Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

Syöpä liittyy strooman fibroblasteja (valuuttalisiin) käyvät transkription ja fenotyypin muutokset, jotka vaikuttavat kasvaimen etenemiseen, mutta mekanismit vastuussa näistä muutoksista ei ole hyvin ymmärretty. Poikkeava DNA: n metylaatio on tärkeä syy transkription muutosten syöpäsoluissa, mutta ei tiedetä, kuinka tärkeää DNA: n metylaatio muutokset on CAF käyttäytymiseen.

Experimental Suunnittelu

Käytimme Affymetrix eksoni taulukot vertailla geenejä aiheuttama DNA: n metylaation estäjä 5-atsa-dC viljellyissä haimasyövän liittyy fibroblastien, haiman ohjaus fibroblastit ja haimasyövän solulinjoissa.

tulokset

Huomasimme, että haiman valuuttalisiin ja hallita haiman fibroblastit olivat vähemmän reagoivien 5-atsa-dC välittämä geenin uudelleenaktivointi kuin haiman syöpäsoluja (keskiarvo +/- SD geenien aiheuttama ≥5-kertainen oli 9 ± 10 geenien 10 haiman CAF kulttuureissa, 17 ± 14 geenejä 3 ohjaus haiman fibroblastiviljelmät, ja 134 ± 85 geenien 4 haimasyövän solulinjoissa). Tutkimme ilmentyvät eri geenien välillä valuuttalisiin ja ohjaus fibroblastit varten ehdokas metyloitu geenien ja tunnistettu disintegriini- ja metallo-

ADAM12

kuin hypometyloidut ja yli-ilmentynyt haiman CAF linjat ja yli-ilmentynyt fibroblasteissa vieressä ensisijainen haiman adenokarsinooman.

Johtopäätökset

verrattuna haimasyöpäsoluissa, harvat geenit aktivoida DNMT1 esto haiman valuuttalisiin viittaa nämä solut eivät satama monia toiminnallisesti tärkeitä muutoksia DNA: n metylaatio. Valuuttalisiin voi myös olla hyvin vastaamaan terapeuttinen kohdistuksen DNA: n metylaatio estäjiä.

Citation: Yu J, Walter K, Omura N, Hong S-M, Young A, Li A, et al. (2012) Toisin haimasyöpäsoluissa Haimasyöpä Associated Sidekudosmuodostussolujen Näyttö Vähäinen Gene induktio jälkeen 5-atsa-2′-Deoksisytidiini. PLoS ONE 7 (9): e43456. doi: 10,1371 /journal.pone.0043456

Editor: Brock C. Christensen, Geisel School of Medicine Dartmouth, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 24 heinäkuu 2012; Julkaistu: 11 syyskuu 2012

Copyright: © Yu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Cancer Institute apurahat (CA62924 ja RC2148346), ja Michael Rolfe Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Epigeneettiset muutoksia geenien ilmentyminen on keskeinen osa syöpäsolujen [1]. Yksi parhaiten karakterisoitu epigeneettinen muutokset on DNA: n metylaatio. DNA metylaation ovat periytyviä ja ylläpidetään jälkeen solunjakautumisen lähinnä DNA metyylitransferaasi Dnmt1. Poikkeava DNA hypermetylaation usein tapahtuu CpG saarilla geenien promoottorit ja liittyy suljetun chromatin tila ja geenien tukahduttamisen. Huomattavaa näyttöä siitä, että poikkeava hypermetylaation ja geenien sekä tuumorisuppressoreilla ja muiden sääntelyyn geenien mukana kehittämässä haiman ja muiden syöpien [2]. Poikkeava hypometylaatio normaalisti metyloitua ja vaiennettu geenejä on kuvattu myös haiman ja muissa syövissä syynä poikkeavan geenin yli-ilmentymisen [3], [4].

mekanismeja vastuussa näistä poikkeavaa metylaatiovyöhykkeiden syövät eivät ole hyvin ymmärretty, mutta epäillään mekanismeihin sisältyy yli-ilmentyminen

DNMT1

, kertyminen DNA: n metylaatio muutoksia iän myötä [5], [6] ja ympäristön vaikutuksia [7], muuttunut aktiivisuus

de novo

metyloinnin entsyymit

DNMT3a

ja

DNMT3b

[8], [9], ja mahdollisesti muuttunut cellular mikroympäristölle kuten kroonisesta tulehdus [3], [10].

ei-neoplastisia strooman solujen kasvaimen mikroympäris- läpikäydä myös transkription ja muita fenotyyppisiä muutoksia suhteessa normaaleihin soluihin, joita uskotaan edistävän kasvaimen etenemiseen. Haimasyöpä on tappava tauti [11] ja on hyvin tunnettu laajasta desmoplastic strooman vastaus sisältää keskimäärin 75% soluista kasvaimen massa [12]. Arvellaan, että strooman komponentti myötävaikuttaa vastus haiman syövistä lääkehoitoja [13], ja useat tutkimukset sotkea eroja strooman käyttäytymisen potilaiden hoitotuloksiin haiman ja muiden syöpien [14], [15], [16], [ ,,,0],17], [18]. Syöpäliittynyt fibroblastit (valuuttalisiin), hallitseva solutyyppi strooman mikroympäristössä hyväksyä aktivoitu fenotyyppi aikana tuumorigeneesiprosessin meneillään morfologinen, toiminnallinen ja geenien ilmentyminen muuttuu suhteessa normaaliin fibroblastien [19]. Nämä aktivoitu valuuttalisiin on tunnusomaista α-sileän lihaksen aktiini (α-SMA) ilmentymistä [20], parantaa supistuvien ja sekretorisen kyky, ja lisääntynyt synteesi kollageenien, soluväliaineen proteiinit [21], ja kasvutekijät, mukaan lukien epiteelin kasvutekijä, platelet- kasvutekijät (PDGF), fibroblastien kasvutekijä, hepatosyyttikasvutekijä, ja transformoiva kasvutekijä beeta (TGF-β) [22]. Näiden ja muiden signaalien, valuuttalisiin vuorovaikutuksessa läheisesti syöpäsolujen edistää niiden kasvua, ja näin ollen valuuttalisiin ovat erittäin kiinnostavia terapeuttisena kohteena. Itse asiassa viime strategioita kohdistaa valuuttalisiin muun muassa käyttämällä kinaasin estäjä, imatinibi estää strooman PDGF-reseptoreita [23], vasta-aineet estävät verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF), jotka ovat peräisin sekä syöpäsolujen ja valuuttalisiin estää kasvaimen angiogeneesiä [24] ja käyttö smoothened (Smo) estäjät estää kasvaimen strooman Hedgehog signalointi ja heikentävistä strooman fibroblastit jotka yli-ilmentävät siilin (Hh) -reseptorin Smo [25], [26], [27], [28]. Tämä alustava tutkimuksissa tasaantunut estäjien haimasyöpä ei ole merkkejä hyöty korostetaan perusopintoihin tutkii kasvain strooman vuorovaikutusta. Toinen mahdollinen hyöty kohdistaminen syöpä stroman on parantaa saatavuutta terapeuttiset haiman syöpäsoluja. Esimerkiksi, lääke Nab-paklitakselin (Abraxanea), joka on nanohiukkasten paklitakselista, sitoutuu Sparc, joka on strooman matriisin proteiini usein ilmentyy voimakkaasti haiman syövän strooman, joka välittää kasvaimen strooman vuorovaikutukset, siten mahdollisesti parantaa lääkeaineen kasvaimen [29] , [30]. Kliiniset kokeet Abraxanen haimasyövän lupaavia ja eläinmalleissa on näyttöä siitä, että toimituksen gemsitabiinin kasvaimeen paranee Abraxanen, ja siili estäjien [25]. Tehokkuus Gemsitabiini /Abraxanella lääkeyhdistelmä odottaa vielä tuloksia vaiheen 3 kliinisissä tutkimuksissa.

Vaikutus valuuttalisiin syövän kasvu on osoitettu lukuisissa tutkimuksissa [31], [32] mutta molekyylitason mekanismeista CAF fenotyyppi ei ymmärretä hyvin. Vaikka merkittävä vaikutus valuuttalisiin epäillään kasvaimen microenvironment myös vaikutteita syöpäsolujen itse, valuuttalisiin säilyttävät kasvain edistäviä ominaisuuksia

in vitro

pitkittyneen soluviljelmissä [33], mikä viittaa siihen, että perinnöllinen mekanismit ovat vastuussa . Vaikka geneettisten muutosten valuuttalisiin on kuvattu, uudempia tutkimukset tutkivat mahdollisuutta, että valuuttalisiin läpikäyvät klonaalisen geneettisiä muutoksia samanlainen syöpäsoluja löytäneet mitään todisteita tällaisille muutoksille [33], [34], [35], [36], [37 ], [38]. Koska laajaa geneettisten mutaatioiden, on kohtuullista olettaa, että epigeneettiset mekanismit, kuten DNA: n metylaatio, jotka ovat mitoottisesti periytyviä, vastaavat stabiilin geeniekspression muutoksia valuuttalisien. Itse asiassa, useita geenejä osallistuvat kasvaimen-strooman vuorovaikutusta ja indusoitiin valuuttalisiin jonka yhteisviljelmä, jossa syöpäsolut, kuten

SPARC

[29], [30],

COX-2

ja matriisin metalloproteinaasien (MMP) [39] säännellään DNA: n metylaatio. Lisäksi valuuttalisiin kohdistuu samaan vaikutteita kasvaimen mikroympäristössä, joiden arvellaan osaltaan metylaation muutoksiin syöpäsoluja, kuten krooninen tulehdus [34].

heterogeenisuus valuuttalisiin eri kasvaimia ja jopa sisällä sama kasvain [14], [30] osoittaa myös, että valuuttalisiin on useampia lähteitä, jotka voisivat edistää epigeneettisiä eroja. Sen lisäksi aktivointi asuvien fibroblastien kasvaimen mikroympäristössä, jotkut valuuttalisiin ovat luuytimestä peräisin mesenkymaalisten esiastesolujen [40], [41] ja ehkä epiteeli- tai endoteelisolujen, joille mesenkymaalitransitioon [21], [42]. Koska nämä erilaistumista ja transdifferentiation prosesseja säätelevät epigeneettisellä mekanismien [43], valuuttalisiin peräisin eri lähteistä on erilaiset epigeneettisellä ja transkription profiileja verrattuna niiden asuville kudosta kollegansa.

Vain harvat tutkimukset ovat alkaneet tutkia epigeneettiset mekanismit näiden transkription muutokset valuuttalisien. Yksi ensimmäisistä tutkimuksista antaa viitteitä DNA metylaatio eroista normaalin ja kasvaimeen liittyvä stroomasolujen otti genominlaajuisten lähestymistapaa käyttäen metylaatiospesifisen digitaalista karyotyping (MSDK) profiiliin epiteelisolujen myoepithelial solut ja strooman fibroblastit aikana rinta- syövän etenemistä [35] . Toinen lähestymistapa, jossa yhdistetään laser kaapata mikrodissektion metylaatiospesifisiin PCR (MSP) kandidaattigeenien tunnistettu usein promoottori metyloinnin

GSTP1

ja

RARB2

eturauhasen kasvaimeen liittyvien stromasoluja suhteessa normaaliin eturauhasen stroomasoluissa [ ,,,0],44]. Kolmas lähestymistapa käyttäen metylaatioherkät SNP erilaisia ​​analyysi (MSNP) osoittivat polttoväli voittoja metylaation ja globaalin hypometylaatio mahalaukun syöpään liittyvän myofibroblasteja [36].

Yksi käyttökelpoinen strategia, jolla metylaation tapahtumia on suorittaa geeni uudelleenaktivointi näytön käyttämällä DNA: n metylaatio inhibiittorit, kuten 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC), joka selektiivisesti kohdistuu DNMT1 entsyymin ehtyminen. Tämän menetelmän etuna on tunnistaa DNA: n metylaation muutoksiin, jotka säätelevät transkriptiota ja näin ollen todennäköisemmin toiminnallisesti tärkeää. Vaikka tämä lähestymistapa on onnistunut tunnistettu metylaatio tapahtumia syöpäsoluissa useista kasvaintyypeille [45] tietojemme tätä lähestymistapaa ei ole käytetty tunnistamaan geenejä säätelee metylaatio valuuttalisien. Sen määrittämiseksi, onko DNA: n metylaatio on samoin tärkeä säätävät geenien ilmentymisen muutoksia valuuttalisiin kuten syövän solulinjat, teimme genomin laajuinen reexpression analyysi ihmisen haiman syöpään liittyvien fibroblastit ja haimasyövän solulinjoissa käyttäen 5-atsa-dC.

Materiaalit ja menetelmät

Culture of Solulinjat

primaariviljelmät strooman fibroblastien, nimetty syöpään liittyvä fibroblasteja (valuuttalisiin) CAF9, CAF11, CAF12, CAF13, CAF14, CAF15, CAF16, CAF18, CAF19, CAF20, CAF21, CAF22, CAF25, ja CAF35 perustettiin kirurgisesti-resektoitiin haimasyöpä kudosta 13 potilaalla (6 urosta keskiarvo ± keskihajonta (SD) ikä 58 ± 7 vuotta), joilla on kliinisesti satunnaista haiman adenokarsinooma. Syövistä olivat kaikki kohtalaisesta heikosti eriytettävä, jolloin kasvaimen keskimääräinen koko on 3,5 cm. Nämä ensisijainen CAF perustettiin viljelmät kuten aikaisemmin on kuvattu [27] kuin kaksi hTERT kuolemattomiksi ohjaus fibroblasteja (SC2 ja SC3, perustetaan kirurgisesti resektoitiin epäneoplastisis- haima kudos 2 narttua (keski-ikä 63 vuotta) [27]. Immortalisoitu ihmisen haiman nestiinifenotyypin-ilmentävien (HPNE) solulinja jalomielinen lahjoitus Dr. Michel Ouellette (University of Nebraska Medical Center) [46]. Neljä haimasyövän solulinjoissa, mukaan lukien A32-1, Panc2.8, Panc3.014 ja Panc215 perustettu alkutuotannosta haimatiehyen adenokarsinooman meidän laitoksen ja kuvattu aiemmin [47] käytettiin myös tässä tutkimuksessa. Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä DMEM (4,5 mg /ml glukoosia; Invitrogen), joka sisälsi 10% FBS vakio-olosuhteissa kuten aiemmin on kuvattu [48] . Kaikki tutkimukset suoritettiin hyväksyntää Johns Hopkins komitean Clinical Investigation.

5-atsa-dC hoito ja RNA

solut maljattiin 2 x 10

5 solua kohti T75 pulloon ja käsiteltiin seuraavana päivänä 1 umol /l 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC, Sigma) [49] 4 päivää aikana eksponentiaalisen kasvuvaiheen, jossa muutos median ja huumeiden aina 24 tuntia. Päivänä 5, kun solut olivat lähes konfluentteja, ne pestiin kylmällä PBS: llä ja kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Qiagen (Qiagen) tai Mirvana miRNA-kittiä (Ambion) mukaisesti valmistajan ohjeiden kuten aiemmin on kuvattu [50].

eksoni array ja valinta geenien validointi

Affymetrix GeneChip- Human eksoni 1.0ST array alustaa käytettiin analysoimaan geeniekspressiomalleja käsittelemättömissä ja 5-atsa-käsitellyt dC fibroblasteja ja syöpäsolujen linjojen, kuten aiemmin on kuvattu [27]. Olemme noudattaen Pienin Tietoa Microarray Experiment suuntaviivoja ja ovat toimittaneet meidän microarray data asetetaan Gene Expression Omnibus arkistoon (GEO liittymistä # GSE20911).

kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR)

1 ug kokonais-RNA: ta käänteiskopioitiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen). Saatu cDNA monistettiin ABI 7300 Real-Time PCR lämpösyklerissä käyttämällä SYBR GREEN PCR Master Mix ja suositellut PCR-olosuhteita (Applied Biosystems). Housekeeping-geeni

GAPDH

käytettiin normalisointia. Primer spesifisyys varmistettiin sulamiskäyräanalyysillä. Tulokset ilmaistaan ​​normalisoituna ilmaisu arvot suhteessa osoitettuun solulinja (= 2

-ΔΔCt). Kaikki PCR-reaktiot suoritettiin kolminkertaisina. Alukkeet sekvenssit ovat seuraavat:

Stratifin

RTsense: 5′-TCTGATCCAGAAGGCCAAG-3 ’;

Stratifin

RTantisense: 5′-GTTTCGCTCTTCGCAGGAG-3 ’;

TKTL1

RTsense: 5′-AGCTCCGGCCACCCTACATCATG-3 ’;

TKTL1

RTantisense: 5′-TGCCACATCCACAAACGACAGTCT-3 ’;

ADAM12

RTsense: 5′-AAATGAAGGTCTCATTGCCAG-3 ’;

ADAM12

RTantisense: 5′-AGAATTACCCGTGTAATTTCGAG-3 ’;

GAPDH

RTsense: 5′-CAACAGCCTCAAGATCATCAG-3 ’;

GAPDH

RTantisense: 5′-ACTGTGGTCATGAGTCCTTC-3 ’.

bisulfiittimodifiointi Sequencing

metylaatiostatuksen 5′-CpG-saarekkeiden kandidaattigeenien määritettiin bisulfiitti sekvensoinnilla. Bisulfiittimodifikaatio ja PCR suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [51]. Vetysulfiitilla Modified Sequencing (BMS) alukkeet olivat seuraavat:

TKTL1

BMS eteenpäin: 5′-TGTGTAGAGAAAGAAGATTTTGTATT-3 ’,

TKTL1

BMS reverse: 5′-CCCTTTAAAATCTAAAAACCCACTC-3′, ja sisäisen sekvensoinnin aluke

TKTL1

BMS-sekvenssi: 5′-GATTGTAGGAGAGAAGATGAG-3 ’;

ADAM12

BMS eteenpäin: 5′-TTTAGTTTTAGTTTGAAAAGTTGGA-3 ’,

ADAM12

BMS reverse: 5′-CTAAACTCTTCTAACCTTTCAT-3′, ja sisäinen Sekvenointialuke

ADAM12

BMS-Seq : 5′-TTCTAACACAAACCAACCTTAACC-3 ’. Puhdistettuja tuotteita sekvensoitiin Johns Hopkins Core Sequencing Facility.

Western blot -analyysi DNMT1 Expression

Western blot -analyysi suoritettiin käyttäen lysaatit käsittelemättömän tai 5-atsa-dC-käsitelty HPNE tai CAF12 solut. Bradford-määritystä käytettiin arvioimaan proteiinin pitoisuus, käyttäen naudan seerumin albumiinia (BSA, Invitrogen) standardina. Yhtä suuret määrät proteiinia (40 ug per kaista) erotettiin 4-12% gradientti SDS-geelielektroforeesilla (Invitrogen), siirrettiin nitroselluloosamembraaneille ja inkuboitiin blokkausliuoksessa (5% maitoa TBS: ssä, jossa oli 0,1% Tween 20) 30 minuutin ajan . Membraaneja inkuboitiin 60 minuuttia anti-DNMT1 polyklonaalista vasta-ainetta (jalomielinen lahjoitus tohtori Bill Nelson, JHU) on 1:200 laimennus tai monoklonaalinen vasta-aine GAPDH (Cell Signaling, Danvers, MA) 1:2000 laimennus. Toissijainen HRP-sidoksissa-aineita (Santa Cruz Biotechnology, ja Amersham Biosciences) levitettiin 1:2000 laimentaminen ja proteiinit havaita käyttäen ECL (Amersham Biosciences).

Haiman adenokarsinooma kudossiruina ja Adam12 immunohistokemia

ilmentyminen Adam12 tutkittiin proteiinin käyttäen immunohistokemiallista (IHC) merkintöjä formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettujen kudossiruina (TMA) käyttäen DAKO Autostaineriin (DAKO, Carpinteria, CA). Neljä TMA, jotka sisälsivät yhteensä 72 erilaista kirurgisesti resektoitiin haimatiehyen adenokarsinoomia ja vastaavassa normaalissa haiman kudoksista muodostettiin kuten aiemmin on kuvattu [29]. Adam12 IHC värjäys suoritettiin kuten on aiemmin kuvattu [29] käyttämällä kanin anti-humaani Adam12-vasta-ainetta (A2601, Sigma) kanssa 1:100 laimennus- ja 60 minuutin inkubaatioajan. Leimaus suoritettiin käyttäen Envision-sPlus Detection Kit (DAKO).

Tilastollinen analyysi

Tarkempi tilastolliset arvot ja käyrät laadittiin Microsoft Excel paketti tai Partek® Genomics Suite ™ V6.3 beta . Robust Multichip keskiarvo (RMA) menetelmää käytettiin normalisoimaan raaka intensiteetti mittauksista kaikista koetinsarjojen. Geenien ilmentyminen arvot saatiin sitten käyttämällä yksivaiheista Tukeyn biweight menetelmällä. Kaksisuuntainen ANOVA tehtiin tunnistaa merkittävät ilmentyminen muuttuu välillä käsittelemättömän ja 5-atsa-dC-käsitelty fibroblastien tai syöpäsolulinjoissa, tai välillä valuuttalisiin ja valvonnan fibroblasteissa. Eroja pidettiin merkittävinä osoitteessa

P

0,05, ja arvot ilmoitetaan ovat keskiarvoja ± SD.

Tulokset

Global geeniekspressioanalyysiä ihmisen haiman fibroblastien ja syöpäsolulinjoissa käsitelty 5-atsa-dC

perustettu ensisijainen haiman CAF kulttuureissa ja ohjaus fibroblastiviljelmät kuten aikaisemmin on kuvattu [38]. Käyttämällä globaalin geeniekspressioprofilointi, olemme aiemmin tunnistettu geeni-ilmentymisen eroja haiman valuuttalisiin suhteessa kontrolliin fibroblasteissa [27]. Hierarkkinen ryhmittely geeniekspressioprofiilien käsittelemättömän CAF ja valvonta fibroblastit on esitetty kuviossa S1. Epäillä, että nämä muutokset geenien ilmentyminen oli osittain välittävät muutokset DNA: n metylaatio, vertasimme geeniekspressioprofiilien CAF ja valvonnan fibroblastiviljelmät ennen ja jälkeen hoidon 5-atsa-dC käyttäen Affymetrix eksoni Array (ST 1,0) (CAF11, CAF12, CAF13, CAF15, CAF16, CAF18, CAF19, CAF22, CAF25, ja CAF35 varten valuuttalisiin, HPNE, SC2 ja SC3 valvonnan fibroblastisolut, vastaavasti).

ensimmäinen vahvistettu 5-atsa-dC ehtyminen n Dnmt1 entsyymin Western blotilla. 5-atsa-dC hoitoon HPNE ja CAF12 solujen johti ehtymiseen Dnmt1 proteiinin 1 uM pitoisuuksina, mutta ei GAPDH kontrolli-proteiinia (kuvio 1). Tutkimaan edelleen vaikutusta 5-atsa-dC pitoisuudet, vertasimme joukko geenejä aiheuttamien 1 uM ja 10 uM 5-atsa-dC kaksi ylimääräistä valuuttalisiin, CAF19 ja CAF35, eikä löytänyt suurta eroa määrä geenit indusoitu näiden lääkeainepitoisuudet (tuloksia ei ole esitetty). Siksi käytetään 1 uM pitoisuuksina 5-atsa-dC kohtelemaan jokaista CAF. Käsittelimme CAF solujen 4 päivää, koska tämä oli riittävä kesto solujen lisääntymisen. Pidemmät hoidot (5-7 päivää) johti usein valuuttalisiin kasvaa konfluenssiin (tietoja ei esitetty). Tämän mukaisesti suoritimme proliferaatiomäärityksillä päälle CAF19 eri 5-atsa-dC pitoisuudet (0 uM, 1 uM, 5 uM, 10 uM, ja 20 uM) ja totesi, että kasvu ei vaikuta huomattavasti klo 1 uM käytimme (Kuva S2).

DNMT1 proteiini on tyhjentynyt (suhteessa GAPDH) 5-atsa-käsitellyt dC HPNE ja CAF12 soluja.

Kun verrataan ilmaisun profiilit kunkin CAF ennen ja sen jälkeen 5-atsa-dC hoito, ensin tunnistaa geenejä, jotka voimistuvan yleisen kertamuutosta keskiarvo ≥2.0 kaikissa kymmenessä 5-atsa-dC-käsitelty valuuttalisiin suhteessa hoitamattomiin valuuttalisiin. Valitsimme 2-kertainen cut-off kuin vaatimattomampi erot RNA katsottiin todennäköisesti liittyvän kokeellisen vaihtelua. Koska olimme kiinnostuneita tunnistamaan geenejä vaiennettu in valuuttalisiin jonka indusoitiin 5-atsa-dC, me sitten suljettu osajoukko geenien ilmaistiin hoitamatta valuuttalisien. Tämä kriteeri tunnistettu 42 kandidaattigeenit (taulukko 1).

edelleen varmistamiseksi 5-atsa-dC välittämä geenin induktion suoritimme qRT-PCR geeni

Stratifin

(14- 3-3 sigma) ja

Transketolaasi kaltaisen proteiinin 1

(

TKTL1

), koska niiden ilmentymistä säädellään metylaation muissa solutyypeissä ja eksonin erilaisia ​​analyysi tunnistaa niiden ilmentyminen kuin aiheuttama 5- atsa-dC [52] [53]. Yhdenmukainen eksonin array seurauksena

stratifin

(

SFN

) mRNA-tasot olivat matalia tai havaitsemattomia kaikissa käsittelemättömät fibroblasteissa (valuuttalisiin ja valvonta fibroblastit), ja lisääntynyt ilmentyminen

SFN

mRNA: ta havaittiin useimmissa 5-atsa-käsitellyt dC-fibroblasteissa (kuvio. 2 A ja B). Havaitsimme kohteen täydellinen metylointi

SFN

promoottorialue kaikissa valuuttalisiin bisulfiitti- sekvensoinnilla (tuloksia ei ole esitetty). Vastaavasti,

TKTL1

mRNA-tasot olivat havaittavissa lähes kaikki käsittelemätön fibroblastien paitsi SC2 soluja, ja lisääntynyt ilmentyminen

TKTL1

havaittiin suurin osa 5-atsa-käsitellyt DC-fibroblasteissa (kuvio. 2 C). Tämän mukaisesti löydettiin todisteita metylaation 5 ’CpG: t on

TKTL1

fibroblasteissa MSP (tuloksia ei ole esitetty). Bisulfiitti sekvensointi 18 CpG sivustoja ylävirtaan

TKTL1

transkription aloituskohdasta (Fig. 2 D) paljasti, että kaikki tai suurin osa CpG kohteet olivat täysin metyloituneita ei-ilmentävien fibroblastien linjat, HPNE ja SC3 ja CAF19 ja CAF25 (Fig. 2 E). Sen sijaan

TKTL1

ilmentävää linja, SC2, puuttui metylaatio monet näistä paikoista, tukeva rooli DNA: n metylaation säätelyssä

TKTL1

ilme. Olemme myös tunnistaneet säätelyä

DAZL

ja

ANXA3

(tuloksia ei ole esitetty), geenit aiemmin raportoitu indusoituvan 5-atsa-dC: [36],

NDN

, raportoitu painettu [54], ja

MT1G

, raportoitu metyloitavaa muiden syöpien [55].

(A) Affymetrix eksonin erilaisia ​​analyysi

SFN

mRNA: n ekspression viisi haiman valuuttalisiin ennen (vihreä) ja sen jälkeen (punainen) 5-atsa-dC hoitoon. (B) ja (C) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

SFN

ja

TKTL1

mRNA: n ilmentymisen suhteen

GAPDH

mRNA haiman fibroblastiviljelmät ennen (siniset palkit) ja jälkeen (punaiset palkit) 5-atsa-dC hoitoa. Kukin määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tiedot ovat keskiarvoja kolmen riippumattoman kokeen; palkit ovat SD-arvoja. (D) Top:

TKTL1

geenin rakennetta ja jakautumista CpG dinukleotidien. Lyhyt pystypalkit edustavat CpG sivustoja. Nuoli osoittaa transkription aloituskohdasta. Alla: bisulfiittimodifiointi genomisen Sekvensointianalyysin haiman valuuttalisiin ja ohjaus fibroblasteissa. Avoimet ympyrät edustavat metyloimattoman CpG sivustoja, kokomusta ympyrät metyloitu CpG sivustoja, ja kuoriutui ympyröitä osittain metyloitu CpG sivustoja. (E) bisulfiittimodifiointi sekvensointi kromatogrammeja

TKTL1

promoottorin haiman CAF (CAF19) ja ohjaus fibroblastien linjat (HPNE ja SC2). Nuolet osoittavat sytosiinitähteiden.

Tutkimme RNA profiilien määrittämiseksi, onko mitään ero vastauksia 5-atsa-p valuuttalisiin vertailuryhmän fibroblasteissa. Kolmekymmentäviisi 42 geenien aiheutettiin valuuttalisiin 5-atsa-dc (taulukko 1) indusoi myös yhden tai useamman valvonnan haiman fibroblasti rivit osoittaa, että vähän tai ei lainkaan geenien selektiivisesti ja jatkuvasti voimistuvan 5-atsa-dC in valuuttalisien.

DAZL

oli pisimmälle indusoidun geeni neljässä valuuttalisiin (CAF12, CAF15, CAF16, ja CAF19) ja oli joukossa kymmenen geenien aiheutettiin kaksi valuuttalisiin (CAF18 ja CAF22) ja yksi kontrolli fibroblasti (HPNE) ( dataa ei esitetty). Suoritimme hierarkkinen klusterointi geenien aiheuttama 5-atsa-dC valuuttalisiin ja ohjaus fibroblastien onko oli havaittavissa eroja yleistä malleja geenin vaste 5-atsa-dC, mutta ei ollut klustereiden mukaan fibroblastien luokka (kuva S3). Viisi seitsemästä valuuttalisiin ryhmitelty yhteen, kaksi muuta valuuttalisiin klustereiden kontrolliin fibroblasteissa.

Lisätietoja näyttöä tästä vähäisyys geenien vaiennetaan DNA-metylaation valuuttalisiin tulee arvioida geeneistä ali-ilmentynyt in valuuttalisien. Havaitsimme geenejä, jotka ali-ilmentynyt mukaan keskimäärin ≥4.0-kertainen kaikissa valuuttalisiin verrattuna haiman ohjaus fibroblasteja (taulukko S2). Erityisesti, ei ole päällekkäisyyksiä tämä lista 86 on ali-ilmentynyt geenien ja geenien aiheuttama keskimäärin 2-kertainen 5-atsa-p valuuttalisiin (taulukko 1). Nämä tiedot osoittavat, että harvat mahdolliset geenit johdonmukaisesti ali-ilmentynyt in valuuttalisiin vaiennetaan DNA: n metylaatio.

tunnistaminen kandidaattigeenit hypometylaatio analyysiä

Olemme aiemmin tunnistettu 200 geenejä, kuten

Smo

, yläreguloituja haiman valuuttalisiin suhteessa haiman ohjaus fibroblastien [27]. Kartoittaakseen hypometyloidut geenien valuuttalisiin, yhdistimme tämä lista geenien yli-ilmennetään haiman valuuttalisiin kanssa luettelon 581 geenien aiheuttama ≥3.0 kertaiseksi ainakin yhdessä fibroblastisolulinjassa 5-atsa-dC hoitoa. Tämä kriteeri tunnistettu 49 kandidaattigeenit (taulukko S1) joista osa voidaan säädellä metylaatio, ja mahdollisesti hypometyloidut haiman valuuttalisiin suhteessa kontrolliin fibroblasteissa.

5-atsa-dC hoitoon ihmisen haiman valuuttalisiin, ohjaus fibroblasteja ja syöpäsolulinjoja

vieressä verrattuna vastauksista valuuttalisiin ja valvonnan fibroblastien 5-atsa-dC kanssa vastausten haimasyövän solulinjoissa. Meillä syntyy yksittäinen geeni luettelo kunkin fibroblastien rivin tai solulinjaan ja sitten laskettiin kokonaismäärä geenien aiheuttama ≥5-kertaisesti kunkin rivin (kuva 3). Sitten verrataan keskimäärin geenien aiheuttama ≥5-kertainen 5-atsa-dC kymmenen valuuttalisiin, 3 ohjaus fibroblastien riviä, ja 4 haimasyöpä solulinjoissa. Huomattavasti vähemmän geenejä indusoitiin 5-atsa-dC valuuttalisiin kuin haimasyövän solulinjoissa (

P

= 0,0009). Määrä geenejä aiheuttama ≥5-kertaiseksi kymmenen valuuttalisiin oli vain 9 ± 10 geenejä (keskiarvo +/- standardipoikkeama) verrattuna 17 ± 14 geenien aiheuttama ≥5-kertaiseksi kolmen haiman ohjaus fibroblasteja, ja 123 ± 86 geenien aiheuttama ≥5-kertaisesti 4 haimasyöpä solulinjoissa (kuvio 3). Ei ollut merkittävää eroa määrä geenejä aiheuttama ≥5.0 kertaiseksi valuuttalisiin ja haiman valvonta fibroblasteissa. Sen varmistamiseksi, että meillä oli valinnut kohtuullisen kertamuutosta sulku vertailun, vertasimme myös joukko geenejä aiheuttama ≥3-kertaiseksi. Samanlaisia ​​eroja havaittiin myös: määrä geenejä indusoidun ≥3-kertaiseksi 5-atsa-dC oli 83 ± 47 geenien aiheutettiin ohjaus fibroblasteissa ja 48 ± 42 geenien aiheutettiin valuuttalisiin ja 430 ± 271 geenien haimasyövän solulinjoissa (

P

= 0,0006 varten valuuttalisiin suhteessa syöpäsolun riviä). Ei ollut merkittäviä eroja, jotka liittyvät potilaan iän tai sukupuolen mukaan joukko geenejä aiheuttama 5-atsa-dC.

keskimäärin 123 ± 86 geenien aiheutettiin 5-kertainen tai enemmän 5-atsa-dC käsittely neljässä haimasyövän solulinjoissa, 9 ± 10 geenejä kymmenen haiman valuuttalisiin (

P

= 0,0009) ja 17 ± 14 geenien kolmessa ohjaus haiman fibroblastien linjat.

Differential metylaatio ehdokas hypometyloidut geeni ADAM12

analyysi geenien ilmentymistä selektiivi- sesti 5-atsa-dC valuuttalisiin ei tuottanut geenit, joiden tiedetään säätelevän DNA: n metylaatio, jotka vaikuttavat strooman fibroblastien käyttäytymiseen. Tutkimme myös listoiltamme geenien differentiaalisesti ilmaistut valuuttalisiin vertailuryhmään nähden haiman fibroblastien ehdokkaita, jotka vaikuttavat kasvaimen /strooman vuorovaikutusta. Yksi ehdokas yliekspressoitiin valuuttalisiin oli

ADAM12

.

ADAM12

(a disintegriini- ja metalloproteaasi 12), säädin solu-solu- ja solu-matriisi vuorovaikutuksia, yliekspressoituu syöpään liittyvän fibroblastit, ja se on osallisena kasvaimen etenemistä [56]. Olemme ensimmäinen vahvistettu säätelyä

ADAM12

mRNA valuuttalisiin vertailuryhmään nähden fibroblasteja käyttäen kvantitatiivista RT-PCR. Vastaa meidän eksonin array tulos (Fig. 4a),

ADAM12

mRNA erittäin yli-ilmentyy haiman ohjaus fibroblastien johdettu haimatulehdus näytteestä (SC3) ja yhdeksän valuuttalisiin suhteessa kontrolliin fibroblastien HPNE ja SC2 (Fig. 4b).

(A) Affymetrix eksonin erilaisia ​​analyysi

ADAM12

mRNA ilmaisun haiman valuuttalisiin ja ohjaus fibroblasteissa. (B) Kvantitatiivinen RT-PCR-analyysi

ADAM12

mRNA ilmaisun haiman valuuttalisiin ja ohjaus fibroblastien jälkeen normalisoinnin

GAPDH

tasoilla. Kukin määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Tiedot ovat keskiarvoja kolmen riippumattoman kokeen; palkit ovat SD-arvoja.

Voit selvittää

ADAM12

oli differentiaalisesti metyloitavaa valuuttalisiin vertailuryhmän fibroblastien, suoritimme bisulfiitti sekvensointi

ADAM12

geenin promoottorin 9 valuuttalisiin ja 3 ohjaus fibroblastien riviä. Olemme monistivat 481 emäsparin alueen ylävirtaan

ADAM12

transkription aloituskohdasta, joka sisälsi 38 CpG sivustoja (kuvio 5a). Bisulfiitti sekvensointi paljasti, että 29 38 (76%) CpG sivustot olivat täysin metyloitu kontrolliryhmässä fibroblastien linja HPNE (kuvio 5b). Sen sijaan, kuusi yhdeksästä valuuttalisiin (CAF12, CAF14, CAF15, CAF16, CAF20, ja CAF22) olivat täysin (100%) metyloimaton ollenkaan CpG-sivustoja. Loput valuuttalisiin olivat osittain metyloidut on 2-7 38 CpG sivustoja ja täysin metyloitumaton kaikissa muissa CpG: t (kuvio 5a). Ohjaus- fibroblastit SC2 ja SC3 oli täysin metyloitu CpG: t lähellä 5′-pää sekvensoitiin alueella ja osittain metyloitu CpG: t lähellä 3′-päätä tällä alueella. He olivat täysin metyloitumaton kaikkina muina CpG: t. Näin ollen, oli suhteellisen hypometylaatio useilla CpG: t välillä fibroblastit, jotka ilmensivät

ADAM12

ja ne, jotka eivät, syytetään poikkeava hypometylaatio

ADAM12

mekanismi sen yli-ilmentymisen haiman valuuttalisiin verrattuna kontrolliin haiman fibroblasteissa.

(A) Top:

ADAM12

geenin rakennetta ja jakautumista CpG dinukleotidien. Lyhyt pystypalkit edustavat CpG sivustoja. Nuoli osoittaa transkription aloituskohdasta. Alla: bisulfiittimodifiointi genomisen Sekvensointianalyysin haiman valuuttalisiin ja ohjaus fibroblasteissa. Avoimet ympyrät edustavat metyloimattoman CpG sivustoja, kokomusta ympyrät metyloitu CpG sivustoja, ja kuoriutui ympyröitä osittain metyloitu CpG sivustoja. (B) bisulfiittimodifiointi sekvensointi kromatogrammeja

ADAM12

promoottorin haiman CAF (CAF19) ja ohjaus fibroblastien linja (HPNE). Nuolet osoittavat sytosiinitähteiden.

Sen määrittämiseksi, Adam12 proteiinin yli-ilmentyy stroomaan ensisijaisen haiman adenokarsinoomat, teimme immunohistokemia kudossiruina. Vaikka Adam12-proteiinin ekspressiota ei havaittu fibroblasteissa ympäröivän normaalin haiman kanava (kuvio 6b), valuuttalisiin ensisijaisen haiman adenokarsinoomien olivat positiivisia Adam12 proteiinin ilmentymisen (kuvio 6c).