Krooninen sairaus

tiivistelmä

ETV1

yliekspressoituu osajoukko kliinisen eturauhasen syöpien fuusiona transkriptio monia eri kumppaneiden kanssa. Kuitenkin,

ETV1

voidaan myös yli-ilmentyy kuin täyspitkä transkripti. Täyspitkä ETV1 proteiini toimii eri tavalla typistetty ETV1 tuottaman -fuusiogeenit. Tässä tutkimuksessa kuvaamme geneettisen taustan täyspitkän

ETV1

yli-ilmentymisen ja biologiset ominaisuudet eri täyspitkän ETV1 isoformien eturauhassyövässä. Break-erilleen FISH osoitti viidessä kuudesta potilaan näytteitä yliekspressioon täyspitkän

ETV1

perimän uudelleenjärjestely geenin, joka ilmaisee usein translokaatio. Pystyimme tutkimaan uudelleenjärjestelyihin tarkemmin kaksi kasvaimia. Ensimmäisessä kasvain 5′-RACE cDNA-osoittivat sidos täydellisen

ETV1

transkriptio ensimmäiseen eksoni eturauhasspesifinen kaksi eksonin ncRNA geeni, joka kartoittaa kromosomissa 14 (

EST14

) . Tämä johti ilmaisu sekä täyspitkän

ETV1

selostukset ja

EST14-ETV1

fuusio selostukset. Kromosomissa levitteet ksenografti johdettu toisesta eturauhassyövän havaitsimme monimutkainen

ETV1

translokaatio, johon liittyy kromosomi 7 fragmentin, jossa sijaitsee

ETV1

ja fragmentit kromosomien 4 ja 10. Lisätutkimukset paljastivat yliekspressio useilla eri täyspitkä transkriptien, synnyttää neljä proteiini-isoformit, joilla on erilaiset N-terminaalisia alueita. Lyhyimmätkin isoformin syntetisoida täyspitkä

ETV1

stimuloidaan

in vitro

kiinnittymisestä riippumatonta kasvua PNT2C2 eturauhasen soluja. Tämä poikkeaa puute aktiivisuuden lyhyin N-katkaistu ETV1 tuottaman fuusio selostukset. Meidän havainnot, joita kliinisissä eturauhassyövän yli-ilmentymisen täyspitkän

ETV1

johtuu genomista uudelleenjärjestelyt, joihin liittyy eri kromosomien ja tunnistaminen lyhennettyä biologisesti aktiivisen ETV1 isoformia ovat erittäin ymmärtämisen kannalta mekanismi ETV1 toiminto eturauhassyövässä .

Citation: Gasi D, van der Korput HA, Douben HC, de Klein A, de Ridder CM, van Weerden WM, et al. (2011) yli-ilmentyminen Full-Length

ETV1

Transkriptejä Kliinisen Eturauhassyöpä johtuen Gene translokaatio. PLoS ONE 6 (1): e16332. doi: 10,1371 /journal.pone.0016332

Toimittaja: Andrew Wilber, Southern Illinois University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 05 syyskuu 2010; Hyväksytty: 10 joulukuu 2010; Julkaistu 26. tammikuuta 2011

Copyright: © 2011 Gasi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Marie Curie Grant (Cancure), jota Euroopan unioni. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Gene fuusiot ovat tärkeitä kehityksen monia hematologisten maligniteettien ja sarkoomat, mutta ne ovat harvinaisia ​​useimmissa muissa elimissä [1]. Kuitenkin usein fuusio välillä

TMPRSS2

ja ETS geeni

ERG

osoitti, että geeni fuusio on erittäin merkittävä tapahtuma eturauhassyövän [2], [3]. Yli-ilmentyminen

TMPRSS2-ERG

fuusio geeni on raportoitu 40-70% eturauhassyövän tapauksista [2] – [5]. Fuusiot

TMPRSS2

ja kolme muuta geeniä, jotka koodaavat ETS transkriptiotekijöitä,

ETV1

,

ETV4

ja

ETV5

, jotka sijaitsevat eri kromosomeissa, tapahtuu matalilla taajuuksilla eturauhassyövässä [2], [6], [7]. Kuitenkin

ETV1

vähintään 10 erilaista fuusiokumppanit on kuvattu [8] – [10]. Useimmat näistä on yhteistä, että kuten

TMPRSS2

, ne ovat eturauhasen-erityinen ja androgeenisäädellyn ilmaistu. Ominaisuudet fuusiokumppanit ovat keskeisiä tekijöitä selitettäessä androgeenisäädellyn yliekspressio ETS onkogeenin eturauhassyövässä. Kuitenkin ainutlaatuinen ominaisuus

ETV1

on, että se ei voi vain yliekspressoituvan eturauhasen syöpä fuusiona transkriptio mutta myös täyspitkä villityypin transkripti.

suuri perhe ETS transkriptiotekijät on 27 jäsentä [11] – [13]. Kaikki jäsenet on yhteistä erittäin homologisia DNA: ta sitovan domeenin, ETS verkkotunnus. Loput alueet useimpien ETS proteiineilla rajallinen rakenteellinen homologia. ETV1, ETV4 ja ETV5 ovat jäseniä pienen alaryhmän rakenteellisesti läheisten ETS proteiineja. Nämä proteiinit sisältävät N-pään alue konservoituneen lyhyt hapan transaktivaatiodomeenin (TAD), joka puuttuu ERG. ETS proteiinit säätelevät monet kohdegeenien moduloivien biologisia prosesseja, kuten solun kasvua, angiogeneesin, muuttoliike, lisääntymistä ja erilaistumista. Kuitenkin mitkä monista molekyyli- ja biologisia toimintoja ETS proteiinit ovat tärkeimpiä eturauhassyövässä ei tiedetä.

jälkeen

ERG, ETV1

on yleisimmin yli-ilmentynyt ETS geeni eturauhassyövässä ( -10%: n kasvaimet) [10]. ETV1 proteiini käännetty kaikkein fuusio selostukset on katkaistu, josta puuttuu 131 N-terminaalista aminohappoa (dETV1). Noin. puolet kasvainten

ETV1

yliekspressio ilmaista fuusio transkriptio, toiset osoittavat korkeaa täyspitkän

ETV1

ilme.

in vitro

biologiset ja molekyylitason ominaisuudet dETV1 näyttävät eroavat täyspitkän 477 aminohapon proteiini [10]. Tämä havainto viittaa siihen, että kasvaimia yliekspressioon täyspitkän ETV1 eroavat ilmentävien kasvainten dETV1.

tiedetään vain vähän mekanismi täyspitkän

ETV1

yli-ilmentymisen ja sen toiminta kliinisissä eturauhassyövän . Nykyinen tulokset osoittavat, että yli-ilmentyminen täyspitkän

ETV1

korreloi uudelleenjärjestely

ETV1

kromosomialueen. Lisäksi olemme tunnistaneet uuden, N-katkaistu

ETV1

isoformin kanssa samaa toimintaa kuin täyspitkä

ETV1

.

Tulokset ja keskustelu

Aiemmin kerroimme

ETV1

yliekspressio kahdeksassa ulos 84 eturauhassyöpänäytteissä. Neljässä tapauksessa tämä johtui geeni fuusio, muissa neljässä täyspitkän

ETV1

transkripti yliekspressoitui [10]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet yliekspressio

ETV1

kvantitatiivisen käänteistranskriptaasireaktio (QPCR) uudella kohortin 66 eturauhassyövissä. Kuudessa RNA: t

ETV1

yliekspressio havaittiin. Näytteet G51, G59, G233, G270 ja G268 saatiin primaarikasvaimista ja G210 johdettiin toistuva kasvain. Kuusi-näytteet tutkittiin QPCR kanssa alukeparien 5′-päässä

ETV1

mRNA (eksoni 1F ja eksonin 4R) ja 3′-pään mRNA: n (eksoni 11F ja eksoni 12R) (kuvio 1A). Korkea eksoni 11-12 eksoni 1-4 suhde on osoitus fuusio geeni; 1:01 suhde osoitti yli-ilmentymisen täyspitkän

ETV1

mRNA. Näiden kriteerien perusteella, kasvaimet G51, G59, G233 ja G270 ilmaisi täyspitkä

ETV1

taas G210 ja G268 ilmaisivat fuusio transkripti (katso myös hallita PC374 joka ilmentää

TMPRSS2-ETV1

).

HNRPA2B1-ETV1

havaittiin, kun fuusio-transkriptin näytteen G210 (tuloksia ei ole esitetty); fuusio nauhoituksen G268 ei todettu vielä. Nämä kaksi näytettä ei tutkittu enempää tässä tutkimuksessa.

(A) QPCR RNA kliinisistä näytteistä, jotka osoittavat

ETV1

yli-ilmentymisen. Kaksi alukepareja käytettiin määrittämään

ETV1

ilmaus:

ETV1

eksonin 1 eteenpäin ja eksonin 4 käänteinen, ja eksonin 11 eteenpäin ja eksonin 12 taakse, vastaavasti. Primer sekvenssit annetaan Täydentävä taulukossa S1. Amplified tuotteet määrällisesti suhteessa ilmaus porfobilinogeeni deaminaasin (

PBGD

) taloudenhoito geeni. Data normalisoitiin täyspitkä

ETV1

yli-ilmentyy Ksenograftikudoksista PC135. Korkea eksoni 11/12 eksoni 1/4 suhde osoittaa

ETV1

fuusio tapahtuma, 1: 1 suhde osoittaa yli-ilmentyminen täyspitkä

ETV1

transkriptio. PC374 on ohjaus ksenografti joka ilmentää

TMPRSS2-ETV1

fuusio geeni. Edustava koe on kuusi näytettä, jotka osoittavat

ETV1

yli-ilmentymisen on kuvattu. (B) Interphase kala makean pakastetut eturauhassyöpä kudosleikkeiden. BAC: käytetyt esitetään alla kromosomin 7 alueen tutkittu. BAC RP11-124L22 (punainen) jännevälit

ETV1

ja RP11-1149J13 (vihreä) menee päällekkäin

DGKB

(vasen paneeli). Kannat geenien ylhäältä kromosomissa 7 on esitetty Mbp. Jaettu signaali edustaa

ETV1

translokaatio merkitty nuolella. (C) translokaatio

ETV1

kromosomiin 14 kasvaimen G270. Kudosleikkeet hybridisoitiin BAC RP11-460G19 (vihreä), joka limittyy

MIPOL1

ja kyljet

ETS14

ja

ETV1

BAC RP11-124L22 (punainen) (ks B lisätietoja). Vasemmassa paneelissa asento

MIPOL1

BAC kromosomissa 14 on osoitettu. Oikeanpuoleisessa paneelissa sulauttamista signaali (keltainen) osoittaa kolokalisaation

ETV1

ja

MIPOL1 Twitter /

EST14

vuonna G270, kuten nuolella.

seuraavaksi kokeet keskityimme selvittämisessä mekanismi yli-ilmentymisen täyspitkän

ETV1

. Viime aikoina on osoitettu, että kahden eturauhassyövän solulinjoissa, jotka yliekspressoivat täyspitkän

ETV1

, LNCaP ja MDA PCa2b,

ETV1

kulkeutua [8]. Nyt käsitteli kysymystä siitä, kliinisissä näytteissä translokaation täydellisen

ETV1

geeni saattaa esiintyä. Havaitsemaan genomista uudelleenjärjestelyjä kudosta dioja kaikkien neljän eturauhassyöpänäytteissä kanssa täyspitkän

ETV1

yliekspressio analysoitiin break-erilleen interphase FISH kaksi leimattua BAC antureista, yksi BAC tunnustettu

ETV1

ja toinen reunustavia geeni

DGKB

(kuvio 1 B). Sarja täydennettiin kaksi näytettä kätkeminen täyspitkää

ETV1

yliekspressio aikaisemmista tutkimus, G89 ja G308 [10], joille pakastetut kudokset riittävän morfologisten laatu oli saatavilla. Kuvio 1B esittää tulokset FISH kokeissa. Mielenkiintoista, löysimme split signaalit kaikissa näytteissä paitsi G59, mikä osoittaa usein

ETV1

uudelleenjärjestelyihin eturauhasen syöpiä, jotka yli-ilmentävät täyspitkä

ETV1

. Absence of jaetun signaalin G59 viittaa puuttuessa translokaation, vaikka emme voi sulkea pois keskeytyskohta ulkopuolelle tutkittu alue. Sen havaittiin korkean taajuuden osoittaa genomista uudelleenjärjestely tärkeänä mekanismi täyspitkän

ETV1

yliekspressio kliinisissä eturauhassyöpää. On selvää, että kromosomaalisen alueen, joka

ETV1

kulkeutua voi edistää selvittäminen mekanismi

ETV1

yliekspressio. Pystyimme tunnistamaan enemmän yksityiskohtia uudelleenjärjestelyjen näytteissä G270 ja G89.

On esitetty LNCaP että

ETV1

kulkeutua sen 14q13.3-q21.1. Koko geeni on integroitu viimeisen intronin

MIPOL1

. MDA PCa2b,

ETV1

kulkeutua samalle alueelle, joskaan tarkkaa sijaintia ei tunneta [8]. Lisäksi olemme aiemmin kuvattu lisätään katkaistun

ETV1

että intronin kahden eksonin koodaavan geenin ncRNA, merkitään

EST14

, joka antaa aihetta

EST14-ETV1

fuusio transkripti, joka sisältää

ETV1

eksonin 5-12 sekvenssit (näyte G342 viitejulkaisussa. 10, kuvio 2A). Tärkeää on,

EST14

kartat suoraan vieressä

MIPOL1

14 q. Kuten useimmat

ETV1

fuusioparien

EST14

on androgeenisäädellyn eturauhasen-geenistä. Sen tutkimiseksi, onko sama geenivirhe oli mukana täyspitkän

ETV1

translokaatio meidän romaani kohortin interphase FISH suoritettiin

ETV1

BAC (kuvio 1 B) yhdistettynä

MIPOL1

BAC (kuvio 1 C). Sulautuvana keltainen signaali havaittiin näytteessä G270 (kuvio 1 C), mutta mikään muista kasvaimia. Nämä tiedot osoittavat, että vaikka näyttää mieluummin kromosomi 14q13.3-21.1, muut genomialuetta edistää myös uudelleen järjestelyn ja yli-ilmentymisen täyspitkän

ETV1

.

(A) Kaaviokuva on

ETV1

–

EST14

fuusio selostukset eturauhastuumoreissa G270 ja G342 (näyte G342 on peräisin ref. 10). Nuolet osoittavat asemat käytetyt alukkeet RT-PCR-koe. Primer sekvenssit esitetään Täydentävä taulukossa S1. (B) sekvenssi jonka sulamispiste

EST14

ja

ETV1

näytteen G270. Asento sulamispiste kasvaimen G270 kartoitettiin pitkän kantaman PCR genomista DNA alukkeena eteenpäin

EST14

intronin ja käänteisaluke- ylävirtaan

ETV1

eksonin 1. Tällä sulamispiste kaksi T jäämiä menetettiin. Murtuessa in

EST14

vuonna G270 ja G342 on merkitty nuolilla.

Lisätietoja on

ETV1

uudelleenjärjestelystä G270 tuli 5′-RACE kasvaimen cDNA (tuloksia ei ole esitetty). Merkillistä, emme vain tunnista odotetusti täyspitkä

ETV1

transkriptio vaan myös fuusio- transkripti (kuvio 2A). Tällainen tulos ei ole löydetty mitään muuta kasvainten yli-ilmentävät täysipituisen

ETV1

. Sekvensointi osoitti, että fuusio transkriptin G270 muodostivat

ETV1

eksonin 1-12 edeltää ensimmäistä eksonia

EST14

(kuvio 2A). Skannaaminen

EST14

intronin ja

ETV1

vierusalueeseen pitkän kantaman PCR ja sekvensointi kartoitti keskeytyskohtia G270 ~1.9 kep ylävirtaan

ETV1

eksonin 1 ja -5 ke: alavirtaan

EST14

eksonin 1. keskeytyskohta

EST14

on vain 180 bp lisäksi murtuessa vuonna G342 (kuvio 2B ja viite. 10).

Lisätietoja on

ETV1

uudelleenjärjestely kerättiin myös näytteen G89. Aiemmin vierassiirrännänmallissa edenneitä nude-hiirten oli luotu tästä kasvain (PC135). Kuten kasvaimen G89, PC135 yli-ilmentää täyspitkää

ETV1

[3]. Saatavuus ksenograftissa sallittu valmistuksessa metafaasissa kromosomilevitteisiin. Monivärinen FISH monimutkainen kromosomaalinen uudelleenjärjestely kuvio havaittiin (tuloksia ei ole esitetty). Yksittäiset kromosomi maaleja käytettiin vahvistamaan monivärinen FISH tiedot. Maalaus kromosomi 7 osoitti, että läsnä useiden kromosomissa 7 fragmentteja (kuva 3). Hybridisoimalla

ETV1

BAC tunnistaa läsnäollessa kolmen geenin kopioita: kaksi normaalisti kromosomien 7 ja yksi monimutkainen merkki kromosomi. Seuranta kokeet osoittivat, että markkeri kromosomi sisälsi fragmentteja kromosomien 4, 7 ja 10, ensimmäisenä merkitty monivärinen FISH (kuva 3).

ETV1

BAC hybridisoitu risteyksessä kromosomin 7 ja kromosomi 4 fragmentti, mikä viittaa vahvasti siihen, että 4, 7 translokaatio oli keskeinen yli-ilmentyminen

ETV1

. Tarkka asemat keskeytyskohtia 4 ja 7 jäävät vielä. Meidän tiedot ennustavat, että useita kromosomaalisia alueita ovat mukana yli-ilmentyminen täyspitkän

ETV1

. Ainakin yksi näistä alueista on kromosomissa 14 ja toinen kromosomissa 4. kromosomi 14 alue on mukana myös

ETV1

geenin fuusio. Deep sekvensointi teknologia voisi olla apuna tunnistaminen muissa

ETV1

uudelleenjärjestelyjä.

Maalit kromosomeja 4, 7 ja 10 ovat vihreitä ja

ETV1

BAC (kuva 1b) on punainen. Mustat nuolet osoittavat kulkeutua

ETV1

. Alemmassa paneelissa asiaan Marker-kromosomi on kehystetty punaisella.

Yksityiskohtainen kuvaus täyspitkän

ETV1

selostukset eri kasvainten 5′-RACE ja sekvensointi osoitti, että ei vain

ETV1

eksonin 1- eksonin 12 transkriptit olivat läsnä, mutta myös useita muita täyspitkä

ETV1

selostukset, vaihtoehtoisista promoottorinkäytöllä. Nämä transkriptit merkitään

ETV1

,

ETV1-1a

,

ETV1-1b

ja

ETV1-1c.

Kuviossa 4A ja Täydennyskuvio S1 Show kannat eri ensimmäisen eksonit geenissä ja osoittavat eri ATG kodonit. Sekä

ETV1-1a

ja

ETV1-1b

kaksi silmukointivarianttia havaittiin (tuloksia ei ole esitetty). QPCR kokeet, joissa käytetään transkriptio-alukkeilla RNA kaikissa kuudessa kliinisen eturauhassyöpänäytteissä, että yli-ilmentynyt

ETV1

osoitti, että ilmentymistaso eri transkriptien vaihteli eri kasvaimissa (katso kuva S2).

ETV1

tuskin ilmaistu ohjaus hyvänlaatuisen liikakasvun näyte G277. Kuvio 4B esittää kaavamaisesti ennustetun koostumuksen eri ETV1 proteiini-isoformit, jotka on tuotettu. Huomaa, että ETV1-1c on ylivoimaisesti lyhin, josta puuttuu N-terminaalinen 60 aminohapon, mukaan lukien suurin osa konservoituneen happaman TAD. In dETV1, että on ilmaistu suurin -fuusiogeenit, N-terminaaliset 131 aminohappoa ovat läsnä. ETV1, ETV1-1b1 ja -1b2 olivat samankokoisia, kuten on esitetty Western blot lysaatit transfektoiduista HEK293T soluista (kuvio 4B).

(A) Kaavamainen esitys järjestämisestä

ETV1

geeni. Vaihtoehtoinen ensimmäinen eksonit ovat 1 a, 1, 1 b ja 1 c. Kannat neljän eri ATG-kodonit on merkitty. Lisätietoja annetaan Täydennyskuvio S1. (B) Kaaviokuva koostumuksen eri ETV1 proteiinit ja niiden ilmentyminen transfektoiduissa HEK293T-soluissa. Eri värejä N-terminaalisia alueita osoittavat eri aminohappokoostumus. dETV1 on typistetty ETV1 tuottama proteiini -fuusiogeenit. Tämä proteiini ei pysty indusoimaan ankkurointi riippumattomaan kasvuun. Oikeanpuoleisessa paneelissa Immunoblotilla ETV1 isomuotojen tuottaman transfektoitiin HEK293T soluissa esitetään. p-aktiini käytettiin latauskontrollina. (C) Soft-agar-määritys osoittaa kiinnittämisestä riippumaton kasvu PNT2C2 infektoitujen solujen lentiviruksia ilmentävät eri ETV1 isoformeja tai kontrolloida GFP. Palkit edustavat keskiarvoa pesäkkeiden lukumäärä mikroskooppikenttää kohden ja kolmen erillisen kokeen (± SD). Edustavat kuvat värjättyä pesäkkeet alla baarissa luku.

Aikaisemmin olemme osoittaneet, että ETV1 ja dETV1 erosivat stimulaation

in vitro

ankkurista riippumaton kasvu [10] . PNT2C2 infektoiduissa soluissa kaikki uudet ETV1 konstruktit indusoiman ankkuroitumisesta riippumattoman kasvun samalla tavalla kuin ETV1 (kuvio 4C). Huomattavaa on, ETV1-1c, vaikka ilmaistuna alemmalla tasolla ja paljon pienempi, on yhtä aktiivinen kuin enää ETV1 isoformit. Siten koko N-pään TAD ei tarvita, mutta aminohapot 61-131 näyttävät välttämättömiä biologisen aktiivisuuden ETV1 (kuvio 4B, C).

Yhteenvetona esitetyt tiedot paljastavat kaksi tärkeää uusia näkökohtia roolia ETV1 eturauhassyövässä. Ensinnäkin, on osoitettu, että kliinisissä eturauhassyövissä alaryhmä ETV1 positiivisten potilaiden osoittavat täyspitkän

ETV1

yliekspression takia toiselle siirtämistä koko geenin eri kromosomeja. Tämä uusi havainto täydentää hyvin kuvattu mekanismi yliekspressio katkaistun ETV1 aiheuttama geenifuusioita, joissa ilmentyminen asetus määräytyy promoottorin ja tehostajia fuusion kanssa. Toiseksi, toisin kuin dETV1 tuotettu geenifuusioita, lyhyen isoformi täyspitkän ETV1, ETV1-1c, josta puuttuu suurin osa N-pään TAD, on yhtä aktiivinen kuin enää ETV1 isomuotojen, joka sisältää täydellisen N-terminaalinen hapan TAD. Tämä havainto kartoitetaan kiinnittämisestä riippumaton kasvu pieni alue, joka puuttuu typistetty ETV1 ilmaistaan ​​-fuusiogeenit.

On erittäin merkityksellisiä laajentaa määrän kliiniset näytteet, jotta voitaisiin vertailla syövän etenemisen kaksi alaryhmää prostatasyövistä osoittaa yli-ilmentyminen katkaistun vs. täyspitkän ETV1, ja määrittää molekyylitason mekanismeja niiden eri biologista käyttäytymistä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics Statement

käyttö näytteiden hyväksyttiin Erasmus MC Medical eettisen komitean mukaan Medical Research ihmiseen kohdistuvan toimittava protokolla MEC-2004-261, ”The käyttö ihmisen normaalia ja syövän jäljellä kudosta kudospankkia karakterisointia DNA, RNA ja proteiini ”.

Hiiriä pidettiin ohjeiden mukaisesti Erasmus Medical Centre, ja menetelmät suoritettiin noudattaen standardien käytöstä koe-eläimiä. Eläinkokeet suoritettiin tämän käsikirjoitus on hyväksynyt eläin kokeellinen komitean Erasmus Medical Centre (DEC-kuulemaan Erasmus MC projekti 102-10-01).

kudosnäytteitä, RNA ja DNA eristys

Snap-pakastetut eturauhasen syöpiä saatiin eturauhasen tai höyläysleikkaus. Hematoxilin /eosiini (HE) värjättiin kudosleikkeet histologisesti arvioitiin patologi (G. van Leenders). Kaikki näytteet sisälsivät vähintään 50% kasvainsoluja.

RNA kliinisistä näytteistä eristettiin käyttäen RNA-Bee (Campro Scientific, Berliini, Saksa). DNA eristettiin käyttäen DNeasy DNA Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA). RNA solulinjoista eristettiin käyttämällä RNeasy RNA (Qiagen).

Breakpoint kartoitus

asento sulamispiste kasvaimen 270 kartoitettiin pitkän kantaman PCR genomista DNA käyttäen alukkeena eteenpäin

EST14

intronin ja käänteisaluke- ylävirtaan

ETV1

eksonissa 1. PCR-tuotteet erotettiin 1% agaroosigeelillä ja sekvensoitiin ABI 3100 geneettinen analysaattori (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA).

Q-PCR

mRNA: n ekspressio analysoitiin QPCR. cDNA valmistettiin MMLV-RT (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ja oligo (dT) 12-aluketta. QPCR suoritettiin Virta SYBR Green PCR Master Mix ABI Prism 7700 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Monistetut tuotteet kvantitoitiin suhteessa porfobilinogeeni deaminaasia (

PBGD

), jonka standardikäyrä menetelmällä. Alukkeina katso taulukko S1.

RNA-ligaasia-välitteisen nopea monistus cDNA-päiden

5′-RLM-RACE suoritettiin käyttämällä GeneRacer kit Invitrogen. cDNA monistettiin käyttämällä GeneRacer 5′-aluketta ja reverse-geeni-spesifisen alukkeen (ETV1 eksoni 6). PCR-tuotteet analysoitiin 1,5% agaroosigeelillä, ja juovat leikattiin irti, puhdistettiin ja sekvensoitiin.

Fluoresenssi

in situ

-hybridisaatio

FISH tehtiin 5 um: kudosjääleikkeitä standardimenetelmien mukaisesti vähäisin muutoksin [14]. BAC-klooneja RP11-124L22 (

ETV1

), RP11-460G19 (

MIPOL1

), RP11-1149J13 (

DGKB

) ostettiin BacPac Resources (bacpac.chori. org). BAC: t olivat joko digoksigeniiniperoksidaasia 11-dUTP tai biotiini-16-dUTP (Roche, Basel, Schweiz) leimattu ja visualisoida anti-digoksigeniini FITC (Roche) tai streptavidiini-Alexa 594 (Invitrogen). Kudosleikkeet vastavärjättiin DAPI. Kuvat kerättiin epifluoresenssimikroskoopilla (Leica DM, Wetzlar, Saksa) varustettu CCD-kenno jäähdytetty kamera (Photometrics, Tucson, AZ, USA).

valmistamiseksi metafaasivaiheeseen leviää, ksenografti- PC135 kasvatettiin urosten nude-hiirissä. Yhden solut kerättiin jauhamista ja suodattamalla. Metafaasissa valmistelu ja hybridisaatio oleellisesti, kuten on kuvattu [14]. Kromosomi maalit 4, 7 ja 10 olivat Euro-Diagnostica (Malmö, Ruotsi). Metafaasien analysoitiin Axioplan 2 Imaging mikroskooppia (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa) ja kuvien otettiin käyttäen Isis ohjelmistoa (MetaSystems, Altiussheim, Saksa).

Ekspressioplasmidit

cDNA eri ETV1 isoformit PCR-monistettiin ja kloonattiin pGEM-Teasy (Promega). Insertit sekvenssi varmistettiin ja kloonattiin pcDNA3 (Invitrogen) tai lenti-virusvektori pWPXLd (Didier Trono, University of Geneva).

Western blot-analyysi

Western blot -analyysiä varten, HEK293T-solut transfektoitiin eri pcDNA3-ETV1 ekspressiorakenne käyttäen kalsiumfosfaattisaostusmenetelmää. Solut kerättiin talteen 48 h transfektion jälkeen. Western blot analyysi suoritettiin käyttäen standardimenetelmiä vasta-aineen kanssa suunnattu ETV1 C-päähän (Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA). p-aktiini käytettiin latauskontrollina (Sigma, St. Louis, MO, USA). Proteiinit saatiin näkyviin kemiluminesenssin (Pierce, Rockford, IL, USA).

Lentivirusvektorikonstruktit infektioita

HEK293T-solut kotransfektoitiin pWPXLd-ETV1 ekspressiovektoreihin, tai pWPXLd-GFP (kontrolli), ja pPAX2 ja pMD2.G (Trono) käyttäen kalsiumfosfaattisaostusmenetelmää. Virus kerättiin supernatantti ja käytetään infektio PNT2C2 soluja. Altaat infektoitujen solujen kasvatettiin.

Soft agar määrityksessä

kerroksen 0,6% matalassa lämpötilassa sulavaa agaroosia standardin viljelyalustaan ​​valmistettiin kuuden kuopan levyillä. Päälle, kerros 0,3% agaroosia, joka sisälsi 1 x 10

4 PNT2C2 infektoiduissa soluissa eri ETV1 ilmentäviä tai valvontaa PNT2C2-GFP-solut maljattiin. Päivänä 14 solut värjättiin kristallivioletilla ja pesäkkeet laskettiin.

tukeminen Information

Kuva S1.

Osa genomisen sekvenssin

ETV1

. Eri eksonit korostetaan keltaisella. Käännös aloituskodoneja on alleviivattu. Huomaa, että transkriptin alkaen eksonista 1 a voi tai ei voi sisältää eksonin 1A1, mutta käännöksen alku on sama kuin transkriptin alkaen eksonissa 1. lopussa eksoni 1B1 on merkitty punaisella.

ETV1

transkriptien alkaen eksonista 1c puute eksonit 1, 2 ja 3, joka johtaa katkaistuun TAD käännetyn proteiinia.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0016332.s001

(DOC)

Kuva S2.

ilmentäminen eri

ETV1

transkriptien määritettiin QPCR on 7900HT Fast Real-Time PCR järjestelmä Applied Biosystems käyttävät valtaa SYBR vihreä master mix (Applied Biosystems). Ekspressiotasot ovat suhteessa taloudenhoito geeni

PBGD

.

ETV1

ja

PBGD

alukkeita luetellaan Täydentävä taulukossa S1. Näyte G277 on BPH. Se on hyvin vähän tai ei ilmentymistä kaikki eri

ETV1

selostukset. Näytteet G51, G59, G89, G233, G270 ja G308-ilmentävät kaikki

ETV1.

Erilaiset transkriptit ilmaistu vaihtelevia määriä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0016332.s002

(TIF )

Taulukko S1.

Alukesekvensseillä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0016332.s003

(TIF) B