Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kertyvät näyttöä siitä, että metformiini, biguanidi luokan diabeteksen lääkkeet, hallussaan syövän ominaisuuksia. Kuitenkin, useimmat tutkimukset terapeuttisen tehokkuuden arvioimiseksi metformiinia on ollut ensisijainen syöpä. Tietoja ei ole saatavilla, onko metformiinin voitaisiin tehokkaasti käyttää toistuvia syövän, erityisesti peräsuolen syöpä (CRC), joka vaikuttaa jopa 50%: lla potilaista tavanomaisilla chemotherapies. Vaikka syyt toistumisen ei täysin tunneta, sen uskotaan johtuvan uudelleen syntyminen kemoterapian vastustuskykyisten syövän varsi /varsi kaltaisia ​​soluja (CSCS /CSLCs). Siksi kehittäminen myrkytön hoitostrategioita kohdistaminen CSCS olisi merkittävää terapeuttista hyötyä.

Nykyisessä tutkimuksessa olemme tutkineet tehokkuutta metformiinin, yhdessä 5-fluorourasiilin ja oksaliplatiinia (FuOx), The tukipilari paksusuolensyöpä terapeuttisten, eloonjäämiseen chemo vastustuskykyisten koolonsyöpäsoluihin jotka ovat erittäin rikastettu CSCS /CSLCs. Meidän tiedot osoittavat, että metformiini vaikuttaa synergistisesti FuOx (a) indusoivat solukuoleman Chemo resistenttejä (CR) HT-29 ja HCT-116-paksunsuolen syöpäsolujen, (b) estää colonospheres muodostumisen ja (c) lisätään colonospheres hajoamisen.

In vitro

soluviljelmätutkimukset ovat lisäksi osoittaneet, että kombinatorinen hoito estää migraation CR koolonkarsinoomasoluissa. Nämä muutokset liittyvät lisääntyneeseen miRNA 145 ja vähennys miRNA 21. Wnt /β-kateniinin signalointireitin myös alassäädetty osoittaa sen keskeinen rooli kasvun säätelemiseksi CR koolonkarsinoomasoluissa. Tiedot SCID-hiiriin ksenograftimallissa CR HCT-116 ja CR HT-29-soluja, osoittaa, että metformiinin ja FuOX on erittäin tehokas kasvun estämiseksi paksusuolen kasvainten osoituksena -50% kasvun inhibointi seuraavissa 5viikko yhdistelmähoidosta , verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin kontrolleihin. Nykyinen tiedot viittaavat siihen, että metformiini yhdessä tavanomaisten kemoterapia voisi olla tehokas hoito toistuvien peräsuolen syöpä (CRC).

Citation: Nangia-Makker P, Yu Y, Vasudevan A, farhana L, Rajendra SG, Levi E, et ai. (2014) Metformiini: potentiaaliseksi terapeuttiseksi aineeksi toistuvat Colon Cancer. PLoS ONE 9 (1): e84369. doi: 10,1371 /journal.pone.0084369

Editor: Shrikant Anant, University of Kansas School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 lokakuu 2013; Hyväksytty: 22 marraskuu 2013; Julkaistu: 20 tammikuu 2014

Copyright: © 2014 Nangia-Makker et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta NIH (AG014343) ja Department of Veteran asioiden (I101BX001927). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Viime ymmärtämistä heterogeeninen monipuolistaa syövän solujen kasvain on paljasti CSCS /CSLCs [1], [2], joilla on uudistuva ominaisuudet, kyky aloittaa kasvaimen pieni määrä ja solut, jotka ovat erittäin kemiallis-resistenttejä [3] – [7]. Karsinooma toistuminen on osittain johtuu siitä, että tavanomaiset kemoterapiaa kohdistettu vain nopeasti jakautuvia soluja, jotka muodostavat suurimman osan kasvain, mutta säästää CSCS /CSLCs [8]. Osuus CSCS on raportoitu lisääntyneen jälkeen tavanomaisen kemoterapian [9]. Siten läsnäolo kemoterapiaa resistenttien CSCS /CSLCs ensisijainen kasvain voi osittain olla vastuussa epäonnistumisesta täydellisen hävittämisen kasvaimen tuloksena sen toistuminen on ensisijainen ja toissijainen sivustoja. Kehittää uudenlaisia ​​hoitostrategioita, jotka kohdistuvat erityisesti CSCS /CSLCs on aiheellinen.

metformiinin, (1,1-dimetyylibiguanidi hydrokloridi) FDA: n hyväksymässä biguanidi diabeteksen lääke, on peräisin ranskalaisen lila (

rohtovuohenherne

), kasvin käytetään kansanlääkinnässä jo vuosisatoja. Sen lisäksi, että sen toimintaa glukoneogeneesin vaimennin, metformiini on äskettäin osoitettu olevan voimakas syövän ominaisuuksia. Tyypin 2 diabeetikoilla metformiinin on osoitettu tukahduttaa syövän syntymistä rinta-, haima- ja keuhkojen ja vähentää syöpään liittyvää kuolleisuutta (tarkistetaan [10], [11]. Joissakin prekliinisissä tutkimuksissa metformiini pienentää leviämisen, indusoi apoptoosin, aiheutti solusyklin pysähtymiseen ja vähentänyt ja kasvua kokeellisten kasvainten

in vivo

[12] – [18]. Jotkut raportit osoittavat myös, että metformiinia paransi vaste ihmisen rinta- tuumoriksenograftien tavanomaisen kemoterapian poistamalla CSCS vuonna kasvain [19], [20].

Monet tutkijat ovat raportoineet avainasema Wnt /β-kateniinin signalointireitin säätelyssä epiteelin kantasolujen itseuudistumisen [21], [22], ja sen säätelyhäiriö on liitetty monien pahanlaatuisten kasvainten, mukaan lukien peräsuolen syöpä (CRC) [23], [24]. sen CRC, seurauksena inaktivaation APC-geenin, koordinoitua fosforylaatiota ja tuhoaminen β-kateniinin häiriintyy. Tämän seurauksena, β-kateniinin kertyy sytoplasmaan, komplekseja DNA: ta sitovien proteiinien TCF /LEF perheen ja siirtyy tumaan, [25], [26]. Siellä se aktivoi transkriptiota sen kohdegeenien, kuten sykliini D1, c-myc, MMP-7, MT1-MMP, axin1 jne [27]. Monet näistä kohdegeenien on osallisena suolen kantasolujen lisääntymistä ja syövän syntymistä [28]. Viime aikoina olemme osoitti, että Wnt /β-kateniinin reitin on keskeisessä asemassa kasvun ja ylläpidon colonospheres, joita korkeasti rikastetun CSC /CSL soluihin [29]. Kohonnut β-kateniinin colonospheres liittyi induktioon transkription aktivaation TCF /LEF, joka väheni, kun β-kateniinin on vaiennettu käyttäen siRNA [29].

uusi luokka lyhyitä ei-koodaavat RNA: t ns miRNA on noussut säätelijänä mRNA translaation. MiRNA voi toimia tuumorisuppressorina tai onkogeeni riippuen sen tavoitteista eri kudoksissa ja solutyypeissä [30]. Laajat analyysit miRNA-ilmentymismalleja ihmisen syövissä ovat osoittaneet, että eri syöpätyyppejä ovat eri miRNA ekspressiokuvioiden [31] Meillä on raportoitu, että miR21, jonka on osoitettu olevan säädelty vahvistavasti CRC [32], indusoi stemness vuonna kemoterapia -kestävistä (CR) koolonkarsinoomasoluissa [33]. miR21 on osoitettu säätelevän kasvua, muuttoliike, invaasion ja apoptoosin liittyvät ominaisuudet syöpäsolujen [34]. Down-regulation miR21 mukaan CDF, analogi curcumin [35], johti normalisoituminen PTEN /Akt-akselin CR HCT-116 ja CR HT-29-solujen ja vähentää kasvua [36]. Yli-ilmentyminen miR21in HCT-116-soluissa johti lisääntyneeseen β-kateniinin toimintaa [33].

Tämä tutkimus tehtiin tutkimaan, metformiinia voidaan käyttää yhdessä tavanomaisten kemoterapia estää kasvun Chemo kestävä koolonkarsinoomasoluissa ja asetus tämän prosessin. Tässä osoitamme, että metformiini vaikuttaa synergistisesti FuOx, yhdistelmä 5-FU: hun ja oksaliplatiinia, tukipilari paksusuolen syövän kemoterapiaa kasvun estämiseksi paksusuolen CR solujen

in vitro

ja

in vivo

sekä niiden siirtymä kautta alaspäin säätäminen miR21and estämällä Wnt /β-kateniinin signalointireitin.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat ja reagenssit

Ihmisen koolonkarsinoomasoluissa HT-29 ja HCT-116 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Soluja pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-väliaineessa (4,5 g /I D-glukoosia), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (Invitrogen, Grand Island, NY) ja 1% antibiootti /antimykoottia kosteutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa oli 95% ilmaa ja 5% hiiltä diaoxide. 5-fluorourasiili + Oksaliplatiini (FuOx) resistenttien solujen (CR-solut) tuotettiin kuten aiemmin on kuvattu [37] – [39] laboratoriossamme. CR-soluja pidettiin normaalissa elatusaineessa, joka sisälsi 2 x FuOx (50 uM 5-FU + 1,25 uM Ox). Endoteelisolut olivat lahja tri Dipak Banerjee, University of Puerto Rico ja ylläpidetään Earlen Minimum Essential väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone), kuten aiemmin on kuvattu [40]. Elatusaine vaihdettiin kaksi kertaa viikossa, ja solut siirrostettiin käyttäen 0,05% trypsiini /EDTA: a (Invitrogen). Käyttö solulinjojen hyväksyttiin Human Investigation komitean, Wayne State University, Detroit, MI. Metformiinihydrokloridi hankittiin Sigma Chemical Co. A 2 M liuos valmistettiin steriiliä tislattua vettä ja säilytettiin -20 ° C: ssa. FU ja Ox saatiin Sigma Chemical Co.

määrittäminen solujen kasvun

kasvu koolonkarsinoomasoluissa arvioitiin mitokondrioiden riippuva väheneminen 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli ) -2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) (Sigma) formatsaaniksi, kuten aiemmin on kuvattu [41]. Lyhyesti, solut (5 x 10

3) ympättiin nelinkertaisesti päälle 24-kuoppaisille viljelylevyille. 24 tunnin kuluttua tuoretta alustaa, joka sisälsi erilaisia ​​pitoisuuksia metformiinin ja /tai FuOx lisättiin. 72. h, soluproliferaatiota määritettiin MTT: llä. Lyhyesti, elatusaine poistettiin ja soluja inkuboitiin 37 ° C: MTT: tä (0,5 mg /ml) 4 tunnin ajan. Elatusaine imettiin pois ja solut liuotettiin 0,04 N HCl: ää isopropanolissa. Optinen tiheys (OD) mitattiin 570 ja 630 nm.

analyysi vuorovaikutuksen metformiinin ja FuOx

Combination indeksit (CI) menetelmä soveltuu

in vitro

huumeiden testaus käytettiin luonteen määrittämiseksi vuorovaikutuksen metformiinin ja FuOx. Tämä menetelmä käyttää useita lääkkeen vaikutuksen yhtälö alun perin peräisin entsyymikinetiikka menetelmä, jossa lähtö on edustettuna CI ja /tai isobologrammia analysis.CI analyysi suoritettiin käyttämällä CalcuSyn-ohjelmisto (Biosoft, Ferguson, MO). Perustuu CI arvoihin, laajuus synergia /anatogonism määritetään. Yleensä CI-arvot alle 1 ehdottaa synergiaa, kun taas Cl-arvot edellä 1 osoittavat vastakkainasettelusta huumeita. Cl-arvot ovat välillä 0,9-1,10 olisivat lähinnä osoittaa lisäaineen vaikutukset: ne välillä 0,9-,85 antavat lieviä synergiaa, ja arvot ovat välillä 0,7-0,3 ovat osoitus kohtalainen synergiaa. Mikä tahansa arvo on alle 0,3 ehdottaa voimakas synergistinen vuorovaikutukset lääkkeitä.

muodostuminen ja erilaistumista colonospheres

solujen kyky muodostaa palloja suspensiossa arvioitiin kuten on kuvattu julkaisussa Liu et ai [42 ] pienin muutoksin [29], [43]. Lyhyesti, colonospheres muodostettiin inkuboimalla rajoitettu määrä vanhempien ja CR HCT-116 ja HT-29-soluja pitoisuuteen 100 solua per 200 ui seerumin vapaata kantasolu väliaineen (SCM), joka sisälsi DMEM /F12 (01:01) täydennetty B27 (Life Technologies, Gaithersberg, MD) 20 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (Sigma, St. Louis, MO), 10 ng /ml fibroblastikasvutekijää (Sigma) ja antibiootti /antimykootti 24-kuoppalevyillä läsnä ollessa metformiini yksinään tai yhdessä FuOx. Colonospheres muodostunut 8 päivän kuluttua arvioitiin niiden kokoa ja lukumäärää valomikroskoopilla. Yhdet kokeissa colonospheres sen tavanomaisessa väliaineessa hoidettiin metformiinin ja /tai FuOx analysoimaan niiden vaikutusta pallo erilaistumiseen ja kiinnitys.

Extreme rajoittavan laimennuksen analyysi

Extreme rajoittavan laimennuksen analyysi (ELDA) suoritettiin kuten ovat kuvanneet Hu ja Smyth [44]. Lyhyesti, yksi solususpensio saatu kiinnittyneet solut esikäsiteltiin metformiinin ja /tai FuOx 72 tuntia maljattiin pitoisuutena 100, 10 ja 1 solujen 100 μLSCM (24 hyvin kutakin laimennosta) 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin 8 päivää . Lopussa 8 päivää, kuoppien määrä osoittaa muodostumisen colonospheres laskettiin. Taajuus pallo muodostavien solujen määritettiin käyttäen ELDA webtool on https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda.

Cell migraatiokokeessa

Tämä määritys suoritettiin käyttämällä Boyden kammio (Neuroprobe Inc., Cabin John, MD), kuten aiemmin on kuvattu [41], [45]. Alemmassa kammiossa 100 ug /ml matrigeeliin (BD Biosciences, Bedford, MA), yksin tai sekoitettuna metformiinin ja /tai FUOX lisättiin. HT-29 tai CR HT-29-solut (5 x 10

4) solut ladattiin ylemmässä kammiossa. Nämä kaksi kammiota erotettiin polykarbonaatin suodattimen 8 μ huokoskoko ja inkuboitiin 37 ° C: ssa kudosviljelyinkubaattorissa 16 tuntia, jonka jälkeen suodatin poistettiin, solut päälle suodattimen pyyhittiin pois ja siirtynyt soluja värjäsimme käyttäen Protocol Hema 3 tahra sarja (Fisher Scientific Company, Pittsburgh, PA). Siirrettyjä soluja valokuvattiin käyttäen Olympus 45 mikroskooppia tukee Spot Idea kameran ja muuttivat solua kenttä laskettiin. Kukin määritys suoritettiin kolmesti ja 6 kaivoja käytettiin kussakin käsittelyssä.

Seuraavassa koesarjassa, migraation koolonkarsinoomasoluissa endoteelisoluja kohtaan mitattiin. Tässä tutkimuksessa enodothelial soluja tai HT-29 /CR HT-29-soluja (2,4 x 10

4) esi-leimattu elävyysvärjäyksellä DiO tai Dil vastaavasti (Invitrogen), pestiin kahdesti täydellistä elatusainetta ja ympättiin kuhunkin kammioon soluviljelmän insertin (ibidi GmbH). 24 tunnin kuluttua, soluviljelmä insertti poistettiin ja kulkeutumista yhteistyössä kulttuureissa toisiaan kohti haavan paranemista havaittiin. Joissakin kulttuureissa, metformiinin ja /tai FuOx lisättiin aikaan insertin poistamiseen. Solut valokuvattiin 0, 24 ja 48 tuntia sen jälkeen, kun insertin poistamiseen.

Western blot-analyysi

Western blot -analyysi suoritettiin standardin protokollan [46]. Lyhyesti, solut liuotetaan hajotuspuskuriin (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% Triton X100, 0,5% NP40, 25 ug /ml kutakin aprotiniinia, leupeptiiniä ja pepstatiini, 1 x fosfataasi inhibiittoriseoksen (Sigma). sen jälkeen kun selventäminen 10000 g 30 minuuttia, supernatantti käytettiin proteiinin analyysiin. Proteiinipitoisuus määritettiin Bio-Rad proteiinimäärityksellä kit ((Bio-Rad, Hercules, CA) ja alikvootit, jotka sisältävät 25 ug proteiinia erotettiin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. elektroforeesin jälkeen, proteiinit siirrettiin polyvinylideenidifluoridimembraanille (Millipore) elektroforeesin ja alistettiin western blot-analyysi, jossa suositeltu laimennus primaarisen vasta-aineen. pesujen jälkeen blotit reagoimaan sekundäärisen vasta-aineen yhdistelmä, joka sisältää 1:2500 laimennokset sopivan piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Amersham Biosciences). Proteiiniviivat tehtiin näkyviksi käyttämällä kaupallisesti saatavilla parannettu tua kemiluminesenssi-kittiä (Amersham Biosciences). Blotit myös immunologiseen reagoida 1:5000 laimennus anti-aktiini hiiren monoklonaalinen vasta-aine (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) normalisoimaan vaihtelua Proteiinilisäyksen.

eristäminen RNA ja Quantitative Polymerase Chain Reaction analyysi

Kokonais-RNA uutettiin vanhempien ja CR-soluja käsiteltiin metformiinin ja /tai FuOx 48 tunnin ajan käyttäen TRIZOL-reagenssia (Invitrogen) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokonais-RNA käsiteltiin DNase1 poistamiseksi kontaminoivan genomisen DNA: n, sen jälkeen puhdistettiin käyttämällä miRNAeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA-pitoisuus mitattiin optinen tiheys 260 nm: ssä.

kvantitoimiseksi miR-21 ja miR-145, ensimmäisen cDNA-synteesi suoritettiin käyttäen Taqman MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) . Mirna RT-PCR-alukkeiden miR21, miR145 ja endogeeninen kontrolli RNU6B hankittiin Applied Biosystems. Reaaliaikainen qRT-PCR-analyysi suoritettiin käyttäen Applied Biosystems 7500 reaaliaikaista PCR System. PCR-yhdistelmä, joka sisältää Taqman 2 x Universal PCR Master Mix käsiteltiin seuraavasti: 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 sekuntia ja 60 ° C 60 sekunnin ajan. Signaali kerättiin päätepisteessä jokaisen syklin. Geeniekspressiota ACk

T-arvot kullekin näytteelle laskettiin normalisoimalla sisäisen valvonnan RNU6B, ja suhteellinen kvantitointi arvot piirrettiin.

virtaussytometrianalyysin

Yksisolususpensiot metformiinin ja /tai FuOx käsiteltyä tai käsittelemätöntä CR HT-29-solut altistettiin suoralla immunofluoresenssilla värjäyksessä, mitä seurasi virtaussytometria-analyysin mukaan protokollaa [38]. Lyhyesti, solut kerättiin ja pestiin PBS: llä. Puoli miljoonaa solua suspensoitiin 90 ul: ssa PBS: ää, joka sisälsi 0,5% BSA: ta. 10 minuutin inkubaatioajan jälkeen huoneenlämpötilassa, 10 ui fluorofori (PE-Cy7 tai PerCP-Cy5) konjugoitua ant-ihmisen CD44 tai CD166-vasta-ainetta lisättiin ja inkuboitiin 30 minuuttia pimeässä huoneen lämpötilassa. Sitten näytteet pestiin ja analysoitiin käyttäen FACS DiVa (BD, San Jose, CA). Solut värjättiin IgG2b (isotyyppi-negatiivinen kontrolli) toimi gating ohjaus. Osuus CD44

+ /CD166

+ /low-solut määritettiin perusteella fluoresenssin voimakkuus-spektri.

kasvaimen kasvua SCID-hiirissä

Voit selvittää yhdistelmän metformiinin ja FuOx olisi tehokas terapeuttinen strategia paksusuolen kasvaimet, SCID-hiirissä ksenograftimallissa paksusuolen kasvaimen käytettiin. Tuottaa koolontuumoreissa, neljän viikon ikäinen nainen SCID-hiiriin, ostettu Taconic Laboratory, injektoitiin s.c. joko 1 x 10

6 CR HCT-116 tai CR HT-29-solujen suspensoitiin 100 ul Matrigel. Sitten ne on jaettu 2 alaryhmiä 4 hiirtä ja metformiinin kanssa aloitettiin 7 päivää ymppäyksen jälkeen ja solujen alaryhmään. Metformiini (RIOMET 500 mg /5 ml; Ranbaxy Laboratories, Princeton, NJ) liuotettiin 100 ml: aan juomavettä saavuttamiseksi annos 200 mg /kg kehon paino. Vesi vaihdettiin päivittäin ja mitattiin veden saanti. Metformiiniin jatkettiin 5 viikkoa, kunnes hiiret tapettiin. Metformiinin ryhmä injektoitiin myös IP-seoksen kanssa 25 mg /kg 5-fluorourasiilin ja 2 mg /kg oksaliplatiinia kerran viikossa 3 viikon ajan. Kasvaimet mitattiin kerran viikossa ja kasvainten tilavuudet laskettiin käyttäen kaavaa: tuumorin tilavuus = pituus x leveys x leveys /2. Hiiriä seurataan säännöllisesti mistään merkkejä epämukavuutta. Kaikki eläinkokeet suoritettiin mukaisesti Wayne State University Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) hyväksytyn tutkimussuunnitelman # A02-02-13. Eläinten hyvinvointi Assurance # A3310-01.

Yhden solun erillään ksenograftissa

Pieniä määriä (5-10 mg) kasvaimen, syntyy SCID hiirillä CR HCT-116 ja CR HT -29-solut, kuten alla on kuvattu pestiin laajasti 1 x PBS: ssä, joka sisälsi 10% antibioottia /antimykoottia (AB /AM) ja sen jälkeen inkuboitiin yön yli Dulbeccon Minimum Essential Media (DMEM /F12), joka sisälsi 5% antibioottia /antimykoottia 4 ° C: ssa. Kudos leikattiin hienoiksi palasiksi käyttäen steriiliä skalpelli ja sitten digestoitiin 1,5 mg /ml kollagenaasia I (Sigma-Aldrich) ja 20 ug /ml hyaluronidaasia I (Sigma Aldrich), varovasti sekoittaen 2-3 tuntia 37 ° C: ssa. Digestoitu kudos suodatettiin 40 μ suodattimen ja sentrifugoitiin 1200 rpm 5 minuutin ajan. Supernatantti (joka sisältää kuolleiden solujen sekä rasvaa solujen) heitettiin pois ja solut (pellet) pestiin kolme kertaa DMEM /F12-väliaineessa, joka sisälsi 5% AB /AM. Solut suspensoitiin aiemmin määritellyn kantasolujen media.

Tilastollinen

Kaikki

in vitro

kokeet toistettiin kolmesti kolmena rinnakkaisena. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Microsoft Excel. P-arvot laskettiin käyttäen 2 otoksen t-testi, olettaen epätasainen varianssit. Arvot 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

metformiinin ja FuOx yhdistelmähoito inhiboi kemiallis-resistenttien HT-29 ja HCT-116-solujen synergistisesti

tarkastella onko metformiini vaikuttaa synergistisesti FuOx estää kasvua kemiallis-resistentit solut, solut käsiteltiin annoksina metformiinin ja FuOx, jokainen yksin tai yhdessä. Sen jälkeen, kun 72 tunnin kuluttua solujen kasvu määritettiin MTT-määrityksellä. Annosvastekäyrät Kuva 1A B osoittavat, että vaikka 10 mM metformiinia tai 8 x (200 uM FU ja 5 uM Oksaliplatiini) FuOx yksin aiheutti -40 ja 60% estäminen, yhdessä ne aiheutti eston -70% ja 80% CR HT-29 ja CR HCT- 116-soluissa. Tulokset osoittavat, että metformiinin ja FuOx vaikuttaa synergistisesti kasvun estämiseksi sekä CR HCT-116 ja CR HT-29-soluja. Kaikki myöhemmät kokeet suoritettiin käyttäen yhtä kemoterapia-resistenttejä koolonsyöpäsolulinjoissa.

(A) ja CR HT-29-soluissa (B) tuotetaan kiinteä suhde menetelmällä. Vahingoittuneiden solujen fraktion yhdistämällä kahden lääkkeen (kiinteä suhde) oli suurempi kuin kummallakaan aineella yksinään. Fa edustaa vahingoittuneiden solujen fraktion vastauksena hoitoon. Fa-arvoja käytettiin tekemään synergian analyysi CalcuSyn-ohjelmisto, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. C. suhteellinen eloonjääminen CR HT-29-solujen läsnä ollessa kasvavia annoksia metformiinin kanssa ja ilman 2 x FuOx. Yhdistelmähoito on tehokkaampi kaikissa pitoisuuksissa. Veh: ajoneuvo yksin. Kukin käsittely suoritettiin neljänä rinnakkaisena, pylväät esittävät keskiarvo ± keskihajonta. * P-arvo 0,05.

jakeet vahingoittuneiden solujen vastauksena kuhunkin hoitoon, käytettiin suorittamaan synergiaa analyysin CalcuSyn- ohjelmisto. CI muotoilema ohjelmiston, paljasti arvot osoittavat kohtalaista synergistinen vuorovaikutus kahden aineen CR HCT-116-solujen metformiiniannoksilla 5 mM ja suurempi ja voimakas synergia 10 ja 20 mM metformiinin CR HT-29-solut (taulukko 1). Ei synergia havaittiin emosoluista (tuloksia ei ole esitetty). Koska kemiallis-resistenttejä soluja ylläpidetään 2 x FuOx (50 uM FU, 1,25 uM oksaliplatiini), seuraavaksi tutkittiin vaikutusta annoksina metformiinin vaihtelevat 0,6-20 mM yhdessä 2 × FuOx kasvuun CR HT 29-soluja. Tulokset osoittavat, että kaikilla käytetyillä pitoisuuksilla, yhdistelmähoito oli tehokkaampi inhiboimaan solun kasvua kuin pelkkä metformiini (Fig. 1 C). Kemoterapia-resistentit solut olivat resistenttejä FuOx ja herkempiä yhdistelmähoidon verrattuna emo-soluja (tietoja ei esitetty).

metformiinin ja FuOx yhdistelmähoito estää colonosphere muodostumista (lukumäärä kantasolujen /stem kaltaisia ​​soluja) B

on raportoitu, että FuOx eloonjääneiden solujen rikastetaan CSCS /CSLCs jotka kasvavat niin suuri, pyöreä irrallista kelluva pallomainen pesäkkeet (colonospheres), kun niitä viljeltiin seerumittomassa kantasolujen väliaineessa suhteellisen alhainen tiheys [38] [29]. Kuviot. 2A ja B (vasen paneeli) osoittaa, että läsnä oli 2 x FuOx, kasvavien pitoisuuksien metformiinin vähensi ja koko colonospheres. Metformin indusoi myös kiinnitys, ja ne hajosivat colonospheres (Fig. 2A ja B (oikea paneeli)) Kun colonospheres trypsinoitiin ja ympättiin, kun läsnä on metformiinin + FuOx, kasvava määrä pallojen menettäneet varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia kuin ne nähdään liittää sen astian pohjalle.

A B: muodostuminen ensisijainen colonospheres läsnäollessa metformiinin ja FuOx (vasen paneeli). Erilaistumisen induktioon ja kiinnitys colonospheres läsnäollessa metformiinin /FuOx (oikea paneeli). V: graafinen esitys numeroiden B: mikrovalokuvia edustavista aloilla. C: virtaussytometrinen analyysi CD44 ja CD166-positiiviset solut sen jälkeen, kun metformiinin /FuOx hoitoon.

arvioitiin myös syövän kantasoluja ominaisuuksia käsiteltyjen solujen suorittamalla äärimmäinen rajoittavan laimennuksen määritystä (ELDA). CR HT-29-soluja käsiteltiin metformiinia + FuOx 72 tuntia ja ympättiin normaalissa kantasolujen välineellä. Vaikka metformiini yksinään vähensi taajuus muodostaa colonospheres 1,5-2 taittuu yhdistelmä vähensi sitä 7-8 taittuu kuin käsittelemätön kontrolli (taulukko 2).

onko ja missä määrin nykyiset hoitomenetelmät vaikuttaisi osuus CSCS /CSLCs, virtaussytometria analyysi tehtiin seuraavat metformiinin ja /tai FuOx hoitoon CR HT-29-soluja. Tulokset paljastivat vähennys (~65%) vuonna CD44

korkea /CD166

alhainen fenotyypin solupopulaation, verrattuna FuOx käsiteltyihin kontrolleihin. Sen sijaan osuus CD44

korkea /CD166

alhainen soluja nousi 5,12-7,34% läsnäollessa FuOx, jotka voivat osittain johtua kuoleman FuOx herkät solut. Yhdistelmähoito vähensi osuutta CD44

korkea /CD166

alhainen solut 2,8% (kuvio 2C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että metformiinin ja FuOx käyttäminen vähentää CR paksusuolen CSC /CSLC väestö, mutta myös pienennetään niiden kantasolujen ominaisuuksia.

metformiinin ja FuOx yhdistelmähoito estää solujen vaeltamiseen

Solun muuttoliikettä määritettiin Boyden kammio (kuvio 3A) ja haavan paranemista (kuvio 3B) määritykset. Boyden kammion määritys osoittaa, että vaikka vanhempien HT-29-solut osoittavat rajoitettu maahanmuutto, CR HT-29-soluilla vahva siirtymistä Matrigel. Kuitenkin metformiini havaittiin estävän muuttoliikettä annoksesta riippuvaisella tavalla, ja yhdistelmähoito aiheutti edelleen vähennys: 10 mM metformiini + FuOx, ~6 kertainen esto siirtymätesteissä havaittiin CR HT-29-soluissa (kuvio 3A).

Metformiini /FuOx vähensi muuttoa CR HT-29-soluja. Jokainen piste edustaa keskimäärin 6 lukemat. Pylväät edustavat keskiarvoa ± keskihajonta (A). Haavojen parantumisen määritys käyttäen endoteelin (top /punainen) ja CRC (alhaalla /vihreä). Ylhäällä vasemmalla paneeli: haava 0 h; alhaalla vasemmalla paneeli: täydellinen haavan paraneminen 48 tunnin CR HT-29-solut; ylhäällä oikealla paneeli: osittainen haavojen paranemista HT-29-solujen 48 tunnin kuluttua; alhaalla oikealla paneeli: puutteellinen haavan paranemiseen CR HT-29-solujen läsnä ollessa 5 mM metformiinin /FuOx 48 h (B). Western blot-analyysi metformiinin /FuOx käsiteltyjen CR H29 soluista osoittaa vähentynyt Pakt tasot (C); suhteelliset muutokset fosfo-Akt (Pakt) laskettiin suhteena Pakt /Akt normalisoinnin jälkeen ß-aktiini, jota käytettiin latauskontrollina. * P 0,05.

Haavan paranemista määritys suoritettiin tutkimaan kulkeutumista vanhempien ja CR HT-29-solujen endoteelisoluja kohtaan. Kuva. 3B osoitti CR HT-29 ja endoteelisolujen siirtyvät kohti toisiaan. 48 h, haava oli täysin parantunut kaksoispiste CR soluja, kun taas vanhempien solut osoittivat vain ~46% haavansulkemiseen (3B). Metformiinin + FuOx hidastui haavan paranemista. Vaikka 54% ja täydellinen haavan sulkemiseen havaittiin käsittelemättömissä CR HT-29-solut 24 ja 48 tunnin vastaavasti, metformiini + FuOx hoito johti 46 ja 77% haavan sulkemiseen 24 ja 48 tunnin vastaavasti. Nämä tulokset vahvistavat edelleen, että metformiini + FuOx yhdistelmä on tehokas elävänä kasvaimia /muuttavien /invasiivisia ominaisuuksia kemiallis-resistenttien koolonsyöpäsoluihin.

On raportoitu, että Akt on olennainen alavirtaan tavoite PI3K varten remontin aktiinisäikeiden lisätä solujen vaeltamiseen [47]. Tämä sai meidät analysoimaan Akt /Pakt ilmentymisen metformiinin ja FuOx käsiteltyjä soluja. Western blot analyysi paljasti alentuneet Pakt käsitellyissä soluissa, verrattuna kontrolleihin (Fig. 3). Ehdotamme, että PI3K /Akt-signalointireitin voi olla rooli säätelyssä metformiini /FuOx inhiboivan vaikutuksen solujen vaeltamiseen.

metformiinin ja FuOx yhdistelmähoitoa vähenee miRNA21 ja lisää miR145 ilmaisun

Ottaen on ajatus, että miR-21 on onkogeenisen, kun taas miR-145 on kasvain tukahduttava, olemme analysoineet niiden tasot kemiallis-resistenttien koolonsyöpäsoluihin. Olemme löytäneet tasot miR21 olevan suurempi CR koolonkarsinoomasoluissa [33] ja miR145 olla pienempi, verrattuna vastaavaan lapsilukko (julkaisematon data). Tulokset kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR-analyysi osoitti, kun metformiinin joko yksin tai yhdessä FuOx aiheutti huomattavaan vähenemiseen miR-21expression, se indusoi miR-145, verrattuna niiden valvontaa (Fig. 4). Riittää kun mainitaan, että qRT-PCR arvot miR-21 ja miR 145 normalisoituivat tasoa RNU6B.

C: metformiini /FuOx hoitoon CR HCT-116-soluissa estää transkription aktiivisuutta TCF /LEF. D: Western blot-analyysi osoittaa alennettu ilmentyminen β-kateniinin ja c-myc metformiinin /FuOx käsiteltiin CR HCT-116-solut. p-aktiini käytettiin latauskontrollina. * P 0,05.

Koska Wnt /β-kateniinin signalointi on kriittinen rooli säätelyssä paksusuolensyöpä kantasolujen lisääntymistä, me seuraavaksi tutkittiin vaikutusta metformiinin hoidon β-kateniinin aktiivisuutta, sen ilme ja tasot sen kohdeproteiinin c-myc. Yhdistelmähoidon metformiinin ja FuOX aiheutti -50%: n lasku transkriptionaalista aktiivisuutta TCF /LEF CR HCT-116-solujen, verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin (kuvio 4C). Western blot-analyysi osoitti selvästi lasku veren kokonaiskolesterolia β-kateniinin sekä c-myc ekspressiota CR HCT-116-solut. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, eston Wnt /β-kateniinin signalointi kemiallis-resistenttejä paksusuolen syövän soluja vasteena yhdistelmähoidon metformiinin ja FuOx.

metformiinin ja FuOx yhdistelmähoito hidastaa kasvaimen kasvua SCID-hiirissä

tutkia terapeuttisen tehon yhdistelmä Metform ja FuOx, SCID-hiiret ksenograftimallissa paksusuolen kasvaimen käytettiin. CR HCT-116 tai CR HT-29 solua injektoitiin ihon alle kylkeen alueella SCID hiirillä. Sen jälkeen palpoitavissa kasvaimet muodostettiin yksi ryhmä syötettiin metformiinia juomaveteen ja injektoitiin myös (i.p.) kanssa FuOx, kerran viikossa 3 viikon ajan. Kasvaimen kasvu mitattiin laskemalla kasvaimen tilavuus 34 päivän. Ksenografteja muodostettu CR HCT-116-solut osoittivat lineaarista kasvua asti 27 päivää, minkä jälkeen kasvaimen kasvu hidastui. Samankaltainen kasvumalli oli metformiinia /FuOx hoidetuissa hiirissä, joskin kasvu oli huomattavasti alhaisempi verrattuna kontrolleihin. Päivällä 34 injektion oli tilastollisesti merkitsevä (lähes 50%) kasvaimen koon pienentyminen metformiinia /FuOx käsiteltyihin hiiriin (kuvio 5A vasen paneeli). CR HT-29-solujen ruiskutetaan hiiret osoittivat hidas kasvaimen kasvua aluksi. Kuitenkin kasvupyrähdys nähtiin kontrollieläimiltä jälkeen 27 päivää. Toisaalta, metformiini /FuOx käsitellyistä hiiristä osoittivat nopea väheneminen kasvaimen tilavuuden jälkeen 27 päivää.

Pylväät edustavat keskiarvoa ± keskivirhe. * P 0,05. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR RNA uutettiin soluista eristettiin CR HT-29-kasvain (B). CD44 laskivat ja CK20 pinta nousi metformiinin /FuOx käsitelty ksenograftit. Colonosphere muodostuminen eristetyt solut CR-HT-29-ksenografteissa (C).

kasvaimet kerättiin, ja yhden solun suspensioita viljeltiin kantasolujen väliaineessa. Reaaliaikainen qPCR analyysi suoritettiin, joka osoitti merkittävää vähenemistä CD44 ja kasvuun CK20 mRNA tasot kasvainsoluissa muodostavat metformiini /FuOx käsitellyissä hiirissä (kuvio 5B).