihteluväli 41-77, (n = 2) (taulukko 1). Potilaat kärsivät munuaisten, virtsarakon tai eturauhasen syöpiä ja tervettä kudosta tuli luovuttajilta, jotka kärsivät vahingossa traumaattinen kuolema.

Keskimäärin rasvakudoksen johdettujen kantasolujen saanto Alkuperäisten laajeneminen oli (2,28 ± 4,62) x 10

5 ja (3,10 ± 5,4) x 10

5 solua per grammaa kudosta joko potilaan tai ei-onkogeenisiä osallistujia, vastaavasti. Saannot vaihtelivat suuresti, joilla on taipumusta saada alemman tuottavuuden suuremmat kappaleet kudoksen (taulukko 1).

Kasvupotentiaalia ja vanhenemista

tutkimiseksi solun kasvupotentiaalia solujen joko osallistujajoukon, populaation kaksinkertaistumista (PD) kunkin näytteen määritettiin jokaisessa passage jopa passage 6, joka vastaa päivä 58 viljelmässä keskimäärin (kuvio 1). Ero potilaiden (6,292 ± 1,394) ja luovuttajan (4,869 ± 1,801) PD ei ollut merkitsevä (p 0,5), määritettynä parittomalla t-testillä tietojen analysoinnin. Semi-yhtymäkohta at passage 1 vaihtelivat noin 3,6 ± 1,2 PD potilaille ja 2,02 ± 1,7 PD ei-onkogeenisiä osallistujia (kuva 1), jolloin myös aikaisempien raporttien [31] – [33].

Tulokset esitetään kun kumulatiivinen jäsenöittäminen kaksinkertaistunut of ADSCs peräisin viidestä eri syöpäpotilaiden ja kaksi ei-tuumorigeeniset osallistujaa (luovuttajien) alle ksenotransplantaatiolla vapaa viljelyolosuhteissa. Solujen lukumäärät määritettiin lopussa jokaisen kanavan ja kumulatiivinen populaation kaksinkertaistumista laskettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät.

Vaikka mitään epänormaalia kasvua käyttäytyminen syöpäpotilaan ADSCs havaittiin, oli tärkeää selvittää nämä solut voivat esittää mitä tahansa kasvun etuja kauemmin kulttuuriin aikoja. Jotta voitaisiin arvioida laajennus-aikaan liittyvät solujen vanhenemista, kaksi analysoiduista näytteistä, jotka vastaavat potilaiden 1 ja 2 olivat edelleen kasvatettiin myöhäiseen kohtia, erityisesti jopa kulun 10 ja 8 vastaavasti. Kasvun jälkeen kanava 10 viljelmässä ei ollut enää eksponentiaalinen (kuvio 1) osoittaa, että rajallinen kasvumahdollisuudet alla kasvuolosuhteissa käytetty. Vanheneminen määritettiin muutokset β-galaktosidaasin aktiivisuus varhaisen

vs

myöhään kohtia. Kuten kuviossa S1, β-galaktosidaasi aktiivisuutta lisääntyi kulkua. Suurin osa soluista alussa kohdissa eivät esittäneet näyttöä käsittelyä varten kromogeenisen X-gal alustalle kuten soluja myöhemmin kohtia teki. Tämä lisäys β-gal värjäys välillä aikaisin ja myöhään kohtia (0,0390 ± 0,0046 vs. 0,1717 ± 0,0181) oli merkitsevä (p 0,005). Tämä viittaa siihen, että monistus vanhenemista MSC: eiden on jatkuva ajasta riippuvainen prosessi, kuten aiemmin on ehdotettu [31], myös ADSCs saatu syöpäpotilailla.

Lisäksi arvioimme vanhenemista liittyvä prosessi autophagy RT -PCR analyysi autophagy liittyviä geenejä. Myöhään kohtia (kohdat 8-10) mRNA ekspressiotasot Atg5 ilmestyi voimistunut (1,61 ± 0,04-kertainen), kun taas Atg7 lievästi esti (-1,10 ± 0,03-kertainen) ja Beclin1 tasoilla osoitti selvästi downregulation (-10,80 ± 0,03) (Kuva S1 C). Havaittu suurten kertyminen autophagosomes, näillä myöhään kohtia, osoituksena ultraestructural analyysi niiden cytoplasms (kuva S1 D, E) samaan aikaan vähenemiseen kasvuvauhdin viittaa siihen, että kasvu autophagy myöhään kulkee kumppaniaan monistus vanhenemista, kuten aiemmin raportoitu [34] – [36]. Se, että ADSCs potilailta senesce kun kulttuuri osoittaa, että ne eivät ole tuumorigeenisiä.

Morfologia

tarkastella mahdollisia morfologisia muutoksia välillä ei-onkogeenisiä osallistujia ja neoplastisia potilaan ADSCs eri kohtia, arvioimme niiden morfologiset ja ultra-rakenteellisia piirteitä by faasikontrastimikroskopiaan ja siirto (TEM) jokaisessa passage jopa passage 4, joka on suositeltu kulku terapiaan [37]. Kuvat paljasti kaikki solut oli kara ja moninapainen muoto morfologia. Ei morfologista eroa solujen joko osanottajien ryhmän havaittiin (kuvio 2 A, B).

edustaja faasikontrasti- kuvia

in vitro

laajentunut ADSCs syöpäpotilaista (A) ja non -tumorigenic osallistujaa (luovuttajat) (B) passage 4, ja toluidiinisinivärjäystä of semithin osien saman soluja (C ja D, vastaavasti) (suurennos 20X).

Semi-ohuita leikkeitä teki ole mitään merkittävää morfologisia eroja joko, jossa useimmat solut esittää yhden ytimen (kuva 2 C, D). Ytimet sisälsi yhden tai kaksi nucleoli ja runsas nucleoplasm. Solut olivat ehjät kalvot kanssa valejalka rakenteiden pinnalla ja ehjä organelle rakenteita. Karkea solulimakalvostossa (RE) ja mitokondrioita havaittiin sekä sisä- reuna endoplasmic alueilla. Perifeerinen vyöhykkeet näytteillä puuttuessa soluelimiin mutta sisälsivät onteloita ja rakkulat.

lisätä resoluutio saimme siirto elektronimikroskoopilla kuvia kummankaan ryhmän ADSCs. Solut passage 2 osoitti runsasta ja laajennettu karkea RE, lukuisia Golgin cisternae ja suuri määrä dictyosomes jaettu pitkin sytoplasmaan, että sisälsi myös mitokondrioita, lipidi- pisaroita ja runsas filamenttikimppuja (kuvio 3 A, B). Electrodense elinten havaittiin myös vierestä dictyosomes.

ADSCs syöpäpotilaista klo passage 2 (A) ja passage 4 (C) osoittavat cytoplasms rikastettu organellit ja suuri tuma (N) kanssa löysästi pakattu chromatin. Yksityiskohtaisesti on ADSC kanavasta 2 (B) esittää organelle rikastamiseen, karkea endoplasmakalvoston (nuolet) ja suuret Golgi cisternae (tähti) joitakin lipidejä tippaa (Li). ADSCs at passage 4 (C) osoittavat näkyvästi ydinvoiman kohtiin, (nuolet) ja laajentuneen nucleoli (Nu). Pienillä suurennus osoittaa myös runsas elektro-tiheä organelles. Suurennettuna runsas karkea Endoplasmakalvosto cisternae, rasva-tippaa (Li) ja runsas kalvo rakenteita tai autophagosomes arvostetaan (D). Mittakaava 10 um (A-C); 1 um (B-D).

ytimet sisälsi yhden tai kaksi nucleoli ja esitetään löysästi pakattu kromatiinin, joskus osoittaa syvä kohtiin, ja runsas nucleoplasm. Tällä kanavan 4, solut osoittivat joitakin pieniä eroja suhteessa kanavan 2, mukaan lukien korkeampi taipumus riippuvaiseksi ytimiä, suurempi nucleolus ja lisätä määrä filamenttien kimppuja ja määrän electrodense kalvomainen elin kaltaisia ​​rakenteita tai autofagosomes (kuvio 3 C, D). Ei kuitenkaan laadullisia eroja voitaisiin arvostaa ryhmien välillä, jotta voimme päätellä, että ADSCs syöpäpotilaista ovat samat kuin ei-onkogeenisiä osallistujaa morfologisiin tasolla.

immunofenotyypin

Jotta vahvistavat, että laajennettu ADSCs noudattanut minimaalinen mesenkymaalisten perusteiden mukaan International Society for Cellular Therapy [38] suoritimme virtaussytometria-analyysi ADSCs potilailta ja ei-onkogeenisen osallistujia passage 4 (kuvio 4 A-G ja kuva S4 A- F).

edustajan virtaus fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) ja RT-PCR-analyysi

in vitro

laajennettu ADSCs syövän potilaille, joilla on kanavan 4. Solut olivat positiivisia CD105 (A), CD73 (B), CD90 (C), CD29 (H-6), CD44 (H-7) ja HLA-ABC (F), mutta eivät ilmennä CD11 (D), NODAL (H-3), UTF1 (H-4 ), ABCG2 (H-5), tai HLA DR (G); kun taas CD34 oli osittain positiivinen (E), kuten aiemmin on kuvattu. Kaistat H-1 ja H-2 esittävät RT-PCR-monistaminen talon pitäminen geenit GAPDH ja β-aktiini, vastaavasti.

Kuten odotettua, solut olivat positiivisia mesenkymaalisten CD73, CD90 ja CD105 markkereita ja negatiivinen hematopoieettisten merkki CD11b. Lisäksi ne olivat positiivisia histocompability antigeeni luokka I HLA-ABC mutta ei ilmaissut HLA-DR pinnan molekyyleihin alle stimuloimattomasta tilassa, kuten aiemmin on kuvattu [38]. Yllättäen CD34, merkkiaine hematopoieettisten ja endoteelin esisolujen [39], oli positiivinen 3-12% soluista.

suoritettiin myös RT-PCR-analyysiä varten ylimääräisiä mesenkymaalisten ja pluripotentti- markkereita. Mesenkymaaliset CD44 ja CD29 merkkiaineet olivat selvästi positiivinen, kun ei monistuminen pluripotenttisuus NODAL ja UTF 1 merkkiaineita saatiin. Olemme myöskään monistamaan monelle vastus liikenteen proteiini ABCG2 joka on pluripotenttisuus merkki aiemmin liittyy alapopulaation MSC: kanssa neurologisesta potentiaalia [40], mikä viittaa mahdolliseen rajoitus näiden solujen terapiaan hermokudoksen. Antigeeni pinta-profiilit on kuvattu olivat samanlaiset MSC-potilaiden ja ei-onkogeenisiä osallistujat (tuloksia ei ole esitetty).

Cell plastisuus

plastisuus laajennetun ADSCs määritettiin niiden erilaistumisen potentiaalin. Solut passage 4 joko potilaiden tai valvontaa viljeltiin eriytyvät median, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Solut Adipogeeniset väliaine sisälsi runsaasti onteloita jaettu pitkin niiden cytoplasms, kuten on esitetty Oil Red O värjäytymistä (kuvio 5 A, D), mikä osoittaa, että erilaistumisen adiposyyteiksi oli tapahtunut. Osteogenesis oli osoituksena läsnä aggregaattien kanssa kyhmyn kaltaisia ​​rakenteita, jotka värjättiin alitsariinipunaisella havaitsemiseksi mineralisoitumista (kuvio 5 C, F). Kondrogeenistä erilaistumista arvioitiin käyttämällä Alcian Blue värjäystä joka paljasti korkea pitoisuus ruston erityisiä proteoglykaanien viljelmissä (kuvio 5 B, E). ADSCs sekä potilailla, (kuvio 5 A-C), ja ei-onkogeenisiä osallistujat (kuvio 5 D-F), olivat yhtä kykenee tehokkaasti erilaistumaan adipogeeniseksi, rustonmuodostuksen ja osteogeeninen suvusta osoittaa, että ADSCs johdettu meidän syöpäpotilailla on samanlaisia ​​solu plastisuus