Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

urothelial virtsarakon syöpä on yhdeksäs yleisin syöpä. Huolimatta kirurginen ja kemoterapian ennuste on edelleen huono, kun virtsarakon syöpä etenee lihas-invasiivisia tilassa. Discovery of diagnostisia markkereita ja patofysiologisia effektorit saattaisi auttaa edistämään uusia diagnostisia ja terapeuttisia vaihtoehtoja. Soluväliaineen mikroympäristölle muovaavat soluväliaineen vaikuttaa kriittisesti kasvainsolun ja strooman solujen toimintaan. Siksi käsillä olevan tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida ilmenee, että pienen leusiinirikkaita proteoglykaanin biglykaania etenemisessä ihmisen urothelial virtsarakon syöpään.

Menetelmät ja tulokset

Tätä tarkoitusta varten kasvain koepaloja 76 virtsarakon syöpäpotilailla eri kasvain vaiheissa (PTA, pT1-T4) tutkittiin osalta biglykaania ilmaisun ja korreloi pitkäaikainen (10 vuotta) kliinistä seurantaa. Mielenkiintoista, korkeampi biglykaania mRNA ilmentyminen liittyi korkeampi kasvaimen vaiheisiin ja lihasten invasiivisuus.

vitro

knock-down endogeenisen biglykaania ihmisen urothelial karsinoomasolut (J82 solut) lisäsi jakautumista, kun taas lisäys rekombinantin biglykaania ja yli-ilmentyminen biglykaania esti kasvainsolujen proliferaatiota. Tämän mukaisesti kasvua estävää vaikutusta biglykaania, transplantaation J82-solujen jälkeen knock-down of biglykaania johti huomattavasti kasvua ihonalaisen ksenograftikasvaimissa nude-hiirissä

vivo

. Lisäksi hoito kaksi antiproliferatiivisia, multi-reseptori tyrosiinikinaasin estäjät-sunitinibia ja Sorafenibin-voimakkaasti säädelty biglykaania ilme. Yhdessä kokeelliset tiedot viittaavat siihen, että suuri biglykaania ilmentyminen liittyy alentunut kasvainsolujen proliferaatiota. Mukaisesti, Kaplan-Meier-analyysi paljasti suurempi 10 vuoden pysyvyys potilailla, joilla on korkea biglykaania mRNA: n ekspression kasvainbiopsioissa.

Johtopäätös

Yhteenvetona esillä tiedot viittaavat siihen, että biglykaania on endogeeninen inhibiittori virtsarakon syövän solujen proliferaatiota, joka on ylössäädelty vasteena anti-proliferatiivista tyrosiinikinaasin estäjät. Lisäksi, korkea biglykaania ilmentyminen liittyy suotuisa ennuste.

Citation: Niedworok C, Rock K, Kretschmer I, Freudenberger T, Nagy N, Szarvas T, et ai. (2013) inhiboiva rooli Small leusiinirikkaita Proteoglykaanin biglykaania sisään virtsarakon syövän. PLoS ONE 8 (11): e80084. doi: 10,1371 /journal.pone.0080084

Editor: Nikos K Karamanoun, University of Patras, Kreikka

vastaanotettu: 02 toukokuu 2013; Hyväksytty: 09 lokakuu 2013; Julkaistu: 06 marraskuu 2013

Copyright: © 2013 Niedworok et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus rahoitettiin osittain Ifores Programm yliopiston klinikat Essen (D107-10800, https://www.uni-due.de/med/forschung/forschungsfoerderung/ifores.shtml) ja Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG (FI 682 /4-1; https://gepris.dfg.de/gepris/OCTOPUS/;jsessionid=E43949FD6A49E805D72DE1129F1DB078?context=person displayMode=print findButton=Finden id=1433803 keywords_criterion=Jens+Fischer module=gepris nurProjekteMitAB=false task=showDetail). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

urothelial virtsarakon syöpä on yhdeksäs yleisin ihmisen pahanlaatuinen syöpä ilmaantuvuutta ja esiintyvyyttä [1]. ei-lihas invasiivinen virtsarakon syöpä käsitellään höyläysleikkaus ja apuaine tiputtamisen terapia tapauksessa korkealuokkaisesta sairauden tai tapauksissa useita, usein toistuvat kasvaimet. alhaisen asteen ei-lihas- invasiivisia tauti voi edetä lihasten invasiivisia suuri riski virtsarakon syöpään. hoito valinta lihaksen invasiivisia virtsarakon syöpä on radikaali cystectomy [2,3], joka tarjoaa edelleen vain pieni (~ 50%) 5-vuoden pysyvyys. tärkein syy tähän tuhoisa selviytyminen usein esiintyviä metastasointiin näillä potilailla [6,7]. Sisplatiini yhdessä gemsitabiinin edustaa ensilinjan hoitona vaihtoehto potilaille, joilla on paikallisesti edennyt tai metastaattinen virtsarakon syöpä. Uusi kemoterapia-strategioita, joissa reseptori tyrosiinikinaasin estäjät, tällä hetkellä tutkitaan prekliinisissä ja kliinisissä tutkimuksissa [4,5]. Siten huolimatta kirurginen ja kemoterapeuttisen hoitovaihtoehtoja vaikeusasteen sairauden ja huono ennuste halu löytämään uusia merkkiaineita taudin etenemisen sekä uusia oivalluksia patofysiologiaan virtsarakon syövän etenemisen.

Tämän vuoksi pyrittiin tutkimaan tiettyjä muutoksia solunulkoisessa micromilieu määritelty solunulkoisen matriisin (ECM), jotka liittyvät etenemisen virtsarakon syöpä ja onko tietty biologinen aktiivisuus voisi johtua kandidaattimolekyylejä . ECM tiedetään vaikuttavan sekä, kasvain ja stroomasolujen suhteessa niiden ilmiasun jotka ovat merkityksellisiä syövän etenemistä kuten invaasio, proliferaatio ja apoptoosi. Lisäksi koostumus ECM micromilieu on todennäköisesti osa solujen välisen viestinnän välillä kasvaimen ja strooman solut. Proteoglykaaneille avaintekijät ECM, ovat yhä merkityksellisiä syövän biologian vuoksi lukuisia toimintoja, jotka ovat kriittisiä kasvaimeen stroomavuorovaikutuksiin [8]. Proteoglykaanit koostuvat ytimestä proteiinin ja glykosaminoglykaanin ketju, joka edellyttää translaation jälkeisiä modifikaatioita. Sekä ydin proteiineja ja glykosaminoglykaaniketjujen myötävaikuttaa toiminnan proteoglykaanien sisällä ECM. Pieni leusiinirikkaita proteoglykaanien (SLRP) ovat perhe solunulkoisia proteoglykaanien, joille on tunnusomaista leusiinirikkaita toistojen ydinproteiinia. SLRPs erittyvät solunulkoiseen tilaan, jossa ne ovat vuorovaikutuksessa muiden proteiinien kanssa, mukaan lukien kasvutekijät, sytokiinit [9-11]: n ja transmembraani-reseptoreihin [12]. Biglykaania (BGN) kuuluu SLRPs joka on vuorovaikutuksessa transmembraaninen reseptoreihin purinergistä P2X7 tyyppi ja toll-like-reseptori (TLR) 2 ja TLR4 [13,14]. Entinen osallistuvat aktivointi inflammasome, kun taas jälkimmäinen aiheuttaa aktivoitumisen luonnollinen immuniteetti. Nämä toimet määrite immuunijärjestelmään ominaisuuksia BGN joka voisi olla merkitystä sekä, syövän synnyn ja kasvaimen etenemiseen sekä etäpesäkkeiden. Lisäksi BGN on osoitettu myötävaikuttavan kollageenin verkon muodostumista ja vakaus, fibronektiiniin fibrillo-, että fibroblastin erilaistumista ja ehdotetaan edistää angiogeenisten vastaukset [15-18]. Yhteenvetona BGN todennäköisesti moduloi tuumoribiologiassa aiheuttamalla tärkeä valvontamekanismeja, kuten immuunivastetta, matriisi kokoonpano ja modulaatio kasvutekijän aktiivisuutta. Tämä on todennäköisesti saavutetaan molemmat, suora solusignalointi herättämän BGN sekä muotoilemalla microenvironment kautta sen vaikutukset kollageenin ja fibronektiinin matriisi muodostumisen.

mukaisesti, että BGN esittelee molemmat, estävä ja edistävät vaikutukset kasvainsoluihin, kiistelty roolit on kuvattu BGN erilaisissa syövissä. Esimerkiksi maha- ja peräsuolen syövän sekä haiman adenokarsinooma, BGN ilmentyminen havaittiin korreloivan huonon ennusteen [19-21]. Toisaalta, yliekspressio BGN havaittiin ihmisen haimasyövän ja todettu estävän kasvua haiman syöpäsoluissa

in vitro

[22]. Lisäksi BGN alassäätöä liittyi HER-2 /neu-välittämää onkogeenisen transformaatio joka oli vahvasti liittyvät pahanlaatuiseen fenotyyppiin näiden solujen [23]. Siksi rooli BGN kasvaimen etenemiseen todennäköisesti riippuu kasvaimen tyypistä, vaihe ja erilaistumista. Näin ollen näitä kysymyksiä on käsiteltävä erikseen eri kasvain yhteisöjä. Lisäksi reagointikykyä BGN hoitotoimenpiteiden ei ole tutkittu vielä. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli arvioida ensimmäistä kertaa ilmaisua ja roolia BGN virtsarakon syöpään.

Materiaalit ja menetelmät

Tuumorinäytteet

Geenien ilmentyminen analyysi suoritettiin jäädytetty kudosnäytteistä 76 potilasta (19x pTa, 15x pT1, 14x pT2, 14x pT3 ja 14x pT4), joille tehtiin kirurginen hoito johtuen urothelial virtsarakon syövän yliopistollisen sairaalan Essen vuosina 1990 ja 2004. Kaikki jäädytetyt kudosnäytteet leikata ja värjättiin H 0,05. Tiedot koskevat kliiniset tulokset potilaasta parametrit puuttuivat normaalijakaumaa, joka osoittaa käyttö ei-parametriset kaksitahoiset Wilcoxonin summa testi (Mann-Whitney) ja pareittain ryhmässä vertailuja. Analyysi elossaololuku tietojen suoritettiin käyttäen standardeja Kaplan-Meier-algoritmia (PROC LIFETEST, SAS-PC 9.3, SAS-INSTITUTE, Cary, USA). Optimaalisen erottaminen ryhmien suhteellisesta BGN lauseke, muuttuja leikata pistettä arvioitiin ja log-rank testi p-arvot kirjattiin. Optimaalinen erottamista kahteen ryhmään, joka vastaa minimaalinen p-arvon havaittiin suhteellisessa BGN ilmaus arvo 0,09. Sillä monimuuttuja analyysiä Coxin suhteellisen vaarat regressiomallit käytettiin. Kaikki tilastolliset analyysit laskettiin käyttäen IBM SPSS® tilastollinen analyysi (versio 18.0, Chicago, IL, USA).

Ethics selvitys

Tutkimus protokolla ja lupamenettely on hyväksynyt eettinen komitea yliopiston Duisburg-Essen, Saksa ja jokaiselle potilaalle toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Hanke määrä oli 07-3537 säilytykseen tuore ja paraffinized kasvain materiaalista ja kliiniset tiedot.

Hiiret Kokeet suoritettiin sääntöjen mukaisesti ja standardeja LANUV (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz, NRW) ja paikallinen Animal Facility Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf. LANUV hyväksyi kokeita ja vahvisti, täyttävätkö laatuvaatimuksia. Hanke tunnistetaan useissa 87-51.04.2010.A149.

Tulokset

BGN mRNA: n ekspression ihmisen virtsarakon syövän

Ensinnäkin näytteitä 76 potilaista eri vaiheissa virtsarakon syövän analysoitiin suhteessa BGN mRNA ilmaisun ja verrattiin ilmaisua terveillä virtsarakkokudos. Mielenkiintoista, merkittäviä eroja ei havaittu mRNA ekspressiotasoja suhteessa kasvaimen invasiivisuus (kuvio 1A), luokittelu (kuvio 1 B) ja lavastus (kuvio 1 C), mikä viittaa lisääntynyt BGN mRNA eteni vaiheittain virtsarakon syöpään. Tästä huolimatta positiivinen yhteys kasvaimen lavastus monimuuttuja-analyysi paljasti, että BGN mRNA ekspressiotaso (

p

= 0,155) ei ollut itsenäinen ennustetekijä. Sen sijaan kasvaimen vaiheessa (

p

= 0,012) ja imusolmukkeesta osallistuminen (

p

= 0.039) olivat riippumattomia ennustavat tekijät syöpäspesifisessä eloonjäämisen odotetusti (taulukko 1). Lisäksi ei ollut mitään korrelaatiota BGN mRNA ilmaisun ja aika ulkonäkö etäpesäkkeiden (

p

= 0,862), taudin etenemiseen (

p

= 0,624) tai tauti uusiutuu (

p

= 0,142). BGN oli korkeampi Tuumorinäytteissä naisista verrattuna miesten (4,86-kertainen verrattuna 1,66-kertainen ohjaus, vastaavasti,

p

= 0,003) ja tupakoitsijoilla verrattuna tupakoimattomien (3,40-kertainen ; tupakoitsijat 2,01-kertaiseksi,

p

= 0,008, taulukko 2).

BGN mRNA tutkittiin 76 potilaalla on virtsarakon syöpä RT-qPCR ja verrattuna ei-pahanlaatuinen virtsarakkokudos . Merkittävä nousu BGN mRNA ekspressiota havaittiin lihas-invasiivisia verrattuna ei-invasiivisia kasvaimet (A) ja korkea-asteen verrattuna huonolaatuisen kasvaimia (B). Lisäksi BGN mRNA: n ekspressio korreloi kasvaimen lisääntyvän vaiheessa (C). n = 76 potilasta, *

p

0,05, ***

p

= 0,0003.

Cancer-tautivapaalle

muuttujat

HR

95% CI

p

Stage (lihas invasiivisia) 1.4881.090-2.0300.012Grade (high-grade) 2.1260.954-4.7400.065Lymphnodes (N +) 2.4001.045-5.5090.039BGN (korkea ) 0.9460.876-1.0210.155Table 1. kasvaimen vaiheessa ja imusolmuke tila ovat riippumattomia prognostisia parametrit virtsarakon syöpään erityisiä selviytymisen.

monimuuttuja Coxin suhteellinen vaara selviytyminen regressionsanalys n = 76 potilasta kasvain vaiheessa ja imusolmuke tila pystyivät ennustamaan syöpäspesifisessä eloonjäämisen riippumaton muiden parametrien

p

-arvot 0,05 määritettiin merkittäviä. CSV Lataa CSV

BGN geeniekspressiota

P

valuesΣ = 76median (alue) ikä ≤ 65 352,81 (0.06-24.33) 0,847 65 n1.95 (0,06-8,28) Sukupuoli 591,66 (0,06-8,28) 0,003 Nainen 174,86 (0,16-24,33) Stage Ta 191.00 (0,13-4,01) 0,986 T1 151,06 (0.12-4.26) 0,512 T2 141,30 (0,06-5,53) 0,069 T3 143,78 (0,23-12,62) 0,909 T4 145,21 (0,24-24,33) Noninvasiiviset 341,03 (0,12-4,26) 0,004 Muscle-invasiivisia 423,37 (0,06-24,33) Grade G1 130,76 (0,12-4,01) 0,919 G2 271,08 (0,13-4,26) 0,002 G3 363,80 (0,06-24,33) Heikompilaatuinen (G 1-2) 380,97 (0,12-4,26) 0,001 Korkeatasoinen (G 3) 373,76 (0.06-24.33) Imusolmuke N0 /Nx622.05 (0,06-24,33) 0,196 N 143,66 (0,23-15,3) Primer 433,01 (0,12-24,33) 0.883Recurrent 331,44 (0,06-8,08) Tupakointi kyllä ​​422,01 (0,06-24,33) 0,008 no 233,40 (0,13-15,28) tuntematon 18Table 2. BGN mRNA ekspressiotasot ovat koholla lihas invasiivisia kasvaimet, korkea-asteen kasvaimet, savuton ja naissukupuoli potilaita.

mRNA geeniekspressiotasot n = 76 virtsarakon syöpään. Tiedot saatiin flash-jäädytetty kasvainnäytteestä. Univariate Coxin suhteellinen vaara eloonjääminen regressioanalyysia käytettiin data-analyysi,

p

-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä. CSV Lataa CSV

BGN proteiinin ilmentymistä ihmisen virtsarakkokarsinoomat

BGN värjäytymistä ihmisen kasvainten näytteissä havaittiin vain heikkoja signaaleja strooman kudokseen noninvasiivisten Ta ja T1 kasvaimet (kuvio 2A). BGN värjäytymisen intensiteetti kasvoi lihas-invasiivisia kasvaimen vaiheissa (kuvio 2B ja C). Kuten odotettua, kasvain morfologia pinnalliseen vaiheissa oli samanlainen normaalissa virtsarakossa morfologia kanssa selkeästi toisistaan ​​kasvainkudoksen ja strooman kudosta. Korkeampi kasvaimen vaiheissa (T4), stroomasolut ja kasvaimen solut sekoitetaan keskenään ja molemmat solutyypit osoittivat yhdessä BGN värjäytymistä (kuvio 2B ja C). Kuitenkin, koska BGN on erittyvä proteoglykaani solu lähde ei voida päätellä, immunovärjäystä kudoksissa. Kvantitointi positiivisen alueen murto vahvisti lisääntynyt värjäytymisen intensiteetti BGN lihaksessa-invasiivisia kasvain vaiheet (T2-4) verrattuna ei-lihas- invasiivisia Ta ja T1 vaiheissa (kuvio 2D). Lisäksi korrelaatio BGN positiivisen alueen osa ja invasiivisuuden kasvaimen havaittu (

p

= 0,0025, kuvio 2E).

A – C, BGN immunovärjäys suoritettiin parafiiniin kudosleikkeet. (A), Ta; (B), T2; (C), T4. (D), kvantitatiivinen kuva-analyysin BGN ei-invasiivisia kasvaimet (Ta, T1) ja lihas-invasiivisia kasvain vaiheessa (T2-T4). (E), korrelaatiota BGN positiivisen alueen osasta, jossa tuumorin luokitus. n = 5 potilas koepaloja kunkin kasvaimen vaiheen ***

p

0,0001, **

p

= 0,0025.

Antiproliferative vaikutus BGN vuonna ihmisen virtsarakon syövän solujen

in vitro

tulokset ihmisen virtsarakon syöpään näytteitä ehdotti, että BGN ilmaisu liittyy syövän etenemiseen. Saadaksemme mekanistinen oivalluksia, mahdolliset vaikutukset BGN kasvainten solujen fenotyyppiin tutkittiin

in vitro

jäljempänä esitetyllä tavalla. Ensimmäinen, immunoblottia erittyy BGN suoritettiin päässä elatusaineesta ihmisen virtsarakon syövän solulinja, J82 (kuvio 3A). Kuten havaitaan näytteestä J82 soluja ilman kondroitinaasi ABC ruoansulatusta BGN proteoglykaanien julkaistiin suhteellisen pieniä määriä alustaan. Lisäksi, BGN ydin-proteiinia ei havaittu näiden näytteiden samoin. Kontrollina soluille, jotka erittävät suuria määriä BGN proteoglykaanien, immunoblot kunnostettua alustaa on johdettu ihmisen sepelvaltimon sileän lihaksen soluissa oli mukana (kaksi kaistaa vasemmalla). Immunoblottaus paljasti lisäksi, että yhdistelmä-BGN käytettiin myöhemmissä kokeissa koostui pääasiassa ydinproteiinista koska bändit eivät siirtynyt kondroitinaasi ABC (kuvio 3A) ja ajaa tyypillinen koko ydin proteiinia. Seuraavaksi rekombinantti biglykaania core-proteiinia käytettiin proliferaatiomäärityksessä (kuvio 3B). Lisäämällä 0,26-26 nM BGN ydin (0,01-1 ug /ml) aiheutti annoksesta riippuvan inhibition soluproliferaation J82-solujen (kuvio 3B). Lopuksi asettaa perustan

in vivo

ksenografti- kokeilu ja purkaa roolia endogeenisen BGN lentivirusten knock-alas BGN suoritettiin ihmisen virtsarakon syövän solulinja, J82. Tärkeää on, knock-alas BGN aiheuttanut lisääntynyttä lisääntymistä (shBGN 1.39 ± 0,06-kertainen ohjaus,

p

0,05), joka oli päinvastainen lisäämällä (2,6 nM) eksogeenisen BGN (0,83-kertainen ohjaus ± 0,06) (kuvio 3C). Lisäämättä eksogeenistä BGN soluihin transdusoitiin salattu shRNA aiheutti suuntaus vähentynyt proliferaatio. Seuraavaksi proliferaatio määritettiin jälkeen yliekspressio ihmisen BGN. Ilmainen pro-proliferatiivisen vaikutuksen jälkeen BGN knock-down, BGN yliekspressio johti huomattavaan vähenemiseen DNA-synteesin verrattuna tyhjän vektorin ohjaus (oeBGN, 0,50 ± 0,06-kertainen ohjaus, PCL-1, 1,0 ± 0,09-kertainen ohjaus, kuvio 3C).

(A) ja immunoblottaus BGN puhdistettiin elatusaineesta ihmisen J82 virtsarakon karsinooman solut ja rekombinantti BGN PlusMinus kondroitinaasi ABC ruoansulatusta. Kontrollina väliaine ihmisen sepelvaltimon sileän lihaksen soluissa (CaSMC) käytettiin, koska nämä solut tiedetään erittävän suuria määriä BGN proteoglykaanin (vasen kaksi kaistaa). Kondroitinaasi ABC levitettiin lisävalvontatoimenpiteenä (oikea kaista) (B) J82-solut inkuboitiin matalan seerumin (2%) ja yhä enemmän rekombinantin BGN ja solujen määrä määritettiin FACS-analyysillä 7 päivän jälkeen; n = 3. Edustavia valomikroskooppisella kuvia näytetään. (C) Ihmisen J82 solut joko lentivirally transdusoitu knock-down BGN ilmentymisen tai yli-ilmentää ihmisen BGN. Vastaavat kontrollit olivat soluja transdusoitu salattu shRNA (scr) tai tyhjän vektorin ohjaus (PCL-1). Lisäksi, yhdistelmä-DNA-BGN on käytetty. Yhdeksän päivää transduktion jälkeen, proliferaatio määritettiin osoituksena DNA-synteesiä. BGN knock-down oli proliferatiivinen vaikutus oli päinvastainen lisäämällä yhdistelmä-BGN (2,6 nM = 100 ng /ml). N yli-ilmentyminen BGN johti vähentyneeseen DNA-synteesin; n = 5, *

p

0,05.

Knock-down of BGN kiihdyttää J82 ksenograftin kasvua nude-hiirissä

J82 solut transdusoitu shRNA kohdistamista BGN ja muokkaamalla shRNA oli ksenosiirrettyjä osaksi nu /nu nude-hiiriin vaikutuksen tutkimiseksi BGN alassäätöä myös

in vivo

. Mittaus ksenografti kasvaimen tilavuuden paljasti merkittävää nousua kasvaimen kasvun BGN knock-down ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään hoidettiin salattu shRNA 49 päivää injektion jälkeen solujen (päivä 49, shBGN 374.7mm

2 ± 82,8 mm

2, salattu shRNA 204,2 mm

2 ± 28,5 mm

2, n = 6,

p

0,001, kuva 4). Kasvaimet olivat yrityksen ulkonäkö mitään merkkejä kuolion ja vain yksi kasvaimia shBGN ryhmä soluttautua ympäröivään kudokseen (tässä tapauksessa alempi kylkiluut). Mikään kasvaimia kontrolliryhmän tunkeutuu ympäröivään kudokseen. Ei ollut mitään näkyvää metastasoituneen kasvainsolujen kasvua keuhkoissa ja maksassa arvioituna histologia. Seuraava immunohistokemiallinen analyysi osoitti, että BGN värjäytyminen vielä pelkistettiin BGN knock-down ryhmä (BGN positiivinen alue jae shBGN ryhmässä 10,82 ± 2,3% ja 25,25 ± 2,4% salattu shRNA kontrolliryhmässä) jälkeen 7 viikkoa (kuva 5 A-C). Tärkeää on, mukaisesti

in vitro

tiedot kuvassa 3, kasvainsolujen lisääntymistä nostettiin jälkeen BGN knock-down osoituksena Ki67 värjäys kontrolliin verrattuna (Ki67 positiivinen alue jae shBGN ryhmässä 16,68 ± 2,1 % ja 7,18 ± 1,2% salattu shRNA kontrolliryhmässä,

p

= 0,005, Kuvio 5D-F). Kasvaimen verisuonten muodostumista ei vaikuttanut osoituksena CD31 värjäytymistä (kuvio 5G-I).

jälkeen knock-down of BGN ihmisen J82 soluissa

vitro

transdusoidun solut injektoitiin bilateraalisesti osaksi paljaiden hiirien kylkiin ja kasvaimen kasvua seurattiin ajan 7 viikkoa. Tämän seurauksena kasvaimen tilavuus oli merkittävästi korkeampi soveltamisen jälkeen J82-solujen transdusoitu shRNA kohdistuksen BGN verrattuna salattu ohjaus (375 mm

2 vs. 204 mm

2); n = 6, ***

p

0,001.

ksenograftikasvaimissa kerättiin talteen 7 viikkoa ja prosessoidaan immunovärjäämistä ja morfologinen analyysi. BGN Immunovärjäyksen ja kuva-analyysi paljasti laski BGN ilmaisu verrattuna salattu ohjaus (A, B). Alueella osa BGN positiivista värjäytymistä oli 25,3% verrokeilla verrattuna 10,8% ksenograftikasvaimissa peräisin shBGN soluista, n = 6, **

p

= 0,0087 (C). Seuraavaksi proliferatiivinen indeksi arvioitiin käyttäen Ki67 antigeeni. Kontrolliin verrattuna (D) osuus alueen osa Ki67-positiivisten solujen merkittävästi kohonnut kasvaimissa koostuu shBGN transdusoitujen J82-solut (E, F, 7,2% vs. 16,7%, n = 6, **

p

= 0,005). (GI) keskimääräinen mikroverisuonitiheys (MVD) määritettynä CD31 immunovärjäyksellä ei vaikuttanut vuonna ksenograftikasvaimissa, n = 6.

Multi-reseptori tyrosiinikinaasin estäjät aiheuttaa BGN

in vivo

ja

in vitro

data edellä kuvattu erittäin suositeltavaa, että BGN on kasvunestäjää ihmisen virtsarakon syöpäsoluja. Ajan tasalla ole terapeuttista modulaattorit BGN ilmentymisen syöpä on kuvattu. Näin ollen, vaikutusta pienen molekyylin reseptorityrosiinikinaasin estäjien BGN ilmentyminen tutkittiin. Tätä tarkoitusta varten usean reseptori tyrosiinikinaasin estäjät, sorafenibia ja sunitinibi, käytettiin pitoisuuksina, jotka tiedetään estävän syöpäsolujen lisääntymistä, mukaan lukien virtsarakon syöpä (J82-solut) [30-32]. Solujen morfologia ei vaikuttanut 24 tunnin kuluessa sorafenibihoidon ja sunitinibin. Huomattavaa on, että sorafenibihoidon (10 uM) ja sunitinibin (1 uM) aiheutti voimakasta ylös-säätely BGN mRNA ilmaisun jälkeen 24 tuntia (kuvio 6A).